pcr- real time ernane
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PCR Real time
PCR em tempo real uma tcnica para a deteco e medida de produtos
gerados durante cada ciclo da PCR; A emisso dos compostos fluorescentes gera um sinal que
aumentar na proporo direta da quantidade de produto da PCR; Em tempo real possvel saber a quantidade de produto em
um ponto no qual a reao ainda est na fase exponencial; Essa tcnica permite a quantificao, o acompanhamento da
reao e a apresentao dos resultados de forma mais precisa e rpida, pois no mais requer a deteco em gel de eletroforese.
PCR em tempo real
Vantagens do PCR em tempo real: No influenciado por amplificao no-especfica
(sondas); Amplificao pode ser monitorada em tempo real; Ciclos mais rpidos; Deteco de alterao menor que 2x; Maior extenso dinmica (de at 1010 x); Requer 1000x menos DNA que demais ensaios; Confirmao da amplificao especfica; MAIS ESPECFICO, SENSVEL e REPRODUZVEL; No muito mais caro que a PCR convencional; (exceo: preo do equipamento);
A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real
revolucionou o processo de quantificao de fragmentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a quantificao destes cidos
nuclicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reao. O ponto que detecta o ciclo na qual a reao atinge o limiar
da fase exponencial denominado de Cycle Thresbold.
Desvantagens do PCR em tempo real: No ideal para multiplex; Utilizao requer alta habilidade tcnica e suporte; Alto custo do equipamento;
PCR em Tempo Real FASES DA PCR:
Exponencial: Dobro do produto acumulado em cada ciclo (eficincia da reao ~100%). Reao especfica e precisa; Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reao); Plat: Deteco por gel para os mtodos tradicionais. Produtos no so mais produzidos e comeam ser degradados;
PCR em Tempo Real
Procedimento Faz-se um mix em um nico epeendorf, contendo: Primers (sense e anti-sense); Agua mili Q; Compostos fluorescentes;
Equipamentos Sistema ptico; Termociclador; Hardware Software
Fluorforos So molculas que absorvem e emitem luz em um
comprimento de onda especfico. SYBR Green um fluorforo, que emite uma fluorescncia verde com
a excitao da luz emitida pelo sistema tico do termociclador. Durante a PCR, as molculas do SYBR Green vo se ligando ao DNA recm sintetizado Um aumento da fluorescncia observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contnuo da reao.
SYBR Green No ligado emite pouca luz; Subtrada durante a anlise; Reconhecimento dos iniciadores; Polimerizao da enzima taq DNA polimerase; Desnaturao/ diminuio da fluorescncia; Extenso de cada ciclo/ aumento da fluorescncia;
Vantagens do SYBR Green: Baixo custo;
Facilidade no uso e sensibilidade;
Desvantagem do SYBR Green: Ligao no especfica;
Sistemas de deteco
Sistema baseado na deteco e quantificao de
um sinal fluorescente;
As duas alternativas mais utilizadas alm do SYBR Green
so TaqMan e Molecular Beacons; Ambos
com capacidade de hibridizao transferncia de energia para a quantificao.
gerando
TaqMan uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para
hibridizar outra molcula de DNA). Utilizada
para detectar seqncias especificas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR.
Apresenta em uma extremidade um fluorforo, e na outra
extremidade um quencher(molcula que aceita energia do fluorforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor).
TaqMan1.Polimerizao
2.Substituio da fita 3.Clivagem
4.Polimerizao finalizada
Fluorforo Quencher
Curva de amplificao do PCR Real Time
1) Linha basal: no houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescncia; 2) Fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo; 3) Fase plat: no h mais aumento no nmero de produtos.
Molecular beacons So oligonucleotdeos
usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundria entre as extremidades 5 e 3 chamada de haste-e-loop.
O loop contm uma sequencia que complementar
seqncia- alvo e a haste formada pelo anelamento das seqncias complementares que so localizadas nas extremidades. No emitem fluorescncia quando esto livres em soluo.
Molecular beaconsAB
(A) Oligonucleotdeo usado como sonda sintetizado de modo a possibilitar a formao de uma estrutura secundria nas extremidades 5e 3; (B) Toda fita nova formada durante a amplificao alvo para o anelamento do molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescncia.
Utilizao da PCR Real Time Identificao de alelos em DNA genmico;
Anlise de seqncias virais, bacterianas ou protozorios a
partir de vrias fontes; Anlise de patgenos em alimentos; Anlise de produtos transgnicos; Diagnsticos, como a deteco de patgenos, ou doenas;
Testes de paternidade e na medicina forense;
Referncias Bibliogrficas NOVAIS, Monteiro Caroline; ALVES, Pires Melissa; Silva, Freitas Fbio. PCR
em Tempo Real: Uma Inovao Tecnolgica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Brasileira de Cincia e Desenvolvimento. Ed. 33 Jul/Dez 2004. Disponvel em: http//:http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/pcr.pdf Acesso em: 25 Mar 2011. CARVALHO, Francisco Robson. PCR em Tempo Real. UNESP: Departamento
de Morfologia.
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