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PCR PCR –– Reação em cadeia pela DNAReação em cadeia pela DNA polimerasepolimerase
Método e AplicaçõesMétodo e Aplicações
DNA DNA –– PCR (conhecer DNA genômico e genes)PCR (conhecer DNA genômico e genes)RNA RNA –– RTRT--PCR (conhecer a expressão de um gene)PCR (conhecer a expressão de um gene)
qRTqRT--PCR (quantificar a expressão de um gene)PCR (quantificar a expressão de um gene)PCR em tempo real (realPCR em tempo real (real--time)time)
Kary Mullis Kary Mullis 19831983
Orientação de uma Orientação de uma cadeia de DNA ou cadeia de DNA ou RNA: RNA: extremidade 5’ e extremidade 5’ e extremidade 3’extremidade 3’
O3PO
5’
3’
LembretesLembretes
Exemplo de um Exemplo de um oligonucleotídiosoligonucleotídios
5’d(CGAAT)5’d(CGAAT)
Notar que é bem Notar que é bem diferente de diferente de 5’d(TAAGC)5’d(TAAGC)
LembretesLembretes
As duas fitas de As duas fitas de DNA correm em DNA correm em sentidos opostossentidos opostos
Pontes de Pontes de HidrogHidrogêênio na dupla hnio na dupla héélice lice
AA forma 2 pontes de forma 2 pontes de hidroghidrogêênio nio com com TT na fita opostana fita oposta
GG forma 3 pontes de forma 3 pontes de hidroghidrogêênionio com com CC na fita opostana fita oposta
LembretesLembretes
2 fitas complementares2 fitas complementares
A DNA A DNA polimerase polimerase necessita de um trecho de necessita de um trecho de dupla fita para se ancorar e iniciar a síntese dupla fita para se ancorar e iniciar a síntese
da segunda fita de “ polímero” de DNA da segunda fita de “ polímero” de DNA baseandobaseando--se na fita complementar que serve se na fita complementar que serve
de matrizde matriz
A DNA A DNA polimerase polimerase funciona sempre funciona sempre adicionando bases na ponta 3´ portanto a fita adicionando bases na ponta 3´ portanto a fita
cresce de 5´ para 3´cresce de 5´ para 3´
Pergunta: Então qual a direção da fita matriz?Pergunta: Então qual a direção da fita matriz?
2
dGTP
dATP
dATP
dCTP
dCTP
dTTP
dCTP primersprimers
dNTPdNTP
MgClMgCl
TaqTaq DNADNA polimerasepolimerase
DNADNA
dGTP
REAGENTES PARA PCRREAGENTES PARA PCR
Thermus aquaticusThermus aquaticus
Desnaturação por Desnaturação por calorcalor
Ação deAção de Taq DNApolimerase Taq DNApolimerase
Cópia Cópia
Associação dos Associação dos ““primersprimers””
primersprimers
Fita 5’Fita 5’Fita 3’Fita 3’
PCRPCR
GG
TTCC
AA
1 21 22 42 43 83 84 164 165 325 326 646 647 1287 1288 2568 2569 5129 51210 102410 102411 204811 204812 409612 409613 819213 819214 1638414 1638415 3276815 3276816 6553616 6553617 13107217 13107218 26214418 26214419 52428819 52428820 104857620 104857621 2,0. 1021 2,0. 1066
22 4,1. 1022 4,1. 1066
23 8,3 . 1023 8,3 . 1066
24 16,7 .1024 16,7 .1066
25 33,5 .1025 33,5 .1066
26 67,1 .1026 67,1 .1066
27 1,34 .1027 1,34 .1088
28 2,68 .1028 2,68 .1088
29 5,36 .1029 5,36 .1088
30 1.1030 1.1099
Aplicação: amplificação de uma Aplicação: amplificação de uma seqûencia seqûencia de de bases, desde que fornecidos os iniciadores bases, desde que fornecidos os iniciadores ((primersprimers) = especificidade) = especificidade
Vantagens: utilização de diminuta quantidade de Vantagens: utilização de diminuta quantidade de matrizmatriz
Desvantagens: conhecimento prévio da Desvantagens: conhecimento prévio da sequência sequência e amplificação de errose amplificação de erros
Visão do DNA por fluorescênciaVisão do DNA por fluorescência
antes e....antes e....
depois do PCRdepois do PCR
acesso restritoacesso restrito
roupa e cabelosroupa e cabelosadequados, adequados, uso de luvasuso de luvas
e...e...
PROCESSAMENTOPROCESSAMENTO
ÁREA 1ÁREA 1
ÁREA 3ÁREA 3
ÁREA 2ÁREA 2preparo de reagentes
extração deDNA ou RNA
reação de amplificação e
detecção
CONTROLE DE CONTROLE DE CONTAMINAÇÃOCONTAMINAÇÃO
fluxo laminarfluxo laminar
separação de áreasseparação de áreas
desinfecçãodesinfecção frequentefrequente e luz ultre luz ultravioletaavioletaautoclavagemautoclavagem do material biológdo material biológicoicoacondicionamento como lixo hospitalaracondicionamento como lixo hospitalar
AplicaçõesAplicações •• Investigação forense Investigação forense
•• AntropologiaAntropologia
•• PaternidadePaternidade
•• Linhagens animaisLinhagens animais
•• IdentificaçãoIdentificação de de PatógenosPatógenos
•• Identificação Identificação de de doençasdoenças
•• Transgenia Transgenia
•• Identificação Identificação de de restos restos humanoshumanos
•• Monitoramento Monitoramento de de transplantes transplantes e e pêga pêga de de enxertosenxertos
Seqüências repetitivas no DNASeqüências repetitivas no DNA
MinisatélitesMinisatélites muito muito polimórficospolimórficos15 15 -- 70 pb70 pb
SatélitesSatélites 5 5 -- 100 pb100 pb poucopoucopolimórficospolimórficos
MicrosatélitesMicrosatélites 2 2 -- 6 pb6 pb muitomuitopolimórficospolimórficos
O que é um alelo de O que é um alelo de microsatélite microsatélite ??
CCATGCCATGATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT
CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT
alelo 1alelo 1
alelo 2alelo 2
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTTCCATGCCATGATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT alelo 3alelo 3
alelo 4alelo 4
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATATATGGATTATGGTTTTTGGATTATGGTTTTT alelo 5alelo 5
““slippageslippage””
A A evidência coletada evidência coletada na cena na cena do crimedo crime
Blood TissueSemen
UrineHair
Teeth Saliva Bone
O DNA é O DNA é extraído da extraído da vítima vítima e dos e dos suspeitossuspeitos
Cena do Crime !
Determine qual o suspeito que não pode ser excluído....
CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 1alelo 1
CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 2alelo 2
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 4alelo 4
M M Mm f p p/f m f p p/f D4S139D4S139P
CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 1alelo 1
CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 2alelo 2
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTA alelo 4alelo 4
alelo mutantealelo mutante
Microsatélites como Marcadores de DoençaMicrosatélites como Marcadores de Doença
CCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT
CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT
alelo 1alelo 1
alelo 2alelo 2
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTTCCATGCCATGATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT alelo 1alelo 1
alelo 4alelo 4
CCATGCCATGATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGAATTTTTTTTTT
CCATGCCATGATATATATATATATATATATATATATATGGATTAGGATTATGTGGGTTTTTTTTTT
alelo 2alelo 2
alelo 5alelo 5
nas meningitesnas meningitesporpor virusvirus como herpes simplescomo herpes simplesporpor microbactériasmicrobactérias: tuberculose : tuberculose
no recém nascidono recém nascidoHIVHIVdoenças genéticasdoenças genéticas
nas infecçõesnas infecçõesjanela imunológica janela imunológica
DIAGNÓSTICOS DIAGNÓSTICOS DIFÍCEISDIFÍCEIS
Preparo dos Preparo dos reagentesreagentespara PCRpara PCR
amplificaçãoamplificação
eletroforeseeletroforese
documentaçãodocumentação
análise de tecido tumoralanálise de tecido tumoral
RNA+
QS
RT-PCR da porção 5’UTdo genoma HCV
com primer biotinilado
adição desolução denaturante
no poço: sonda de DNA interna
reação colorimétricae leitura da placa de ELISA
QSQS
amostraamostra ctrlctrl++ ctrlctrl--
Detecção Quantitativa de Detecção Quantitativa de HIVHIV
produto
QSQSQS
adição de avidinaconjugada à peroxidase
******
Ilhotas Normais
Tumoral - Insulinoma
DNA DNA Microarrays Microarrays –– CodeLink CodeLink (20000 genes)(20000 genes)
SeqüenciamentoSeqüenciamento
Frederick SangerFrederick Sangerganhou 2 prêmios ganhou 2 prêmios Nobel!Nobel!
tecido tumoraltecido tumoral
p53 ....p53 ....
doenças genéticasdoenças genéticas
fibrose císticafibrose cística
hemoglobinopatiashemoglobinopatias
bactériasbactérias
vírus:vírus: genotipagemgenotipagem
medicina forensemedicina forense
paternidadepaternidade
histocompatibilidadehistocompatibilidade
SEQUENCIAMENTOSEQUENCIAMENTO
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