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Nanotecnologia

Mestrandos: Amanda Lima Daniele Aimi Denise Baldissera Ricardo Lorenzoni

Professoras: Dra. Marta Palma Alves Dra. Renata Raffin Dra. Solange Fagan

Fator de Impacto: 5.44

ADMINISTRAÇÃO TRANSDÉRMICA DE UM AGENTE ANTI-HIV ATRAVÉS DE LIPOSSOMAS ETANÓLICO

O vírus é mais frequentemente transmitido pelo contacto sexual (característica que faz da AIDS uma doença ou infecção sexualmente transmissível), pelo sangue (inclusive em transfusões), durante o parto (mãe para o filho), durante a gravidez ou no aleitamento.

SINDROME DE IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (AIDS)

O HIV age no interior das principais células do sistema imunológico, os linfócitos. Ao entrar nessa célula, o HIV  se integra ao seu código genético para poder se multiplicar. Entre os linfócitos, o tipo mais atingido pelo vírus é o chamado linfócito TCD4, usado pelo HIV para gerar cópias de si mesmo.

AIDS

Uma vez que o HIV está ligado ao linfócito T CD4+, uma estrutura viral conhecida como GP41 penetra na membrana celular e o RNA do HIV e várias enzimas, incluindo (mas não limitada) à transcriptase reversa, integrase e protease são injetadas na célula.

Uma vez que a célula T hospedeira não processa o RNA em proteínas, o próximo passo é gerar um DNA a partir do RNA do HIV usando a enzima transcritase reversa para que ocorra a transcripção reversa.

Se bem sucedida, o DNA pró-viral deve ser então integrado ao DNA da célula hospedeira usando a enzima integrase. Se o DNA pró-viral é integrado ao DNA da célula hospedeira, a célula torna-se altamente infectada, mas não produzindo ativamente proteínas do HIV.

HIV protease é a responsável pelo processamento das poliproteínas levando à formação das proteínas estruturais e funcionais do vírus.

O vírus pode ficar escondido na medula óssea, onde fica protegido do efeito de medicamentos e dormente. Descobrir onde o vírus latente se esconde é o primeiro passo para eliminá-lo.

Vírus do HIV-1 na superfície de um macrófago infectado

A inativação da protease, demonstrou a incapacidade das partículas virais formadas de se replicar, produzindo, após a etapa de “brotamento”, apenas vírions não infectivos. Estudos sustentam a hipótese de que inibidores específicos de HIV PR podem prevenir a formação de vírions infectivos a partir de linfócitos T infectados, o que resulta em um efeito terapêutico anti-viral significante.

INIBIDORES DA PROTEASE

Saquinavir Indinavir Ritonavir Nelfinavir Amprenavir Lopinavir

INIBIDORES DA PROTEASE

O presente trabalho tem como objetivo formular e caracterizar o encapsulamento do Indinavir dentro de lipossomas etanólicos (Ethosomes), e verificar seu potencial em uma aplicação transdérmica.

INIBIDORES DA PROTEASE

Sua meia vida curta (em torno de 1,8h), absorção dependente do pH oral, o extenso metabolismo de primeira passagem, os intensos efeitos colaterais gastrointestinais apresentam um desafio sobre o seu potencial terapêutico através da via oral.

Uma formulação liquida do indinavir também é rejeitada pela maioria dos pacientes devido aos seus fatores organolépticos.

INDINAVIR

Estrutura química do indinavir

Sendo assim, o referido trabalho desenvolveu estudos utilizando lipossomas etanólicos (Ethossomas) onde o Indinavir foi encapsulado e aplicado pela via transdérmica;

Caracteriza-se como alternativa que poderia manter os níveis da droga por um período maior de tempo,diminuição dos efeitos grastrointestinais e consequentemente aumentando a adesão do paciente ao tratamento;

A importância de lipossomas como modelo de membranas biológicas deriva do fato de que eles são constituídos por elementos capazes de formar bicamada idêntica à membrana natural. A similaridade entre lipossomas e membranas biológicas pode ser aumentada por modificações químicas na membrana dos lipossomas, possibilitando sua exploração em áreas como direcionamento de fármacos (GREGORIADIS, 1973; CHONN e CULLIS, 1998) ou modulação imune in vivo e in vitro (MEYENBURG et al., 2000).

LIPOSSOMAS

A habilidade de imitar a conduta das membranas biológicas pelo mesmo caminho torna os lipossomas seguros e eficazes como veículos para aplicação terapêutica (FORSSEN e WILLIS, 1998). O maior interesse de lipossomas como carreadores de medicamentos ou substâncias biologicamente ativas, consiste na capacidade de incorporação tanto de agentes lipofílicos, na membrana fosfolipídica (IWAMOTO e SUNAMOTO, 1982), quanto compostos hidrofílicos, na cavidade aquosa (BRANDL e gREGORIADIS, 1994) ou espaços interlamelares.

LIPOSSOMAS

O encapsulamento de substâncias em lipossomas se constitui em uma técnica poderosa e apresenta potencial terapêutico com relação à entrega seletiva de agentes bioativos por causa da baixa

toxidez e/ou do aumento da eficácia do medicamento. Isto tem ocorrido com agentes antineoplásicos, antibióticos, antivirais e antiparasitários.

LIPOSSOMAS

Não são conhecidas as razões pela qual a toxicidade é reduzida, mas presume-se que seja por causa de alterações na farmacocinética ou na biodistribuição dessas drogas.

De modo geral o encapsulamento de substâncias medicamentosas em lipossomas depende de três fatores principais: o tipo de lipossoma, a técnica utilizada para carregar o lipossoma com um dado composto e a estabilidade do produto final.

LIPOSSOMAS

O Etanol tem uma boa penetração na pele, levando isso em consideração no trabalho foi usado lipossomas etanólicos como carreadores do fármaco Indinavir um antiretroviral, inibidor de protease que permitiu uma maior penetração no estrato córneo (SC) em comparação com os lipossomas convencionais.

Lipossomas Etanólicos

LIPOSSOMAS ETANÓLICOS

A melhor penetração dos lipossomas etanólicos no estrato córneo pode ser atribuída a dois efeitos:

a) Aumento da atividade termodinâmica devido à evaporação do etanol, conhecido como efeito de repulsão;

b) Um efeito de atração nos quais a penetração da molécula do fármaco é aumentada através de uma redução de etanol da propriedade de barreira da SC.

MATERIAIS E MÉTODOS

MÉTODOS

Materiais:• Soja fosfatidilcomina (99% pureza)

• Ácido fosfotúngstico

• Sulfato de indinavir

• Água destilada

PREPARAÇÃO DE INDINAVIR CARREGADO EM LIPOSSOMAS ETANÓLICO

• PC de soja 1,0% para 3,0 wt/vol• Etanol 25% a 45% vol/vol• Indinavir 1,0% wt/vol• Água 100% vol/vol

Dissolvidas em etanol

Salina tamponada com fosfato PBS, pH 7,4

700 rpm

5 minutos30ºC (durante)

25ºC (esfriar)

Lipossomas convencionais

Método da películaPC de soja 3% wt/vol

Indinavir 1,0% wt/vol

Filmes hidratados com PBS (pH 7,4)

60 rpm por 1 hora a 55ºC

Passados em filtro de polibicarbonato

(antes da caracterização)

FORMA VESICULAR E MORFOLOGIA DA SUPERFÍCIE DAS VESÍCULAS ETHOSOMAL

• Visualizadas com MET• As amostras foram desidratadas e coradas com uma solução de

ácido fosfotúngstico

Após secagem

Microscópio de 10.000 para 100.000 vezes

MEV

TAMANHO VESICULAR E TAMANHO DE DISTRIBUIÇÃO

2 conjuntos de 3 exemplares por espalhamento de luz dinâmico (DLS)

Tamanho de distribuição

Tamanho vesicular

A suspensão foi misturada com PBS (pH 7,4) em triplicata

ESTABILIDADE DO ARMAZENAMENTO FÍSICO DOS LIPOSSOMAS ETANÓICO

Droga retentiva120 dias em diferentes temperaturas

4ºC e 25ºC

Frascos fechados

EFICIÊNCIA DE APRISIONAMENTO

Lipossomas separadas do medicamento

Técnica de centrifugação

Quantidade de aprisionamento

Utilizando HPLC

Percentagem foi calculada

A = Q / Qt x 100

A = aprisionamento da droga

Q = quantidade de droga encapsulada

Qt = quantidade total de droga adicionada

ESTUDOS CALORIMÉTRICOSTemperatura de transição Medida em triplicata

Calorimetria exploratória diferencial modulada (DSC TA)

Sob um fluxo constante de nitrogênio dentro de um intervalo de -50ºC a 50ºC

ESTUDOS IN VITRO DE PERMEAÇÃO NA PELE

Péle de cadáver das áreas abdominais

Armazenadas a -20ºC – Controladas através de uma lupa

Experimentos realizados durante 24 horas• Temperatura 32ºC com 100 μL de

a) Indinavir ethosomal

b) Indivanir lipossomal

c) Solução etanólica indinavir

d) Solução de indivanir

• A pele foi lavada 10 vezes com um pano de algodão imerso em metanol • Uma amostra de pele foi pesada, cortada com uma tesoura, posicionado em

um homogeneizador de vidro contendo 1 ml de metanol e homogeneizado durante 5 minutos com um agitador elétrico

• A solução resultante foi centrifugado por 10 minutos a 7000 rpm • O sobrenadante foi analisado por HPLC

• Determinação quantitativa do Indinavir foi realizada por HPLC utilizando 65:15 (vol / vol) dihidrogenofosfato de amônio (10 mM) com o ácido 1-heptanesulfonic (1 mM) em pH 4,8 misturada com acetonitrila como fase móvel a uma vazão de 1,0 mL / min

• As concentrações de indinavir foram comparadas com uma curva de concentração padrão de indinavir em fase móvel.

• Para análise estatística foi usado ANOVA e seguido pelo teste Tukey de comparação múltipla.

RESULTADOS

MET vesículas com uma forma esférica (Figura 1, A)

MEV superfície lisa

características vesicular (Figura 1, B).

Na otimização formulações

para aplicação transdérmica

tamanho e eficiência do armazenamento

são os principais parâmetros,

desempenhando um papel decisivo na determinação do fluxo.

Variando os fosfolipídios

(1,0% para 3,0% wt / vol)

e concentração de etanol (25% a 45% vol / vol)

obteve-se uma mudança no tamanho vesicular variando de 112 nm e 242 nm

e eficiência no encapsulamento de 83% para 97%.

O eixo x representa as diferentes formulações contendo concentrações variadas de etanol (25% a 45% vol /) e fosfolipídios (1% a 3% em peso / volume), e o eixo y representam tamanho vesicular (nm) e eficiência percentuais do encapsulamento obtidos a partir de várias formulações ethosomal, respectivamente.

com 3,0% (wt / vol) PC de soja, 45% (vol / vol) de etanol foi selecionada para estudos de permeação cutânea.

Essa formulação apresentou a melhor eficiência de encapsulamento (96,71% ± 1,4%).

Tamanho (147 ± 4,5 nm).

A formulação lipossomal etanólica selecionada para estudos de permeação cutanea

Um ótimo índice de polidispersão (0,12 ± 0,03) da formulação potenciada para utilização, na medida em que, indicou a homogeneidade na formulação

As temperaturas de fusão de fosfolipídios nos sistemas ethosomal (Tm) foram avaliadas por DSC com o objetivo de demonstrar a fluidez bicamadas lipídicas.

Varreduras de DSC mostraram temperaturas de transição de -9,16 ° C e 16,62 ° C para etosomas sem fármacos e lipossomas respectivamente.

Ethosomes carregados com fármacos apresentaram temperaturas de -10,78 ° C, um valor mais baixo em comparação aos etosomas sem fármaco

Os estudos de estabilidade foram realizados em lipossomas etanólicos armazenado a (4 ° C e 25 ° C) ± 1 ° C por 120 dias.

TEM não revelaram nenhuma diferença significativa na forma lamelar em qualquer temperatura.

DLS revelou um aumento no tamanho dos lipossomas etanólicos armazenadas a 25 °C, enquanto que as formulações armazenadas a 4 °C não apresentou variação de tamanho significativo.

O potencial de liberação transdérmica

lipossomas etanólico

através da determinação do fluxo através da pele de cadáveres humanos

tempo de latência, a pele ea deposição da droga

DISCUSSÕES

DISCUSSÕES

Avanços na compreensão dos processos fisiológicos levaram ao desenvolvimento de novos transportadores de fármacos que são capazes de controlar a liberação do fármaco, entregando os fármacos no local desejado em uma taxa predeterminada.

MAIOR ADERÊNCIA AO TRATAMENTO E MELHORIA DA SEGURANÇA E EFICÁCIA DO FÁRMACO.

No entanto, a maioria dos medicamentos são administrados via oral.

VIA QUE, ALGUMAS VEZES, LIMITA A BIODISPONIBILIDADE DE UMA AMPLA VARIEDADE DE MEDICAMENTOS.

INDINAVIR - pH; extenso metabolismo de primeira passagem; meia vida curta; apetência.

DISCUSSÕES

• A AIDS é um dos maiores desafios enfrentados pela comunidade médica.

• Tipos de HIV: HIV-1 (infecção mundial) HIV-2 (áfrica).

• Os medicamentos anti-HIV tentam bloquear a replicação viral, inibindo a transcriptase reversa, a integrase e a protease.

• O tratamento bem sucedido à AIDS requer níveis sistemicos constantes do fármaco.

• A manutenção desses níveis constantes do fármaco pela via transdermica usando lipossomas etanólicos pode ser uma estratégia promissora na luta contra a AIDS.

DISCUSSÕES

Com base nisso, o INDINAVIR foi formulado, caracterizado e avaliado quanto a absorção transdermica.

• ↑ [etanol]; ↓ tamanho da partícula.

Lasic et. al. Propuseram que o etanol provoca uma alteração da carga líquida do sistema, conferindo um certo grau de estabilização estérica que pode, finalmente, levar a uma diminuição de partícula.

• A melhor formulação, dentre as preparadas, foi a que continha maior concentração de etanol e de fosfolipídeos, pois apresentou um ótimo tamanho e maior encapsulamento de fármaco, o que proporciona um modo de entrega seguro (Verma D.D., 2003).

DISCUSSÕES

• Estudos de permeação in vitro (célula de difusão de Franz), fornecem informações importantíssimas sobre o comportamento do produto in vivo.

• A quantidade de fármaco que se difunde através da pele, determina a quantidade de fármaco disponível para absorção.

x 4,32x 2,06

x 6,3

A eficácia de fluxo transdérmico obtido através do sistema de lipossomas etanólicos, podem ser justificada com base na dupla função realizada pelo etanol presente na formulação etossomal. Maior fluidização das bicamadas lipídicas, tanto nas vesículas lipossomais e nos lipídios do estrato córneo, proporcionando assim uma maior maleabilidade às vesículas e reforçando a permeabilidade da pele (Touitou E., 2000.)

DISCUSSÕES

• O perfil de deposição de indinavir na pele também foi melhor no lipossomos etanólicos quando comparada com outras formulações, possivelmente como resultado de um efeito combinado do etanol e fosfolipídios, apoiado à natureza lipofílica do fármaco, fornecendo assim um modo sustentado para entrega do fármaco, durante um maior período de tempo.

Estes resultados estão de acordo com observações anteriores sobre lipossomas etanólicos carregado com melatonina(Dubey. V., 2007) e metotrexato (Dubey V, 2007) que produziu uma acumulação considerável desses compostos na pele.

DISCUSSÕES

• De acordo com Harrison et al, os lipídios do estrato córneo estão numa fase sólida-gel a temperatura fisiológica.

• Conforme os resultados obtidos por Calorimetria Exploratória Diferencial, os lipossomas etanólicos apresentam-se no estado líquido em temperaturas acima de -10,78°C.

O que implica a capacidade dos lipossomas etanólicos de interagir com os lípidios do estrato córneo (SC), levando possivelmente a interrupção, extração e fluidização dos lipídios do SC.

• Outros grupos (Jacobs. M., 1988 e Honeywell. P.L., 2002), relataram resultados semelhantes, de melhor interação das vesículas com a pele humana.

DISCUSSÕES

• Houve um efeito sinérgico dos fosfolipídios e do etanol, confirmando a perspectiva de entrega transdérmica do fármaco por esse sistema.

• Outros estudos, realizados anteriormente, não detectaram mudanças específicas na histopatologia da pele quando da aplicação deste sistema.

• A natureza inerte e boa tolerância dos lipossomas etanólicos, apoiam o desenvolvmento deste sistema como uma tecnologia inovadora para administração transdérmica de fármacos.