mÉtodo indireto de elisa para detecÇÃo e titulaÇÃo de ... · mÉtodo indireto de elisa para...

MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA

DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE

ANTICORPOS DE CAMUNDONGO ANTI-

GAMAGLOBULINA BOVINA (GGB)

Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

ELISA

FASE SÓLIDA POLIESTIRENO

POLIVINILCLORETONYLON

IMUNOPEROXIDASE

SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES

WESTERN BLOTTING

SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU

NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE

ELETROFORESE

UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA

REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA

DIRETO (ANTÍGENO)

DIRETO COM Ac CAPTURA (ANTÍGENO)

INDIRETO (ANTICORPOS)

INDIRETO COM Ac DE CAPTURA (ANTÍGENO E ANTICORPOS)

BLOQUEIO EM FASE LÍQUIDA(ANTICORPOS)

COMPETITIVOS (ANTICORPOS)

ELISPOT (CÉLULAS SECRETORAS DE Ac)

Enzimas utilizadas nos EIE

PEROXIDASE

FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO

ALTA TAXA DE “TURNOVER”

FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS

ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO

VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS

FOSFATASE ALCALINA

PERMITE O USO DE FLUOROGÊNICOS

MELHOR SINAL NO WESTERN BLOTTING (?)

BETA-D-GALACTOSIDASE

ALTA SENSIBILIDADE (?)

L L

NEGATIVOPOSITIVO

? Antígeno Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

Cromógeno sem corCromógeno com cor

Conjugado anti L Lavagens

ELISA DIRETO

1 2

3 3

3

1

4

POSITIVO

5

L L

1 2

LL

NEGATIVO

5

ELISA INDIRETO

Antígeno (conhecido) Fonte de proteínas

estranhas ao sistemaAnticorpo anti

Conjugado anti

Cromógeno sem corCromógeno com cor

L Lavagens?

?

ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA

Fonte de proteínas

estranhas ao sistema

Cromógeno sem corCromógeno com cor

L Lavagens

Antígeno

Anticorpo anti

L L L

L

POSITIVO NEGATIVO

1

5

432

Conjugado anti

5

Material:-

1-) Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina (GGB).

2-) Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno

citado + adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund;

AIF – Adjuvante Incompleto de Freund) ou sem adjuvante.

3-) Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de camundongo com

peroxidase (enzima)

4-) Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3%

(substrato)

5-) Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)

6-) Microplacas para Elisa

7-) Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M

8-) Tampão PBS pH 7,4

9-) Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado

Procedimento:-

1- Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição

ideal de uso (1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato

(1:12500). Incubar a reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar

as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS. (Realizado

previamente)

2- Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a

10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar

a microplaca como no item anterior. (Realizado previamente)

3- Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em

tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao

final, lavar novamente, conforme já descrito. (Realizado previamente)

Procedimento:-

4- Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000)

preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a

37ºC. Ao final, lavar novamente.

5- Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob

proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.

6- Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos

controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.

Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação

Marcada com enzimático de cor

enzima

Lavagem Lavagem Lavagem

Esquema da Reação de ELISA (Método Indireto)

Antígeno

Anticorpo

Substrato Enzimático

Antiglobulina marcada com

enzima

S/ ADJ

SORO

Camun

dongo

Normal

1/50 1/100 1/200 1/400 1:800 1/1600 1/3200 1/12800 1/512001/6400 1/25600

81 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12

A

B

D

E

F

C

G

H

ACF

AIF

Sem Adjuvante

Soro Normal Camundongo

1/100240

H2O2 H2O+ ½ O2

PEROXIDASE OPD

OPD Oxidado - COR

e-