manipulação genética em modelos animais · com os avanços das técnicas de biologia molecular e...

Manipulação genética em

modelos animais

Antes da biologia molecular aplicada a genética:

-Modelos animais = mutações espontâneas

-Transmitidas para descendentes

-Identificar defeitos genéticos de interesse

Com os avanços das técnicas de biologia molecular e celular e da engenharia genética:

novas metodologias passaram a ser empregadas e tornou-se possível a manipulação do

DNA bem como a alteração controlada do genoma

Animais transgênicos

•O termo transgênico: engloba animais que tiveram genes adicionados

(transgênicos por adição), modificados (knockin) ou retirados (knockout).

•As técnicas para a geração de modelos transgênicos representavam uma

das mais promissoras biotecnologias tanto para fins comerciais como para

diversas áreas da pesquisa básica

•Os primeiros animais transgênicos knockout, produzidos pela técnica de

recombinação homóloga em células tronco só foram gerados em 1987

por dois grupos diferentes (Doetschmann e cols, 1987; Thomas e

Capecchi, 1987)

Mario R. Capecchi, Ph.D., of the University

of Utah, has won the 2007 Nobel Prize in

Physiology or Medicine

animais transgênicos

•Diferentes espécies como boi, porco, ovelha, coelho, rato e

camundongo , etc...

Camundongos:

•menor tamanho,

•custo de manutenção reduzido,

•embriões de boa qualidade para manipulação,

•além de ser uma das poucas espécies cuja manutenção de células

tronco indiferenciadas em cultura é viável, o que possibilita a retirada de

genes por recombinação homóloga e geração de modelos knockout

Em pesquisa biomédica, na criação de modelos animais de doenças

humanas, entre elas,

•doenças cardiovasculares,

•auto-imunes e neurológicas,

•AIDS

• câncer

•Tais modelos animais permitem o exame detalhado da fisiopatologia

da doença, além de servirem para delinear novas formas de

tratamento, desenvolvimento de testes diagnósticos, agentes

terapêuticos inovadores e em terapia gênica

Camundongos transgênicos

Importância:

Camundongo transgênicoPor adição

Camundongos knockout

Camundongos knockout

Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray or white fur.

Step 2. Remove embryonic stem cells from gray or white-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture.

(C57Bl6 albino)

Células embrionarias: 129

Recombinação homologaneomicina

Timidina kinase

Timidina kinase

Não vive na presença de

ganciclovir

+ neomycin + gancyclovir

Step 3. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and gancyclvir.

Step 4. Remove homologously recombined

stem cells from petri dish and inject into a new

blastocyst that would have only white fur.

Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white or black fur mouse.(C57Bl6)

Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.

Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination.

Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a "knockout mouse".

knockout mouse

Step in the Process Responsibility Timeframe

1. Wait for transfection avaliability: 1-2 weeks

2. Transfection, picking, expanding, freezing:

CORE 4 weeks

3. Screening: Investigator 1 month max

4. Expanding homologous recombinant clones:

CORE 3 weeks

5. Reconfirmation: Investigator 2 weeks

6. Karyotype: CORE 2-3 weeks

7. Blastocyst injection: CORE 1-2 weeks

8. Transfer chimeric mice after blastocyst injection:

CORE 5 weeks

9. Breeding for germline transmission: Investigator 1-6 months

10. Breeding to homozygosity: Investigator 2-3 months

Reasonable expectation: 1 year

A Timeline for Knockouts after DNA is provided to Core

green fluorescent protein

GFP

Vitor – 1o camundongo transgênico pela microinjeção pronuclear

UNIFESP-2001 - hipertenso

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Pink e cérebro

“Vamos conquistar o mundo”

Obrigado!!!