identificação laboratorial de leveduras de importância médica inneke marie van der heijden...

Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica

Inneke Marie van der HeijdenLaboratório de Bacteriologia (LIM-54)

Instituto de Medicina Tropical IIHospital das Clínicas - FMUSP

Características geraisCaracterísticas gerais

Grupo heterogêneo

Unicelulares

Diversidade

Cor das colônias

Textura

Reprodução

Reprodução das levedurasReprodução das leveduras

Assexuada

Estado anamorfo

Por brotamento ou

gemulação

Formação

blastoconídios e

pseudo-hifas

Reprodução das levedurasReprodução das leveduras

Reprodução sexuada: conjugação Ascosporadas

Candida guilliermondii (anamorfo) Pichia guilliermondii (teleomorfo)

Anascosporadas Candida famata (anamorfo) Debaryomyces hansenii (teleomorfo)

Balistosporadas Rhodotorula rubra

BasidiosporadasCryptococcus neoformans (anamorfo)Filobasidiella neoformans (teleomorfo)

Procedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriais

Diagnóstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo

filamentoso ? Cultura: isolamento e identificação

Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo

Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos

filamentosos)

Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos)

Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos

patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à

cicloheximida, inclusive leveduras)

Meios mais utilizados na Meios mais utilizados na micologiamicologia

Exame direto da amostraExame direto da amostraExame direto da amostraExame direto da amostra

“a fresco” entre lâmina e lamínula

após clarificação com KOH (10 a 20%)

com tinta da China (nanquim)

após coloração:

.esfregaços (Gram, Giemsa e outras)

.cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)

Exame da cultura:Exame da cultura:achados microscópicosachados microscópicos

Exame da cultura:Exame da cultura:achados microscópicosachados microscópicos

Leveduras com filamentação (hifas) abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outras dezenas de

gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)

Leveduras sem filamentação Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros

capsuladas: Cryptococcus neoformans

Exame direto - Leveduras

Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial

Coloração de GRAMColoração de GRAM

Coloração de Mucicarmin

Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

Coloração de Gomori-GrocottColoração de Gomori-Grocott

Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial

Pureza das colônias Detecção por exame direto Sub-cultivo Técnica de esgotamento Meios seletivos

Cloranfenicol: inibir bactérias

Cicloheximida: inibir fungos anemófilos

Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial

Características macroscópicas

Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial

Características microscópicas

Técnica de esgotamentoTécnica de esgotamento

Finalidade: obter colônias isoladasFinalidade: obter colônias isoladas

Pureza das colôniasPureza das colônias

CHROMagar CHROMagar CandidaCandidaSugere espécie conformeSugere espécie conformecor da colônia:cor da colônia:Verde = Verde = C. albicansC. albicansAzul = Azul = C. tropicalisC. tropicalisRosa = Rosa = C. kruseiC. kruseiBranco = outras espéciesBranco = outras espécies e outros gênerose outros gêneros

Alternativa: meios cromogênicosAlternativa: meios cromogênicos

Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial

Métodos clássicos

Análise morfológica

Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio

Fermentação de carboidratos

Hidrólise da uréia (teste da urease)

Métodos comerciais

Métodos clássicos de Métodos clássicos de identificação de levedurasidentificação de leveduras

Análise morfológica

presença de cápsula

produção de tubo germinativo, em geral

leitura às 2h

cultivo em lâmina (micromorfologia,

filamentação e presença de clamidosporos)

Tubo germinativoTubo germinativo

Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans

Descrito em 1960

Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h)

Humano, fetal bovino ou cavalo

Técnica simples

94-97% de positividade para C. albicansSidrim et al., 1999

Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7

Análise morfológicaAnálise morfológica Produção de tubo germinativo

1 - ausência de tubo germinativo1 - ausência de tubo germinativo2 - presença de tubo germinativo2 - presença de tubo germinativo

11 22

Produção de tubo Produção de tubo germinativogerminativo

Análise morfológicaAnálise morfológica

Cultivo em lâmina

Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Módulo 7

Cultivo em lâmina Cultivo em lâmina

Espécies de

Candida spp

Candida albicansCandida albicans

Análise morfológicaAnálise morfológica Presença de cápsula

Análise morfológicaAnálise morfológica

Presença de cápsula

Assimilação de fontes de C

Assimilação de nitrogênio

Fermentação de carboidratos ZIMOGRAMA

Hidrólise da uréia (teste da urease)

Métodos clássicos de Métodos clássicos de identificação de levedurasidentificação de leveduras

AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA

}

}

Presença de oxigênio

Utilização de fontes de:

Carbono (a partir de açúcares)

Nitrogênio (a partir de nitrato)

CQ: cepas ATCC

AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA

Meio basal sem fonte de carbono

Sólido ou líquido

Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL

Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)

Incorporar suspensão de levedura ao meio

Aplicação de discos ou açúcar in natura

Incubação 30oC por 24-48h

AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA

Meio basal sem fonte de nitrogênio

Sólido

Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL

Inóculo: escala 1 McFarland (1mL)

Incorporar suspensão de levedura ao meio

AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA

AuxanogramaAuxanograma

Aplicação de compostos nitrogenados

Peptona (controle positivo)

Nitrato de potássio

Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias

Resultados: presença de zona de

crescimento (leitura visual)

Baixa tensão de oxigênio

Fermentação

Utilização de fontes de Carbono

a partir de açúcares

produção de CO2

Meio líquido ou semi-sólido gelosado

a 0,6%

ZIMOGRAMAZIMOGRAMA

Meio basal (3mL)

Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura,

peptona, etanol 95% e água

Solução de açúcar 6% (1,5mL)

Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)

Leitura após 10-14 dias de incubação a 37oC

Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de

Durham

ZIMOGRAMAZIMOGRAMA

Testes adicionaisTestes adicionais

Teste da urease Positiva: Cryptococcus neoformans

Negativa: Candida albicans

Resistência à cicloheximida Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea,

C.guilliermondii e C.pseudotropicalis

Cultura positiva

Exame direto

Bactéria Levedura

Cultura Pura

Sim Não

Obter Colônia Pura por isolamento

Cápsula

+

Macromorfologia

Colônia bege: Criptococcus spColônia salmão/laranja:Rhodothorula sp

-

Tubo Germinativo

- +

C. albicans

Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)

Fluxograma para Fluxograma para Identificação de Identificação de

Leveduras de Leveduras de Importância MédicaImportância Médica

Cultivo em lâminaCultivo em lâmina

Provas bioquímicasProvas bioquímicas

Blastoconídios - Urease positiva: Inositol - : Rhodotorula

Inositol + : Cryptococcus

Presença de artrósporos(=artroconidios) Urease - : Geotrichum

Urease + : Trichosporon (brotamento +)

ArtrósporosArtrósporos

www.botany.utoronto.ca www.mycology.adelaide.edu.au

Geotrichum Geotrichum sp.sp.

Artrósporos – Artrósporos – TrichosporonTrichosporon sp. sp.

http://www.doctorfungus.org

Trichosporon beigeliiTrichosporon beigelii

Sidrim et al., 1999

Métodos comerciais de Métodos comerciais de identificação de levedurasidentificação de leveduras

Chromoagar Candida

API 20C AUX (BioMérieux)

ID 32C (BioMérieux)

Candifast (International Microbio)

Vitek (BioMérieux)

Meios cromogênicosMeios cromogênicos

Cromogênicos: detectam enzimas

através de substratos específicos ou

substratos cromógenos

Permitem detecção de colônias mistas

Rápida identificação de C. albicans

Colônias:Colônias:

Verdes = Verdes = C. albicansC. albicansAzul = Azul = C. tropicalisC. tropicalisRosa = Rosa = C. kruseiC. kruseiBranco = outras Branco = outras espéciesespécies

Chromoagar Chromoagar CandidaCandida

Painel de identificaçãoPainel de identificação API20C AUX system (BioMérieux)API20C AUX system (BioMérieux)

19 testes assimilativos - incubação 30oC - 24, 48 e 72 horas

Leitura por verificação de crescimento - turbidez

Necessidade de correlação com a análise morfológica

Informa a necessidade de testes adicionais

Método de referência

Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais

API20C AUX systemAPI20C AUX system (BioMérieux) (BioMérieux)

API20C AUX system API20C AUX system (BioMérieux)(BioMérieux)

API20C AUX system API20C AUX system (BioMérieux)(BioMérieux)

ID 32 C STRIPS ID 32 C STRIPS (BioMérieux)(BioMérieux)

29 testes

leitura após 24/48 horas de incubação a 30oC - visual ou automatizada

taxas de identificação variam de 94 a 98 %

Ramani et al, 1998 taxa de identificação de 92% para as espécies comuns

de leveduras 85 % para isolados raros

apresenta uma base de dados bastante ampliada

Comparação entre os métodos comerciais Comparação entre os métodos comerciais semi-automatizados mais utilizados na semi-automatizados mais utilizados na

identificação de levedurasidentificação de leveduras

Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.

Candifast Candifast (International Microbio)(International Microbio)

Identificação e teste de sensibilidade

Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces

Único inóculo e leitura colorimétrica

Resultados em 24 a 72 horas (37oC)

Identificação sensibilidade actidione fermentação de 7 açúcares hidrólise da uréia

Teste de Sensibilidade sete antifúngicos: 1 concentração

www.int-microbio.com

Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)

Sistema automatizado: leitura turbidimétrica26 substratos baseado nos métodos convencionaisBionúmero - banco de dados do sistemaResultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada

16 espécies de Candida6 espécies de Cryptococcus3 espécies de Rhodotorula2 espécies de Trichosporon3 espécies de Geotrichum2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca

Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)

Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)

Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais

93 % das leveduras comuns foram identificadas

55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas

Falhas na identificação: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)

Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)

Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos comuns

Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al, 1994)

Vitek 2Vitek 2

Vitek 2 ID YST Card

47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)

leitura fluorescente automatizada

15 horas de incubação

base de dados com 51 espécies

inclui Candida dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon

taxa de identificação de 96,8%

Comparação entre métodos Comparação entre métodos comerciais para identificação de comerciais para identificação de

levedurasleveduras

Candifast X Vitek

98% de concordância (www.int-microbio.com)

Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001)

116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e

outras leveduras)

87% de identificações corretas para API 20C

82,7% de identificações corretas para Candifast

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Considerações finaisConsiderações finais

Diversos métodos

Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em cada sistema

Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais

Escolha do(s) método(s) Realidade de cada laboratório Freqüência de isolamento Custo do teste Eficácia do teste