identificação laboratorial de leveduras de importância médica inneke marie van der heijden...
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Identificação Laboratorial de Leveduras de Importância Médica
Inneke Marie van der HeijdenLaboratório de Bacteriologia (LIM-54)
Instituto de Medicina Tropical IIHospital das Clínicas - FMUSP
Características geraisCaracterísticas gerais
Grupo heterogêneo
Unicelulares
Diversidade
Cor das colônias
Textura
Reprodução
Reprodução das levedurasReprodução das leveduras
Assexuada
Estado anamorfo
Por brotamento ou
gemulação
Formação
blastoconídios e
pseudo-hifas
Reprodução das levedurasReprodução das leveduras
Reprodução sexuada: conjugação Ascosporadas
Candida guilliermondii (anamorfo) Pichia guilliermondii (teleomorfo)
Anascosporadas Candida famata (anamorfo) Debaryomyces hansenii (teleomorfo)
Balistosporadas Rhodotorula rubra
BasidiosporadasCryptococcus neoformans (anamorfo)Filobasidiella neoformans (teleomorfo)
Procedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriaisProcedimentos laboratoriais
Diagnóstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo
filamentoso ? Cultura: isolamento e identificação
Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo
Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos
filamentosos)
Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos)
Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos
patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à
cicloheximida, inclusive leveduras)
Meios mais utilizados na Meios mais utilizados na micologiamicologia
Exame direto da amostraExame direto da amostraExame direto da amostraExame direto da amostra
“a fresco” entre lâmina e lamínula
após clarificação com KOH (10 a 20%)
com tinta da China (nanquim)
após coloração:
.esfregaços (Gram, Giemsa e outras)
.cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)
Exame da cultura:Exame da cultura:achados microscópicosachados microscópicos
Exame da cultura:Exame da cultura:achados microscópicosachados microscópicos
Leveduras com filamentação (hifas) abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outras dezenas de
gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)
Leveduras sem filamentação Sem cápsula: Candida spp e outros gêneros
capsuladas: Cryptococcus neoformans
Exame direto - Leveduras
Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial
Coloração de GRAMColoração de GRAM
Coloração de Mucicarmin
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Coloração de Gomori-GrocottColoração de Gomori-Grocott
Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP
Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial
Pureza das colônias Detecção por exame direto Sub-cultivo Técnica de esgotamento Meios seletivos
Cloranfenicol: inibir bactérias
Cicloheximida: inibir fungos anemófilos
Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial
Características macroscópicas
Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial
Características microscópicas
Técnica de esgotamentoTécnica de esgotamento
Finalidade: obter colônias isoladasFinalidade: obter colônias isoladas
Pureza das colôniasPureza das colônias
CHROMagar CHROMagar CandidaCandidaSugere espécie conformeSugere espécie conformecor da colônia:cor da colônia:Verde = Verde = C. albicansC. albicansAzul = Azul = C. tropicalisC. tropicalisRosa = Rosa = C. kruseiC. kruseiBranco = outras espéciesBranco = outras espécies e outros gênerose outros gêneros
Alternativa: meios cromogênicosAlternativa: meios cromogênicos
Identificação LaboratorialIdentificação Laboratorial
Métodos clássicos
Análise morfológica
Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio
Fermentação de carboidratos
Hidrólise da uréia (teste da urease)
Métodos comerciais
Métodos clássicos de Métodos clássicos de identificação de levedurasidentificação de leveduras
Análise morfológica
presença de cápsula
produção de tubo germinativo, em geral
leitura às 2h
cultivo em lâmina (micromorfologia,
filamentação e presença de clamidosporos)
Tubo germinativoTubo germinativo
Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans
Descrito em 1960
Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h)
Humano, fetal bovino ou cavalo
Técnica simples
94-97% de positividade para C. albicansSidrim et al., 1999
Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7
Análise morfológicaAnálise morfológica Produção de tubo germinativo
1 - ausência de tubo germinativo1 - ausência de tubo germinativo2 - presença de tubo germinativo2 - presença de tubo germinativo
11 22
Produção de tubo Produção de tubo germinativogerminativo
Análise morfológicaAnálise morfológica
Cultivo em lâmina
Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Módulo 7
Cultivo em lâmina Cultivo em lâmina
Espécies de
Candida spp
Candida albicansCandida albicans
Análise morfológicaAnálise morfológica Presença de cápsula
Análise morfológicaAnálise morfológica
Presença de cápsula
Assimilação de fontes de C
Assimilação de nitrogênio
Fermentação de carboidratos ZIMOGRAMA
Hidrólise da uréia (teste da urease)
Métodos clássicos de Métodos clássicos de identificação de levedurasidentificação de leveduras
AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA
}
}
Presença de oxigênio
Utilização de fontes de:
Carbono (a partir de açúcares)
Nitrogênio (a partir de nitrato)
CQ: cepas ATCC
AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA
Meio basal sem fonte de carbono
Sólido ou líquido
Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL
Inóculo: escala 1 McFarland (2mL)
Incorporar suspensão de levedura ao meio
Aplicação de discos ou açúcar in natura
Incubação 30oC por 24-48h
AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA
Meio basal sem fonte de nitrogênio
Sólido
Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL
Inóculo: escala 1 McFarland (1mL)
Incorporar suspensão de levedura ao meio
AUXANOGRAMAAUXANOGRAMA
AuxanogramaAuxanograma
Aplicação de compostos nitrogenados
Peptona (controle positivo)
Nitrato de potássio
Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias
Resultados: presença de zona de
crescimento (leitura visual)
Baixa tensão de oxigênio
Fermentação
Utilização de fontes de Carbono
a partir de açúcares
produção de CO2
Meio líquido ou semi-sólido gelosado
a 0,6%
ZIMOGRAMAZIMOGRAMA
Meio basal (3mL)
Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura,
peptona, etanol 95% e água
Solução de açúcar 6% (1,5mL)
Suspensão levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)
Leitura após 10-14 dias de incubação a 37oC
Resultados: presença ou ausência de bolhas no tubo de
Durham
ZIMOGRAMAZIMOGRAMA
Testes adicionaisTestes adicionais
Teste da urease Positiva: Cryptococcus neoformans
Negativa: Candida albicans
Resistência à cicloheximida Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea,
C.guilliermondii e C.pseudotropicalis
Cultura positiva
Exame direto
Bactéria Levedura
Cultura Pura
Sim Não
Obter Colônia Pura por isolamento
Cápsula
+
Macromorfologia
Colônia bege: Criptococcus spColônia salmão/laranja:Rhodothorula sp
-
Tubo Germinativo
- +
C. albicans
Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
Fluxograma para Fluxograma para Identificação de Identificação de
Leveduras de Leveduras de Importância MédicaImportância Médica
Cultivo em lâminaCultivo em lâmina
Provas bioquímicasProvas bioquímicas
Blastoconídios - Urease positiva: Inositol - : Rhodotorula
Inositol + : Cryptococcus
Presença de artrósporos(=artroconidios) Urease - : Geotrichum
Urease + : Trichosporon (brotamento +)
ArtrósporosArtrósporos
www.botany.utoronto.ca www.mycology.adelaide.edu.au
Geotrichum Geotrichum sp.sp.
Artrósporos – Artrósporos – TrichosporonTrichosporon sp. sp.
http://www.doctorfungus.org
Trichosporon beigeliiTrichosporon beigelii
Sidrim et al., 1999
Métodos comerciais de Métodos comerciais de identificação de levedurasidentificação de leveduras
Chromoagar Candida
API 20C AUX (BioMérieux)
ID 32C (BioMérieux)
Candifast (International Microbio)
Vitek (BioMérieux)
Meios cromogênicosMeios cromogênicos
Cromogênicos: detectam enzimas
através de substratos específicos ou
substratos cromógenos
Permitem detecção de colônias mistas
Rápida identificação de C. albicans
Colônias:Colônias:
Verdes = Verdes = C. albicansC. albicansAzul = Azul = C. tropicalisC. tropicalisRosa = Rosa = C. kruseiC. kruseiBranco = outras Branco = outras espéciesespécies
Chromoagar Chromoagar CandidaCandida
Painel de identificaçãoPainel de identificação API20C AUX system (BioMérieux)API20C AUX system (BioMérieux)
19 testes assimilativos - incubação 30oC - 24, 48 e 72 horas
Leitura por verificação de crescimento - turbidez
Necessidade de correlação com a análise morfológica
Informa a necessidade de testes adicionais
Método de referência
Acurácia entre 96 e 98% para as espécies patogênicas mais comuns, sem testes adicionais
API20C AUX systemAPI20C AUX system (BioMérieux) (BioMérieux)
API20C AUX system API20C AUX system (BioMérieux)(BioMérieux)
API20C AUX system API20C AUX system (BioMérieux)(BioMérieux)
ID 32 C STRIPS ID 32 C STRIPS (BioMérieux)(BioMérieux)
29 testes
leitura após 24/48 horas de incubação a 30oC - visual ou automatizada
taxas de identificação variam de 94 a 98 %
Ramani et al, 1998 taxa de identificação de 92% para as espécies comuns
de leveduras 85 % para isolados raros
apresenta uma base de dados bastante ampliada
Comparação entre os métodos comerciais Comparação entre os métodos comerciais semi-automatizados mais utilizados na semi-automatizados mais utilizados na
identificação de levedurasidentificação de leveduras
Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.
Candifast Candifast (International Microbio)(International Microbio)
Identificação e teste de sensibilidade
Gêneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces
Único inóculo e leitura colorimétrica
Resultados em 24 a 72 horas (37oC)
Identificação sensibilidade actidione fermentação de 7 açúcares hidrólise da uréia
Teste de Sensibilidade sete antifúngicos: 1 concentração
www.int-microbio.com
Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)
Sistema automatizado: leitura turbidimétrica26 substratos baseado nos métodos convencionaisBionúmero - banco de dados do sistemaResultado: percentual de probabilidade de ser a espécie identificada
16 espécies de Candida6 espécies de Cryptococcus3 espécies de Rhodotorula2 espécies de Trichosporon3 espécies de Geotrichum2 espécies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca
Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)
Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)
Percentual de probabilidade é baixo = testes adicionais
93 % das leveduras comuns foram identificadas
55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas
Falhas na identificação: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (não C.neoformans)
Vitek system (BioMérieux)Vitek system (BioMérieux)
Sistema rápido e adequado para identificar os isolados clínicos comuns
Falhas na identificação de leveduras não usuais (Dooley et al, 1994)
Vitek 2Vitek 2
Vitek 2 ID YST Card
47 testes (29 clássicos e 18 enzimáticos)
leitura fluorescente automatizada
15 horas de incubação
base de dados com 51 espécies
inclui Candida dubliniensis e a atualização sistemática dos gêneros Rhodotorula e Trichosporon
taxa de identificação de 96,8%
Comparação entre métodos Comparação entre métodos comerciais para identificação de comerciais para identificação de
levedurasleveduras
Candifast X Vitek
98% de concordância (www.int-microbio.com)
Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001)
116 isolados clínicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e
outras leveduras)
87% de identificações corretas para API 20C
82,7% de identificações corretas para Candifast
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).
Considerações finaisConsiderações finais
Diversos métodos
Diferentes níveis de sensibilidade, especificidade e acurácia em cada sistema
Necessidade de estudo morfológico e/ou a complementação com testes tradicionais
Escolha do(s) método(s) Realidade de cada laboratório Freqüência de isolamento Custo do teste Eficácia do teste