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Post on 17-Dec-2018
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Tópicos• Origem e características das sondas de hibridação
• Métodos de marcação de DNA
• Sondas de RNA
• Sondas homólogas, heterólogas e degeneradas
• Marcação não isotópica de DNA
• Sistema de detecção de hibridação baseado na afinidade biotina-estreptavidina
• Temperatura de desnaturação/temperatura de hibridação
• Tipos de sondas e condições de hibridação
• Hibridação ASO
Marcação de extremidades 5’ do DNA
A marcação é fornecida na forma de 32P na posição γ-fosfato do ATP( [γ-32P]ATP).
A cinase de polinucleótido catalisa uma reacção de troca com os fosfatos 5’terminais.
Sondas de RNA (ribossondas)
As sondas de RNA são produzidas por transcrição run-off de insertos clonados em vectores apropriados e terão de ter o sentido inverso ao da transcrição do transcrito em estudo.
Estrutura de fluoróforos utilizados na marcação directa não isotópica
O grupo de fluoresceína do dUTP-fuoresceína está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina por um grupo espaçador, de modo que quando o nucleótido modificado é incorporado no DNA o grupo fluoresceína fica acessível, facilitando a sua detecção.
Um fluoróforo é um grupo químico que fluoresce quando exposto a luz de um determinado comprimento de onda.
A fluoresceína é um corante fluorescente verde claro.
A rodamina é um corante fluorescente vermelho.
A coumarina amino metil éum corante fluorescente azul.
Estrutura de um nucleótido modificado com digoxigenina
O grupo digoxigenina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do dUTP por um grupo espaçador de 11 átomos de carbono.
No sistema digoxigenina, a molécula de afinidade é um anticorpo anti-digoxigenina.
Os grupos digoxigenina e biotina são grupos repórter: após incorporação no ácido nucleico são ligados por ligandos específicos acoplados a um marcador. Os marcadores podem ser fluoróforos ou enzimas, tais como a fosfatase alcalina e a peroxidase.
A digoxidenina é um esteróide natural obtido a partir de Digitalis.
Estrutura de um nucleótido modificado com biotina
O grupo biotina está ligado ao átomo de carbono 5’ da uridina do dUTP por um grupo espaçador de 16 átomos de carbono.
No sistema biotina-estreptavidina, a molécula de afinidade é a estreptavidina.
A biotina é uma vitamina natural e a estreptavidina é uma proteína bacteriana.
Temperatura de desnaturação (Tm)
As condições de hibridação são escolhidas de modo a promover a formação de heterodúplices, sendo a temperatura de hibridação (65 a 680 C), em geral 250 C abaixo da Tm.
A Tm é uma medida útil da estabilidade de um ácido nucleico de cadeia dupla.
Corresponde ao ponto médio na transição de densidade óptica da forma de cadeia dupla para a forma de cadeia simples.
ODSS e ODDS indicam a densidade óptica de DNA de cadeia simples e de cadeia dupla, respectivamente.
As bases dos ácidos nucleicos absorvem fortemente luz ultravioleta a 260 nm.A absorção pelo DNA de cadeia dupla é consideravelmente menor do que pelos nucleótidos livres.
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