GENOMA

Genomas procariótico e eucarióticoGenomas procariótico e eucariótico

• Organização do DNA nos cromossomas

• Organização dos genes nos cromosssomas

• Estrutura dos genes

e ainda:

• DNA repetitivo

• (DNA extracromossómico)

GenomasGenomas(generalidades)

EucariotasCélula- compartimentos celulares delimitados por membranas

Genoma- 2 ou mais moléculas de DNA lineares- DNA mitocondrial e plastidial

. menores dimensões

. circular- 1x102 Mb- 1x105 MB (o mais pequeno = 10 Mb)

ProcariotasCélula- não compartimentalização interna

Genoma- 1 molécula DNA circular- haplóides- 1- 10 Mb- plasmídios (1 kb-250 kb), profagos e elementos móveis- informação genética mais compacta- grande diversidade de organização

Ex: Borrelia burgdorferi

cromossoma linear: 911 kb (835 genes)17 ou 18 moléculas lineares e circulares: 533 kb (430 genes)

Genoma = DNA cromossómico

Genoma = DNA cromossómico + DNA plasmídico

O que se considera “Genoma”?O que se considera “Genoma”?

Genoma = DNA cromossómico + DNA plasmídico

Vibrio cholerae: 2 moléculas de DNA circulares

- 2, 96 MB (3885 genes); 71% genoma- 1,07 MB (caract. plasmídio)

Genoma = DNA cromossómico + DNA mitocondrial e/ou plastidial

Dimensões de GenomasDimensões de Genomas

Relação complexidade dos organismos com dimensão Relação complexidade dos organismos com dimensão do genomado genoma

1) Organismos mais complexos Genoma de maiores dimensões

ex. Homo sapiens (3 Gb) vs Drosophila melanogaster (180 Mb)

2) Paradoxo CSalamandra- > 90 Gb vs Homem- 3 Gb

Relação do número de genes com dimensão do Relação do número de genes com dimensão do genomagenoma

S. cerevisae - 12 Mb 0,004 do genoma humano (3 Gb)

Genoma humano – 35 000 genes x 0,004 = 140 genes para S. cerevisae

Genoma de levedura contém

aprox. 5 800 genes

ECONOMIA DE ESPAÇO NO GENOMA DOS ORGANISMOS MENOS COMPLEXOS

Relação de complexidade do organismo com o número de Relação de complexidade do organismo com o número de genes e com dimensão do genomagenes e com dimensão do genoma

ARROZ MILHO

Mesmo número de genes

0,43 Gb 2,5 Gb

Organismos semelhantes diferem na dimensão do genoma, mantendo o mesmo número de genes aproximadamente

DNA supercoiling“sobrenrolamento” ou “subenrolamento”

DNA within the cells adopts several forms of ordered

tertiary structurestertiary structures begining with the formation of coiled

and supercoiled helical DNA under the control of enzymes

known as topoisomerases

A dupla hélice do DNA é uma hélice ααααo que significa que tem enrolamento

right-handed, ie, no sentido dos ponteiros do relógio

O supercoliling é consequência de:

demasiadas rotações (“super-rotação”- overwound )

da hélice sob si própria (positive supercoiling),

ou perda de rotações (“sub-rotação”- underrotating)

sob si própria (negative supercoiling)sob si própria (negative supercoiling)

Neste caso a direcção do enrolamento é oposta à do right-handed da dupla hélice

O supercoling só ocorre quando as duas cadeias de DNA não conseguem rodar

livremente uma sobre a outra, ie,

quando as extremidades estão fixas e as

superrotações ou subrotações

não podem ser compensadas (como o que acontece no DNA circular)

Superhelical tension in DNA causes DNA supercoiling

-an excess of helical turns

to accumulate in the DNA helix

ahead of the protein

- a deficit of helical turns to arise

in the DNA behind the proteinThe movement of the protein causes :

Positive and negative supercoiling

Forma relaxada- 10 pb/rotação na conformação B

Alteração da forma relaxada- mais ou menos de 10 pb/rotação + -- mais ou menos de 10 pb/rotação na conformação B

+ -

Negative supercoil

Ocorre quando o DNA está underrotated

Enrolamento no sentidocontrário do enrolamento da dupla hélice

Positive supercoil

Ocorre quando o DNA está overrotated

Enrolamento no mesmosentido do enrolamento da dupla hélice

Topoisomerases

Enzimas que adicionam ou removem rotações da dupla hélice de DNA,quebrando temporariamente a dupla hélice, permitindo a rotação de uma cadeia em volta da outra, e depois ligando-a de novo.

Topoisomerase Iquebra de uma cadeia, e reduz o

supercoiling devido a remoção de rotações

Topoisomerase IIquebra de ambas as cadeias,

adicionando ou removendo rotações

Organização do DNA cromossómicoem E. coliem E. coli

Chromosome is condensed in one part of the cell

Cromossoma de Cromossoma de E.coliE.coli

- Molécula de DNA circular-fechada, negativamente enrolada

- 4 600 kb- 99-100% codificante- aproxi. 4280 genes

Nick allows this loop

-Nucleóide (estrutura condensada): . 40-50 domínios independentes ou “loops” de 10-100 kb. Topoisomerases. Proteínas de ligação ao DNA

- HU- H-NS (H1)- Fis- IHF-Divisão celular: “attachment point”

(versão desactualizada)

Nick allows this loopto become relaxed

Organização do DNA cromossómicoOrganização do DNA cromossómicoem eucariotasem eucariotas

Estrutura dos cromossomas eucarióticos

23

Nucleossoma- unidade elementar da cromatina

Structure of a nucleosome

H3 and H4 are among the most conserved proteins.

H2A and H2B an be recognized in all eukaryotes, but show species-specific variation in sequence.

The nucleosome core particle consists of 146 bp of DNA wrapped 1.65 turns around a histone octamer consisting of two molecules each of H2A, H2B, H3, and H4.

A nucleosome (chromatosome) contains two full turns of DNA locked in place by one molecule of H1.

show species-specific variation in sequence.

H1, closely related proteins that show appreciable variation between tissues and species(and are absent from yeast)

Octâmero de histonas

Dímero: H2ADímero: H2ADímero: H2ADímero: H2A

Tetrâmero: 2H3, 2H4Tetrâmero: 2H3, 2H4Tetrâmero: 2H3, 2H4Tetrâmero: 2H3, 2H4

Dímero: H2BDímero: H2BDímero: H2BDímero: H2B

Nuclease protection assays of chromatin from human nuclei

Higher-level of packaging

Electron micrographs contrasting the

100 Å fiber with the 300 Å fiber (30 nm)100 Å fiber with the 300 Å fiber (30 nm)

Diferentes níveis de organização das fibras de cromatina

Estados de condensação do DNA

Outras proteínas não-histonas presentes no cromossoma

• No cinetocóro• Nos telómeros• No scaffold

• Proteína da maquinaria da replicação– DNA polimerases– DNA polimerases– Helicases – Primases

• HMP (high-mobility-group proteins)– RNA polimerases– Acetilases– Factores de transcrição

E ainda proteínas importantes na alteração do empacotamento e enrolamentoda cromatina durante a transcrição

Proteins scaffold

Papel importante na estrutura do cromossoma

MARs (matrix attachment regions) ou SARs (scaffold attachment regions)

Estruturas particulares dos Estruturas particulares dos cromossomas linearescromossomas lineares

Centrómeros

Telómeros

Principais estruturas do cromossomaPrincipais estruturas do cromossoma

Classificação dos cromossomas em função da Classificação dos cromossomas em função da localização do centrómerolocalização do centrómero

Estrutura do centrómero de leveduraEstrutura do centrómero de levedura

Point mutantions in the central CCG of CDE3, completely inactivate the centromere

Mutations in CDE1 or CDE2 reduce but do not inactivate centromere function

Proteins bind to yeast CDE elementsProteins bind to yeast CDE elements

The centromere is identified by a DNA sequence that binds specific proteins.

These proteins do not themselves bind to microtubules but establish the site at whichthe microtubule-binding proteins bind in turn.

Telomeres

Telomeres are required for the stability of the chromosome end

Telomeres are replicated by a special mechanism

Heterocromatina e eucromatina

Heterocromatina- geralmente mantémestado de condensação durante o ciclo celular. Heterocromatina facultativa vs constituitiva

Eucromatina- geralmente sofre condensação e descondensaçãodurante o ciclo celular.

celular. Heterocromatina facultativa vs constituitiva

Position-effect variegation in Drosophila is a phenotypic effect

of facultative heterochromatin

A chromosomal rearrangement (inversion or translocation) silence w+ in some cells and not others, produces a position-effect variegation

The heterochromatin can spread into de euchromatic regions, shutting off geneexpression of euchromatic genes localized in the vicinity of heterochromatin,

in those cells

Técnicas de coloração para produzir padrões de bandas Técnicas de coloração para produzir padrões de bandas cromossómicoscromossómicos

Técnica Padrão de bandas

G-banding Bandas escuras são ricas em ATBandas claras em GC

Q-banding Bandas escuras são ricas em GCBandas claras em AT

C-banding Bandas escuras contêm heterocromatina constituitiva

Padrões citogenéticos

Estrutura dos genesEstrutura dos genesee

Organização dos genesOrganização dos genesOrganização dos genesOrganização dos genes

Procariotas

Eucariotas

O que é um gene?O que é um gene?

-Unidade de informação genética contida num segmento de DNA, logo é uma sequência de

nucleótidos. O produto final pode ser uma proteína ou um transcrito (ex. tRNA)

-Pode variar entre 75 pb e 2 300 000 pb

- A informação biológica está contida na sequência de nucleótidos e é

tornada disponível através da expressão genética, que é altamente REGULADAtornada disponível através da expressão genética, que é altamente REGULADA

Quaisquer 6 nts podem originar 4096 sequências diferentes (46)

Os genes estão organizados de diferentes modos nos diferentes organismos

Operões: possível organização dos genes em procariotas

• Alguns genes de procariotas estão organizados linearmentesob o controlo da mesma região reguladora da transcrição formando um OPERÃO

Regulação da expressão é coordenadaRegulação da expressão é coordenada

• Genes com funções relacionadas

• Ocorre em bactérias

DNA

lacZ lacY lacARegião reguladora

Estrutura de um gene eucariótico

Identificaram-se intrões nos genes de tRNAs e rRNAs de Archaea

Organização geral dos genesTopografia dos genes em 4 organismos diferentes

13

1111

8

3

Feature Yeast Fruit fly Human

Compactamento do genoma em organismos diferentes

Gene density (average number per Mb) 479 76 11

Introns per gene (average) 0.04 3 9

Amount of the genome that is taken upby genome-wide repeats

3.4% 12% 44%

Exemplos de organização, pouco usual, de genes Exemplos de organização, pouco usual, de genes

Genes que se sobrepõem

-Alguns vírus (ex, fago X174 de E. coli)-Tradução dos mRNAs em diferentes grelhasabertas de leitura-Muito raro nos organismos superiores, mas -Muito raro nos organismos superiores, mas há exemplos nos genomas mitocondriais dealguns animais e no Homem

Genes dentro de genes

- Frequente nos genomas nucleares- Genes dentro de intrões de genes

Ex. no genoma humano o gene da neurofibratose de tipo I, que contém trêspequenos genes (OGMP, EVI2B, EVI2A),dentro do intrão 27

- Muitos snoRNAs são codificados por genesMuitos snoRNAs são codificados por genesdentro de intrõesdentro de intrões

DNA repetitivoDNA repetitivo

Equilibrium density gradient centrifugation of DNA

is also analytical useful , since the precise buoyant density

of the DNA (p) is a linear function of its G+C content

p= 1.66 + 0.098% (G+C)

DNA satélite no genoma humanoDNA satélite no genoma humano

DNA fraccionadoem gradiente

% G/C muito diferente nas bandas satélites, em relação à encontrada na banda principal

DNA repetitivo

Nota: existem outras sequências repetitivas para além das observadas no DNA satélite

em gradientede densidade

Renaturação dos ácidos nucleicosRenaturação dos ácidos nucleicos-- CCoott

Cot- Concentração em moles (Co) de nucleótidos, por litro, de determinada molécula de DNA, e o tempo (t) de reacção.O tempo de reassociação é proporcional à concentração

Set of Cot curves for various DNA samplesSet of Cot curves for various DNA samples

O componente que renaturamais rapidamente no genoma

eucariótico é oDNA altamente repetitivo

Influência do tipo de Influência do tipo de sequência de nucleótidossequência de nucleótidos, no tempo de renaturação do DNA, no tempo de renaturação do DNA

A cinética de reassociação identifica dois tipos de sequências genómicas:

-DNA NÃO REPETITIVO (únicas) e DNA repetitivo (mais do que uma cópia), este subdividido em

MODERADAMENTE REPETITIVO e ALTAMENTE REPETITIVO

DNA altamente repetitivo

• DNA altamente repetitivo

– até 105 cópias/genoma

Ex. DNA satélite centromérico, SINEs, LINEs etc

DNA repetitivoDNA repetitivo(DNA altamente e moderadamente repetitivo)(DNA altamente e moderadamente repetitivo)

vsvsDNA cópia únicaDNA cópia única

• DNA moderadamente repetitivo

– 10 a 1000 cópias/genoma

Ex. famílias de genes relacionados (rRNAS, tRNAs, histonas, cinases etc.),alguns transposões, mini e microsatélites etc.

Mini and microsatellites

• Minisatellites

usually few tens of nucleotides in length repeated in tandem (repeating unit from 10 to 100 nts). Also called VNTR (variable number of tandem repeats).

Ex. telomeric DNA

• Microsatellites

usually, di- tri- or tetranucleotides repeated 10-20 x in tandem (repeating unit <10 pb).

Also called a simple tandem repeat (STR).

DNA repetitivo agrupado e disperso

Repetições agrupadas: micro- e minisatélites

Repetições dispersas: Lines, Sines, transposões e retrotransposões

Localização (mapeamento) de algumas sequências de DNA Localização (mapeamento) de algumas sequências de DNA (repetitivo agrupado) no cromossoma 1 humano(repetitivo agrupado) no cromossoma 1 humano

Estas sequências de DNA funcionam como marcadores genéticos

What is a genetic marker or DNA marker?

A distinctive feature of a genome mapex.

- Any polymorphic mendelian character that can be used to follow a chromosomal segment through a pedigree.

Genetic markers are usually DNA polymorphismsGenetic markers are usually DNA polymorphisms

- A gene carried by a cloning vector, that codes a distinctive protein and/or phenotype and so can be used to determine if a cell contains a copy of the cloning vector (we can follow plasmid transference)

DNA polymorphisms

• DNA polymorphisms are sequence variations at specific sites (loci), in non-

coding regions of the genome. The precise sequence of DNA tends to

differ in unrelated individuals

• These polymorphisms when found in genes, accounting for the differences

in phenotype, are usually referred as mutations or variants

• DNA polymorphisms of a specific locus, as well as variants of a gene, are

alleles

VNTR detection by PCRI

Ex: D1S80

VNTR detection by PCRII

VNTR detection by PCR using multiple primersMultiplex reaction

Composição dos ribossomas eucariótico e bacteriano

Gene familiesFamílias Multigénicas Simples

ex. genes de rRNAs

Gene de rRNA 5S1)

No Homem há 2000 cópias do gene que codifica rRNA 5S,em tandem no cromossoma 1

DNA intergénico

2)

Cromossomas 13, 14, 15, 21, 22

28 S 5.8 S 18 S

X 50 – 70/cromossoma

28 S 5.8 S 18 S28 S 5.8 S 18 S

Gene de 45 S (28 S, 5.8 S, 18 S)

Gene families Famílias Multigénicas Complexas

Gene clusters de αααα- e ββββ-globulina humana

Cromossoma 16

Agrupadas (Agrupadas (clustered clustered oror tandemtandem))

Cromossoma 16

Cromossoma 11

Ex: genes da aldolase que se localizam nos cromossomas 2, 9, 10, 16, 17

Dispersas Dispersas

Famílias Multigénicas

- Simples e Agrupadas- várias cópias em tandem, de um mesmo gene, no mesmo cromossoma

(ex. rRNA 5S)

- Simples e Dispersas- várias cópias de um mesmo gene em cromossomas diferentes (ex. gene

do RNA 45S (rRNA 15S, 23S, 5.8S))

- Complexas e Agrupadas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função - Complexas e Agrupadas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função

semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos, localizando-se

todos no memsmo cromossoma e com alguma proximidade (ex. α− e β−globulina)

- Complexas e Dispersas- diferentes cópias de genes que codificam proteínas com função

semelhante,mas com algumas diferenças na sua sequência de aminoácidos,, que se

encontram em cromossomas diferentes (ex. gene da aldolase)

Grande parte do DNA moderadamente repetitivo pertence a uma classe de elementos

ELEMENTOS MÓVEISSão sequências de DNA móveis que se encontram no genoma de todos os organismos

Transpõem-se deixando cópias (daí o repetirem-se)

Podem já estar fixas ou ainda terem a capacidade de se transpôr

Sequências de Inserção (IS) e transposões

Podem já estar fixas ou ainda terem a capacidade de se transpôr

MECANISMO DE TRANSPOSIÇÃONão utiliza a maquinaria de recombinação homóloga da célula

ePodem transpôr-se através de

intermediário deDNA (é o caso da maioria dos procariotas)ou RNA (é o caso da maioria dos eucariotas)

inserindo-se em sequências preferenciais ou sem sequência alvo

Será leccionado nas aulas de recombinação