genômica funcional

Genômica FuncionalGenômica Funcional

Genômica - Histórico1977 – Técnica de seqüenciamento de DNA – Método de

Sanger1991 – Projeto Genoma Humano1995 – Primeiro genoma sequenciado (Haemophylus

influenzae)2001 – Primeiro rascunho do Genoma Humano2003 – Conclusão do seqüenciamento do Genoma Humano2009 – Mais de 998 genomas bacterianos seqüenciados

23 genomas de eucariotos completos 189 montados 1060 genomas bacterianos montados – falta a anotação 1012 em andamento

Haemophilus influeanzae

Fleischmann et al., Science 269:496-512, 1995

Science, July 28, 1995 v269 n5223 p496(17) Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. (first genome of free-living organism ever completely sequenced. Robert D. Fleischmann; Mark D. Adams; Owen White; Rebecca A. Clayton; Ewen F. Kirkness; Anthony R. Kerlavage; Carol J. Bult; Jean-Fracois Tomb; Brian A. Dougherty; Joseph M. Merrick; Keith McKenney; Granger Sutton; Will FitzHugh; Chris Fields; Jeannine D. Gocayne; John Scott; Robert Shirley; Li-Ing Liu; Anna Glodek; Jenny M. Kelley; Janice F. Weidman; Cheryl A. Phillips; Tracy Spriggs; Eva Hedblom; Matthew D. Cotton; Teresa R. Utterback; Michael C. Hanna; David T. Nguyen; Deborah M. Saudek; Rhonda C. Brandon; Leah D. Fine; Janice L. Fritchman; Joyce L. Fuhrmann; N.S.M. Geoghagen; Cheryl L. Gnehm; Lisa A. McDonald; Keith V. Small; Claire M. Fraser; Hamilton O. Smith; J. Craig Venter.

ABSTRACTAn approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1,830,137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus influenzae Rd. This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable. The H. influenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism.

•É o conjunto de mRNA transcritos por um determinado tecido ou célula.• Estuda-se o transcriptoma pela técnica de microarranjo (Microarray)

Microarray Data AnalysisA simple concept: Dot Blot + Northern Reverse the hybridization - put the probes

on the filter and label the bulk RNA Make probes for lots of genes - a

massively parallel experimentMake it tiny so you don’t need so much

RNA from your experimental cellsMake quantitative measurements

cDNA Microarray Technologies

Spot cloned cDNAs onto a glass microscope slideusually PCR amplified segments of plasmids

Label 2 RNA samples with 2 different colors of fluorescent dye - control vs. experimental

Mix two labeled RNAs and hybridize to the chip

Make two scans - one for each colorCombine the images to calculate ratios of

amounts of each RNA that bind to each spot

Princípio do Microarranjo

Chip Spoter Robot spotter

Microarray analysis

Operation Principle:

Samples are tagged with flourescentmaterial to show pattern of sample-probe interaction (hybridization)

Microarray may have 100K probe

cDNA Spotted Microarrays

Microarray Processing sequence

From: Shin-Mu Tseng

tsengsm@mail.ncku.edu.tw

DNA Chip MicroarraysPut a large number (~100K) of cDNA sequences

or synthetic DNA oligomers onto a glass slide (or other substrate) in known locations on a grid.

Label the DNA sample and hybridize Measure amounts of DNA bound to each square

in the gridMake comparisons

Cancerous vs. normal tissueTreated vs. untreated

Many applications in both basic and clinical research

Equipamentos de Microarranjo

O que é Proteômica?É a identificação, caracterização e

quantificação de todas as proteínas envolvidas em uma rota metabólica, organela, célula, tecido, orgão, ou organismo, que pode ser estudado em conjunto para fornecer dados precisos e compreensivos sobre aquele sistema.

SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)

SDS-PAGE

Tratamento

Mr

Mr

pI

acid base

• Scanear imagem dos géis. Importar imagens no software PDQuest.

• Remover Ruído. Ruído de fundo, artefatos, e riscos são removidos para uma comparação mais precisa.

•Alinhamento das imagens. Os géis são alinhados após definir proteínas de referência em cada gel.

• Detecção e quantificação. Spots são detectados e analisados após normalização com proteínas “housekeeping” presentes no gel.

• Proteínas expressas diferentemente. Aumento ou diminuição de pelo menos 2 X entre gel de tratamento e controle.

Controle acid base

pI

• Proteínas diferentemente expressas são excisadas do gel 2D e digeridas com tripsina. Os peptídeos resultantes são analisados por Espectrometria de Massa (MS)

• O MALDI-TOF MS fornece um “peptide fingerprint” da proteína, usando a massa correspndente de cada peptídeo.

MALDI-TOF-MSMatrix-Associated Laser Desorption Ionization Time of Flight

MALDI-TOF determina o tempo que partículas (i.e. peptídeos) levam para transitar uma distância específica após serem “desalojadas” de uma superfície por uma quantidade de energia específica, para determinar o peso molecular com precisão.

• Proteínas são identificadads inserindo a massa dos peptídeos em um banco de dados de peptídeos como o ProFound.

• Parâmetros de busca são refinados incluindo massa e ponto isoelétrico determinados por 2D PAGE.

•http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/profound.htm

Análise proteômica de proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae

Imunoblot das proteínas separadas por 2D com soros de suínos imunizados ou doentes.

Identificação das proteínas antigênicas por espectrometria de massa.

Imunoblot2D

MALDI/TOF/TOF-MS/MS

• Análise comparativa dos perfis de eletroforese bidimensional das cepas 7448 e J de M. hyopneumoniae;

• Identificação das proteínas de M. hyopneumoniae resolvidas por eletroforese bidimensional por espectrometria de massa;

• Identificação de proteínas de caráter antigênico.

Análise proteômica de M. hyopneumoniae

LC/MS/MS System – API5000™