genética 2001/2002prof.doutor josé cabeda a genética molecular em análises clínicas

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética

A Genética Molecular em Análises Clínicas

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-LambertC=C=AA

maxmax

L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)

A(solvente)A(solvente)

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA

maxmax

L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)

A(solvente)A(solvente)

Espectofotometria

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA

maxmax

L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)

A(solvente)A(solvente) AA(contaminantes)(contaminantes)

maxmax=260 nm=260 nm max(proteínas) max(proteínas) =280 nm=280 nm ref ref =320 nm=320 nm Concentração = f(ODConcentração = f(OD260260). Se L=1cm:). Se L=1cm:

dsDNA 1OD=50µg/mldsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/mlssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/mlssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)

..

Quantificação de DNA

)280(

)260(

fPureza

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Fazer um gel de agarose

Electroforese

ELECTROFORESE

V=IR V=IR P=IP=I22RR A resistência é inversamente proporcional á secção e á A resistência é inversamente proporcional á secção e á

força iónica da soluçãoforça iónica da solução

TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE)Agarose (TAE e TBE)

SeakamSeakam NusieveNusieve Nusieve 3:1Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc)outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturanteformamida como desnaturante

Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida Acrilamida/bisacrilamida

/TEMED /peróxido de amónio/TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturanteSDS como desnaturante

HorizontaisHorizontais VerticaisVerticais

Electroforese em campo pulsado (PFGE)

Electroforese Capilar

Electroforese em capilares de pequeno Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno)interno)

Utiliza campos eléctricos muito elevados Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiênciacalor com muita eficiência

Separações muito boas, num período de Separações muito boas, num período de tempo inferior. tempo inferior.

Electroforese Capilar (II)

Fluxo Electro-osmótico (FEO):Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos

funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. negativo, carregando consigo moléculas do solvente.

Moléculas neutras viajam á velocidade do FEOMoléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEOMoléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEOMoléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com todas as moléculas migram para o pólo negativo (com

velocidade que depende da sua carga e do seu peso velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.aparelhagem utilizado em HPLC.

Electroforese capilar (III)

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Brometo de etidio e análogosBrometo de etidio e análogos RadioactividadeRadioactividade

3232P e P e 3333PP 3535SS 125125II 1414CC 33HH Tempos de exposiçãoTempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidorCassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geisNecessidade de secagem dos geis

Nitrato de prataNitrato de prata

Marcação de sondas

Radio-isótoposRadio-isótopos 3232PP 3333PP 3535SS 33HH 1414CC 125125II

DigoxigeninaDigoxigenina BiotinaBiotina

detecção directa da cadeia dupladetecção directa da cadeia dupla

Marcação de sondas

Enzimas para a marcação de sondas PolimerasesPolimerases

Actividade exonucleoliticaActividade exonucleolitica Temp. optimaTemp. optima estabilidade térmicaestabilidade térmica

TdTTdT

Tipos de sondas

OligonucleótidosOligonucleótidos inserts de plasmideosinserts de plasmideos prod. de PCRprod. de PCR

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Fotografia

FOTOGRAFIA

Abertura do diafragmaAbertura do diafragma Tempo de exposiçãoTempo de exposição Focagem e profundidade de focoFocagem e profundidade de foco Filtros necessáriosFiltros necessários Tipos de fotos PolaroidTipos de fotos Polaroid Sistemas alternativosSistemas alternativos

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Aquisição computorizada de imagens de geis

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Integração de histogramas

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Reacção de restrição

SISTEMAS R-M

Protecção contra DNA estranhoProtecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%)TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas)TIPO II: (93% das enzimas)

reconhecem sequencias simétricas cortando reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequenciasentre as sequencias

As endonucleases requerem MgAs endonucleases requerem Mg2+ 2+ e as e as metiltransferases requerem s-adenosylmetioninametiltransferases requerem s-adenosylmetionina

endonucleases compostas por um homodimeroendonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomerometiltransferases compostas por monomero

SISTEMAS R-M

TIPO IIs:TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de como as Iis, mas com sequencias de

reconhecimento assimétricas e interrompidasreconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência local de corte a até 20 nucleótidos da sequência

reconhecidareconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para Metilação efectuada po 2 metilases (uma para

cada cadeia, podendo ser metiladas bases cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia)diferentes em cada cadeia)

TIPO III: pouco frequentes (<1%)TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantesTIPO IV: as restantes

MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO

Instabilidade térmicaInstabilidade térmica Concentração de glicerolConcentração de glicerol Tampão de reacçãoTampão de reacção Actividade enzimática:Actividade enzimática:

1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNAconformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzimautilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µlvolume total > 50µl Homogeneizar por pipetagemHomogeneizar por pipetagem Verificar a temperatura de reacçãoVerificar a temperatura de reacção

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética

Genética Molecular em Medicina Transfusional

Técnicas de estudo de mutações Técnicas de estudo de mutações desconhecidasdesconhecidas

Técnicas de estudo de mutações desconhecidas

Métodos Baseados No TmMétodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clampsMelting Profiles and GC clamps DGGEDGGE

• PerpendicularPerpendicular• ParaleloParalelo

CDGECDGE TTGETTGE

Métodos Baseados na conformaçãoMétodos Baseados na conformação SSCPSSCP HAHA CSGECSGE

“Melting Profiles”

Vários domínios de fusãoVários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapasAs moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gelMoléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu PmMoléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão totalPodem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Gradiente de desnaturaçãoGradiente de desnaturação QuímicoQuímico TemperaturaTemperatura

O gradiente pode ser:O gradiente pode ser: Perpendicular ao Perpendicular ao

campo eléctricocampo eléctrico Paralelo ao campo Paralelo ao campo

eléctricoeléctrico

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

heteroduplexes

homoduplexes

Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

Não existe um gradiente no gel, Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corridaem cada momento da corrida

Existe uma temperatura Existe uma temperatura crescente ao longo da corridacrescente ao longo da corrida

Em cada momento, a migração Em cada momento, a migração em cada molécula depende de em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não esta já ter atingido ou não algum domínio de fusãoalgum domínio de fusão

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)

VantagensVantagens

Mais fácil de fazer os Mais fácil de fazer os geisgeis

Mais reprodutível de Mais reprodutível de gel para gelgel para gel

DesvantagensDesvantagens

Mais difícil de acertar Mais difícil de acertar a gama de Tma gama de Tm

Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA

não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da

dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da

sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA

depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)

Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-

desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas

Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de desnaturanteConcentração de desnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos

(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)

WT1

WT2

mutantes

Heteroduplex Analysis (HA)

Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta

Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR

Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M

Heteroduplex Analysis (HA)

Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou

DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente

semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA

Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio:Principio:

Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais.conformacionais.

Método:Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina

e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,

aumentando a força do gel e tamanho dos seus porosaumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bpUtilizar fragmentos com 300-800 bp

Hibridização

desnaturar

Hibridização

Adicionar sonda

Hibridização

Hibridização

Adicionar substracto

Dot-Blot

Variações

Hibridização em microplacaHibridização em microplaca hibridização reversahibridização reversa

DEIA(hibridização reversa em microplaca)(detecção com anti-dsDNA)

Inno-Lippa

Hibridização em filtroHibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras Várias sondas por filtro dispostas em tiras

(tipo código de barras)(tipo código de barras) Hibridização reversaHibridização reversa Marcação no produto do PCRMarcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA

MEIA

Southern Blot

Northern Blot

Semelhante ao SouthernSemelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNAUtiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restriçãoNão utiliza reacções de restrição