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A SEQUENCIAÇÃO EM ANÁLISES CLINICAS

Prof. Doutor José Cabeda

Índice

1. Métodos para a sequenciação de fragmentos de DNA............................................. 2

1.1. O método de sequenciação química ................................................................. 2

1.2. O método de sequenciação de Sanger .............................................................. 2

1.2.1. Clonagem dos fragmentos a sequenciar ................................................... 4

1.2.2. Os terminadores ........................................................................................ 5

1.3. A resolução dos produtos da reacção de sequenciação .................................... 6

1.4. A sequenciação directa por PCR ...................................................................... 8

1.5. O sequenciador ABI 310 .................................................................................. 9

1.6. Vantagens e limitações da sequenciação em análises clínicas ....................... 15

2. A sequenciação do genoma Humano ...................................................................... 16

2.1. Estratégias para a sequenciação do genoma Humano .................................... 16

2.1.1. O consórcio Público: Estratégia do mapeamento ................................... 16

2.1.2. A celera genomics: Estratégia do “Whole genome shot-gun”................ 19

2.2. Estratégias para a identificação de genes na sequência do genoma Humano . 20

2.2.1. recurso à identificação de genes ortólogos ............................................. 20

2.2.2. Identificação de sequências conservadas entre espécies ........................ 20

2.2.3. Identificação de zonas de elevada densidade com sequências consenso

para caixas promotoras/enhancers .......................................................... 21

2.2.4. O mapa de EST....................................................................................... 21

A sequenciação em análises clínicas Prof. Doutor José Cabeda

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1. Métodos para a sequenciação de fragmentos de DNA

1.1. O método de sequenciação química

O método de sequenciação de Maxam-Gilbert utiliza um processo de degradação

química para cortar o DNA em pontos específicos, produzindo fragmentos de DNA de

diversos tamanhos. Os fragmentos assim produzidos são então separados em gel, o que

permite pela determinação do seu tamanho determinar o nucleótido que se encontra em

cada posição da sequência a analisar. Apesar de totalmente automatizado, e da

modificação introduzida com a sequenciação multiplex (que permite analisar cerca de

40 clones por gel), este método é muito menos utilizado que o método enzimático

(sequenciação de Sanger ou método de sequenciação didesoxi).

1.2. O método de sequenciação de Sanger

O método original de Sanger para a sequenciação de ácidos nucleicos é um método

enzimático, utilizando uma reacção simples de polimerização. Por este motivo, e porque

nenhuma polimerase inicia o seu trabalho se não tiver disponível uma extremidade 3’

Fig. 1


3

livre, é necessário para a utilização deste método ter algum conhecimento da sequência

da extremidade 5’ da zona a sequenciar. Com este conhecimento é assim possível

desenhar um primer complementar da cadeia a sequenciar, que por hibridização com

esta vai fornecer a necessária extremidade 3’ livre. De seguida a reacção prossegue,

incorporando nucleótidos até que o nucleótido incorporado seja um terminador (ver

secção à frente).

Como na reacção original de Sanger, era efectuado apenas um ciclo de polimerização,

era necessário garantir uma elevada quantidade de DNA molde, bem como uma grande

sensibilidade de detecção dos produtos da reacção. Assim, os nucleótidos utilizados

eram frequentemente radioactivos, o que aumentava a sensibilidade de detecção dos

produtos da reacção. Por outro lado, o aumento da concentração do DNA molde era

assegurado com um passo inicial de clonagem dos fragmentos a sequenciar.

Fig. 2 -


4

1.2.1. Clonagem dos fragmentos a sequenciar

A clonagem dos fragmentos a sequenciar era no período pré-PCR a única forma de

garantir, por um lado a especificidade do material a sequenciar, e por outro a existência

de uma amplificação do material genético antes da reacção de sequenciação. Para clonar

o material genético, este era inicialmente fragmentado (por sonicação, ou mais

frequentemente com recurso a reacções de restrição), separado em gel, purificado, e

inserido em vectores de sequenciação. Estes não eram mais que plasmídeos ou DNA de

fagos, alterados geneticamente, por forma a possuírem locais de ligação, e genes de

selecção. Os locais de ligação serviam para efectuar o posicionamento do material a

sequenciar de forma ordenada e precisa, habitualmente por recurso a reacções de

restrição do vector, seguida de incubação com o DNA a sequenciar (insert), seguido de

uma reacção de ligase. O vector assim produzido era então inserido em bactérias. Estas

eram cultivadas, habitualmente na presença de antibióticos, o que apenas permitia o

crescimento das bactérias que possuíssem o plasmídeo, já que um dos genes de selecção

deste era um gene de resistência ao antibiótico utilizado. Um segundo gene de selecção

frequentemente utilizado permitia às colónias bacterianas que tinham incorporado

plasmídeo com o insert apresentar cor diferente das colónias cujo plasmídeo não

possuía insert.

O conjunto de colónias obtido era chamado de biblioteca genómica, e destas colónias

eram escolhidas algumas para serem sequenciadas. As colónias escolhidas eram então

colocadas em meios líquidos de cultura bacteriana contendo o antibiótico anteriormente

referido, o que permitia o crescimento exponencial das bactérias, e consequentemente a

multiplicação do plasmídeo com o insert. No final da cultura, as bactérias eram

utilizadas para purificar o plasmídeo, e deste retirar o insert.

Como já foi referido, a sequenciação pelo método de Sanger exige a utilização de um

primer (iniciador), o qual só é passível de ser desenhado quando se conhece a sequência

do DNA alvo. Obviamente que esta situação cria um dilema tipo ovo-galinha (só se

pode sequenciar aquilo de que já se conhece a sequência), a qual é no entanto

ultrapassável com recurso ao vector de clonagem. Com efeito, próximo do local de

clonagem do insert, o plasmídeo foi alterado por forma a possuir uma sequência

conservada contra a qual pode ser desenhado um primer. No entanto, para utilizar este

primer, é necessário que a remoção do insert se faça por forma a que esta sequência seja


5

conservada junto ao insert, o que se faz recorrendo a uma enzima de restrição diferente

da inicialmente utilizada. Deste modo, a sequenciação precedida de clonagem tem ainda

a vantagem de poder ser realizada, mesmo quando o DNA alvo não possui uma

sequência conhecida.

1.2.2. Os terminadores

Os nucleótidos habitualmente utilizados na polimerização de DNA são

desoxirribonucleótidos, enquanto os utilizados na polimerização do RNA são

ribonucleótidos. O que distingue estes dois tipos de nucleótidos é a existência no

carbono 2 da ribose de um grupo OH que não existe na desoxirribose (Fig.3). No

entanto em ambos os nucleótidos existe um grupo OH no carbono 3 (fig. 3). Este grupo

hidroxilo (OH) é essencial para que os nucleótidos possam formar uma ponte

fosfodiester com o nucleótido seguinte (fig 4), pelo que a remoção deste grupo torna o

respectivo nucleótido (um didesoxirribonucleótido ou ddNTP) um terminador muito

eficaz, já que, na incorporação de nucleótidos, a polimerase não detecta esta subtil mas

decisiva alteração química.

Fig.3 -


6

1.3. A resolução dos produtos da reacção de sequenciação

Os produtos da reacção de sequenciação de Sanger necessitam então de ser resolvidos

segundo o seu peso molecular em geis de grande resolução (habitualmente geis de

acrilamida). Se em cada reacção de sequenciação for apenas incorporado uma espécie

de terminador, cada reacção pode servir como revelador da posição em que aparece o

respectivo nucleótido. A electroforese em paralelo das 4 reacções irmãs de sequenciação

permite então obter um gel de sequenciação clássico, que se lê seguindo os produtos

com peso molecular sucessivamente crescente (Fig. 5).

Fig. 4 -

Fig. 5 -


7

Com o intuito de facilitar a leitura dos geis de sequenciação, tornando ao mesmo tempo

mais precisas as diferenças de migração em gel, pretendeu-se incorporar todas as quatro

reacções de sequenciação numa só, utilizando para isso terminadores modificados. A

modificação adicional consiste na marcação de cada espécie de terminador com um

fluorocromo, o que permite que cada produto de PCR específico emita luz num

comprimento de onda bem determinado, e diferente dos demais. Foi assim possível

efectuar todas as reacções num só tubo, correndo todos os produtos numa só “lane” do

gel (Fig. 6), ainda que a leitura dos geis necessite agora de equipamentos específicos

capazes de analisar os comprimentos de onda emitidos.

Fig. 5 -

Fig. 6 -


8

1.4. A sequenciação directa por PCR

O advento do PCR veio permitir a simplificação substancial da sequenciação

habitualmente utilizada num laboratório de rotina. Com efeito, ao contrário do que

ocorre num laboratório de investigação, a rotina diagnóstica não lida frequentemente

com sequências totalmente desconhecidas, já que habitualmente procura apenas detectar

mutações/polimorfismos em genes ou loci previamente bem estudados. Assim, é

possível na esmagadora maioria dos casos saltar todos os passos da clonagem, e

estabelecimento de bibliotecas genómicas, já que quer a amplificação do material

genético quer a especificidade do produto a sequenciar podem ser conseguidas com

recurso a uma reacção de PCR convencional. Desta forma, a sequenciação directa

inicia-se com um PCR que amplifica o gene/loci alvo com recurso a primers específicos

e previamente escolhidos. A este PCR chamamos PCR simétrico, porque amplifica de

igual modo ambas as cadeias do dsDNA original.

De seguida, o DNA é de novo submetido a 2 novas reacções de PCR em paralelo. Em

cada uma destas reacções é utilizado apenas um dos primers iniciais, o que faz com que

em cada reacção seja amplificado apenas uma das duas cadeias do DNA alvo. Por este

motivo este PCR é denominado de PCR assimétrico.

O PCR assimétrico consiste ele próprio na reacção de sequenciação de Sanger. Por este

motivo, a mistura de reacção necessita de possuir os terminadores (ddNTP) ainda que

em menor concentração que os nucleótidos normais.

Uma vantagem adicional para a utilização do método da sequenciação directa consiste

no facto de a reacção de sequenciação ser ela própria também uma reacção de PCR, o

que aumenta muito a quantidade de produto final a ser detectado por electroforese.


9

1.5. O sequenciador ABI 310

Os produtos da reacção de sequenciação devem então ser resolvidos em função do seu

tamanho por electroforese. Se tradicionalmente a electroforese vertical em geis de

acrilamida era o método de eleição, na última década, a electroforese capilar tem-se

tornado gradualmente técnica de eleição. As suas vantagens consistem na maior

resolução, reprodutibilidade, capacidade de automatização, bem como numa menor

exigência tecnológica ao nível dos detectores. O principal problema consiste num

habitualmente menor nível de paralelismo, já que os equipamentos de electroforese

capilar com capacidade para processarem mais que uma amostra em simultâneo são

consideravelmente mais caros (mas existem, e são utilizados em alguns laboratórios de

análises clínicas de rotina como os de medicina forense!).

De longe, o equipamento de electroforese capilar mais utilizado para resolver os

produtos de uma reacção de sequenciação é o ABI 310 (Fig. 7), pelo que vamos deter-

nos um pouco sobre o seu princípio de funcionamento.

Fig. 7 -


10

O ABI 310 é um aparelho de electroforese capilar cujos componentes por questões de

segurança (as diferenças de potencial aplicadas são da ordem das dezenas de milhar de

volts) se encontram encerrados no interior de 2 portas com janelas (Fig. 7). A abertura

das portas (Fig 7 B), permite encontrar vários componentes. Do lado direito em baixo,

podemos visualizar o suporte das amostras (Fig. 8). Por cima deste fica o suporte

térmico para o capilar (Fig. 8), o qual possui também uma porta que quando se abre

expõe o capilar encostado a uma placa de cerâmica (Fig. 9) que assegurará durante a

electroforese a manutenção da temperatura nos níveis programados. À esquerda do

suporte térmico do capilar encontra-se o suporte da seringa com polímero (Fig. 8), a

qual será utilizada para encher o capilar antes e durante a electroforese. Por baixo da

seringa encontramos o bloco de válvulas, o qual controla o sentido do enchimento com

o polímero e liga e desliga a aplicação da diferença de potencial nos momentos

programados. O ânodo encontra-se aplicado ao tubo com tampão de electroforese, o

qual se encontra na extremidade esquerda inferior do bloco de válvulas (Fig. 8).

Fig. 8 -


11

Fig. 10 -

Na extremidade inferior esquerda do suporte térmico do

capilar encontra-se a janela de detecção (Fig.9), cuja porta

abrindo-se expõe a janela transparente do capilar, alinhada

com a lente que foca neste a fonte de luz de excitação, e

recolhe a emissão de fluorescência (Fig. 10).

Fig. 9 -


12

O funcionamento do aparelho consiste então em :

1) Fazer a montagem do equipamento, nomeadamente do capilar, amostras, tubos

suplementares com água e tampão de electroforese, encher o capilar com

polímero, assegurar que não existem bolhas de ar no sistema, e colocar o tampão

de electroforese no ânodo.

2) Programar num computador a posição (no suporte) de cada amostra, o tipo de

polímero e de terminadores utilizados, bem como as condições de electroforese a

aplicar. Uma vez terminada a programação, o software controla de modo

automático todo o processo, o qual consiste em:

a. O aparelho estabiliza a temperatura do capilar ao valor programado

b. Injecção da amostra: consiste na colocação de uma amostra na

extremidade do cátodo do capilar, após o que é aplicada uma diferença

de potencial, que impele o DNA a entrar no capilar.

c. Electroforese: O aparelho interrompe a diferença de potencial, retira a

extremidade do capilar do tubo da amostra e lava-a num tubo com água.

De seguida coloca esta extremidade do capilar num tubo com tampão de

electroforese e reaplica uma diferença de potencial programada. Durante

toda a corrida, o aparelho indica o que está a realizar (Figura 11),

Fig.11 -


13

permitindo ao operador acompanhar as várias fases da electroforese.

d. Leitura: Durante a electroforese, o aparelho regista a intensidade de

fluorescência que é detectada na janela de leitura para cada um dos

canais correspondentes aos terminadores utilizados (figura 12).

e. No final da electroforese de cada amostra, o processo é repetido até não

existirem mais amostras a analisar no suporte.

f. Análise: No final do processo, os ficheiros com os dados recolhidos são

analisados por um programa que:

i. Corrige as diferenças de mobilidade apresentadas devido aos

terminadores utilizados

ii. Corrige a sobreposição de espectros referente aos fluorocromos

acoplados a cada terminador

iii. Compara as curvas obtidas, inferindo a sequência de nucleótidos

iv. O operador pode (e deve) ainda observar as curvas resultantes

(cromatogramas; figura 13), e corrigir eventuais erros na

atribuição da sequência. Por vezes é necessário pedir ao programa

para reanalisar os dados utilizando configurações diferentes, que

o operador considere mais adequadas à amostra em questão

Fig. 12 -


14

A utilização do ABI 310 (ou de qualquer um dos modelos posteriores) para

sequenciação, é ainda facilitada pela disponibilidade comercial de kits (Fig. 14) e

consumíveis (Fig. 15) prontos a usar, com protocolos padronizados, e de utilização

relativamente fácil.

Fig.13 -

Fig. 15 -

Fig. 14 -


15

1.6. Vantagens e limitações da sequenciação em análises

clínicas

A utilização da sequenciação em análises clínicas apresenta como principal vantagem a

identificação inequívoca da existência de uma mutação/polimorfismo associada a um

dado perfil clínico (fenótipo). No entanto, é necessário ter presente que não é

habitualmente razoável (em análises clínicas) utilizar a sequenciação nas seguintes

situações:

1) Situações em que o diagnóstico tem carácter urgente

2) Situações em que a informação clínica não permite ter uma ideia precisa de qual

o(s) gene(s) em que é provável encontrar a mutação

3) Situações em que o número de genes candidatos é muito elevado

4) Situações em que o(s) gene(s) candidato possui um locus de elevado tamanho e

não há uma concentração habitual das mutações numa zona do gene.

Por outro lado convém ter sempre presente que o tempo de execução desta técnica,

apesar de já muito reduzido em comparação com o que era possível há 10 anos, é

consideravelmente superior ao necessário para um diagnóstico baseado em Real-Time-

PCR.

Convém ainda ter presente, que a identificação de uma alteração genética num

indivíduo com uma dada patologia, não associa de imediato essa alteração como

causadora do fenótipo clínico. Em todos os casos, é necessário estabelecer a natureza da

mutação (polimorfismo ou mutação; causadora de alteração proteica ou não; causadora

de alteração reguladora do gene ou não; perturbadora dos mecanismos de splicing ou

não), bem como estudar a sua ocorrência ou não numa população “normal”, sem os

mesmos sinais clínicos. Em suma, a identificação de uma alteração genética é apenas o

início, servindo para justificar a existência de estudos funcionais. Ressalva-se

obviamente desta situação a descoberta de alterações que já tenham sido previamente

identificadas e caracterizadas noutros doentes.


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2. A sequenciação do genoma Humano

2.1. Estratégias para a sequenciação do genoma Humano

2.1.1. O consórcio Público: Estratégia do mapeamento

Quando se fala de um mapa do genoma humano, fala-se de realidades que podem ser

bastante diversas. A definição original de um mapa do genoma refere-se à identificação

da posição de marcadores genéticos em intervalos tão pequenos quanto possível, ao

longo de todo o genoma. Este tipo de mapa tem o intuito de facilitar a identificação da

zona do genoma envolvida numa dada doença em estudo. A razão para a utilização de

um mapa deste tipo prende-se com o facto de por crossing-over os marcadores tenderem

a recombinar entre si. No entanto, como o crossing-over entre dois loci é tão mais

provável quanto mais distantes eles se encontrarem um do outro, a frequência de

recombinação entre dois marcadores pode ser utilizada para inferir a sua distância.

Assim, se considerarmos um fenótipo clínico como estando associado a um locus

genético desconhecido, a determinação da frequência com que este hipotético locus se

recombina com loci de posição conhecida permite delimitar uma zona do genoma onde

existe maior probabilidade de se encontrar um gene responsável pela característica

clínica em estudo. Estes mapas foram os primeiros a ser desenvolvidos, chamam-se

mapas genéticos, e procuram ter uma resolução de aproximadamente 2 Mb (milhões de

pares de bases) ou 2 cM (centimorgan; 1 cM corresponde à distância a que se encontram

dois loci que recombinam em 1% dos cruzamentos e equivale aproximadamente a 1

Mb). Note-se que num mapa genético, a localização do marcador num cromossoma é

muitas vezes desconhecida, apenas se conhecendo a posição relativa (distância) entre os

vários marcadores.

O mapa genético pode ser refinado, utilizando tecnologia do DNA recombinante

(técnicas de engenharia genética). Para esse efeito são produzidos mutantes contendo

cromossomas fragmentados por radiação, os quais são depois mantidos por fusão com

outras células. A determinação de que marcadores permanecem juntos após a

fragmentação permitiu acelerar o processo de mapeamento, bem como obter maior

resolução no mapa genético.

Um outro tipo de mapa, com uma resolução pretendida da ordem dos 0,1 Mb (ou

100Kb) é o mapa físico. Os mapas físicos acrescentam relativamente ao mapa genético


17

a informação da localização do marcador num cromossoma, e em que zona do

cromossoma. Obviamente que o mapa físico de menor resolução é o mapa citogenético

ou cromossómico, o qual se baseia na identificação de um padrão específico de bandas

cromossómicas após um tratamento com determinados agentes. Um mapa de cDNA

indica a localização de exões no mapa cromossómico.

Um mapa de cosmídeos indica em que zona de que

cromossoma se localiza cada um dos fragmentos

genómicos clonados em cosmídeos, bem como a sua

sobreposição relativa (fig.16). Um mapa de

macrorestrição indica em que zonas de cada

cromossoma uma dada enzima de restrição reconhece

o DNA e o fragmenta (forçosamente enzimas com um

baixo número de locais de corte, daí o chamar-se

macrorestrição).

Obviamente, o mapa físico de maior resolução é a

sequência completa dos nucleótidos em cada

cromossoma (resolução de 1bp).

A estratégia de sequenciação do consórcio público que na última década do século XX

iniciou o programa de sequenciação do Genoma Humano consistiu em primeiro obter

um mapa físico do genoma ao nível de cosmídeos, e de subclones destes cosmídeos.

Desta forma, esperava-se que o processo de atribuição da ordem de encaixe das

sequências parcelares obtidas fosse mais fácil e mais fidedigno. A estratégia consistiu

então em definir um mapa físico para um conjunto cromossomas artificiais de levedura

(YAC) depois de definir um conjunto mínimo destes clones, subdividir cada clone em

sub-clones com sobreposições entre si, cloná-los em cromossomas artificiais de

bactérias (BAC) contendo cerca de 200000 bp, e mapeá-los e assim sucessivamente

utilizando cosmídeos (40000 bp) e plasmídeos (2-10000 bp) até ter um mapa de clones

em plasmídeos, suficientemente pequenos para que pudessem ser sequenciados

individualmente (Fig. 17).

Deste modo, o resultado da sequenciação de cada clone poderia ser utilizado para,

através das sobreposições com os clones vizinhos definir uma sequência contínua que

resulte do alinhamento ordenado das sequências parcelares (Fig. 18)

Os resultados revelaram que esta estratégia produz de facto sequências relativamente

fáceis de trabalhar e ordenar numa única sequência, mas tem o problema de constituir

Fig. 16 -


18

um processo moroso e que depende da estabilidade de cada fragmento em YAC’s,

BAC’s e plasmídeos.

Fig.18 -

Fig. 17 -


19

2.1.2. A celera genomics: Estratégia do “Whole genome shot-gun”

Como resposta à grande morosidade do processo de clonagem, mapeamento, e

subclonagem, foi desenvolvido um processo alternativo para fragmentos de DNA, o

qual consiste em produzir fragmentos aleatórios da sequência a estudar, e antes mesmo

de os mapear, sequenciá-los (Fig. 19). Após a obtenção das sequências, o seu

alinhamento numa sequência contínua é feita

recorrendo a massivo poder computacional.

Esta estratégia permite encurtar

substancialmente o tempo necessário para

obter uma sequência, mas não assegura que:

1) que todo o DNA alvo tenha sido

sequenciado

2) que seja possível alinhar as sequências

parcelares numa única sequência

consenso

3) Que a sequência consenso tenha sido

montada de forma correcta

Para obviar a estas dificuldades, esta

estratégia envolve a sequenciação de um

número muito maior de fragmentos,

procurando assegurar que todo o DNA a

estudar foi sequenciado 7 a 9 vezes. Deste modo aumenta-se a redundância das

sequências parcelares, aumentando a probabilidade de que todo o DNA tenha sido

sequenciado, e que a montagem final seja correcta.

Esta estratégia foi inicialmente desenvolvida com vista a apressar a sequenciação do

genoma, aplicando-a aos clones intermédios (cosmídeos), mas uma nova empresa

(Celera Genomics) entretanto fundada com o apoio da Applied Biosystems,

pretendeu aplicar esta estratégia a todo o genoma, fundando um plano paralelo de

sequenciação do genoma humano, em concorrência directa com o consórcio público.

Este projecto, apesar do enorme desafio informático que acarretava (o passo

decisivo consistia na capacidade de formar sequências contínuas com as sequências

parcelares), acabou por ter um enorme sucesso, devido aos enormes recursos

informáticos que o projecto congregou (a Celera Genomics possuí hoje os

Fig. 19 -


20

supercomputadores com maior poder de cálculo para uso não militar em todo o

mundo).

2.2. Estratégias para a identificação de genes na sequência

do genoma Humano

A descodificação de um genoma, não fica nunca completa com a sequência de

nucleótidos que compõe cada cromossoma desse genoma, do mesmo modo que nenhum

texto é compreensível se as palavras que o compõem não tiverem sido identificadas e o

seu significado for perceptível. Na verdade, a sequência de um genoma, na ausência da

identificação dos respectivos genes e elementos reguladores (sejam eles reguladores da

transcrição genética, da replicação, etc) equivale a possuir um livro escrito numa língua

completamente desconhecida. A informação existe, mas não é convertível em

conhecimento, nem é utilizável para outros fins que não o armazenamento. Assim, o

passo seguinte à elaboração da sequência de um genoma consiste em identificar os

elementos funcionais desse genoma, e as suas funções respectivas. Para tal, existem

também várias estratégias complementares.

2.2.1. Recurso à identificação de genes ortólogos

Uma vez que hoje em dia dispomos de informação parcelar sobre o genoma de um

alargado leque de organismos biológicos, essa informação (sequência de genes com

funções e elementos reguladores conhecidos) pode ser utilizada para procurar genes

homólogos no meio da sopa de letras em que consiste um genoma sequenciado. Pode-se

assim encontrar genes com elevada homologia entre espécies diferentes (genes

ortólogos), e daí deduzir a localização de um novo gene no genoma sequenciado, bem

como uma provável organização intrão/exão, localização de promotores e enhancers.

2.2.2. Identificação de sequências conservadas entre espécies

A disponibilidade de sequências genómicas quase completas para mais do que um

organismo, e em alguns casos para organismos no mesmo ramo evolutivo (ex homem-

ratinho), permite efectuar comparações entre

os genomas, por blocos e encontrar zonas

que ao longo da escala evolutiva foram

conservadas com grande homologia. É assim Fig. 20 -


21

possível encontrar zonas genómicas com maior probabilidade de possuírem genes.

2.2.3. Identificação de zonas de elevada densidade com

sequências consenso para caixas promotoras/enhancers

Conhecem-se hoje sequências consenso para vários domínios de ligação a factores de

transcrição, bem como sequências que funcionam como enhancers. Como tanto uns

como outros são elementos apenas úteis na vizinhança de genes, a sua identificação

permite também focar a atenção em zonas de maior probabilidade de ocorrência de

genes. Em particular, zonas onde se identificam várias sequências consenso para

factores de transcrição são fortes candidatos à existência de genes.

2.2.4. O mapa de EST

Os EST são “Expressed sequence tags”. Tratam-se de pequenas sequências derivadas de

cDNA (ou de DNA complementares de mRNA), as quais podem ser sequenciadas,

marcadas e hibridizadas com os clones, permitindo construir um mapa de zonas de

expressão genómica que provavelmente contêm genes. De igual modo, as sequências

consenso derivadas dos EST podem ser utilizadas para procurar na sequência total do

genoma onde existem zonas para as quais foram encontrados EST, e que por isso devem

conter genes.

Fig. 21 -

a sequenciaÇÃo em anÁlises clinicas -...

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