expressão gênica em oócitos e embriões priscila m. m. de leon doutoranda ppgb novembro, 2010...

Expressão Gênica em Oócitos e Embriões

Priscila M. M. de LeonDoutoranda PPGB

Novembro, 2010

Universidade Federal de PelotasGraduação em Biotecnologia

Disciplina de Manipulação de Gametas e Embriões

Análise de Expressão Gênica

Análise do mRNA e de proteínas em oócitos e embriões

Conceito:

• Ferramenta importante na evolução de biotecnologias da

reprodução assistida;

• mRNA:

Diferença de expressão in vivo e in vitro;

Envolvidos no desenvolvimento inicial embrionário;

• Apoptose:

principal fator que afeta o potencial de desenvolvimento

embrionário;

Análise da Expressão Gênica:

Análise de Expressão Gênica

Obtenção de Marcadores Moleculares;

Identificação de genes envolvidos na Maturação oocitária;

Identificação de genes envolvidos no Desenvolvimento

Embrionário;

Marcadores de sobrevivência e imalntação embrionária;

Diferenças na expressão gênica IN VIVO e IN VITRO;

Resistência ou suscetibilidade a Criopreservação;

Objetivos:

Maturação in vitro

Insucesso da FIV

Cultivo in vitro embrionário

Danos na Criopreservação de Oócitos

Implantação embrionária

Desafios da PIV de Embriões:

Metodologia empregada na Avaliação da Expressão Gênica

• Qualidade do oócito:

» Qtidade de camadas do cumulus;

» Integridade do citoplasma e zona pelúcida;

• Expansão das células do cumulus:

» % Total e % parcial;

• Maturação nuclear e integridade de membrana:

» % MII e coloração IP e DF;

• Clivagem e desenvolvimento embrionário:

» Clivagem em 24 h, avaliação a cada 48 h;

• Viabilidade embrionária

» Coloração IP e DF;

Avaliações:

• Análise da Expressão Gênica:» Extração RNA total: reagente TRIzol® (Invitrogen™, USA);

»Quantificação e padronização do RNA;

» Sintese do cDNA: kit High Capacity cDNA Reverse

Transcription® (Applied Biosystems™, USA);

» Primers específicos (H2a, Telomerase, Caspase 3, Bcl-2,

BAX, Hsp 70, STAT-1, p 53, calpaína e catepsina);

» Avaliação da expressão: qRT-PCR (PCR quantitativa em

Tempo Real);

» Gene normalizador: GAPDH e beta-actina;

Apoptose:

• H2a;

• Telomerase;

• Caspase 3;

• Bcl-2;

• BAX;

• Hsp 70;

• STAT-1;

• p 53;

• Calpaína;

• Catepsina.

Aplicações Análise de Expressão Gênica:

• Qualidade de Oócitos e Embriões:– Avaliação morfológica têm sido utilizada como critério para selecionar

Oócitos e Embriões de melhor qualidade (Grau 1 a 5);– no entanto, a morfologia é insuficiente na avaliação do

desenvolvimento embrionário– não permitindo distinguir oócitos competentes que têm a

habilidade de levar uma gestação à termo

• Necessidade de uma seleção mais precisa que reflita a Competência Oocitária e embrionária....

• Estudos de expressão gênica associados à competência elucidando os mecanismos genéticos e bioquímicos envolvidos na sobrevivência;

• melhores resultados obtidos na reprodução assistida

• A caracterização molecular é importante:– na elucidação dos mecanismos necessários para que

o oócito adquira competência– Identificação de marcadores moleculares

relacionados com a capacidade de desenvolvimento.• A abordagem utilizada na investigação desses

mecanismos é a comparação de ovócitos com diferentes graus de competência.

Competência Oocitária:

• Definida como a habilidade ou potencial de um oócito passar pela maturação, ser fecundado, desenvolver até o estágio de blastocisto e ter a capacidade de induzir uma gestação

• é progressivamente adquirida durante os estágios finais da foliculogênese, por várias alterações celulares e moleculares que proporcionam ao oócito capacidade para o desenvolvimento embrionário após a fecundação

Aplicações Análise de Expressão Gênica:

• Maturação de Oócitos:• Genes que estão envolvidos na capacidade de maturação do

oócito;• Identificar os fatores que regulam a aquisição da competência

durante o processo de maturação;

• Esse conhecimento é fundamental para indicar as alterações necessárias para que o sistema in vitro possa ser o mais semelhante possível do in vivo, e com isso aumentar a disponibilidade de oócitos de melhor qualidade para serem utilizados

Maturação Oocitária:• A maturação se refere ao estágio final de preparação do oócito para

ser fecundado, e envolve modificações nucleares e citoplasmáticas. • A maioria dos oócitos recuperados a partir de folículos antrais é

capaz de completar a maturação nuclear, mas apenas os competentes são capazes de ter desenvolvimento embrionário normal.

• Nem todos que completam a maturação nuclear têm a capacidade de se desenvolver até o estágio de blastocisto.

• Essa diferença pode ser atribuída ao “status” de maturação citoplasmática e molecular que difere entre os competentes e incompetentes

Maturação Oocitária: 8000 genes estão sendo expressos em oócitos bovinos; Destes 821 são relacionados a maturação; Genes de origem materna tem sido foco devido seu papel no

desenvolvimento embrionário; Um aspecto importante durante o crescimento do oócito é

seu alto grau de atividade transcricional; portanto, mudanças moleculares podem ser responsáveis

pelo aumento na competência dos ovócitos; Os eventos moleculares se referem a essas modificações, que

envolvem síntese, degradação e alterações de RNAm e proteínas, favorecendo o oócito com o estoque molecular necessário para a fecundação e os eventos posteriores (clivagem, desenvolvimento e implantação)

• Oócitos possuem RNAm e proteínas necessárias ao primeiro estágio do desenvolvimento embrionário:– sendo que qualidade e quantidade de transcritos podem estar

associadas ao potencial do oócito em desenvolver um embrião– os ovócitos de mamíferos possuem a necessidade de acumular

todos os fatores maternos necessários para os eventos pós-fecundação

• Os resultados mostraram que a classificação morfológica de COCs pode separar oócitos com alto e baixo potencial de desenvolvimento antes da MIV:– Oócitos com alto potencial de desenvolvimento possuem, em geral,

maior quantidade de mRNA que foram estocados durante o crescimento do ovócito e fase final da foliculogênese

– Oócitos com baixo potencial de desenvolvimento possuem menor quantidade de mRNA

Atividade Transcricional:• Período de crescimento do oócito: oócito possui alto grau de atividade

transcricional;

• Período de Maturação oócito: a transcrição diminui marcadamente

antes da maturação do oócito.

• Em bovinos é quando o folículo possui 3 mm;

• A partir deste ponto a transcrição continua em nível bem menor,

sugerindo que as proteínas e transcritos que foram estocados não são

substituídos, pelo contrário, são gradualmente traduzidos ou

degradados até o momento da ativação do genoma embrionário, de

forma a suprir as necessidades da fecundação e desenvolvimento

embrionário inicial.

• Transcrição na maturação: comparado com o oócito não maturado, após a MIV a quantidade de RNAm foi reduzida em 69% (em oócitos bovinos)

• Clivagem: diminuindo para 10% o nível de transcrição em embriões de 2 células.

• Desenvolvimento embrionário: um aumento de 4 vezes no nível de transcrição foi observado em embriões de 4 células.

• Uma nova redução na quantidade de mRNA é evidenciada em embriões de 8 células e blastocistos

• Novo aumento no nível de transcrição em estágios de blastocistos eclodidos, é observado 9 vezes mais atividade.

Tremoleda et al., 2006.

Crescimento .: ↑ TranscriçãoMaturação .: ↓ Transcrição

(redução em 69%)

2 céls.: ↓ 10%

Blastocisto: ↓ transcrição4 céls.: ↑ 4x

8 céls.: ↓ transcrição

Blastocisto Eclodido: ↑ 9x

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