estratÉgias de controle biolÓgico de laravas ......prof. claudio luiz melo de souza (d.sc.,...
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ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES ndash RJ NOVEMBRO - 2009
ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de Ciecircncias e Tecnologias Agropecuaacuterias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como parte das exigecircncias para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Produccedilatildeo Vegetal
Orientador Prof Richard Ian Samuels
CAMPOS DOS GOYTACAZES ndash RJ NOVEMBRO - 2009
ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de
Ciecircncias e Tecnologias
Agropecuaacuterias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro como parte das
exigecircncias para obtenccedilatildeo do
tiacutetulo de Doutor em Produccedilatildeo
Vegetal
Aprovada em
Comissatildeo Examinadora
Prof Francisco Joseacute Alves Lemos (PhD Bioquiacutemica) - UENF
Prof Milton Erthal Junior (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Claudio Luiz Melo de Souza (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Richard Ian Samuels (PhD Entomologia) - UENF
Orientador
Dedico esse trabalho de conclusatildeo de Doutoramento agrave minha companheira
Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude nas
agruras do exiacutelio por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos
os projetos aos quais dediquei minha vida profissional
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Bioloacutegico de Vetores mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre eacute muito mais do que proporcionar informaccedilotildees
Ser Mestre ensinou-me a convivecircncia com o Professor Richard eacute sentir-se
responsaacutevel pelo aprendizado pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus disciacutepulos
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estiacutemulo e
colaboraccedilatildeo
Ao Adriano de Paula Paulo Ceacutesar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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da Silva JR Kipnis T Kanashiro MM Petretski JH Valle D (2009)
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entre o viacuterus dengue e o inseto vetor Aedes aegypti
httpwwwivdrjufrjbrvetoreshtm14 em 10032009 paacutegina mantida pelo
Instituto Virtual da Dengue do Estado do Rio de Janeiro
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Rep Ser 793 54
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de Ciecircncias e Tecnologias Agropecuaacuterias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro como parte das exigecircncias para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Produccedilatildeo Vegetal
Orientador Prof Richard Ian Samuels
CAMPOS DOS GOYTACAZES ndash RJ NOVEMBRO - 2009
ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de
Ciecircncias e Tecnologias
Agropecuaacuterias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro como parte das
exigecircncias para obtenccedilatildeo do
tiacutetulo de Doutor em Produccedilatildeo
Vegetal
Aprovada em
Comissatildeo Examinadora
Prof Francisco Joseacute Alves Lemos (PhD Bioquiacutemica) - UENF
Prof Milton Erthal Junior (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Claudio Luiz Melo de Souza (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Richard Ian Samuels (PhD Entomologia) - UENF
Orientador
Dedico esse trabalho de conclusatildeo de Doutoramento agrave minha companheira
Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude nas
agruras do exiacutelio por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos
os projetos aos quais dediquei minha vida profissional
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Bioloacutegico de Vetores mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre eacute muito mais do que proporcionar informaccedilotildees
Ser Mestre ensinou-me a convivecircncia com o Professor Richard eacute sentir-se
responsaacutevel pelo aprendizado pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus disciacutepulos
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estiacutemulo e
colaboraccedilatildeo
Ao Adriano de Paula Paulo Ceacutesar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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Rep Ser 793 54
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
ESTRATEacuteGIAS DE CONTROLE BIOLOacuteGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGEcircNICOS
CEacuteSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de
Ciecircncias e Tecnologias
Agropecuaacuterias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro como parte das
exigecircncias para obtenccedilatildeo do
tiacutetulo de Doutor em Produccedilatildeo
Vegetal
Aprovada em
Comissatildeo Examinadora
Prof Francisco Joseacute Alves Lemos (PhD Bioquiacutemica) - UENF
Prof Milton Erthal Junior (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Claudio Luiz Melo de Souza (DSc Produccedilatildeo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof Richard Ian Samuels (PhD Entomologia) - UENF
Orientador
Dedico esse trabalho de conclusatildeo de Doutoramento agrave minha companheira
Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude nas
agruras do exiacutelio por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos
os projetos aos quais dediquei minha vida profissional
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Bioloacutegico de Vetores mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre eacute muito mais do que proporcionar informaccedilotildees
Ser Mestre ensinou-me a convivecircncia com o Professor Richard eacute sentir-se
responsaacutevel pelo aprendizado pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus disciacutepulos
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estiacutemulo e
colaboraccedilatildeo
Ao Adriano de Paula Paulo Ceacutesar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
Dedico esse trabalho de conclusatildeo de Doutoramento agrave minha companheira
Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude nas
agruras do exiacutelio por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos
os projetos aos quais dediquei minha vida profissional
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Bioloacutegico de Vetores mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre eacute muito mais do que proporcionar informaccedilotildees
Ser Mestre ensinou-me a convivecircncia com o Professor Richard eacute sentir-se
responsaacutevel pelo aprendizado pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus disciacutepulos
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estiacutemulo e
colaboraccedilatildeo
Ao Adriano de Paula Paulo Ceacutesar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Bioloacutegico de Vetores mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre eacute muito mais do que proporcionar informaccedilotildees
Ser Mestre ensinou-me a convivecircncia com o Professor Richard eacute sentir-se
responsaacutevel pelo aprendizado pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus disciacutepulos
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estiacutemulo e
colaboraccedilatildeo
Ao Adriano de Paula Paulo Ceacutesar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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Rep Ser 793 54
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
SUMARIO
Paacutegina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 ndash INTRODUCcedilAtildeO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA ----------------------------------------------- 4
21 - Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
22 - Caracteriacutesticas do Viacuterus ---------------------------------------------- 12
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas ------- 18
231 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana -------- 22
25 - Fungos Entomopatogecircnicos----------------------------------------- 23
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle
de Vetores de Doenccedilas Humanas ----------------------------------------
26
3 ndash OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
31 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
32 - Objetivos especiacuteficos -------------------------------------------------- 28
4 ndash MATERIAL E MEacuteTODOS --------------------------------------------------
29
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval -------------------------- 30
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos
de Laboratoacuterio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do 32
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
Fungo ESALQ 818 em Aacutegua ---------------------------------------------
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gratildeo de Arroz ------------------------------------------------------------
33
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de
Arroz em Condiccedilotildees de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gratildeos de Arroz -----------------------------------------------------------
34
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti ---------------------------------------------
36
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas --------------------------- 36
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados ------------------------------ 36
5 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gratildeo de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
513 ndash Persistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz ----------------------------
42
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratoacuterio - ------------------
46
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condiccedilotildees de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
55 Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 ndash DISCUSSAtildeO ------------------------------------------------------------------- 53
7 ndash CONCLUSOtildeES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
LISTA DE QUADROS
Paacutegina
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para
virulecircncia contra larvas de Aedes aegypti ----------------------------------
30
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma)-------------------------------
39
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo
zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito somente com
Tween --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo
meacutedio sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz
com ESALQ 818 inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos
(Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo ----------------------
43
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com
fungo mantidos em aacutegua por (Tempo zero 5 10 e 20 dias) ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gratildeos de arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo
(DP) da mortalidade de larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
das larvas que natildeo foram mortas pelo fungo---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e
adultos formaccedilatildeo de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos
entomopatogecircnicos e dos grupos controle com desvio padratildeo----------
40
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da
patogecircnicidade do fungo-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na
aacutegua com um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento
controle foi feito com um gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado --
42
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas
expostas ao gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de
arroz (10 ndash 20 gratildeos) com fungos ESALQ 818 ------------------------------
44
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas
ao fungo inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
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-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
por diferentes tempos (tempo zero 5 10 e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 005 Tween 80 -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O
tratamento controle foi feito apenas com 005 Tween 80 --------------
47
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo da populaccedilatildeo de larvas
do municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz) -----------------
48
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle -------------
-
50
Figura 15 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
RESUMO
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro novembro de 2009 Seleccedilatildeo e Formas de Inoculaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle Bioloacutegico de Aedes Aegypti (DipteraCulicidae) Professor orientador Richard Ian Samuels Professores Conselheiros Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue eacute uma das mais seacuterias doenccedilas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos meacutetodos de controle do vetor Aedes aegypti A
patogenicidade e virulecircncia de vaacuterios isolados do fungo entomopatogecircnico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratoacuterio
contra larvas do 2ordm ndash 3ordm instares de Ae aegypti Suspensotildees de fungo foram
adicionadas em copos de plaacutesticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90 de mortalidade Trecircs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24 CG114 ESALQ818) sem diferenccedila
estatisticamente significativa entre eles As curvas de sobrevivecircncia mostraram
que o isolado CG 144 de M anisopliae causou 50 mortalidade das larvas em 5
dias Anaacutelise de Probit foi usada para estimar a concentraccedilatildeo letal do CG144 Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 316 x 105 conidios mL-1 Numa segunda
etapa foi avaliado a virulecircncia e a persistecircncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes RJ Este teste foi feito em condiccedilatildeo de semi-campo O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) manteve-se viaacutevel
por 10 dias depois de inoculado em copos plaacutesticos com 50 mL de aacutegua
Observaccedilotildees do desenvolvimento das larvas formando pupas mostrou que
aproximadamente 20 das pupas morreram ou seja natildeo resultaram em adultos
Entretanto dos adultos emergindo das pupas a longevidade foi considerada
normal O isolado LPP133 foi re-isolado de cadaacuteveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
-
- 32
-
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
-
- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
-
- Hospedeiro
-
- B bassiana
-
- Euschistus heros Fabr
-
- B bassiana
-
- Piezodorus guildinii
-
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
-
- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
-
e um aumento na virulecircncia foi subsequentemente observado O isolado
originalmente causou 8 de mortalidade de larvas enquanto apoacutes o re-
isolamento o fungo causou 60 mortalidade em 2 dias Gratildeos de arroz com
fungo aderido tambeacutem foram usados para verificar a virulecircncia e a persistecircncia do
fungo na aacutegua Para isso foi testado agrave virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos da sua permanecircncia na aacutegua (Tempo zero 5 10 e 20 dias) Foi
adicionado 1 gratildeo de arroz em 50 mL de aacutegua para verificaccedilatildeo da persistecircncia O
tempo zero representou o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo
expostas ao fungo imediatamente Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo
das larvas Os valores do tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 de sobrevivecircncia das larvas Os proacuteximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gratildeos de arroz
numa simulaccedilatildeo de campo Foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos
de arroz em 1 litro de aacutegua O uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que
10 gratildeos com 5 das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos sendo de um dia Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle bioloacutegico de larvas de Ae
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposiccedilatildeo de fecircmeas
do mosquito Este meacutetodo reduziria a populaccedilatildeo deste inseto e portanto a
incidecircncia da Dengue
ABSTRACT
PEREIRA GOMES CEacuteSAR RONALD DSc Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro november 2009 Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (DipteraCulicidae) Supervisor Richard Ian Samuels Committee Members Francisco Joseacute Alves Lemos Milton Erthal Junior Claudio Luiz Melo de Souza
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd ndash 3rd instar Ae aegypti larvae
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence with 6 to 90 mortality Three of the isolates were considered
virulent (CG24 CG114 ESALQ818) with no statistical difference between them
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M anisopliae caused 50
larval mortality within 5 days Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
316 x 105 conidia mL-1 In the next phase of the experiments the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes
RJ Results showed that ESALQ818 (1x108 coniacutedios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae showed approximately 20 mortality of these pupae
previously exposed to the fungus However adult emergencelongevity from
surviving pupae was considered normal Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed
originally this isolate caused 8 mortality but following re-isolation caused 60
mortality in 2 days Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique adding the rice grains to water
containing larvae The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero 5 10 and 20 days) For tests in plastic cups with 50 mL
water 1 rice grain was added to each cup Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae However the mortality was still considered high
with only 25 of the larvae surviving Experiments were then carried out under
field conditions The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water In this case 10 and 20 rice grains were tested It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains However the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time Even so
the results show that following future studies of fungal formulation it should be
possible to improve field persistence Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescimento da populaccedilatildeo de Aedes aegypti principal mosquito vetor da
Dengue deve-se ao aumento do uso de recipientes natildeo bio-degradaacuteveis oriundos
da estrateacutegia da ldquoObsolescecircncia Planejadardquo aos sistemas de coleta de lixo
deficientes ao aumento da densidade populacional em aacutereas urbanas agrave maacute
qualidade das habitaccedilotildees agrave decadecircncia dos sistemas de sauacutede e principalmente
agraves condiccedilotildees precaacuterias de saneamento agraves quais a maioria da populaccedilatildeo
brasileira estaacute submetida (Alva 1997)
A persistecircncia da hiperinfestaccedilatildeo de Ae aegypti deve-se tambeacutem entre
outros fatores ao acuacutemulo de aacutegua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanccedilados nos peridomiciacutelios1 e nos refugos que natildeo satildeo devidamente
acondicionados para recolhimento pelo serviccedilo de coleta de lixo urbano tornando-
se os principais focos de proliferaccedilatildeo de mosquitos (FUNASA 2002)
Normalmente os criadouros iniciais desses diacutepteros satildeo os terrenos
baldios ferros-velhos recauchutadoras borracharias e cemiteacuterios A permanecircncia
dessas condiccedilotildees predispotildee o ambiente agrave surtos eou epidemias combatidos
pelos serviccedilos de vigilacircncia sanitaacuteria com a aplicaccedilatildeo de larvicidas e inseticidas
organofosforados Mesmo em baixas doses essas substacircncias entram no
ecossistema e tecircm accedilatildeo cumulativa sobre a flora e a fauna regional e em longo
prazo sobre a sauacutede humana Cabe ressaltar a ocorrecircncia de populaccedilotildees de
Aedes sp resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al 2007)
O Dengue viacuterus (DENV) eacute a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica
especialmente nos paiacuteses tropicais A pandemia de dengue que teve em meados
do seacuteculo XX vem intensificando-se nas uacuteltimas deacutecadas com a expansatildeo da 1-Peridomicilio compreende a aacuterea exterior agrave casa poreacutem no interior do terreno como o quintal e os jardins
distribuiccedilatildeo geograacutefica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
viacuterus A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede estima que cerca de 100 milhotildees de
pessoas se infectem anualmente em 100 paiacuteses de todos os continentes com
exceccedilatildeo da Europa Dessas pessoas cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizaccedilatildeo e pelo menos 20 mil morrem da doenccedila (Silva Juacutenior e Pimenta
Juacutenior 2008)
Ateacute o final da deacutecada de 1970 devido ao Programa Continental de
Erradicaccedilatildeo de Ae aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasiatildeo a dengue nas Ameacutericas deixou de ser um problema importante
de sauacutede puacuteblica O programa foi na realidade executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela e com exceccedilatildeo de poucos paiacuteses como a Venezuela o
sul dos EUA as Guianas e algumas aacutereas do Caribe o vetor desapareceu do
continente americano Infelizmente o programa foi suspenso e a partir de entatildeo o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das aacutereas onde natildeo
havia sido erradicado (Schatzmayr 2008)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados para
combater e controlar a populaccedilatildeo de Ae aegypti Apoacutes a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) este se tornou o principal meacutetodo utilizado em
programas tendentes agrave erradicaccedilatildeo do mosquito O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistecircncia na populaccedilatildeo de Ae aegypti e com isso foi necessaacuteria
a sua substituiccedilatildeo pelos inseticidas organofosforados No entanto o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistecircncia na populaccedilatildeo desse
mosquito (Giannini 2001) Apesar dos efeitos negativos do uso dos quiacutemicos
contra o mosquito esses salvaram muitas vidas e durante um periacuteodo foram
bastante eficientes no combate do vetor O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na deacutecada de 50 e somente apoacutes o
ressurgimento desse vetor no paiacutes devido a fatores externos como o natildeo controle
nos paiacuteses vizinhos o DDT passou a natildeo apresentar eficiecircncia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira 1998)
As bacteacuterias satildeo os agentes de controle bioloacutegico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo As duas espeacutecies mais estudadas e utilizadas satildeo
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proteacuteicas as quais quando ingeridas pelas
larvas atacam e destroem o epiteacutelio do intestino meacutedio levando-as agrave morte (Neto
amp Oliveira 1985) Atualmente no Brasil B thuringiensis variedade israelensis
(Bti) estaacute sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae
aegypti enquanto peritroacuteides estatildeo sendo aplicados para o controle da fase
adulta Ainda natildeo existe um programa de uso de controle bioloacutegico para
mosquitos adultos de quaisquer espeacutecies (Vilarinho et al 1998)
A possibilidade de utilizar fungos entomopatogecircnicos para o controle de
larvas de uma gama de espeacutecies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas sem chegar ao niacutevel de programa de controle bioloacutegico (Scholte et al
2004b)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de adultos das
espeacutecies de mosquitos vetores da Malaria recentemente tem gerado muito
interesse natildeo somente pela possibilidade de reduzir as populaccedilotildees de vetores
mas tambeacutem pelo fato que os mosquitos infectados com os fungos natildeo
transmitem a doenccedila na mesma taxa que os mosquitos natildeo infectados (Thomas e
Read 2007)
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patogecircnicos e virulentos
contra larvas de Ae aegypti (Pereira et al 2009) e contra adultos dessa memsa
espeacutecie (Paula et al 2008)
O presente trabalho investigou a seleccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos
para o controle de larvas de Ae aegypti visando sua futura aplicaccedilatildeo em campo
2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
21 ndash Dados Bioloacutegicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue eacute um inseto domeacutestico inteiramente relacionado agrave
populaccedilatildeo humana sendo tambeacutem o principal vetor da febre amarela urbana
Estaacute presente na Aacutefrica nas Ameacutericas e na Aacutesia sendo provavelmente originaacuterio
do continente africano (FUNASA 1998) na regiatildeo da Etioacutepia onde se encontram
trecircs formas dessa espeacutecie o Ae aegypti na forma tiacutepica o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus um mosquito silvestre e mais escuro
Somente as duas primeiras formas satildeo encontradas no continente americano
que provavelmente foram transportadas em tambores de aacutegua dos barcos durante
as primeiras exploraccedilotildees e colonizaccedilotildees europeacuteias (Silva Junior e Pimenta Junior
2008)
Ae aegypti se adaptou intimamente ao homem em regiotildees aacuteridas
utilizando seus reservatoacuterios de aacutegua junto agraves moradias para postura e
consequumlentemente passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sanguumlineo de preferecircncia a outros mamiacuteferos (Schatzmayr 2008)
A longa associaccedilatildeo de Ae Aegypti com a espeacutecie humana parece tecirc-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua viacutetima durante o
repasto sanguiacuteneo Se o hospedeiro produz algum movimento mesmo que
suave a fecircmea de Ae Aegypti prontamente o abandona procurando outra viacutetima
ou voltando a atacaacute-lo depois de cessado o perigo de ser atingido Esta
peculiaridade tem grande importacircncia epidemioloacutegica pois uma soacute fecircmea de Ae
aegypti infectada pode fazer vaacuterias alimentaccedilotildees curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o viacuterus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira 1998)
Devido agraves suas caracteriacutesticas bioloacutegicas Ae aegypti tem criadouros
transitoacuterios que satildeo condicionados diretamente pelas chuvas como os seus
preferenciais Decorrente disso sua populaccedilatildeo de alados sofre flutuaccedilatildeo grande e
abrupta de densidade no ciclo anual isto eacute seu ciclo anual eacute influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental Seus criadouros
representados pelas poccedilas daacutegua e pelos recipientes naturais e artificiais satildeo
preenchidos quase somente na eacutepoca chuvosa Com o aumento da precipitaccedilatildeo
pluviomeacutetrica simultacircnea agraves ascensotildees teacutermicas que precedem a chegada do
veratildeo e que se mantecircm durante esta estaccedilatildeo estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de aacutegua desencadeando o processo de eclosatildeo dos
ovos depositados ali meses antes Assim as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira 1998)
O ciclo bioloacutegico de Ae aegypti compreende as seguintes fases ovo larva
pupa e adulto (Figura 1) O ovo tem forma eliacuteptica com cor variaacutevel de marrom a
negra e possui forma alongada e fusiforme Seu desenvolvimento embrionaacuterio
dura de 2 a 3 dias A larva tem antenas ciliacutendricas e curtas cerdas antenais
curtas e simples As cerdas cefaacutelicas 5 6 e 7 satildeo simples O toacuterax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax No oitavo segmento abdominal existem
espinhos dispostos em uma fileira uacutenica O estaacutegio larval tem o periacuteodo entre 5 a
7 dias A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratoacuterias curtas e escuras
Abdome tem a cerda nordm 1 do primeiro segmento com tufo de pecirclos simples ou
biacutefida e cerda nordm 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos pecirclos
A palheta natatoacuteria tem pecirclos curtos em sua borda A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira 1998)
Figura 1 ndash Ciclo bioloacutegico do Aedes aegypti (Fonte FUNASA 1998)
Ae aegypti eacute um pernilongo de coloraccedilatildeo escura com faixas brancas no
toacuterax formando uma lira na parte superior (Figura 1) As pernas possuem aneacuteis
brancos e o macho se distingue da fecircmea pelas antenas que satildeo mais plumosas
A fecircmea pica preferencialmente durante o dia e potildee seus ovos tanto em
criadouros naturais como artificiais de preferecircncia naqueles que contenham
aacutegua limpa pobre em sais e mateacuteria orgacircnica (FUNASA 1998)
Os machos de Ae aegypti satildeo atraiacutedos pela frequumlecircncia vibratoacuteria do
batimento das asas da fecircmea da mesma espeacutecie Na superfiacutecie interna da bomba
cibarial em machos e fecircmeas de Ae aegypti encontram-se numerosas ceacutelulas
de funccedilatildeo supostamente quimioreceptora que as fecircmeas utilizam para avaliar as
caracteriacutesticas dos possiacuteveis locais para oviposiccedilatildeo (Clements 1963)
Em laboratoacuterio uma fecircmea pode viver ateacute 2 meses Em condiccedilotildees normais
uma fecircmea pode fazer 12 ou mais repastos sanguumliacuteneos em um mecircs o que eacute de
grande importacircncia na transmissatildeo da dengue e da febre amarela Somente as
fecircmeas dos mosquitos satildeo hematoacutefagas Os estiletes bucais satildeo introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes aglutininas e
substacircncias eventualmente alergecircnicas mas natildeo haacute evidecircncias que contenham
enzimas digestivas O volume de sangue ingerido varia conforme a espeacutecie em
Ae aegypti tem sido assinalado de 15 a 42 mm3 (Clements 1963)
A digestatildeo sanguiacutenea ocorre em 2 dias Pouco apoacutes a ingestatildeo forma-se
uma camada de material quitinoso secretado pelas ceacutelulas do intestino a
membrana peritroacutefica que separa a superfiacutecie interna do intestino e o sangue
ingerido Se um segundo repasto sanguiacuteneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido forma-se uma segunda membrana peritroacutefica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido A membrana peritroacutefica eacute
permeaacutevel agraves enzimas proteoliacuteticas e aos produtos da digestatildeo que satildeo
absorvidos Diferenccedilas na formaccedilatildeo da membrana peritroacutefica estatildeo relacionadas
com diferenccedilas na suscetibilidade de Ae aegypti e Anopheles a microorganismos
patogecircnicos para o homem (Consoli e Oliveira 1998)
Um ou dois dias apoacutes emergirem os adultos se acasalam sendo que as
fecircmeas fazem o repasto sanguumliacuteneo Em relaccedilatildeo ao acasalamento Ae aegypti se
acasala em pequenos espaccedilos durante o vocirco ou pousados sobre uma superfiacutecie
Embora as coacutepulas intraespeciacuteficas sejam a regra cruzamentos interespeciacuteficos
podem ocorrer entre Ae aegypti e Ae albopictus O acasalamento pode se dar
antes ou apoacutes a ingestatildeo do primeiro repasto sanguiacuteneo mas eacute frequumlentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira 1998)
A escolha do local para oviposiccedilatildeo por parte das fecircmeas eacute o principal fator
responsaacutevel pela distribuiccedilatildeo dos mosquitos nos criadouros e eacute da maior
relevacircncia para a distribuiccedilatildeo das espeacutecies na natureza Fatores fiacutesicos quiacutemicos
e bioloacutegicos como a intensidade luminosa comprimento da onda de luz refletida
temperatura grau de salinidade presenccedila de vegetais microorganismos e
substacircncias diversas podem influenciar nessa seleccedilatildeo (Consoli e Oliveira 1998)
A oviposiccedilatildeo ocorre em geral em recipientes escuros ou sombreados
com superfiacutecies aacutesperas preferindo aacutegua limpa e cristalina ao inveacutes de aacutegua
tuacuterbida ou muito poluiacuteda com mateacuteria orgacircnica Em geral a fecircmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
O mosquito Ae aegypti eacute holometaboacutelico ou seja desenvolve-se atraveacutes
de metamorfose completa Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estaacutedio e o tempo de desenvolvimento depende das condiccedilotildees da aacutegua
temperatura e da alimentaccedilatildeo do mosquito em seus estaacutegios iniciais (Consoli e
Oliveira 1998)
Fase 1 - a do ovo que para se desenvolver eacute dependente da atividade
hematoacutefaga da fecircmea em homens ou outros animais Os ovos tecircm aspecto
alongado simetria bilateral e satildeo envolvidos por uma capa composta de 3
camadas a fina membrana vitelina interna que envolve o nuacutecleo o citoplasma e
o vitelo o endocoacuterio endurecido e grosso e o exocoacuterio fino e transparente que
constitui o envoltoacuterio externo O embriatildeo depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteccedilatildeo mecacircnica passagem de gases respiratoacuterios e
resistecircncia agrave perda de aacutegua (Consoli e Oliveira 1998)
Os ovos se desenvolvem em cerca de trecircs dias apoacutes a coacutepula e satildeo postos
isoladamente pela fecircmea natildeo havendo formaccedilatildeo de nichos Cada fecircmea pode
pocircr de 70 a 150 ovos Aleacutem disso satildeo bastante resistentes a periacuteodos de seca e
baixas temperaturas podendo resistir nessas condiccedilotildees ateacute um ano depois de
postos pela fecircmea (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
As fecircmeas fixam os ovos individualmente nas paredes internas dos
recipientes na aacuterea uacutemida logo acima da superfiacutecie da aacutegua Em geral seu
desenvolvimento embrionaacuterio demora 48 horas quando o ambiente eacute uacutemido e
quente ou podem suportar longos periacuteodos de dessecaccedilatildeo dependendo das
condiccedilotildees ambientais Em contato novamente com a aacutegua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vaacuterias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Em geral os ovos postos 1 a 2 mm proacuteximos agrave superfiacutecie da aacutegua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionaacuterio Quando deixados fora
da aacutegua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
periacuteodos mais longos Apoacutes um periacuteodo de maturaccedilatildeo inicial em ambiente uacutemido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionaacuterio a resistecircncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae
aegypti (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Pesquisadores da Fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz descobriram que 15 horas
depois de postos os ovos do Ae aegypti formam uma peliacutecula protetora com uma
camada transparente e impermeaacutevel que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas Assim que depositados os ovos passam a absorver aacutegua aumentam
de volume desenvolvem uma casca escura e riacutegida e tornam-se impermeaacuteveis
adquirindo grande resistecircncia em ambientes pouco favoraacuteveis onde natildeo existe
aacutegua Dessa forma por exemplo podem sobreviver durante a eacutepoca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no iniacutecio do veratildeo seguinte com a chegada
de condiccedilotildees ambientais mais favoraacuteveis Os ovos se tornam riacutegidos e escuros
em cerca de trecircs horas apoacutes a postura (Rezende et al 2008) A eclosatildeo larvaacuteria
eacute auxiliada pelo atrito de um ldquodenterdquo quitinoso situado dorsalmente na cabeccedila da
larva de 1ordm estaacutegio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsaacuteteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
A fase 2 - a eclosatildeo de larvas de 1ordm iacutenstar ocorre a partir de dois a trecircs dias
ateacute vaacuterios meses apoacutes a postura dos ovos que eclodem quando em contato com
a aacutegua As larvas possuem sifatildeo respiratoacuterio os espiraacuteculos se abrem na
extremidade desse oacutergatildeo e posiciona-se em acircngulo com a superfiacutecie liacutequida As
larvas satildeo providas de grande mobilidade e tecircm como funccedilatildeo primaacuteria o
crescimento As larvas se alimentam indistintamente do microplacircncton existente
nos seus habitats constituiacutedo por algas rotiacuteferos bacteacuterias esporos de fungos ou
quaisquer partiacuteculas de mateacuteria orgacircnica O movimento das escovas orais faz
com que a aacutegua flua em direccedilatildeo agrave cabeccedila trazendo as partiacuteculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde seraacute filtrada em uma proporccedilatildeo de
ateacute 2 litros por dia Natildeo selecionam alimentos o que facilita a accedilatildeo dos larvicidas
bem como natildeo toleram elevadas concentraccedilotildees de mateacuteria orgacircnica na aacutegua
(Consoli e Oliveira 1998)
A duraccedilatildeo da fase larval em condiccedilotildees favoraacuteveis de temperatura (25 a
29ordm C) e de boa oferta de alimentos eacute de 5 a 10 dias podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira 1998)
As larvas passam por quatro estaacutedios de desenvolvimento sendo o uacuteltimo
destes o mais prolongado Os machos tecircm em meacutedia um desenvolvimento
larvaacuterio mais raacutepido do que as fecircmeas (Consoli e Oliveira 1998) A duraccedilatildeo
desses estaacutegios depende da temperatura da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvaacuteria no recipiente Em condiccedilotildees oacutetimas o periacuteodo entre a eclosatildeo
do ovo e a pupaccedilatildeo pode natildeo exceder cinco dias ou em condiccedilotildees mais
adversas com baixas temperaturas ou alimentaccedilatildeo insuficiente pode se estender
por vaacuterias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
As larvas nadam ateacute a superfiacutecie para respirar e descansar utilizando
aleacutem das nadadeiras o sifatildeo respiratoacuterio situado na extremidade do abdocircmen
para auxiliar o movimento em ldquoSrdquo caracteriacutestico dessa etapa A larva assume uma
posiccedilatildeo vertical em relaccedilatildeo ao niacutevel aquaacutetico e apresenta fotofobia reagindo
imediatamente agrave presenccedila da luz (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Embora aquaacuteticas as larvas respiram sempre o oxigecircnio do ar
necessitando para isso chegar agrave superfiacutecie da aacutegua aspirando o ar atraveacutes do seu
sifatildeo respiratoacuterio O tempo que as larvas suportam longe da superfiacutecie da aacutegua
varia com a espeacutecie idade e estado fisioloacutegico (Clements 1963)
A presenccedila de substacircncias oleosas na aacutegua eacute prejudicial agraves larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respiraccedilatildeo e por essa caracteriacutestica
vaacuterios tipos de oacuteleos minerais e vegetais combinados ou natildeo com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
seacuteculo passado (Rosen 1994)
A temperatura oacutetima para o desenvolvimento larvaacuterio situa-se entre 24 e
28ordmC e Ae aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de aacutegua ou de esgoto preferindo entretanto coleccedilotildees de
aacutegua com concentraccedilotildees salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998)
Apoacutes aproximadamente 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas
Satildeo bastante moacuteveis quando perturbadas mas estatildeo quase sempre paradas em
contato com a superfiacutecie da aacutegua A pupa possui trombeta alongada geralmente
de forma ciliacutendrica e de abertura estreita possui sifotildees na extremidade da cabeccedila
e palhetas natatoacuterias na extremidade abdominal Natildeo se alimenta e movimenta-se
apenas por contraccedilotildees Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergecircncia do
adulto Esta fase dura de dois a trecircs dias (FUNASA 2000)
O adulto aleacutem das caracteriacutesticas morfoloacutegicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada proboacutescida que a fecircmea usa para sugar o
sangue necessaacuterio agrave maturaccedilatildeo de seus ovos e os machos a utilizam para se
alimentar do neacutectar das plantas Essa fase tem duraccedilatildeo de 30 a 35 dias Ae
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa parede etc) Assim
contabilizando a duraccedilatildeo das diversas formas a vida meacutedia de uma geraccedilatildeo de
Ae aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas desde a postura do ovo ateacute o fim
da fase adulta (FUNASA 2000)
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participaccedilatildeo crescente na transmissatildeo da dengue eacute Aedes albopictus que
tambeacutem se faz presente em outros Estados como Minas Gerais e Espiacuterito Santo
Seu ciclo bioloacutegico eacute semelhante ao de Ae aegypti e exerce um papel de
fundamental importacircncia no mecanismo de transmissatildeo da dengue (FUNASA
2000) pois eacute ateacute hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participaccedilatildeo de primatas e ocasionalmente do homem Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na Aacutesia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na Aacutefrica o que reforccedila o
conceito da origem asiaacutetica do viacuterus (Schatzmayr 2008)
O Aedes albopictus eacute uma espeacutecie silvestre que se adaptou aos
ambientes rurais suburbanos e urbanos Eacute muito menos relacionado ao homem
que o Ae aegypti pois se alimenta e faz oviposiccedilatildeo no ambiente peridomiciliar
sendo a sua dispersatildeo pelo vocirco maior que a de Ae aegypti em meacutedia 500
metros adaptando-se melhor agraves regiotildees frias como o norte da Aacutesia onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior 2008)
Percentuais proacuteximos de 1 de infestaccedilatildeo domiciliar satildeo considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue Percentuais
proacuteximos de 4 satildeo considerados condiccedilatildeo predisponente para epidemias ou
surtos de febre amarela caso haja importaccedilatildeo para essa aacuterea de casos aloacutectones
originaacuterios de aacutereas de febre amarela silvestre (SES-RJ1999)
Assim permanece fortalecida a convicccedilatildeo de que a eliminaccedilatildeo do vetor eacute
ateacute o presente momento a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regiatildeo ou de um paiacutes
22 - Caracteriacutesticas do viacuterus
O viacuterus causador da dengue eacute do tipo RNA da famiacutelia Flaviviridae e do
gecircnero Flavivirus (Figura 2) Existem quatro sorotipos da dengue DENV 1 2 3 e
4 Segundo Figueiredo e Fonseca (1996) o gecircnero Flavivirus compreende 60
viacuterus diferentes entre os quais se destacam por sua importacircncia epidemioloacutegica o
viacuterus da dengue da febre amarela o viacuterus rocio e o viacuterus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA 2000)
O periacuteodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos
Intriacutenseco - eacute o que se passa no homem Comeccedila um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila Durante esse periacuteodo o
viacuterus estaacute presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar
Extriacutenseco - eacute o que se daacute no mosquito Os viacuterus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glacircndulas salivares de 8 a 12 dias apoacutes um repasto
de sangue infectado os mosquitos se tornam infectantes isto eacute capazes de
transmitir a doenccedila e assim continuaratildeo por toda a sua vida (FUNASA 2000)
O viacuterus da dengue natildeo se transmite de pessoa a pessoa nem por qualquer
outro mecanismo que natildeo seja atraveacutes da picada dos mosquitos do gecircnero
Aedes principalmente de Ae aegypti Portanto soacute eacute possiacutevel interromper o ciclo
da doenccedila com o controle ou erradicaccedilatildeo do mosquito transmissor (FUNASA
2000)
Quando acontece a primo infecccedilatildeo por qualquer sorotipo habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doenccedila chamada de ldquodengue claacutessicardquo
Quando ocorre a convivecircncia simultacircnea ou sequumlencial de dois ou mais
sorotipos de viacuterus e o paciente eacute reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez particularmente pelo sorotipo 2 podem ocorrer formas
mais graves da doenccedila como a ldquodengue hemorraacutegicardquo que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA 1998)
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp da dengue
Fonte Silva Juacutenior JB amp Pimenta JFG (2008)
Basicamente o viacuterus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indiviacuteduos O mosquito fecircmea ao picar um indiviacuteduo
infectado se contamina ao sugar seu sangue onde haacute viacuterus circulando A partir
daiacute o viacuterus migra para as glacircndulas salivares da fecircmea e para seus ovos caso jaacute
tenham sido fecundados A transmissatildeo pode ocorrer a partir de dois
mecanismos 1) a fecircmea contaminada pica um indiviacuteduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos contaminando entatildeo a pessoa picada com o viacuterus
que estaacute alojado nas glacircndulas salivares ou 2) a fecircmea ao picar um indiviacuteduo
contaminado transmite o viacuterus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano) contaminando a geraccedilatildeo seguinte cujas larvas eclodiratildeo jaacute
possuindo em seu interior o viacuterus da dengue Esse mecanismo de transmissatildeo eacute
tambeacutem denominado de transmissatildeo vertical (SES-RJ 1999)
A Dengue eacute transmitida por picada de mosquitos infectados Assim o
conhecimento acerca da interaccedilatildeo entre o mosquito e o viacuterus pode revelar
elementos criacuteticos para o controle desta doenccedila O periacuteodo de incubaccedilatildeo da
doenccedila no homem ou seja o periacuteodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas pode variar de 3 a 15 dias sendo em meacutedia de 5 a 6 dias e o
periacuteodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver viacuterus no sangue (periacuteodo
de viremia) Este periacuteodo comeccedila um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai ateacute o 6ordm dia da doenccedila (FUNASA 2002)
Para infectar uma ceacutelula eacute necessaacuteria a interaccedilatildeo de proteiacutenas virais com
moleacuteculas presentes na superfiacutecie celular que funcionam como receptores No
caso do gecircnero Flavivirus o papel de adesatildeo e fusatildeo eacute desempenhado pela
proteiacutena E (Figura 2) No entanto o receptor celular utilizado ainda natildeo eacute conhecido
(Martinez 1999)
Diferentes linhagens de Ae aegypti apresentam diferentes niacuteveis de
susceptibilidade e refratariedade agrave infecccedilatildeo Um candidato a mediar esta
susceptibilidaderefratariedade seria o sistema imune do vetor (Silva 2008)
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito possibilitando a infecccedilatildeo persistente e a transmissatildeo do viacuterus RNAi eacute um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons transgenese ou ainda durante a
replicaccedilatildeo viral Este mecanismo tem sido descrito nos uacuteltimos anos em um grande nuacutemero de modelos
incluindo insetos Eacute possiacutevel que exista uma associaccedilatildeo entre virulecircncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae aegypti Existe a hipoacutetese de trabalho de
que populaccedilotildees de insetos refrataacuterios ao viacuterus provavelmente apresentam uma forte resposta celular agrave
presenccedila dos mesmos Em contrapartida o viacuterus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular Assim o ciclo do viacuterus no inseto e consequentemente o
comportamento ciacuteclico da endemia pode estar relacionado agraves alteraccedilotildees dos
mecanismos de escape do viacuterus agraves respostas celulares do inseto ou agraves alteraccedilotildees
primaacuterias dessas respostas celulares do inseto ou ateacute mesmo a concomitacircncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al 2009)
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Ameacuterica do Sul comeccedilou em 1978
afetando inicialmente Venezuela Colocircmbia e as Guianas Cerca de 702 mil casos
foram reportados agrave Organizaccedilatildeo Pan Americana de Sauacutede (OPAS) no periacuteodo de
1977-1980 mas calcula-se com base em dados da Colocircmbia e da Venezuela
que mais de 5 milhotildees de pessoas se infectaram nesses anos Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente para outros paiacuteses da Ameacuterica
do Sul chegando ao Brasil por Roraima em 19811982 e no Rio de Janeiro em
1986 Casos de dengue hemorraacutegica surgiram quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em paiacuteses como Boliacutevia Paraguai Equador Peru e Argentina
e em 1990 no Brasil (Schatzmayr 2008)
No Brasil o primeiro registro da doenccedila foi no Rio de Janeiro em 1846
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tiacutepicas da dengue (Figueredo amp Fonseca
1996) A campanha de erradicaccedilatildeo do Ae aegypti motivada pela epidemia de
febre amarela comeccedilou em 1903 com Emiacutelio Ribas e Osvaldo Cruz e em 1953 o
mosquito foi considerado erradicado do paiacutes sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973 Reapareceu em 1976 na Bahia em 1977 no Rio de Janeiro
e em Roraima em 1981-1982 O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987 1990-1991 comportando-se em progressatildeo ascendente desde
1994 Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municiacutepios infestados enquanto que no
ano de 2008 jaacute totalizavam 4006 municiacutepios com presenccedila de A aegypti
confirmada (Aguiar 2009)
A incidecircncia da doenccedila apresentou comportamento ascendente
hiperendecircmico em concordacircncia com a expansatildeo do vetor com variaccedilotildees
ciacuteclicas entretanto dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes
disponibilidade de populaccedilotildees suscetiacuteveis pluviosidade sazonal e outros fatores
A incidecircncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores de 1987 com 89394 casos notificados e de 1991
com 97209 casos notificados para 56621 casos notificados em 1994 De 1995 a
1998 o nuacutemero de casos notificados saiu de 128619 para 528000 ateacute que em
2002 794219 casos foram notificados o que representou na eacutepoca um estado
hiperendecircmico2 de dengue em niacutevel nacional sem precedentes na histoacuteria do
Brasil (FUNASA 2008)
No Brasil desde 1986 vecircm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do paiacutes foram notificados cerca de 3 milhotildees de casos
(SESDEC-RJSVSSVEACVEDTISDTVZ ndash 2008)
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidecircncia de casos notificados nas regiotildees Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3 Do total de 528000 casos em 1998 o Nordeste
contribuiu com 259574 casos e o Sudeste com 250065 casos notificados
Figura 3 - Notificaccedilotildees de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte PNCD
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se agravequeles que procuram
algum serviccedilo meacutedico implicando em meacutedia em 3 dias de afastamento do
trabalho Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etaacuteria produtiva a maioria deles eacute notificada exatamente por circunstacircncias
laborais (Figueiredo e Fonseca 2006)
2- Hiperendecircmico eacute a presenccedila habitual da doenccedila poreacutem com incidecircncia muito elevada
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1 com 50000 e 96000 casos
notificados (Figura 4) No inqueacuterito soroloacutegico realizado no ano seguinte pelo
Ministeacuterio da Sauacutede constatou-se a presenccedila de um milhatildeo de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsaacutevel pela epidemia Essa observaccedilatildeo
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado provavelmente ocorram
outros nove casos assintomaacuteticos ou oligossintomaacuteticos poreacutem natildeo notificados e
consequumlentemente natildeo contabilizados (Secretaria Estadual de Sauacutede 1998)
Figura 4 ndash Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC 2009)
Esses iacutendices elevados de infestaccedilatildeo estatildeo ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altiacutessimo percentual de pessoas com a
presenccedila de anticorpos IgG e presenccedila de ceacutelulas de memoacuterias especiacuteficas para
viacuterus da dengue concausa imprescindiacutevel para eventos de dengue hemorraacutegica
Segundo Martinez (1999) Guimaratildees (1999) e Figueredo amp Fonseca (1996) a
primoinfecccedilatildeo geralmente provoca a presenccedila de ceacutelulas de memoacuteria por um
periacuteodo miacutenimo de cinco anos podendo significar que a populaccedilatildeo
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorraacutegica eacute a soma da
populaccedilatildeo primoinfectada nos uacuteltimos cinco anos De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999 acredita-se que a primoinfecccedilatildeo deixa
a memoacuteria imunoloacutegica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez 1999)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regiatildeo Sudeste o Estado do Rio de Janeiro apresenta haacute mais tempo
a convivecircncia simultacircnea de dois sorotipos diferentes de viacuterus desde 1990 com
uma uacutenica interrupccedilatildeo na simultaneidade dessa co-ocorrecircncia em 1997 sendo
retomada em 1998 No ano 2000 foi registrada a presenccedila do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense o que contribuiu para agravar o quadro
epidemioloacutegico do Estado (SES-RJ 2001)
Os primeiros casos de dengue hemorraacutegica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990 devido a presenccedila dos dois sorotipos diferentes
simultacircnea no mesmo periacuteodo (FUNASA 2000)
O Estado do Rio de Janeiro reuacutene o maior nuacutemero de variaacuteveis preacute-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorraacutegica na Regiatildeo Sudeste
caso natildeo sejam revertidas essas condiccedilotildees particularmente aquelas que dizem
respeito aos niacuteveis de infestaccedilatildeo domiciliar do mosquito O Estado do Rio de
Janeiro eacute composto de 92 municiacutepios dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaccedilotildees domiciliares confirmadas pela Fundaccedilatildeo Nacional de Sauacutede
conforme boletim epidemioloacutegico oficial (FUNASA 2001)
23 - Controle Quiacutemico e Bioloacutegico de Vetores de Doenccedilas
231 - Controle de Aedes aegypti
As praacuteticas para controle de insetos satildeo muito antigas Haacute registro de seu
uso na China haacute mais de 2000 anos No final do seacuteculo XIX descobriu-se que
certas espeacutecies de insetos e outros artroacutepodes eram responsaacuteveis pela
transmissatildeo de algumas das mais importantes doenccedilas Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda natildeo estavam disponiacuteveis e o
controle da transmissatildeo era todavia fortemente centralizado no combate ao
vetor
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle de acordo
com as condiccedilotildees ambientais e a dinacircmica populacional do vetor O manejo
ambiental lanccedila matildeo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos ou ainda
para impedir o contato homem-vetor como a eliminaccedilatildeo de criadouros a
drenagem e a instalaccedilatildeo de telas em portas e janelas Satildeo selecionados os
meacutetodos de controle apropriados e as populaccedilotildees do vetor satildeo mantidas em
niacuteveis que natildeo causam dano agrave sauacutede (Braga amp Valle 2007)
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilacircncia
reduccedilatildeo da fonte (ou manejo ambiental) controle bioloacutegico controle quiacutemico com
uso de inseticidas e repelentes armadilhas e manejo da resistecircncia a inseticidas
O controle quiacutemico com inseticidas de origem orgacircnica ou inorgacircnica eacute uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sauacutede Puacuteblica (Rose 2001)
Desde o comeccedilo do seacuteculo XX os agentes quiacutemicos tecircm sido usados
para combater e controlar as populaccedilotildees do mosquito Ae aegypti Durante as
primeiras campanhas diferentes tipos de oacuteleos eram colocados em recipientes
com aacutegua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que jaacute
haviam eclodido Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos paiacuteses principalmente
do Brasil No entanto paiacuteses vizinhos ao Brasil natildeo erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvasatildeo desse vetor em alguns estados brasileiros Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e consequumlentemente
para o aparecimento de populaccedilotildees de Ae aegypti resistentes a este composto
Observado a resistecircncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor Poreacutem semelhante ao DDT os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaccedilotildees resistentes de Ae
aegypti (Consoli et al 1986)
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por periacuteodos
longos foi um dos mais importantes avanccedilos no controle de insetos no seacuteculo XX
O primeiro inseticida de efeito prolongado ou propriedade residual foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT) um organoclorado desenvolvido em 1939 que
quando aplicado em paredes e tetos de casas permanecia ativo contra os insetos
por vaacuterios meses (Rozendaal 1997)
Inseticidas sinteacuteticos como os piretroides tecircm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados como o temefoacutes estatildeo
sendo usados para o controle da fase larval Uma alternativa ao controle quiacutemico
da fase larval estaacute baseada na eliminaccedilatildeo fiacutesica dos criadouros e o uso de
bacteacuterias entomopatogecircnicos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey amp Undeen 1986)
Os inseticidas tecircm sido bastante usados na agricultura agropecuaacuteria e na
sauacutede puacuteblica Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaccedilotildees
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores Resistecircncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas afetando direta e
profundamente a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon
et al 1998) Por esse motivo a partir de 2009 estaacute sendo introduzido o
diflubenzuron que eacute um inibidor da siacutentese de quitina nas atividades de controle
das larval de Ae aegypti (PNCD 2009)
A resistecircncia eacute definida pela OMS como a habilidade de uma populaccedilatildeo de
insetos tolerar uma dose de inseticida que em condiccedilotildees normais causaria sua
morte A resistecircncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluccedilatildeo acelerada de uma populaccedilatildeo que responde a uma intensa pressatildeo
seletiva com a consequumlente sobrevivecircncia dos indiviacuteduos que possuem alelos
que conferem resistecircncia A resistecircncia eacute preacute-adaptativa resultado de mutaccedilotildees
(Braga amp Valle 2007)
Aleacutem de provocar resistecircncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa agrave formaccedilatildeo de resiacuteduos toacutexicos a sauacutede
humana (DrsquoAmato 2002) Resistecircncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas afetando a re-emergecircncia das doenccedilas transmitidas por vetores
(Brogdon amp McAllister 1998) Apesar dos importantes avanccedilos alcanccedilados no
desenvolvimento de meacutetodos alternativos os inseticidas quiacutemicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose
2001) Nesse contexto o monitoramento e o manejo da resistecircncia assim como o
uso de substacircncias com modos de accedilatildeo diferentes dos inseticidas quiacutemicos
convencionais satildeo elementos de suma importacircncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari 1996)
Os mecanismos que tecircm provocado a resistecircncia de insetos aos patoacutegenos
incluem mudanccedilas no comportamento na cutiacutecula mudanccedila no ciclo das ceacutelulas
do intestino meacutedio reduccedilatildeo da afinidade de proteiacutenas no intestino meacutedio e
imunidade agrave maturaccedilatildeo O desenvolvimento da resistecircncia aos patoacutegenos em
especial aos que natildeo atuam por meio de uma toxina deveraacute ser de natureza
diferente da resistecircncia aos inseticidas quiacutemicos e poderaacute progredir mais
lentamente Desse modo populaccedilotildees de insetos aacutecaros e outros artroacutepodes
naturalmente apresentam uma proporccedilatildeo de indiviacuteduos que tenham alelos que
lhes confiram resistecircncia a um determinado produto quiacutemico Populaccedilotildees
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indiviacuteduos com alelos suscetiacuteveis e natildeo matam aqueles que possuam
alelos resistentes Assim um pequeno nuacutemero de indiviacuteduos possui
caracteriacutesticas que permitem sua sobrevivecircncia sob doses de inseticidas
normalmente letais O proacuteprio inseticida natildeo produz uma mudanccedila geneacutetica seu
uso continuado entretanto pode selecionar indiviacuteduos resistentes Apesar dos
vaacuterios estudos documentados sobre a resistecircncia o nuacutemero de mecanismos
envolvidos eacute bastante pequeno e inclui diminuiccedilatildeo da taxa de penetraccedilatildeo pela
cutiacutecula detoxificaccedilatildeo metaboacutelica aumentada e diminuiccedilatildeo da sensibilidade do
siacutetio alvo (Braga amp Valle 2007)
O manejo por ataque muacuteltiplo envolve a utilizaccedilatildeo de dois ou mais produtos
em rotaccedilatildeo ou mistura O princiacutepio da rotaccedilatildeo de produtos eacute baseado no fato de
que a frequumlecircncia de resistecircncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex B e C) satildeo utilizados (Georghiou 1983 Tabashnik 1989
Roush 1989) Sendo assim para o sucesso da rotaccedilatildeo haacute a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indiviacuteduos resistentes na ausecircncia da
pressatildeo de seleccedilatildeo e que natildeo existe resistecircncia cruzada entre os componentes
da rotaccedilatildeo O princiacutepio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indiviacuteduos resistentes ao produto A seratildeo controlados pelo produto B e vice-
versa Poreacutem existe a possibilidade de se encontrarem indiviacuteduos resistentes ao
produto A e B atraveacutes da resistecircncia muacuteltipla Dentre as vaacuterias condiccedilotildees para o
sucesso da mistura estatildeo baixa frequumlecircncia de resistecircncia ausecircncia de
resistecircncia cruzada e persistecircncia bioloacutegica semelhante para os dois compostos
O surgimento de populaccedilotildees resistentes tem ocasionado seacuterios problemas para o
controle de mosquitos Alteraccedilatildeo na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas afetando diretamente a re-emergecircncia das
doenccedilas transmitidas por vetores (Brogdon amp McAllister 1998) Apesar de
importantes avanccedilos em metodologias alternativas os inseticidas quiacutemicos satildeo
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaratildeo desempenhando papel
importante no controle integrado Poreacutem eles possuem desvantagens como o
custo elevado riscos a sauacutede humana e a organismos natildeo alvo bioacumulaccedilatildeo e
desenvolvimento de resistecircncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al 2009) pelo menos ateacute a descoberta de meacutetodos alternativos
sustentaacuteveis que permitam um controle raacutepido e seguro de vetores Com a alta
densidade e dispersatildeo de Ae aegypti e Ae albopictus muitas vezes coexistindo
em diversos estados brasileiros faz-se necessaacuterio na vigilacircncia entomoloacutegica o
monitoramento de mudanccedilas comportamentais que favoreccedilam o surgimento de
resistecircncia destes vetores fornecendo informaccedilotildees importantes na transmissatildeo
de arboviroses como a dengue e a febre amarela Sobretudo pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espeacutecies de Culicidae ( WHO 1990
Braks et al 2003)
Aleacutem dos inseticidas quiacutemicos propriamente ditos outros produtos vecircm
sendo usados no controle de vetores Eles pertencem principalmente aos grupos
dos inseticidas bioloacutegicos e com isso foi dada grande importacircncia ao uso de
microrganismos bioloacutegicos patogecircnicos e virulentos contra populaccedilotildees de
mosquitos vetores de doenccedilas humanas Isolados de fungos bacteacuterias e viacuterus
entomopatogecircnicos apresentam baixa contaminaccedilatildeo ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente e
ademais possibilita a auto-dispersatildeo (Giannini 2001)
24 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sauacutede Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogecircneos e satildeo encontrados nos mais diversos nichos ecoloacutegicos do planeta
Excluindo-se os insetos os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito amp Azevedo 2004)
Os fungos satildeo responsaacuteveis pela produccedilatildeo de importantes aacutecidos
orgacircnicos como o aacutecido ciacutetrico pela produccedilatildeo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econocircmico destacando-se as celulases lacases xilanases
pectinases e amilases pelo controle bioloacutegico de insetos-pragas da agricultura
pelo controle de inuacutemeras moleacutestias que atacam plantas cultivadas e pela
produccedilatildeo de etanol Mais ainda satildeo eles que tornam a vida no planeta mais
agradaacutevel pois sem os fungos natildeo existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos satildeo os principais decompositores de celulose e lignina os
componentes primaacuterios da madeira (Esposito amp Azevedo 2004)
Fungos ligninoliacuteticos como Phanerochaete chrysosporium satildeo capazes
degradar vaacuterios poluentes incluindo o DDT diferentes PCbs dioxina lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al 1985) Degradam tambeacutem plaacutesticos
biodegradaacuteveis incluindo poliidroxibutirato Com relaccedilatildeo aos metais toacutexicos
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos absorveriam esses metais e por meio de translocaccedilatildeo os
concentrariam nos basidiocarpos que eventualmente seriam colhidos e os
metais extraiacutedo e reutilizados ou ainda eliminados de maneira apropriada (Gray
1998) Os fungos tecircm potencial de serem utilizados tambeacutem na remoccedilatildeo de
corantes e na decomposiccedilatildeo de mateacuteria orgacircnica em lagos e coacuterregos de uso
humano
25 - Fungos Entomopatogecircnicos
Os fungos foram os primeiros agentes patogecircnicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas Em condiccedilotildees naturais a ocorrecircncia de fungos
entomopatogecircnicos tem sido no Brasil e em outros paiacuteses um fator importante
para reduzir as populaccedilotildees de pragas Aproximadamente 80 das doenccedilas de
insetos tecircm como agentes etioloacutegicos os fungos pertencentes agrave cerca de 90
gecircneros e mais de 700 espeacutecies (Alves 1998)
Os fungos entomopatogecircnicos satildeo mais empregados para o controle de
pragas agriacutecolas o interesse no uso destes fungos para o controle de artroacutepodes
vetores de doenccedilas tem sido crescente devido agrave aumento de incidecircncia de
doenccedilas tais como a dengue e pelos altos niacuteveis de resistecircncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponiacuteveis no mercado (ffrench-Constant 2005)
O uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vaacuterios estudos (Clark et al 1968 Goettel 1988 Alves et al
2002) poreacutem somente um produto baseado na espeacutecie Lagenidium giganteum foi
comercializado ateacute agora (Laginex) embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al 2004)
Pesquisas com o uso de fungos entomopatogecircnicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malaacuteria Anopheles gambiae e A stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patogecircnicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al 2003
Blanford et al 2005 Scholte et al 2005) Scholte et al (2007) mostrou que o
fungo M anisopliae foi patogecircnico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae albopictus vetores da dengue e da febre amarela Recentes estudos
demonstraram que vaacuterios isolados de M anisopliae satildeo virulentos contra adultos
de Ae aegypti (Paula et al 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor
A grande variabilidade geneacutetica desses entomopatoacutegenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos Com teacutecnicas apropriadas de bioensaios eacute possiacutevel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos com caracteriacutesticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek amp St Leger 1994)
Essa caracteriacutestica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientiacutefico na utilizaccedilatildeo dos fungos como agentes de controle microbiano
Mais de 50 dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil satildeo sobre fungos entomopatogecircnicos sendo que 90 deles
foi desenvolvido nas duas uacuteltimas deacutecadas (Alves 1998)
As espeacutecies que parasitam insetos estatildeo presentes em todos os grupos
taxonocircmicos de fungos conhecidos Esses parasitos apresentam dois modos de
colonizaccedilatildeo do hospedeiro ectoparasitismo e endoparasitismo Os ectoparasitas
provocam infecccedilotildees superficiais no hospedeiro crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o geralmente por meio de uma estrutura especializada o
haustoacuterio para obtenccedilatildeo de alimento Os fungos endoparasitas satildeo aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracteriacutestica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves 1998)
M anisopliae conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora eacute distribuiacutedo habitando o solo O primeiro uso de M anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879 quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gratildeo
do trigo austriacuteaca de Anisoplia Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de accediluacutecar Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos M
anisopliae eacute categorizado como um fungo verde do muscardine devido agrave cor
verde das colocircnias em esporulaccedilatildeo M anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espeacutecies de insetos das diferentes ordens (Alves 1998)
M anisopliae penetra nos insetos atraveacutes da cutiacutecula Uma vez dentro do
inseto o fungo produz uma extensatildeo lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos oacutergatildeos internos do inseto O crescimento
das hifas continua ateacute que o inseto esteja totalmente colonizado por miceacutelios
(Cole 2003)
Foram realizados estudos de toxicidadepatogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidadepatogenicidade pulmonar aguda estudos
de toxicidadepatogenicidade aguda com aplicaccedilatildeo intravenosa toxicidade
dermatoloacutegica e de irritaccedilatildeo conjuntival em coelhos Os estudos indicaram que M
anisopliae eacute incapaz de crescer em temperaturas acima de 35degC Os resultados
dos estudos de toxicidadepatogenicidade natildeo mostraram nenhum efeito toacutexico
patogecircnico ou adverso Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M anisopliae natildeo pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamiacuteferos e consequumlentemente natildeo crescem em oacutergatildeos ou
tecidos humanos (Cole 2003)
Embora M anisopliae natildeo seja infeccioso ou toacutexico para mamiacuteferos a
inalaccedilatildeo dos esporos pode causar reaccedilotildees aleacutergicas em indiviacuteduos sensiacuteveis
(Alves 1998) A maioria dos produtos resultantes da transformaccedilatildeo fuacutengica eacute
menos mutagecircnica do que os compostos originais e no caso de poluentes em
geral a transformaccedilatildeo de compostos precursores toacutexicos resulta em compostos
intermediaacuterios mais polares portanto mais disponiacuteveis e que seratildeo facilmente
eliminados do ambiente Como exemplo os epoacutexidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromaacuteticos policiacuteclicos satildeo compostos muito instaacuteveis
que satildeo faacutecil e rapidamente eliminados bioacutetica e abioticamente (Silva e Espoacutesito
2004)
A ocorrecircncia desses fungos em condiccedilotildees naturais tanto enzooacutetica como
epizooticamente tem sido aqui e em outros paiacuteses um fator importante na
reduccedilatildeo das populaccedilotildees de pragas (Alves 1998)
26 - Utilizaccedilatildeo de Fungos Entomopatogecircnicos para o Controle de Vetores de
Doenccedilas Humanas
Aleacutem de causarem incocircmodo sensaccedilatildeo de repulsa afliccedilatildeo algumas
espeacutecies de insetos satildeo causadores de doenccedilas que comprometem a sauacutede
humana o que agrava satildeo os altos iacutendices de pessoas acometidas por essas
doenccedilas e o elevado niacutevel de mortalidade entre a populaccedilatildeo A mosca fleboacutetomo
transmite para o homem atraveacutes de sua picada a doenccedila leishimaniose (WHO
1990) Estudos laboratoriais tecircm demonstrado que os fungos entomopatogecircnicos
satildeo virulentos a estas moscas (Reithinger et al 1997)
A doenccedila de Chagas um dos mais graves problemas de sauacutede puacuteblica no
Brasil tem como causa de infecccedilatildeo a presenccedila do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos Os vetores mais importantes desta doenccedila
satildeo Triatoma infestans T brasilienses Rhodnius prolixux e T dimidiata que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatogecircnicos (Costa et al 2003)
Mosquitos do gecircnero Culex satildeo vetores da filariose humana doenccedila
endecircmica no nordeste do Brasil A partir de 1970 vaacuterios casos de resistecircncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como consequumlecircncia do uso excessivo
de inseticidas quiacutemicos (Consoli et al 1986) Por esses motivos fungos
entomopatogecircnicos como M anisopliae e Lagenidium giganteum e tambeacutem
bacteacuterias do gecircnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
bioloacutegico desses insetos
Daoust amp Roberts (1982) testaram o fungo M anisopliae observando alta
virulecircncia para larvas de Culex pipiens Ae aegypti e Anopheles stephens De
acordo com Riba et al (1986) o segundo estaacutegio de Ae aegypti eacute o de maior
resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo fungo poreacutem quando testado o fungo Penicillium spp
foi altamente patogecircnico e virulento agraves larvas de Ae aegypti
Scholte et al (2004a) observou em laboratoacuterio que fecircmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M anisopliae infectam o macho durante a
coacutepula E que possivelmente o macho infectado dissemina o fungo para outras
fecircmeas Scholte et al (2005) testaram tecidos pretos impregnado com o fungo
M anisopliae suspensas em habitaccedilotildees humanas na Aacutefrica e observaram a
reduccedilatildeo da populaccedilatildeo de Anopheles
Blanford et al (2005) usando B bassiana infectou fecircmeas de Anopheles
stephensi previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi e constatou que
durante a infecccedilatildeo as fecircmeas param de se alimentar Com isso
consequumlentemente ocorre a reduccedilatildeo da transmissatildeo do Plasmodium o que
diminui a incidecircncia de malaacuteria na populaccedilatildeo
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadecircmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatogecircnicos virulentos e que infecte
todos os estaacutegios de desenvolvimento ovo larva e adultos de mosquitos vetores
de doenccedilas humanas
3 - OBJETIVOS
31 - Objetivo geral
Elaborar estrateacutegias de aplicaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos em
possiacuteveis criadouros do mosquito
32 - Objetivos especiacuteficos
bull Determinar em condiccedilotildees de laboratoacuterio a virulecircncia de isolados de fungos
entomopatogecircnicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti
bull Avaliar a persistecircncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae aegypti em condiccedilotildees de semi-campo
bull Avaliar o efeito da infecccedilatildeo fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae aegypti
4 - MATERIAL E MEacuteTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratoacuterio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) Campos dos
Goytacazes Estado do Rio de Janeiro
41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetaacuterio do Laboratoacuterio de Biotecnologia (CBBUENF)
Para a criaccedilatildeo mosquitos machos e fecircmeas foram mantidos em uma
gaiola de plaacutestico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento
As fecircmeas foram nutridas com sangue de camundongo o que propiciou a
maturaccedilatildeo dos ovos
Para oviposiccedilatildeo copos plaacutesticos de volume de 100 mL contendo papel-
filtro em seu interior como siacutetio de oviposiccedilatildeo e mantidos com 50 mL de aacutegua
foram colocados dentro da gaiola para que a fecircmea ovipositasse O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com aacutegua estimulando a eclosatildeo das larvas As larvas foram alimentadas
com raccedilatildeo de camundongo no primeiro dia de eclosatildeo
A temperatura usada para criaccedilatildeo foi de 25degC com Umidade Relativa (UR)
de 70 plusmn 10
42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
Foram testados dois isolados de B bassiana e oito isolados de M anisopliae
oriundos de diferentes regiotildees do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulecircncia (Tabela1)
Tabela 1 ndash Isolados de fungos entomopatogecircnicos usados para virulecircncia contra
larvas de Ae aegypti
Numeraccedilatildeo Espeacutecies Hospedeiro Origem Geograacutefica
CG 24 B bassiana Euschistus heros Fabr
(Heteroptera Pentatomidae)
Londrina Parana
CG 494 B bassiana
Diacuteptera Rio do Pomba Bahia
CG 144 M anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera Pentatomidae)
Goiania Goias
ESALQ 818 M anisopliae Isolado de solo Piracicaba Satildeo Paulo
LPP 96 M anisopliae
Isolado de solo Satildeo Francisco de
Itabapoana Rio de
Janeiro
LPP 137 M anisopliae
Isolado de solo Campos Rio de
Janeiro
LPP 87 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 45 M anisopliae Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 128 M anisopliae
Isolado de solo Rondocircnia Roraima
LPP 133 M anisopliae Isolado de solo Montenegro Roraima
Os isolados de M anisopliae e B bassiana foram obtidos da coleccedilatildeo do
CENARGEN (CG) em Brasiacutelia ESALQ 818 em Piracicaba (Satildeo Paulo) e os
isolados denominados ldquoLPPrdquo do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g
peptona 25g extrato de levedura 25g agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos
Isolados de M anisopliae e B bassiana foram testados contra larvas de
Ae aegypti adicionando-se a suspensatildeo de fungo em copos de plaacutesticos
descartaacuteveis de 200 mL contendo 50 mL de aacutegua e 10 larvas por copo Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspensatildeo de fungo com 1 x 108
coniacutedios ml-1 (Tween 80 005 em aacutegua destilada) sendo a concentraccedilatildeo final de
5 x 105 coniacutedios ml-1 As larvas foram alimentadas com 05 g da raccedilatildeo animal a
cada copo no iniacutecio do experimento Os copos foram mantidos em BOD em 25degC
UR de 70 plusmn 10 e fotofase de 1212 (LE)
Os ensaios foram realizados com larvas de 2ordm e 3ordm instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas
Como tratamento controle foram usados cinco copos plaacutesticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presenccedila de coniacutedios para avaliaccedilatildeo
da mortalidade natural se possa aferir a presenccedila de possiacuteveis variaacuteveis
intervenientes
Em experimento preliminar coniacutedios in-ativados com radiaccedilatildeo ultravioleta
por 10 minutos em cacircmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possiacuteveis efeitos fiacutesicos dos coniacutedios suspensos na aacutegua na sobrevivecircncia das
larvas Um mL de suspensatildeo desses coniacutedios de M anisopliae na concentraccedilatildeo
de 108 coniacutediosmL foi adicionado a cada frasco
43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de coniacutedios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cacircmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com aacutelcool 70 e 15
minutos de exposiccedilatildeo agrave UV A quantificaccedilatildeo dos coniacutedios foi feita em Cacircmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluiccedilatildeo consecutiva usando
Tween 80 a 005 ateacute a obtenccedilatildeo da concentraccedilatildeo de 1x108 coniacutediosmL-1
suspensatildeo padratildeo usada nos testes Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 005
Tambeacutem foram feitos testes usando gratildeos de arroz com coniacutedios do fungo
aderidos Neste caso o tratamento controle foi feito com gratildeos de arroz sem
coniacutedios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C)
As suspensotildees do fungo foram preparadas com Tween 80 (005) em
aacutegua destilada esteacuteril Os coniacutedios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma alccedila de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inoacuteculos A concentraccedilatildeo de coniacutedios foi avaliada por
contagem na cacircmara de Neubawer O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos coniacutedios Essa suspensatildeo estoque foi preparada
agrave uma concentraccedilatildeo de 109 coniacutediosmL e diluiacuteda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentraccedilatildeo final de 108 coniacutediosmL no dia de sua utilizaccedilatildeo nos
experimentos
44 ndash Bioensaio 2 Persistecircncia da virulecircncia da Suspensatildeo do Fungo ESALQ 818
em Aacutegua
Para verificar a persistecircncia do fungo na aacutegua 1 mL da suspensatildeo ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plaacutestico com 50 mL de aacutegua
destilada O copo foi armazenado em BOD a 25degC UR 70 plusmn 10 fotofase de
1212 (LE) nos periacuteodos de tempo zero 3 5 e 10 dias Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os proacuteximos 8 dias O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 005
Utilizou-se 3 repeticcedilotildees de 1 copo plaacutestico com 10 larvas 2ordm e 3ordm instar de
Ae aegypti
45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os coniacutedios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio soacutelido SDA (Dextrose 10g Peptona 25g Extrato de
levedura 25g Aacutegar 20g e aacutegua destilada 1L) por duas semanas a 27o C em
cacircmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador
Para a produccedilatildeo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de aacutegua destilada como meio de
cultura autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C)
Apoacutes a autoclavagem os coniacutedios foram adicionados ao meio com o auxiacutelio
de uma colher esteacuteril Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
coniacutedios entre os gratildeos de arroz
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cacircmera
climatizada a 27 oC
46 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gratildeo de Arroz
Para a determinaccedilatildeo da persistecircncia da virulecircncia do fungo crescidos e
aderidos nos gratildeos de arroz foram usados copos plaacutestico com 50 mL de aacutegua e
adicionados 1 gratildeo de arroz contendo coniacutedios do isolado ESALQ 818 com
concentraccedilatildeo final de 59 x104 O tratamento controle foi feito com 1 gratildeo de arroz
autoclavado sem fungo
47 ndash Virulecircncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em Condiccedilotildees
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetaacuterio do Laboratoacuterio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF) da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF) Campos dos Goytacazes RJ Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulecircncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gratildeos de arroz contra
larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) Dentro de cada balde foi 1 L de
aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Foram adicionados 10 ou 20
gratildeos de arroz em cada balde
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gratildeos
arroz foi 29 x 105 A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gratildeos arroz foi 59 x 105
48 ndash Persistecircncia da virulecircncia do Fungo Crescido e Aderido em Gratildeos de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 47 poreacutem somente 20 gratildeos de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de aacutegua e
deixados em condiccedilotildees de semi-campo Foram realizados trecircs testes com
diferentes periacuteodos de tempo de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua Tempo zero 5 10
e 20 dias Completados os dias de inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua as larvas foram
colocadas entatildeo iniciando a avaliaccedilatildeo da mortalidade
49 ndash Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gratildeos de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de aacutegua e 50 larvas do 2ordm e 3ordm instar de Ae aegypti Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambeacutem coletada e quantificada o nuacutemero
de pupas que emergiram durante o teste Estas pupas foram colocadas em copos
plaacutesticos com 100 mL de aacutegua Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza ateacute a eclosatildeo dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possiacutevel mortalidade
decorrente da exposiccedilatildeo das larvas ao fungo Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluccedilatildeo de sacarose (10) Os mosquitos mortos foram
submersos em aacutelcool 70 por 30 segundos depois colocados dentro de uma
cacircmara uacutemida por 10 dias para observar a ocorrecircncia do processo de
conidiogecircnese com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infecccedilatildeo do fungo
Em todos os testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulecircncia foi submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti e
melhorou sua eficiecircncia diminuindo a taxa de sobrevivecircncia larval
A concentraccedilatildeo final do isolado ESALQ 818 (20 gratildeos arroz) inoculado em
1000 mL de aacutegua foi de 59 x105 coniacutedios A concentraccedilatildeo final do isolado LPP
133 (20 gratildeos arroz) inoculado em 1000 mL de aacutegua foi de 65 x 105 coniacutedios
410 ndash Virulecircncia em Condiccedilotildees de Laboratoacuterio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas para oviposiccedilatildeo foram confeccionadas com um recipiente
(vaso) de plaacutestico preto de 500 mL com uma palheta de madeira de 3 x 12 cm
presa na borda do vaso por um elaacutestico A madeira foi colocada na parte interna
do vaso em contato com a aacutegua limpa de forma possibilitar a oviposiccedilatildeo dos
mosquitos fecircmeas
As armadilhas permaneceram 5 dias no campus da UENF e eram
vistoriadas diariamente No quinto dia as palhetas foram retiradas das
armadilhas e acondicionadas em cacircmara climatizada a 25 degC por 48 horas a fim
que secassem totalmente Depois de secas atraveacutes de uma lupa foram
quantificados os ovos dos mosquitos aderidos nas palhetas e imediatamente
estas foram colocadas dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x 20 cm) com aacutegua
destilada para propiciar a eclosatildeo das larvas
Grupos de 10 larvas dos estaacutegios L2 e L3 foram mantidas dentro dos
copos (9 cm de largura e 7 cm de altura) com 50 mL de aacutegua destilada e 05g de
raccedilatildeo de camundongo
A infecccedilatildeo de larvas com o isolado ESALQ 818 ocorreu quando 1 mL da
suspensatildeo fungica foi adicionado em cada copo O tratamento controle consistiu
do mesmo procedimento poreacutem sem adiccedilatildeo do fungo
Foram montados 3 parcelas para o tratamento com fungo e 3 parcelas para
o tratamento controle Foram feitos trecircs repeticcedilotildees deste teste O valor total da
mortalidade formaccedilatildeo de pupa e tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foram
avaliados
411 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em Gratildeo de Arroz em
Condiccedilotildees de Semi-campo para Larvas Selvagens de Aedes aegypti
Foi feito o mesmo procedimento que o item 48 poreacutem as larvas usadas
foram oriundas de ovos coletadas no campus da Universidade Estadual do Norte
Fluminense
412 ndash Avaliaccedilatildeo da mortalidade das larvas
Nos experimentos realizados a mortalidade das larvas foi avaliada
diariamente por 8 dias As larvas mortas foram removidas esterilizadas em aacutelcool
70 por 30 segundos e enxaguadas imediatamente na aacutegua destilada esteacuteril e
em seguida transferida para placas de Petri que eram mantidas a 25degC para
estimular o coniacutediogecircnese
413 ndash Forma de Anaacutelise dos Resultados
O valor meacutedio de sobrevivecircncia foi calculado pelo meacutetodo de Kaplan-Meier
(Blanford et al 2005) As curvas de sobrevivecircncia foram comparadas usando o
Log-Rank Test a 95 de niacutevel de significacircncia Este meacutetodo foi conduzido pelo
GraphPad Prism 30 Software Primeiramente foram analisadas as repeticcedilotildees de
cada tratamento com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivecircncia entre
as repeticcedilotildees foram estatisticamente diferentes Natildeo ocorrendo diferenccedilas
significativas entre repeticcedilotildees as repeticcedilotildees de cada experimento foram
agrupadas (ldquopooledrdquo) dando-se inicio agrave anaacutelise das curvas de sobrevivecircncia entre
os tratamentos O tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) das larvas tambeacutem foi
avaliado pelo GraphPad Prism
Os grupos controles que natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em
suas curvas de sobrevivecircncia foram agrupados calculadas as meacutedias e
apresentada somente uma curva de sobrevivecircncia
A Anova com teste de Duncan das mortalidades totais foi feita para
comparar a significacircncia das meacutedias de mortalidade entre os tratamentos
O teste de Duncan tambeacutem foi usado para verificar a significacircncia da
mortalidade das larvas de Ae aegypti no trabalho de campo
5 RESULTADOS
51 ndash Seleccedilatildeo em Laboratoacuterio de Fungos Virulentos Para Lavas de Aedes aegypti
(Rockefeller)
Dos dez isolados testados contra as larvas de 2ordm e 3ordm instar somente trecircs
(CG24 CG 144 e ESALQ 818) foram considerados mais virulentos contra as
larvas apresentando porcentagens de mortalidade maiores que 80 A maior
porcentagem de mortalidade ocorreu quando foi utilizado o isolado CG 144 de M
anisopliae (90) A anaacutelise de variacircncia mostrou que natildeo houve diferenccedila
significativa quanto agrave mortalidade entre esses trecircs isolados (CG24 CG 144 e
ESALQ 818) com F (26) = 080 pgt 005
A Tabela 2 mostra a porcentagem de mortalidade causada pelos isolados de
fungos testados A porcentagem de mosquitos mortos no controle variou de 0 ndash
10 A menor porcentagem de mortalidade (6) ocorreu quando o isolado CG
494 de Beauveria bassiana foi testado contra as larvas de Ae aegypti
Tabela 2 ndash Meacutedia de mortalidade () plusmn desvio padratildeo das larvas expostas por 8
dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e oito isolados de Metarhizum
anisopliae (Ma)
Isolado
(espeacutecie)
Mortalidade
( media) e
desvio padratildeo
S50
(dias)
Mortalidade
Controle
()
CG 24 (Bb) 827 plusmn 239 6 8
CG 494 (Bb) 6 plusmn 05 NA 2
CG 144 (Ma) 90 plusmn 174 5 8
ESALQ 818 (Ma) 88 plusmn 147 6 10
LPP 96 (Ma) 22 plusmn 18 NA 4
LPP 137 (Ma) 20 plusmn 15 NA 0
LPP 87 (Ma) 20 plusmn 14 NA 3
LPP 45 (Ma) 14 plusmn 32 NA 46
LPP 128 (Ma) 14 plusmn 16 NA 0
LPP 133 (Ma) 8 plusmn 2 NA 0
S50= Tempo meacutedio de sobrevivecircncia NA Analise natildeo apropriada experimentos repetidos 3 vezes com 50 larvas por repeticcedilatildeo
Foi possiacutevel calcular somente o tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) destes
trecircs isolados os demais apresentaram mortalidade de larvas menor de 50 O
isolado mais virulento foi o CG 144 causando 50 de mortalidade das larvas em
5 dias de exposiccedilatildeo ao fungo Os outros dois isolados CG 24 e ESALQ 818
causaram 50 de mortalidade das larvas em 6 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 80
20
40
60
80
100CG 24 (Bb)CG 144 (Ma)ESALQ 818 (Ma)CONT CG 24 (Bb)CONT CG 144 (Ma)CONT ESALQ 818 (Ma)
Dias
Sobrev
ivecircn
cia
Figura 5 - Sobrevivecircncia das larvas tratadas com fungos entomopatogecircnicos e dos grupos
controle com desvio padratildeo
Os insetos submetidos a infecccedilatildeo com os trecircs isolados mais virulentos
(Figura 5) mostraram similaridade entre as porcentagens de mortalidades
contudo a sobrevivecircncia dos insetos submetidos aos isolado CG144 (M
anisopliae) apresentaram mortalidade mais precoce A anaacutelise de Probit mostrou
que a CL50 para CG 144 foi de 316 x 105 conidios mL-1
511 ndash Persistecircncia em Aacutegua da Suspensatildeo de Fungo ESALQ 818 para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller)
Foi escolhido o fungo ESALQ 818 por apresentar maior facilidade de
produccedilatildeo em laboratoacuterio e menor desvio padratildeo nos resultados das parcelas de
acordo com a Tabela 2
A menor sobrevivecircncia larval ocorreu quando as larvas foram expostas a
infecccedilatildeo no mesmo instante em que o fungo foi inoculado na aacutegua (Tempo zero)
A maior taxa de sobrevivecircncia larval (53) foi observada quando o fungo
permaneceu por 10 dias na aacutegua antes da colocaccedilatildeo das larvas
CG 24(Bb)
CG 144 (Ma)
ESALQ 818 (Ma)
CONTROLE CG 24 (Bb)
CONTROLE CG 144 (Ma)
CONTROLE ESALQ 818
( )
A Figura 6 mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas ao fungo
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (0 3 5 10 dias) avaliando entatildeo a
persistecircncia da virulecircncia do fungo em meio liacutequido Foi observado que as larvas
expostas imediatamente agrave inoculaccedilatildeo do fungo (0 dia) apresentaram em 7 dias
0 de sobrevivecircncia e tambeacutem o menor S50 (2 dias) A maior S50 (9 dias) ocorreu
quando o fungo ficou inoculado na aacutegua por 10 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dia
Sobrevivecircncia
Figura 6 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao Fungo
ESALQ 818+Tween armazenado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero
3 5 e 10 dias) para a avaliaccedilatildeo da patogecircnicidade do fungo
Tabela 3 ndash Sobrevivecircncia (SOBR) plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ 818+Tween inoculado
na aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O tratamento
controle foi feito somente com Tween
DIAS DO FUNGO NA AacuteGUA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
SOBR TRAT FUNGO 0 plusmn 1128 7 plusmn 798 17 plusmn 501 54 plusmn 247
S50 2 4 6 9
SOBR TRAT CONTROLE 777 81 80 79
512 ndash Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aderido no Gratildeo de Arroz
para Larvas Rockefeller
Neste teste apenas um gratildeo de arroz com coniacutedios do fungo ESALQ 818
foi usado para verificar a virulecircncia do fungo contra larvas de Aedes aegypti O
tratamento controle foi feito com um gratildeo de arroz sem fungo e autoclavado
verificando possiacuteveis efeitos desse substrato na sobrevivecircncia das larvas
No tratamento feito com fungo as larvas apresentaram 4 de
sobrevivecircncia com o valor do S50 de 2 dias O controle manteve-se estaacutevel
apresentando 82 de sobrevivecircncia das larvas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100ESALQ 818CONTROLE
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 7 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas colocadas na aacutegua com
um gratildeo de arroz do isolado ESALQ 818 O tratamento controle foi feito com um
gratildeo de arroz sem coniacutedios e autoclavado
513 ndashPersistecircncia em Aacutegua do Fungo ESALQ 818 Crescidos e Aderidos no Gratildeo
de Arroz
A menor sobrevivecircncia larval (0) ocorreu quando as larvas foram
expostas a infecccedilatildeo no mesmo instante em que o gratildeo de arroz com o fungo foi
inoculado na aacutegua (Tempo zero) A maior taxa de sobrevivecircncia das larvas (25)
foi observada quando o gratildeo de arroz com o fungo foi inoculado na aacutegua por 10
dias (Figura 8) com S50 das larvas de 7 dias (Tabela 5)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100Tempo zero3 Dias5 Dias10 Dias
Dias
Sobrevivecircncia
Figura 8 ndashCurvas de sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao
gratildeo de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5
10 dias)
Tabela 4 ndash Taxa de sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio
sobrevivecircncia (S50) das larvas expostas ao gratildeo de arroz com ESALQ 818
inoculado em aacutegua por diferentes periacuteodos (Tempo zero 3 5 10 dias) O
tratamento controle foi feito da mesma forma com arroz autoclavado mas sem
fungo
SOBREVIVEcircNCIA TEMPO
ZERO 3 DIAS 5 DIAS 10 DIAS
GRAtildeOS ARROZ COM FUNGO 0 plusmn 1115 11 plusmn 537 18 plusmn 598 25 plusmn573
S50 (dias) 2 4 6 7
Tratamento controle 79 86 81 86
52 ndash Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
521 Virulecircncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em duas Quantidades
de Gratildeo de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
Nos testes feitos em condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 20 gratildeos) com coniacutedios aderidos foram usados para verificar a
virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti da linhagem
Rockfeller
No tratamento feito com 10 gratildeos de arroz com fungo foi verificado em 7
dias 52 de sobrevivecircncia das larvas Aumentando a quantidade de arroz (20
gratildeos) foi observado 5 de sobrevivecircncia das larvas e um valor de S50 de 1 dia
(Figura 9)
0 1 2 3 4 5 6 70
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 9- Curvas de Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas da linhagem
Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gratildeos de arroz (10 e 20 gratildeos)
com fungos ESALQ 818
522 Persistecircncia em Aacutegua da Virulecircncia do Fungo ESALQ 818 Crescidos e
Aderidos em 20 Gratildeos de Arroz para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller)
As larvas que entraram em contato com os gratildeos de arroz no Tempo zero
apresentaram 5 de sobrevivecircncia (Figura 10) com valor do S50 de 1 dia Os
demais tempos de permanecircncia do fungo na aacutegua (5 10 e 20 dias) apresentam
42 54 e 58 de sobrevivecircncia das larvas respectivamente (Tabela 7)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
20
40
60
80
100TEMPO ZERO5 DIAS10 DIAS20 DIASCONTROLE
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 10 ndash Sobrevivecircncia com desvio padratildeo das larvas expostas ao fungo
inoculado em gratildeos de arroz que permaneceram em aacutegua por diferentes tempos
(tempo zero 5 10 e 20 dias)
Tabela 5 ndash Sobrevivecircncia plusmn desvio padratildeo (DP) e tempo meacutedio de sobrevivecircncia
(S50) das larvas exposta aos gratildeos de arroz com fungo mantidos em aacutegua por
(Tempo zero 5 10 e 20 dias)
TEMPO
ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS
SOBREV 5 plusmn 7879 42 plusmn 2859 54 plusmn 2661 58 plusmn 1935
S50 (dias) 1 9 10 -
53 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populaccedilatildeo Natural de Larvas
Aedes aegypti em Laboratoacuterio
531 ndash Virulecircncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares Larvais de
Aedes aegypti
Foi observado que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
ESALQ 818 A menor porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu
quando os instares larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico
(ESALQ 818) com 8 de sobrevivecircncia (Figura 11) Para todos as fases larvais o
tempo meacutedio de sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4L1 L2 CONTROLL3 CONTROLL4 CONTROL
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 11 ndash Sobrevivecircncia () dos diferentes instars larvais infectados com o
isolado ESALQ 818 Os tratamentos controle foram feitos apenas com 005
Tween 80
532 ndash Virulecircncia de LPP 133 para os Diversos Instares Larvais de Aedes aegypti
Observou-se que todos os instares larvais foram susceptiacuteveis ao isolado
LPP 133 (submetido agrave sucessivas passagens por larvas de Ae aegypti) A menor
porcentagem de sobrevivecircncia do tratamento fungo ocorreu quando os instares
larvais L1L2 foram infectados com o fungo entomopatogecircnico (10 de
sobrevivecircncia) Os instars L3 e L4 tiveram 11 e 13 de sobrevivecircncia das
larvas respectivamente (Figura 12) Para todos as fases larvais o tempo meacutedio de
sobrevivecircncia (S50) foi de 2 dias
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100L1 L2L3L4CONTROLE L1 E L2CONTROLE L3CONTROLE L4
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivecircncia dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado LPP 133 A + 005 Tween 80 O tratamento controle foi
feito apenas com 005 Tween 80
54 Virulecircncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818 Crescidos e Aderidos
em Gratildeo de Arroz Contra uma Populaccedilatildeo Natural de Larvas de Aedes aegypti em
condiccedilotildees de Semi-campo
Nos testes feitos com larvas de populaccedilatildeo natural de Ae aegypti em
condiccedilotildees de semi-campo diferentes quantidade de gratildeos de arroz com o fungo
foi usado para verificar a virulecircncia do isolado ESALQ 818 contra as larvas desse
inseto
Em 14 dias as larvas expostas a 1 L de aacutegua com 10 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 23 As larvas expostas a 20 gratildeos de arroz com
fungo tiveram sobrevivecircncia de 15 (Figura 13)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
20
40
60
80
10010 GRAtildeOS20 GRAtildeOSCONTROLE 10 GRAtildeOSCONTROLE 20 GRAtildeOS
DIAS
SOBREVIVEcircNCIA
Figura 13 - Sobrevivecircncia com desvio padratildeo de uma populaccedilatildeo de larvas do
municiacutepio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes quantidades de
gratildeos de arroz (10 ndash 20 gratildeos de arroz)
A Tabela 10 mostra a porcentagem das larvas que formaram pupas nos
tratamento com arrozfungo
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e 20 gratildeos de
arroz com fungo ( MORT LARVAL) plusmn desvio padratildeo (DP) da mortalidade de
larvas porcentagem da formaccedilatildeo de pupas das larvas que natildeo foram mortas pelo
fungo
10
GRAtildeOS
CONTROLE
10 GRAtildeOS
20
GRAtildeOS
CONTROLE
20 GRAtildeOS
MORT LARVAL 77 plusmn 128 2 plusmn 065 85 plusmn 311 8 plusmn 191
FORMACcedilAtildeO
PUPA 23 98 15 92
55 ndash Influecircncia da Infecccedilatildeo do ESALQ 818 no desenvolvimento de Aedes aegypti
Para verificar se o fungo apresentaria efeito residual nas diferentes fases
do inseto Ae aegypti as larvas foram expostas a 1L de aacutegua com 20 gratildeos de
arroz (com coniacutedios do fungo aderidos) O tratamento controle foi feito da mesma
forma poreacutem com os gratildeos de arroz sem fungo
Neste teste foi avaliado as porcentagens de mortalidade das larvas
formaccedilatildeo de pupas mortalidade de pupas emergecircncia dos adultos e mortalidade
dos adultos
O teste apresentou 60 de larvas mortas e 40 de pupas formadas Das
pupas formadas 20 morreram e 80 formaram mosquitos adultos Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
O desvio padratildeo (DP) da quantidade de pupas mortas devido o efeito
residual do fungo e as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo
apresentados na Tabela 11
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi ligeiramente mais raacutepido quando comparado com o tratamento controle
(Figura 14)
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DIA
SOBREVIVEcircNCIA ()
Controle
Trat fungo
Pup
as Formad
as ()
Figura 14 ndash Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos e desvio padratildeo (DP) do tratamento fungo ESALQ 8181 e
tratamento controle
TRATAMENTO
FUNGO
TRATAMENTO
CONTROLE
LARVAS MORTAS 60 plusmn 294 0
PUPAS FORMADAS 40 plusmn 178 100
PUPAS MORTAS 20 plusmn 156 0
ADULTOS FORMADOS 80 100
ADULTOS MORTOS 0 0
56 Influecircncia da Infecccedilatildeo do LPP 133 no desenvolvimento de Aedes aegypti
O teste apresentou 62 de larvas mortas e 38 de pupas formadas Das
pupas formadas 58 morreram e 42 formaram mosquito adulto Natildeo ocorreu
mortalidade dos mosquitos adultos durante 8 dias de observaccedilatildeo
Os nuacutemeros meacutedios das pupas mortas devido ao efeito residual do fungo e
as porcentagens de mortalidade do tratamento controle satildeo apresentados na
Tabela 12
O desenvolvimento das pupas oriundas das larvas expostas ao arroz com
fungo foi novamente um pouco mais raacutepido quando comparado com o tratamento
controle
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dias
Desenvolvimento pupal
Controle
Trat fungo
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos feitos com o
isolado LPP 133 e os tratamentos Controle
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas pupas e adultos formaccedilatildeo de
pupas e adultos de insetos tratamentos com fungo LPP 133 e os tratamentos
controles
TRAT FUNGO TRAT CONT
LARVAS MORTAS 62 plusmn 965 0
PUPAS FORMADAS 38 plusmn 995 100
PUPAS MORTAS 58 0
ADULTOS FORMADOS 42 100
ADULTOS MORTOS 0 0
Pup
as Formad
as ()
6 - DISCUSSAtildeO
Neste estudo foram selecionados isolados de fungos entomopatogecircnicos
para investigar a patogenicidade e virulecircncia contra larvas de Ae aegypti com a
finalidade de reduzir as populaccedilotildees de adultos desse vetor e portanto a incidecircncia
da dengue
Os resultados iniciais mostraram que somente dois isolados de M
anisopliae e um de B bassiana foram virulentos contra as larvas do 2deg e 3ordm instar
do mosquito Ae aegypti Similar resultado foi demonstrado em estudo usando M
anisopliae e B bassiana contra larvas de mosquitos onde somente um dos oito
isolados testados por Alves et al (2002) foi considerado virulento Jaacute foi
documentado que a variabilidade geneacutetica dessas duas espeacutecies de fungo resulta
em significativas diferenccedilas na virulecircncia (Hajek amp St Leger 1994)
Recentemente Luz et al (2007) mostrou que algumas espeacutecies de fungos
entomopatogecircnicos satildeo capazes de colonizar ovos de Ae aegypti quando em
contato prolongado com o fungo contudo 11 espeacutecies de fungo testadas natildeo
foram capazes de infectar o estaacutegio de ovo
Neste estudo os trecircs isolados mais virulentos contra larvas de Ae aegypti
natildeo tiveram diferenccedilas significativas quanto a porcentagem de mortalidade
poreacutem uma pequena diferenccedila no valor do S50 foi observado indicando diferenccedilas
entre a virulecircncia dos isolados Estas diferenccedilas podem ser consideradas
importantes pois a alteraccedilatildeo no tempo meacutedio de mortalidade tem como
consequumlecircncia a reduccedilatildeo da populaccedilatildeo adulta do mosquito Ae aegypti e
consequumlentemente na transmissatildeo da dengue
Um isolado de M anisopliae usado por Alves et al (2002) contra larvas de
Culex quinquefasciatus causou 50 de mortalidade em 24 horas quando aplicado
sobre a superfiacutecie de aacutegua contendo as larvas Entretanto esse fungo perdeu
rapidamente a viabilidade dois dias depois da aplicaccedilatildeo O presente estudo
mostra que o fungo ESLQ 818 manteve-se viaacutevel por 10 dias depois de
inoculados em copos plaacutesticos com aacutegua Eacute possiacutevel que a larva sobreviva a
infecccedilatildeo e forme a pupa poreacutem pode ser que a pupa torne-se inviaacutevel e natildeo
emergem os adultos (Tabela 7 e 8)
As larvas que sobreviveram agrave exposiccedilatildeo ao fungo e se desenvolveram em
pupas ainda assim podem sofrer os efeitos tardios do patoacutegeno Neste caso as
pupas infectadas com o fungo natildeo concluiriam o seu desenvolvimento ou seja as
pupas natildeo se desenvolveriam em adultos
O fungo foi re-isolado de larvas mortas de Ae aegypti e um aumento na
virulecircncia foi subsequentemente observado M anisopliae ESALQ 818
demonstrou um aumento de virulecircncia depois desse procedimento com uma
reduccedilatildeo no tempo meacutedio de sobrevivecircncia das larvas O isolado originalmente
demonstrou valores de S50 de 6 dias (Tabela 2) enquanto apoacutes o re-isolamento o
fungo causou 50 mortalidade em 2 dias (Tabela 3) Posteriormente esse
isolado veio ser usado para os outros experimentos O fenocircmeno de aumento de
virulecircncia apoacutes a passagem no hospedeiro tem sido relatado anteriormente em
larvas de mosquito por Daoust amp Roberts (1982)
Com a finalidade de aplicar os fungos contra larvas de Ae aegypti de modo
mais conveniente e dispensar a necessidade de uma formulaccedilatildeo investigamos a
virulecircncia de coniacutedios inoculados na aacutegua junto com as larvas diretamente
aderidos nos gratildeos de arroz no intuito de ter uma forma de liberaccedilatildeo lenta (slow
release) dos coniacutedios similar ao processo de encapsulaccedilatildeo jaacute usado na
formulaccedilatildeo de fungos entomopatogecircnicos (Feng et al 1994) A Figura 7 mostra a
sobrevivecircncia das larvas na presenccedila de um gratildeo de arroz com coniacutedios de
ESALQ 818 As larvas morreram rapidamente e o valor de S50 de dois dias
(Tabela 4) foi melhor do que no experimento anterior (Figura 6) que consistiu na
inoculaccedilatildeo do fungo +Tween na aacutegua
Devido ao resultado positivo desse experimento foi montado outro
experimento para monitorar a persistecircncia dos coniacutedios inoculados em arroz
contra larvas de Ae aegypti em condiccedilotildees de laboratoacuterio Os resultados desse
experimento (Figura 8) mostram a virulecircncia dos coniacutedios depois de diferentes
tempos de permanecircncia na aacutegua antes de adicionar as larvas O tempo zero
representa o controle ldquopositivordquo no sentido que as larvas satildeo expostas ao fungo
imediatamente como foi feito no experimento anterior Esperava-se portanto um
resultado igual de Figura 7 confirmado pelo valor de S50 de 2 dias Pode-se
observar entretanto uma queda na mortalidade conforme a passagem do tempo
entre a inoculaccedilatildeo do fungo na aacutegua e a adiccedilatildeo das larvas Os valores de S50
aumentam gradativamente sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
aacutegua por 10 dias antes de colocar as larvas Poreacutem a mortalidade ainda foi
considerada alta com somente 25 das larvas sobrevivendo no final do
experimento (Tabela 4)
Os proacuteximos experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado
nos gratildeos de arroz numa simulaccedilatildeo de campo chamado ldquosemi-campordquo quando os
baldes foram colocados na varanda coberta do insetaacuterio Devido o aumento no
volume de aacutegua usado (1 litro nas baldes ao inveacutes de 50 ml usado nos copos
plaacutesticos) foi testado o efeito da inoculaccedilatildeo de 10 e 20 gratildeos de arroz A Figura 9
mostra as curvas de sobrevivecircncia das larvas expostas as diferentes
concentraccedilotildees de coniacutedios liberados na aacutegua depois da inoculaccedilatildeo com arroz O
uso de 20 gratildeos de arroz foi mais eficiente do que 10 gratildeos com somente 5 das
larvas sobreviventes ateacute dia 7 do experimento O valor de S50 foi o menor de
todos os experimentos ateacute agora sendo de um dia
Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (Morley-Davis et al 1995)
devem ser levados em consideraccedilatildeo quando este for usado em recipientes
propiacutecios para o desenvolvimento do mosquito Os efeitos deleteacuterios da luz solar
sobre o BTi jaacute foi demonstrado por Vilarinhos et al (2003)
A maioria dos experimentos descritos aqui foi feita com larvas da linhagem
de laboratoacuterio chamada Rockfeller Entretanto essa linhagem depois de muitos
anos de cruzamentos entre si e muitos anos vivendo em condiccedilotildees de laboratoacuterio
poderia natildeo responder do mesmo jeito do que Ae aegypti selvagem Portanto
decidimos testar a virulecircncias do isolado ESALQ 818 contra larvas de Ae aegypti
oriundas de ovos coletado no campo A Figura 13 mostra a sobrevivecircncia das
larvas selvagens expostas a 10 e 20 gratildeos de arroz em condiccedilotildees de semi-
campo Em comparaccedilatildeo com as curvas de sobrevivecircncia da linhagem Rockfeller
(Figura 10) natildeo houve grandes diferenccedilas embora a mortalidade da linhagem de
campo foi mas acentuada do que a de Rockfeller com 20 gratildeos de arroz
Testamos tambeacutem a persistecircncia dos coniacutedios aplicados em gratildeos de arroz
em condiccedilotildees de semi-campo numa forma similar ao experimento feito em
laboratoacuterio adicionando o fungo na aacutegua primeiro e posteriormente colocando as
larvas (Figura 10) No controle ldquopositivordquo (tempo zero) as larvas morreram
rapidamente entretanto as mortalidades registradas depois de 5 10 e 20 dias de
permanecircncia do fungo na aacutegua foram bastante reduzidas com sobrevivecircncia final
em torno de 50 Os resultados de 5 ou 10 dias de persistecircncia foram similares
Foi observado durante o experimento que a aacutegua nos baldes ficou turva
possivelmente devido de crescimento de bacteacuterias se nutrindo do arroz Portanto
a microbiota da aacutegua poderia ter inibido a accedilatildeo do fungo A possiacutevel ocorrecircncia de
competiccedilatildeo entre bacteacuterias e fungos entomopatogecircnicos tem sido relatada em
alguns trabalhos de controle microbiano de pragas mostrando a necessidade de
levar em consideraccedilatildeo essas interaccedilotildees (Meyling amp Eilenberg 2007)
Para verificar se a virulecircncia dos isolados ESALQ 818 e LPP 133 seriam
iguais para as trecircs fases do desenvolvimento larval de Ae aegypti dois
experimentos foram montadas em condiccedilotildees de laboratoacuterio inoculando larvas de
L1+L2 (instares difiacutecil de diferenciar e separar) L3 e L4 separadamente As
Figuras 11 e 12 mostram que natildeo houve diferenccedilas entre os dois fungos quanto agrave
sobrevivecircncia das trecircs fases larvais com 8 a 18 sobrevivecircncia e 10 a 13
sobrevivecircncia observada respectivamente Os valores de S50 para as trecircs fases
de desenvolvimento foram iguais (2 dias) usando os dois isolados
Haacute diferenccedilas na susceptibilidade ao fungo de diferentes fases de
desenvolvimento de insetos Tem sido relatado que as fases imaturas satildeo mais
susceptiacuteveis do que a fase de pupa e adulta entretanto tambeacutem existe diferenccedilas
entre os instares larvaisninfais sendo considerado normal que os primeiros
instares satildeo mais susceptiacuteveis (Alves 1998) Poreacutem a fase ninfal do percevejo do
gecircnero Blissus (Hemiptera Lygeidae) foi mais resistente agrave infecccedilatildeo de Beauveria
bassiana do que os adultos da mesma espeacutecie (Samuels amp Coracini 2004)
A infecccedilatildeo pelo fungo pode natildeo somente resultar em mortalidade das
larvas mas tambeacutem poderia ter um efeito na formaccedilatildeo das pupas (tempo de
formaccedilatildeo e nuacutemero formado) mortalidade das pupas e viabilidade das mesmas
ou seja o desenvolvimento normalemergecircncia de adultos A Tabela 7 e 8
demonstram esse efeito no desenvolvimento das pupas e adultos Exposiccedilatildeo ao
fungo ESALQ 818 nesse experimento causou 60 de mortalidade das larvas
Das larvas sobrevivendo o contato com o fungo todas formaram pupas
entretanto 20 dessas pupas natildeo desenvolveram em adultos ou seja as pupas
foram consideradas mortas pela infecccedilatildeo tardia do fungo ou por causas ligadas a
exposiccedilatildeo ao fungo Seguindo o ciclo de vida dos insetos os adultos emergindo
das pupas viaacuteveis (80) foram observados para sinais de infecccedilatildeo ou efeitos do
fungo na sobrevivecircncia deles Natildeo foi observado mortalidade dos adultos durante
um periacuteodo de 10 dias O mesmo experimento com o LPP 133 (Figura 15)
demonstrou resultados semelhantes ao experimento do ESALQ 818
Outros fatores como a capacidade reprodutiva e locomotora natildeo foram
observadas contudo os adultos se comportaram normalmente Esses resultados
satildeo importantes para a hipoacutetese de que o fungo inoculado na fase larval possa ter
efeitos ainda depois da metamorfose e processo de muda e a simples contagem
de mortalidade de larvas poderia subestimar o efeito total do fungo na populaccedilatildeo
de mosquitos
Um outro aspecto de efeitos no desenvolvimento das larvas causado pelo
fungo poderia ser no tempo que a larva leva para formar a pupa Mudanccedilas no
tempo de desenvolvimento larva-pupa podem ser causadas pela depleccedilatildeo de
nutrientes que acontece enquanto o fungo coloniza o hospedeiro ou por causa da
liberaccedilatildeo de toxinas na hemolinfa pelo fungo (Samuels et al 1988) Os dois
isolados foram utilizados para a avaliaccedilatildeo de tempo de desenvolvimento
Interessantemente as curvas dos nuacutemeros de pupas formadas mostraram que
as larvas expostas ao fungo produziram as primeiras pupas no mesmo dia do
grupo controle (dia 6) entretanto com o dobro da quantidade de pupas Essa
tendecircncia continuou ateacute o final do experimento A esperada inibiccedilatildeo do
desenvolvimento das larvas natildeo aconteceu Uma possiacutevel explicaccedilatildeo desse
fenocircmeno seria uma forma de defesa do inseto contra infecccedilatildeo em que um
desenvolvimento acelerada poderia resultar numa antecipada troca de cutiacutecula
durante a muda deixando a proacutexima fase larval livre do fungo
A seleccedilatildeo de isolados virulentos ao mosquito Ae aegypti visa o
desenvolvimento de um programa de controle bioloacutegico com um fungo de faacutecil
produccedilatildeo e com alta persistecircncia no ambiente Os isolados LPP133 e ESALQ 818
foram selecionados natildeo apenas por sua alta virulecircncia contra as larvas de Ae
aegypti mas tambeacutem devido a sua faacutecil produccedilatildeo in vitro e a alta concentraccedilatildeo de
coniacutedios quando cultivados em arroz Tambeacutem eacute importante selecionar um isolado
de fungo virulento para o estaacutegio de larva e adulto do mosquito contudo com
meacutetodos de controle diferentes para ambos os estaacutegios Neste caso o ESALQ 818
seria um forte candidato pois foi observada neste trabalho alta virulecircncia deste
isolado contra larvas e Paula et al (2008) demonstrou que este isolado eacute
altamente virulento contra os mosquitos fecircmeas de Ae aegypti
Os estudos da persistecircncia do fungo satildeo considerados importantes por
darem subsiacutedios para o desenvolvimento destes e de outros fungos para uso no
controle Integrado de Pragas Inyang et al (2000) estudaram a persistecircncia de M
anisopliae em formulaccedilotildees de aacutegua e de oacuteleo e concluiacuteram que o
desenvolvimento epizooacutetico induzido pelo fungo depende natildeo somente da
relaccedilatildeo entre a densidade da populaccedilatildeo do inseto alvo e da quantidade do
inoacuteculo mas tambeacutem do tipo de formulaccedilatildeo utilizada Ribeiro et al (1992)
observaram a viabilidade de coniacutedios de M anisopliae var anisopliae em folhas
de cana-de-accediluacutecar por 14 dias a 283ordmC e 65 de umidade
Nos testes feitos em laboratoacuterio o isolado ESALQ 818 suspenso em Tween
80 apresentou-se virulento contra larvas de Ae aegypti (linhagem Rockefeller) ateacute
5 dias depois de inoculados na aacutegua matando 50 das larvas O valor do S50 foi
de 6 dias O gratildeo de arroz com fungo aderido foi virulento agraves larvas 10 dias apoacutes
sua inoculaccedilatildeo em aacutegua O valor do S50 foi de 9 dias Resultados tais que
corroboraram para posteriores experimentos feitos em condiccedilotildees de semi-campo
larvas de Aedes aegypti onde 20 gratildeos de arroz com fungo inoculado em baldes
de 8 litros com aacutegua teve virulecircncia por 5 dias causando mais de 50 de
mortalidade Lingg amp Donaldson (1981) constatou que a sobrevivecircncia do fungo
em aacutegua depende primariamente da sua temperatura
Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogecircnico eacute um bom
candidato para ser usado em programas de controle do mosquito Ae aegypti
Futuros estudos pretendem melhorar teacutecnicas de aplicaccedilatildeo e aumentar a
eficiecircncia e a persistecircncia dos coniacutedios em condiccedilotildees de campo
7 ndash CONCLUSOtildeES
1 Dos isolados originalmente selecionados para experimentos visando o
controle de larvas de Aedes aegypti somente trecircs foram considerados
virulentos e subsequentemente a maior parte dos trabalhos foi conduzida
com o isolado ESALQ 818 (Metarhizium anisopliae)
2 Um dos isolados (LPP 133) com pouca virulecircncia originalmente foi usado
em experimentos de passagem sucessivas nas larvas e houve um
aumento significativo em sua virulecircncia
3 Isolados ESALQ 818 e LPP 133 foram virulentos contra larvas de Ae
aegypti oriundas da linhagem do laboratoacuterio (Rockfeller) e de larvas
oriundas de ovos coletados no campo
4 Em condiccedilotildees de laboratoacuterio os fungos persistentes causam mortalidade
mesmo depois de 10 dias de incubaccedilatildeo em aacutegua
5 O fungo continuou virulento usando-se agrave metodologia de aplicaccedilatildeo em
arroz
6 Os fungos natildeo somente causam mortalidade diretamente das larvas mas
tambeacutem satildeo capazes de interferir no desenvolvimento dos insetos
causando a morte de 20 das pupas e alternando o padratildeo de formaccedilatildeo
de pupas
7 Os fungos entomopatogecircnicos se mostraram viaacuteveis como ferramenta para
programas de manejo integrado de vetores
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- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
- 29
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- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval --------------------------
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- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo ------------------------------------
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- 32
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- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com Fungos em Arroz --
- 36
- 41 - Criaccedilatildeo das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
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- 42 ndash Bioensaio 1 Teste de Virulecircncia larval
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- Hospedeiro
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- B bassiana
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- Euschistus heros Fabr
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- B bassiana
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- Piezodorus guildinii
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- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
- M anisopliae
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- 43 ndash Preparo das Suspensotildees de Fungo para os Experimentos de Laboratoacuterio e de Semi-campo
- 45 ndash Bioensaio 3 Infecccedilatildeo das Larvas com coniacutedios aderidos ao Arroz
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