enzimas. enzimas as enzimas são proteínas globulares solúveis sintetizadas pelos organismos vivos...

ENZIMASENZIMAS

ENZIMAS

As enzimas são proteínas globulares solúveis sintetizadas pelos organismos vivos com a

finalidade específica de catalisar as reações bioquímicas, que, de outro modo, não ocorreriam

sob as condições fisiológicas habituais.

• Com exceção de moléculas de RNA com propriedades catalíticas chamadas de RIBOZIMASRIBOZIMAS, todas as Enzimasnzimas são PROTEÍNASPROTEÍNAS

Características das Enzimas

• Apresentam alto grau de especificidade;• São produtos naturais biológicos;• Reações seguras;• São altamente eficientes acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 +

rápida);• reduz a energia de ativação;• Não são tóxicas.

As enzimas...

• Aceleram reações químicas

Ex: Decomposição do H2O2

H2O2 H2O O2+Catalase

• Não são consumidas na reação

H2O2 H2O O2+Catalase

E E ++ SS EE ++ PP

• Atuam em pequenas concentrações

1 molécula de Catalase decompõe

5 000 000 de moléculas de H2O2

pH = 6,8 em 1 min

Número de renovação =Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.

• Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou Chave-Fechadura Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato.

• Koshland (1958): Encaixe InduzidoEncaixe Induzido,, enzima e o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.

NOMENCLATURA E NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃOCLASSIFICAÇÃO

• 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar.

• Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:

•1° dígito - classe

•2° dígito - subclasse

•3° dígito - sub-subclasse

•4° dígito - indica o substrato

FATORES QUE FATORES QUE INFLUENCIAM A INFLUENCIAM A

ATIVIDADE ATIVIDADE ENZIMÁTICAENZIMÁTICA

• pH;

• temperatura;

• concentração das enzimas;

• concentração dos substratos;

• presença de inibidores.

• ação do cofator

pHpH

• O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia.

• Enzimas grupos ionizáveis existem em diferentes estados de ionização.

TemperaturaTemperatura temperatura causa dois efeitos:

- a velocidade de reação aumenta;

- a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.

A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.

Concentração de EnzimasConcentração de Enzimas

• Desvios da linearidade ocorrem:• Presença de inibidores na solução de enzima;• Presença de substâncias tóxicas;• Presença de um ativador que dissocia a enzima;• Limitações impostas pelo método de análise.

• Recomenda-se:• Enzimas com alto grau de pureza;• Substratos puros;• Métodos de análise confiável.

Concentração de SubstratosConcentração de Substratos

• [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.

• Medir Vo = velocidade inicial da reação.

vo

[S]

Vmax

Presença de InibidoresPresença de Inibidores

• Inibidor é qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

INIBIDORES

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS

COFATORCOFATOR

• Moléculas pequenas

• Não proteicas

• Termo estáveis

• Derivadas de Vitamina B1 e B6, nucleotídeos

ATIVIDADE ATIVIDADE ENZIMÁTICAENZIMÁTICA

• As enzimas são medidas através de suas atividades catalíticas e seus resultados expressos em termos de quantidade de atividade presente em determinado volume ou massa da amostra

- Quantidade do produto formado - Quantidade do substrato consumido

Determinação da Atividade Enzimática

Determinação da Atividade Enzimática

• Comissão Enzimas da União Internacional de Bioquímica

- Unidade Internacional (UI) – é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato/min.

APLICAÇÕESAPLICAÇÕESDIAGNÓSTICASDIAGNÓSTICAS

Enzimologia Clínica

É a aplicação da ciência das enzimas ao diagnóstico e tratamento das doenças.

DISTRIBUIÇÃO DAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA DIAGNÓSTICAENZIMA FONTES PRINCIPAIS PRINCIPAIS APLICAÇÕES

CLÍNICAS

ALT Fígado, músculo esquelético, coração

Doença hepática parenquimatosa

ALDOLASE Músculo esquelético, coração Doenças musculares

AMILASE Glândulas salivares, pâncreas, ovários

Doenças pancreáticas

Fosfatase ácida Próstata, hemácias Carcinoma da próstata

AST Fígado, músculo esquelético, coração, rim, hemácias

Infarto do miocárdio, doença hepática parenquimatosa, doença muscular

Colinesterase Fígado Envenenamento por inseticida organofosforado, doenças hepáticas parenquimatosa

Creatino quinase Músculo esquelético, cérebro, coração, músculo liso

Infarto do miocárdio, doenças musculares

Fosfatase alcalina Fígado, osso, mucosa intestinal, placenta, rim

Doenças ósseas, doenças hepatobiliares

LD Coração,fígado,músculo esquelético, hemácias, plaquetas, linfonodos

Infarto do miocárdio, hemólise, doenças hepáticas parenquimatosa

Enzimas x Laboratório Clínico

• Aplicação diagnóstica

• Aplicação prognóstica

• Acompanhamento das diversas patologias

Métodos para Determinação das Atividades Enzimáticas

Métodos que analisam:

• Consumo de substrato

• Produto formado

• Variação de absorção da coenzima que participa da reação enzimática

Erros na Coleta da Amostra

• Uso de Anticoagulantes

• Hemólise

• Estase venosa

• Coagulação

• Lipemia

Erros na Conservação da Amostra

• Realizar o mais breve possível

• Conservar à 4°C

• Evitar congelamento da amostra

Determinação da Atividade Enzimática

Importante

• Estabilidade do reagentes

• Pipetagem

• Limpeza da vidraria

• Controle de qualidade das análises

Enzimas nas Doenças CardíacasAST – GOT - TGO ( Aspartato aminotransferase)• Encontrada em concentrações elevadas no

músculo cardíaco, fígado e músculos esqueléticos

• Em menor concentração nos rins e pâncreas• Aumenta em lesões do parênquima hepático• Eleva mais de 10 vezes na hepatite virótica aguda• Na cirrose alcoólica ativa se eleva

moderadamente

AST-GOT-TGO

• Catalisa especificamente a transferência do grupo amina do ácido aspártico para cetoglutarato

AST

L-Aspartato + cetoglutarato Oxalacetato + L-Glutamato MDH

Oxalacetato + NADH Malato + NAD

Aspartato Aminotransferase

AST – TGOValores elevados são encontrados:• Hepatite virótica crônica ativa • Mononucleose infecciosa• Hepatite aguda na fase de recuperação • Disfunção hepática induzida por drogas• Tumor hepático metastático• Obstrução extra hepática• Infarto do miocárdio

Aspartato AminotrasferaseAST –TGOFatores Interferentes:

• Exercícios• Anticoncepcionais orais• Anti-hipertensivos• Isoniazida• Agentes colinérgicos• Drogas hepatotóxicas

Enzimas nas Doenças Cardíacas

Creatinoquinase (CK- CPK)

• pH ótimo: 6,8 no sentido da formação de ATP e 9,0 no sentido da fosforilação da creatina

• Encontrada no músculo cardíaco, na musculatura esquelética e no cérebro

• Aumentos podem ocorrer numa faixa de 60 a 100% com infarto agudo do miocárdio

Creatinoquinase (CK- CPK)

Valores elevados são encontrados:• Infarto agudo do miocárdio• Miosites• Distrofia muscular• Exercício intenso• Doença vascular cerebral• Convulsões• Alcoolismo crônico

Diagnóstico do Infarto do MiocárdioIsoenzimas de Creatinoquinase (CK) • CK-BB (CK1)

• CK-MB (CK2)

• CK-MM (CK3)

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-BB (CK1)

• Encontrada no cérebro e pulmão

• Eleva-se após embolia pulmonar, carcinoma de próstata e de pulmão

• Não é comum a elevação em distúrbios cerebrais

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-MB(CK2)

• Fração híbrida de cadeias M e B• Encontrada predominantemente no músculo cardíaco• Determinação bastante específica para diagnóstico de infarto agudo do

miocárdio• Aumenta de 3 a 6 horas após a ocorrência do infarto com valor máximo

em 12-24 horas• Retorna ao normal em 24-48 horas

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK) CK-MM(CK3)

• Compreende + de 95% da CK dos músculos esqueléticos• Cerca de 70-75% da enzima do miocárdio

Níveis elevados:

• Lesão, hipóxia do músculo esquelético (exercício intenso, traumatismo, inflamação)

Isoenzimas de Creatinoquinase (CK)

Drogas que causam aumento no soro:

• Ampicilina• Anfotericina B• Alguns anestésicos • Lítio• Lidocaína

Desidrogenase Láctica LDH – LD - DHL• pH ótimo: 8,8 a 9,8 no sentido da formação de

ácido pirúvico e 7,4 a 7,8 no sentido da formação de ácido láctico

• Encontrada no coração, hemácias, músculo esquelético, rim, cérebro, pulmões e tecido linfóide

• Não é indicador específico de doença hepática e cardíaca

Desidrogenase Láctica

Valores elevados LD total:• Anemia megaloblástica• Carcinoma• Infarto do miocárdio e pulmonar, cirrose• Leucemia• Hepatite aguda• Icterícias obstrutivas• Doenças do parênquima renal

Importância• Cerca de 50% óbitos no mundo• 1/3 faixa etária de 35 a 65 anos• Prevalência nos países industrializados• Evolução diagnóstica com marcadores mais

sensíveis e específicos• Compreender a “Janela Diagnóstica”

Infarto Agudo do Miocárdio

Isoenzimas de LD

• LD1: coração, hemácias e rins• LD2: coração e sistema retículo endotelial• LD3: pulmão e outros tecidos• LD4: placenta e pâncreas• LD5: fígado e músculos esqueléticos

Desidrogenase Láctica

Aplicação Clínica do Fracionamento da LD

Doenças ↑ acentuado ↑ moderado ↑ leve

Infarto A. Miocárdio LD1 LD2Doenças Hepáticas LD5 LD4SNC LD2 e LD3Doenças Malígnas LD2, LD3 e LD4Distrofia Muscular LD1, LD2 e LD3Anemia Megaloblástica LD1Anemia Aplástica LD1,2,3,4e5

Fatores Interferentes

• Hemólise• Álcool, anestésicos, aspirina ↑ • Ácido ascórbico ↓

Desidrogenase Láctica

• AST – década de 50 (substituído por CK)

• LD – década de 70 (mais sensível que AST), porém com janela diagnóstica tardia

• CK-MB com CK total mais indicada

• CK total aumenta de 65 a 100% no IAM

• Troponina

Marcadores Clássicos

• São proteínas estruturais envolvidas no processo de contração das fibras musculares esqueléticas e cardíacas.

• O complexo troponina é composto por três proteínas:troponina T, troponinaI e troponina C

• As troponinas T (cTnT) e I (cTnI) são marcadores bioquímicos mais específicos e sensíveis para o diagnóstico de lesão isquêmica do miocárdio.

Troponina

• Elevação dos níveis de cTnI no soro ocorre entre 4 e 6 horas após início da dor precordial

• Atinge um pico em 12 horas e permanece elevada por 3 a 10 dias após um evento isquêmico único

• A isoenzima CK-MB só se eleva após lesão isquêmica irreversível

• As troponinas são liberadas mesmo em situação de isquemia reversível

Troponina

• A mioglobina é uma proteína constituinte das células dos músculos esquelético e cardíaco.

• Proteína liberada para a circulação precocemente após lesão isquêmica da fibra miocárdica.

• Concentrações elevadas são observadas 1 a 2 horas após o início da dor, atingindo o pico em 12 horas e, em geral, normalizando 24 horas após um episódio único.

Mioglobina

• Elevação de mioglobina circulante não é específica de lesão cardíaca, ocorrendo no trauma da musculatura esquelética e na insuficiência renal.

Mioglobina

Importância da coleta seriada de amostras

• Devem ser coletadas amostras seriadas, em geral, na admissão, 3, 6 e 9 horas.

• Dosagens seriadas de cTnI, resultados do eletrocardiograma e a condição clínica são necessários para o diagnóstico diferencial entre infarto agudo do miocárdio e outras doenças cardíacas.

• NACB - National Academy of Clinical Biochemistry propõe o uso de dois marcadores para o diagnóstico de infarto agudo do miocárdio: a mioglobina, como marcador precoce e uma das troponinas (cTnT ou cTnI) como definitivo.

Características da dinâmica de elevação, pico e retorno aos níveis basais dos marcadores cardíacos.

MarcadorTempo de

alteração inicial Tempo de pico de

elevação Tempo de retorno

ao normalCK-MB 4-8 horas 12-24 horas 72-96 horas

Mioglobina 2-4 horas 8-10 horas 24 horascTnI 4-6 horas 12 horas 3-10 diascTnT 4-6 horas 12-48 horas 7-10 dias

CK-MB = isoenzima MB da creatina quinase; cTnI = troponina cardíaca I; cTnT = troponina cardíaca T

Sensibilidade clínica estimada dos marcadores de isquemia miocárdica, levando-se em conta o tempo após o início da dor precordial.

Marcador 2 a 8* 8 a 24* 24 a 72*acima de

72*Mioglobina 95% 75% 0% 0%

CK-MB 60% 95% 98% 50%LD1 40% 85% 95% 90%

Troponina (T ou I) 75% 95% 98% 98%

Enzimas de maior utilidade Diagnóstica

Creatino Quinase – CK

Doenças do músculo esqueléticoDistrofia muscular progressivaDoenças musculares neurogênicas

• Doenças do coração Infarto miocárdioOutras doenças cardíacas

• Troponina• Mioglobina