dissertação final da mestranda verbena carvalho alves
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO – MEC UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO – PRPPG CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO – PPGAN
VERBENA CARVALHO ALVES
ASPECTOS MICOLÓGICOS E MICOTOXICOLÓGICOS DE PÃES TIPO HOT-DOG
INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO
Teresina
2014
VERBENA CARVALHO ALVES
ASPECTOS MICOLÓGICOS E MICOTOXICOLÓGICOS DE PÃES TIPO HOT-DOG
INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição
da Universidade Federal do Piauí, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área: Qualidade de Alimentos.
Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches
Muratori.
Teresina
2014
VERBENA CARVALHO ALVES
ASPECTOS MICOLÓGICOS E MICOTOXICOLÓGICOS DE PÃES TIPO HOT-DOG
INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição
do da Universidade Federal do Piauí,
como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre em Alimentos e Nutrição.
Área: Qualidade de Alimentos.
Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches
Muratori.
Aprovada em:____/____/____
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________________________
Orientadora/Presidente: Profª. Drª. Maria Christina Sanches Muratori – UFPI
___________________________________________________________________
1º Examinador: Prof. Dr. Luiz Antonio Moura Keller – UFF
___________________________________________________________________
2º Examinador: Prof. Dr. Rodrigo Maciel Calvet – IFMA
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por cada momento vivido, pelas oportunidades
proporcionadas, pela proteção, amparo e força para vencer cada etapa e as
adversidades da vida.
Aos meus pais, Raimundo Nonato e Maria de Jesus, pelo amor incondicional
e por todo o apoio e educação que me proporcionaram.
Às minhas irmãs, Valéria e Viviane e a todos os meus familiares pelo carinho
e por sempre torcerem pelo meu sucesso e felicidade.
Ao Fábio, meu namorado, obrigada por seu amor, carinho, paciência e
pensamentos positivos.
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Maria Christina Sanches Muratori, pela
grande oportunidade, pelos ensinamentos, amizade e confiança na minha
capacidade de conduzir este estudo.
Aos professores Dr. João Batista e Drª. Maria Marlúcia Gomes Pereira,
membros da banca examinadora da qualificação do projeto, obrigada pelas
preciosas contribuições oferecidas.
Aos professores Dr. Luiz Antônio Moura Keller, Dr. Rodrigo Maciel Calvet,
agradeço pela solicitude em fazerem parte da minha banca examinadora, além das
valiosas sugestões apresentadas.
À Profª. Drª. Waleska Albuquerque por ter contribuído com a realização
desta pesquisa ao ceder gentilmente o laboratório de para execução das análises.
Aos amigos conquistados ao longo do curso de Pós-Graduação, em especial
aos “amadinhos”: Aline Dourado, Carla Cristina, Thiago Hipólito, Marília Marques,
Cecília Muniz e Rocilda, por todo o período em que convivemos juntos, dividindo
momentos de angústias, de alegrias, mas principalmente de muita descontração!
Às minhas eternas companheiras de laboratório e da vida: Raizza Escórcio,
Josyanne Araújo, Cristiane Evangelista, Julliet Teixeira, Juliana Abreu. Agradeço
imensamente pelo apoio na realização das coletas e das análises laboratoriais desta
pesquisa e principalmente pela amizade, companheirismo e por todos os momentos
de alegrias que passamos juntas. Tenho vocês no meu coração pra vida toda!
À Universidade Federal do Piauí, por meio do Programa de Pós-Graduação
de Mestrado em Alimentos e Nutrição, pelo apoio necessário à realização do curso
em particular à Coordenação do Programa de Pós-Graduação de Mestrado
Alimentos e Nutrição pelo competente trabalho que exercem, fornecendo subsídios
necessários para a conclusão do curso.
Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição,
pelo conhecimento transmitido.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela bolsa de estudos concedida.
Aos funcionários do Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento dos
Alimentos (NUEPPA) que de forma direta ou indireta colaboraram na condução da
pesquisa.
Aos proprietários e funcionários das panificadoras onde foram realizadas as
coletas amostrais pela contribuição para que o trabalho fosse concretizado.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho!
“
“É muito melhor lançar-se em
busca de conquistas
grandiosas, mesmo expondo-
se ao fracasso, do que
alinhar-se com os pobres de
espírito, que nem gozam
muito nem sofrem muito,
porque vivem numa
penumbra cinzenta, onde não
conhecem nem vitória, nem
derrota.”
(Theodore Roosevelt)
RESUMO
O pão está presente na vida do homem desde os seus primórdios. De uma
forma geral, tem presença expressiva na mesa dos brasileiros, até mesmo como
refeição principal. Muitos ingredientes usados no preparo de pães oferecem riscos
de contaminação por fungos. Dentre eles, a farinha pode disseminar conídios
fúngicos no ambiente industrial, que em condições ideais de umidade e temperatura,
podem produzir micotoxinas com propriedades imunossupressoras, alergênicas,
teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas. Os principais gêneros contaminantes
de alimentos produtores de micotoxinas são: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. O
estudo objetivou verificar os aspectos micológicos e micotoxicológicos de pães tipo
hot-dog influenciados pela qualidade da farinha de trigo. Semanalmente, foram
efetuadas coletas de farinha de trigo e pães do tipo hot-dog (elaborados com a
mesma farinha de trigo que foi amostrada) em duas panificadoras de Teresina, PI.
Este procedimento foi repetido por 15 semanas em cada estabelecimento
pesquisado, com 30 amostras de farinha e 30 de pães, totalizando 60 unidades
experimentais. As variáveis avaliadas foram: umidade relativa do ar (URA);
temperatura ambiental; atividade de água (aw); contagem de fungos filamentosos e
leveduras; isolamento e identificação de gêneros micotoxigênicos; perfil toxígeno de
espécies fúngicas por cromatografia de camada delgada (CCD); e detecção de
aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE). As contagens de fungos filamentosos e leveduras das amostras
de farinha de trigo e de pães tipo hot-dog da panificadora “A” foram semelhantes
(P>0,05), entretanto, na panificadora “B” a contaminação fúngica dos pães foi maior
que a da farinha de trigo. Das amostras analisadas, foram isoladas 66 cepas de
fungos filamentosos pertencentes a oito gêneros e, pode-se constatar que a
variedade de fungos foi maior na farinha de trigo do que nos pães. Não foram
detectadas cepas de Aspergillus das seções Flavi e Nigri com potencial capacidade
para produção de AFB1 e OTA. Das 60 amostras analisadas de pão tipo hot-dog e
farinha de trigo não foi detectada AFB1 e OTA. Concluiu-se que a qualidade da
farinha de trigo influencia os aspectos micológicos e micotoxicológicos dos pães
produzidos e que os produtos são seguros para o consumo por não apresentarem
AFB1 e OTA.
Palavras-chaves: Panificação. Fungos. Aflatoxina B1. Ocratoxina A. CLAE.
ABSTRACT
The bread has been present in the life of men since its beginnings. In a
general manner, it has an expressive presence in tables of Brazilians, even as a
main meal. Many ingredients used to prepare breads offer contamination risks by
fungi. Among them, the flour can disseminate fungal conidia in the industrial
environment. In ideal conditions of humidity and temperature, it can produce
mycotoxins with immunosuppressant, allergenic, teratogenic, mutagenic and
carcinogenic proprieties. The main genus contaminants of food which produce
mycotoxins are: Aspergillus, Penicillium and Fusarium. The purpose of this study was
to verify mycological and mycotoxicological aspects of hot dog breads influenced by
wheat flour quality. Collection of wheat flour and hot dog breads (made with the same
wheat flour samples) at two bakeries in Teresina, PI was made weekly. This
procedure was repeated during 15 weeks in each establishment researched, with 30
samples of flour and 30 breads, in a total of 60 experimental units. The variables
evaluated were: ambient temperature, air relative humidity (RH), water activity (aw);
filamentous fungi and yeasts plate counts; isolation and identification of
mycotoxigenic genres; toxigenic profile of fungal species by thin layer
chromatography (TLC), and detection of aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA)
by high performance liquid chromatography (HPLC). Cell count of filamentous fungi
and yeast from the wheat flour and hot dog breads from bakery “A” were similar
(P>0,05).However, at bakery “B” the fungal contamination of breads was higher than
of wheat flour. From the analyzed samples, 66 strains of filamentous fungi were
isolated belonging to eight genus. It was observed that the variety of fungi was higher
in the wheat flour than in breads. There was no detection of strains of
Aspergillusfrom the Flavi and Nigrisections with potential capacity for production of
AFB1 and OTA. From the 60 samples analyzed from the hot dog breads and wheat
flour AFB1 and OTA were not detected. In conclusion, the quality of wheat flour
influences mycological and mycotoxicological aspects of breads produced and that
the other products are safe for consumption, as they do not present AFB1 and OTA.
Keywords: Bakery. Fungi. Aflatoxin B1. Ochratoxin A. HPLC.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Estruturas químicas das principais
aflatoxinas.....................................................................................
27
Figura 2 Estrutura química da ocratoxina
A....................................................................................................
29
Figura 3 Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero
Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições
de temperaturas (25 e 37 °C)........................................................
34
Figura 4 Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero
Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N
em três regimes de temperatura (5, 25 e 37°C)............................
35
Figura 5 Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos
diferentes meios de cultivo até sua identificação final...................
36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Principais espécies fúngicas toxigênicas e micotoxinas de
importância mundial...................................................................... 25
Tabela 2 Classificação das micotoxinas em grupos conforme a potencial
carcinogênico em seres humanos................................................ 26
Tabela 3 Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pães
tipo hot-dog produzidos em duas panificadoras de Teresina,
PI...................................................................................................
40
Tabela 4 Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha
de trigo e pão tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de
Teresina, PI...................................................................................
41
Tabela 5 Ocorrência (%) de fungos filamentosos isolados em amostras
de farinha de trigo e pão tipo hot-dog adquiridas em
panificadoras de Teresina, PI........................................................
42
Tabela 6 Densidade relativa das espécies de Aspergillus, Penicillium
e Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães
tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina,
PI............................................................................................. 44
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a.C Antes de Cristo
aw Atividade de Água
ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria
AF Aflatoxinas
AFB1 Aflatoxina B1
AOAC Association of Analytical Communities
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BDA Agar Batata Dextrose
BLA Agar Folhas de Bananeira
CCD Cromatografia de Camada Delgada
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CL-EM Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
CV Coeficiente de variação
CO2 Gás carbônico
CY20S Extrato de Levedura Czapek 20% Sacarose
CYA Agar Extrato de Levedura Czapek
DON Deoxinivalenol
DRBC Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FIB Food Ingredients Brasil
g Grama
G25N Ágar Glicerol Nitrato 25%
IARC Agência Internacional Para Pesquisa Sobre o Câncer
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
kg Quilograma
LMT Llimites Máximos Tolerados
LOD Limite de detecção
MEA Ágar Extrato de Malte
mg Miligrama
mL Mililitro
ng Nanograma
nm Nanômetro
NUEPPA Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos
OPAS Organización Panamericana de la Salud
OTA Ocratoxina A
OTB Ocratoxina B
OTC Ocratoxina C
RDC Resolução de Diretoria Colegiada
SENAI Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial
SNA Agar Spezieller Nalvistoffarmer
T2 Toxina T-2
UFC Unidade Formadora de Colônia
UFPI Universidade Federal do Piauí
URA Umidade Relativa do Ar
UV Ultravioleta
ZEA Zearalenona
μL Microlitros
% Percentual
°C Grau Celcius
λ Comprimento de onda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 14
2 OBJETIVOS......................................................................................................
16
2.1 Objetivo Geral................................................................................................
2.2 Objetivos Específicos.....................................................................................
16
3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 17
3.1 Pão................................................................................................................. 17
3.1.1 Histórico do pão.......................................................................................... 17
3.1.2 Consumo de pães no Brasil........................................................................ 18
3.1.3 Tipos de pães.............................................................................................. 19
3.1.4 Ingredientes da panificação........................................................................ 19
3.1.4.1 Ingredientes essenciais............................................................................ 20
3.1.4.2 Ingredientes não essenciais..................................................................... 21
3.1.5 Interferência do trigo na micobiota dos pães............................................. 22
3.2 Fungos e micotoxinas.................................................................................... 23
3.2.1 Aflatoxinas................................................................................................... 26
3.2.2 Ocratoxinas................................................................................................. 28
3.3 Análise de micotoxinas em alimentos............................................................ 29
3.4 Legislação para micotoxinas.......................................................................... 31
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 32
4.1 Coleta das amostras...................................................................................... 32
4.2 Temperatura ambiental e umidade relativa do ar (URA)................................ 32
4.3 Análise da atividade de água (aw)................................................................. 32
4.4 Contagem de fungos filamentosos e leveduras............................................. 33
4.5 Isolamento e identificação fúngica................................................................. 33
4.6 Detecção e quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) ......................................................................................... 36
4.6.1 Extração e purificação dos extratos............................................................ 36
4.6.2 Condições cromatográficas para determinação e quantificação de 37
AFB1....................................................................................................................
4.6.3 Condições cromatográficas para determinação e quantificação de
OTA.................................................................................................................... 38
4.7 Análise Estatística.......................................................................................... 38
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 39
6 CONCLUSÃO................................................................................................... 46
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 47
14
I INTRODUÇÃO
O pão (do latim “panis”) está presente na vida do homem desde os seus
primórdios, é um produto bastante consumido, especialmente pelas populações
ocidentais. Basicamente, é resultado do cozimento da massa feita com farinha de
trigo, água, fermento e sal.
Ao longo do tempo, o preparo de pães foi aperfeiçoado, ganhando novas
formulações, formas e processos, com acréscimo de ingredientes que melhoraram
as características da massa e a qualidade do produto final. Para estas finalidades,
podem ser acrescentados os seguintes ingredientes: gorduras vegetais, açúcares,
ovos, emulsificantes, agentes oxidantes, enzimas, frutas, doces e especiarias
conforme a criatividade do panificador. Deste modo, os pães são muito apreciados
devido à sua aparência, aroma, sabor, preço e disponibilidade, considerando-se os
hábitos alimentares observados entre as diferentes culturas e religiões.
Por ser rico em carboidratos, esse alimento serve como fonte de energia,
sendo consumido por quase todas as classes sociais, desde complemento alimentar
nas populações com maior poder aquisitivo até como única fonte de alimento, nas
famílias de menor renda. De uma forma geral, tem presença expressiva na mesa
dos brasileiros no café da manhã, sendo também muito consumido em lanches ou
até mesmo como refeição principal.
A maior parcela de produção e venda dos pães concentra-se em padarias ou
panificadoras. Essas empresas fazem parte da história e cultura da humanidade e
difundiram-se no Brasil a partir da colonização, quando portugueses e espanhóis
trouxeram hábitos alimentares da Europa. De um modo geral, as padarias
caracterizam-se por serem empreendimentos de pequeno porte com sistemas de
produção artesanais, o que pode favorecer a contaminação dos produtos no
ambiente de processamento.
Muitos ingredientes usados no preparo de pães conferem riscos de
contaminação por fungos filamentosos nos produtos de panificação. Dentre eles, a
farinha pode estar disseminando conídios fúngicos no ambiente industrial. A
princípio o processo de cocção dos pães seria suficiente para eliminar os micro-
organismos presentes na massa, entretanto, pode-se observar que certos pães
apresentam desenvolvimento de fungos após estocagem prolongada. Em grande
parte a contaminação posterior ao cozimento pode ocorrer pela exposição indevida
15
às condições ambientais da panificadora durante o resfriamento, fatiamento e
embalagem, sendo este o principal ponto crítico de contaminação do produto, porém
os conídios fúngicos podem resistir à temperatura de cocção e nas condições
adequadas se desenvolverem. Assim, os fungos quando se desenvolvem nos pães
causam alterações sensoriais e prejuízos pelo consumo de nutrientes essenciais.
Convém ressaltar que os efeitos deletérios da elevada população fúngica
encontrada no interior das padarias não se restringem apenas à deterioração de
seus produtos, mas também à saúde dos trabalhadores do estabelecimento, pelo
desenvolvimento de afecções bronco pulmonares de risco alérgico e infeccioso, pela
exposição à poeira da farinha. Ademais, quando os fungos micotoxígenos presentes
em alimentos encontram condições ideais de umidade e temperatura, podem
produzir micotoxinas que têm propriedades imunossupressoras, alergênicas,
teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas.
Deste modo, o controle de fungos e seus metabólitos tóxicos deve ser
realizado eficazmente desde a farinha até a expedição dos pães, visto que a maioria
das micotoxinas são compostos termorresistentes, podendo permanecer ativas
mesmo após a cocção, expondo os consumidores a enfermidades quando ingerem
esse alimento.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Verificar os aspectos micológicos e micotoxicológicos de pães tipo hot-dog
influenciados pela qualidade da farinha de trigo.
2.2 Objetivos Específicos
Efetuar a contagem dos fungos filamentosos e leveduras presentes em
farinhas de trigo e pães tipo hot-dog;
Isolar e identificar espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e
Fusarium presentes em farinhas de trigo e pães tipo hot-dog;
Caracterizar o perfil toxígeno das espécies fúngicas isoladas;
Detectar e quantificar aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) em
farinhas de trigo e pães tipo hot-dog.
17
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Pão
A Resolução RDC nº 263, de 23 de setembro de 2005 da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária define o pão como: “o produto obtido da farinha de trigo e/ou
outras farinhas, adicionados de líquido, resultantes do processo de fermentação ou
não e cocção, podendo conter outros ingredientes, desde que não descaracterizem
os produtos. Podem apresentar cobertura, recheio, formato e textura diversos”
(BRASIL, 2005a). A Resolução determina ainda que “os produtos também possam
ser designados por denominações consagradas pelo uso”, deste modo, o pão tipo
hot-dog no Brasil também é denominado como: “pão doce comum”, “pão careca” ou
“pão para lanches” e no Piauí é conhecido como “pão massa fina”.
3.1.1 Histórico do pão
A história do pão, praticamente acompanhou a evolução do homem, pois
desde que deixou de ser nômade o pão passou a ser um de seus principais víveres
e foi o primeiro alimento processado por mãos humanas a partir de matéria-prima
natural. Estima-se que o pão tenha surgido na pré-história há cerca de 10.000 anos
a.C e que a princípio fosse uma simples mistura de grãos e água que era cozida em
pedras quentes. Como na época não havia fermento para fazê-la crescer e melhorar
suas características sensoriais, os pães eram achatados, com consistência dura por
fora e macia por dentro (SENAI, 2008).
Cerca de 6.000 anos a.C, os egípcios descobriram acidentalmente o
processo da fermentação, a qual tornava o pão mais semelhante ao consumido
atualmente. Presume-se que um pedaço de massa contendo farinha e água tenha
sido exposta ocasionalmente ao ambiente e tenha sido fermentado por bactérias
oportunistas, acarretando incremento do volume da massa, tornando o pão mais
macio (CANELLA-RAWALS, 2005).
Por volta de 250 a.C, as trocas comerciais beneficiaram a chegada do pão à
Europa, e na mesma época surgiam às primeiras padarias como estabelecimentos
comerciais na Grécia. No século II d. C., o pão transformou-se em um dos principais
alimentos da Roma Antiga. Após este período, a indústria de “padarias públicas”
18
progrediu e o hábito de consumir pães se amplificou pela maior parte da Europa
(BAUMGARTEN, 2007).
Na Idade Média, com a queda do Império Romano, as padarias públicas
fecharam e a produção de pães voltou a ser caseira. Assim, as pessoas voltaram a
consumir pão sem fermento. No século XII, as atividades foram retomadas na
França, e no século XVII o país se destacou mundialmente na fabricação de pães, a
partir do aprimoramento das técnicas e receitas de panificação (BAUMGARTEN,
2007). A técnica de fermentação biológica foi utilizada exclusivamente na fabricação
de pães até o século XIX, posteriormente foram também utilizados fermentos
químicos para preparação de produtos de panificação.
No Brasil o consumo de pães ocorreu desde o início da colonização no
século XVI, devido aos hábitos alimentares dos portugueses. Todavia, foi apenas no
século XX que os imigrantes italianos se encarregaram de expandir a panificação no
território nacional (QUEIROZ; LOPES, 2007), especialmente em São Paulo.
No Brasil e em outras partes do mundo, a produção de trigo se expandiu
juntamente com a urbanização e na década de 1950, houve um grande impulso à
indústria de derivados do trigo, fortalecendo ainda mais o hábito de consumo de
pães. A partir da década de 1990 as padarias se modernizaram e muitas delas estão
em estágio de transição, procurando se adaptar à nova realidade do consumo
variado de produtos panificados (SENAI, 2008).
Em 2012, a panificação brasileira foi um dos setores mais crescentes da
economia, permanecendo entre os seis maiores segmentos industriais do Brasil.
Sua participação no setor industrial de produtos alimentícios foi de 36,2%, e na
indústria de transformação 7,0%. Incorporam em torno de 63 mil panificadoras em
todo o país que atendem em média 44 milhões de pessoas por dia. Além disso, em
2012 os negócios neste setor geraram 802 mil empregos diretos e 1,85 milhões de
empregos indiretos (ABIP, 2012).
3.1.2 Consumo de pães no Brasil
O consumo brasileiro de pães estimado de 2008 a 2009 foi de 53,4
kg.habitante-1.ano-1, (IBGE, 2011). Rotineiramente os brasileiros consomem: pão
doce, pão de hot-dog, pão de leite, pão de hambúrguer, pão sovado e bisnaguinhas.
A preferência por estes pães é devida a maciez e facilidade de mastigação,
19
associado ao uso de recheios cremosos como: manteiga, requeijão, maionese,
margarinas, patês, geléias e outros (ESTELLER et al., 2004).
Os pães são bem aceitos por pessoas de qualquer faixa etária e diferentes
classes sociais, são nutritivos (CATANHO; MACIEL, 2005), principalmente pelos
carboidratos, além disso, fornecem lipídeos, proteínas, minerais e vitaminas: B1, B2,
C, E, D, A e K (GUTKOSKI et al., 2007).
3.1.3 Tipos de pães
Devido à ampla variedade de hábitos culturais e alimentares, foram
desenvolvidas preparações e apresentações diversificadas de pães, criando uma
diversidade de massas, receitas e formulações, que foram classificadas por Costa
(2009) em quatro grupos principais de massa:
Salgada ou de sal: É a massa utilizada no preparo de: pão francês,
italiano, bisnagas e baguetes. São crocantes, possuem volume extenso e miolo
macio. Pode ainda receber temperos diversos no interior da massa ou apenas na
superfície.
Doce: é a massa usada no preparo de pão doce, pão de leite, tipo hot-
dog e tipo hambúrguer. Possui casca fina e marrom, miolo macio e denso, com
sabor levemente adocicado e aroma característico.
Massa para confeitar: É a massa típica das roscas, panetones e
chineques, que podem incorporar frutas em seu interior ou superfície e apresentar
coberturas de sabores variados.
Massa especial: É a massa das broas e dos pães de forma. São
confeccionados em assadeiras especiais e exigem grande mão de obra. Pode ser
preparada com diversos tipos de farinha ou produtos similares, apresentando como
aspectos principais as dimensões e o formato, crosta levemente crocante e miolo
bem firme.
3.1.4 Ingredientes da panificação
Os produtos obtidos da panificação são compostos por ingredientes
diversificados, que exercem funções distintas no processo de formação da massa.
Esses constituintes estão distribuídos em diferentes proporções de acordo com o
20
tipo de pão que está sendo produzido ou da finalidade da formulação da massa. De
um modo geral, para fabricação de pães, os ingredientes podem ser divididos em
dois grupos: os essenciais: farinha de trigo; água; fermento e sal e os não
essenciais: açúcar; gordura; leite; ovos; dentre outros (WALLY, 2007).
3.1.4.1 Ingredientes essenciais
A farinha de trigo é amplamente utilizada para elaboração de diversos
alimentos, tais como: pães, biscoitos, bolos e massas em geral, sendo definida
como: “produto elaborado com grãos de trigo (Triticum aestivum L.) ou outras
espécies de trigo do gênero Triticum, ou combinações por meio de trituração ou
moagem e outras tecnologias ou processos” (BRASIL, 2005b).
No Brasil, o consumo da farinha de trigo distribui-se entre panificação (55%),
consumo doméstico (11%), indústria de massas (17%), indústria de biscoitos
(13,0%), e outros segmentos (4,0%) (COSTA, 2009). São disponibilizadas para
consumo em diversos tipos de apresentações: farinhas refinadas brancas e
amarelas (especiais), farinhas integrais (grossa e fina), farelo, fibra, gérmen, flocos,
grão inteiro, triguilho (grão triturado). A legislação brasileira classifica a farinha de
trigo em: “Tipos 1, Tipo 2 e Integral”, conforme a granulometria e os teores de: cinza,
proteína e umidade (BRASIL, 2005b).
A qualidade da farinha de trigo depende das seguintes características do
grão: composição centesimal, propriedades estruturais e microbiota (MOUSIA et al.,
2004). De um modo geral, a farinha é composta por: carboidrato (70,0 a 75,0%),
água (12,0 a 14,0%), proteínas (8,0 a 16,0%), lipídeos (2,0%), cinzas (1,0%) e
outros constituintes menores como polissacarídeos não amiláceos (2,0 a 3,0%).
Essa composição pode variar de acordo com a cultivar e grau de extração do grão
de trigo (MATUDA, 2008).
O principal carboidrato presente na farinha de trigo é o amido, constituído de
76% de amilopectina e 24% de amilose. O amido é importante para formação do
miolo dos pães e apresenta-se em forma de grânulos, sendo seu tamanho e formato
característicos da origem botânica. Sob a ação da amilase são formados açúcares
que servem de substrato para as leveduras durante o processo de fermentação
(AQUINO, 2012).
As proteínas da farinha de trigo têm papel fundamental à formação da massa
21
do pão, sendo a maior porcentagem destas compostas pelo glúten (MATUDA, 2008)
que é formado quando as proteínas da farinha entram em contato com a água. O
glúten confere viscoelasticidade da massa, ajuda na formação da estrutura do miolo
(GALLAGHER et al., 2004) e favorece a retenção do gás que aumenta o volume da
massa (DEMIRKESEN et al., 2010). Essas proteínas podem ser classificadas como
solúveis e insolúveis. As primeiras, albumina e globulina, representam 15% do total e
não formam o glúten; e as segundas, gliadina e gluteína, que constituem 85% das
proteínas conferem as propriedades de panificação da farinha. A glutenina é
responsável pela coesão e elasticidade da massa e a gliadina pela extensibilidade e
viscosidade (ESTELLER, 2004; MATUDA, 2008).
Para formação da massa dos produtos de panificação é imprescindível a
utilização de água, visando hidratar as proteínas da farinha de trigo para a formação
da rede de glúten. Este ingrediente favorece a homogeneização dos componentes
da massa, permitindo que durante o processo de cocção, ocorra a gelatinização do
amido e consequente aumento do volume do pão (LÉON; ROSELL, 2007).
O fermento biológico a base da levedura Saccharomices cerevisiae é o mais
utilizado em panificação para produzir gás carbônico (CO2) a partir da conversão de
açúcares, acarretando o incremento da massa. Além de produzir CO2, o fermento
também exerce influência sobre as propriedades reológicas da massa, tornando-a
mais elástica e porosa, permitindo maior incorporação de nutrientes após o
cozimento. Outro ingrediente importante é o sal que contribui para acentuar o sabor
melhorar a aparência do pão, aumentar a estabilidade da rede de glúten, controlar a
atividade de água (aw) da massa e conservar o produto final por sua ação
bactericida (FIB, 2009).
3.1.4.2 Ingredientes não essenciais
A adição de açúcar na massa favorece a retenção da umidade, facilita a
adaptação das leveduras ao processo de fermentação; acentua o sabor e o aroma e
desenvolve coloração característica à crosta. Geralmente é empregada a sacarose,
podendo também ser usado xarope de milho ou açúcar invertido (GUERREIRO,
2006).
Geralmente, as gorduras hidrogenadas têm sido mais utilizadas para o
preparo da massa de pães, pois são manuseadas com facilidade, são mais estáveis
22
e conferem melhores características tecnológicas para os produtos de panificação
(PEREIRA, et al., 2004). As gorduras atuam como lubrificante da massa, conferindo
maciez e umidade ao pão. Contribuem para realçar características sensoriais: sabor,
cor e textura, além de auxiliar como aerador de produtos mais cremosos, permitindo
a incorporação de ar na massa e favorecem a manipulação da massa por reduzir a
viscosidade. Os ovos contribuem para conferir aspectos sensoriais ao produto final,
tendo as seguintes funções tecnológicas: participar da formação estrutural da
massa, incorporar ar, fornecer nutrientes diversos e emulsionar gordura com
ingredientes líquidos, distribuindo uniformemente a textura e o sabor nos produtos.
(FIB, 2009).
Em panificação geralmente o leite desengordurado e desidratado é usado
para favorecer a absorção de água na farinha, melhorar a estrutura do miolo e da
textura do pão, prolongar a vida de prateleira e aumentar o valor nutricional
(GUERREIRO, 2006).
3.1.5 Interferência do trigo na micobiota dos pães
A produção brasileira do trigo encontra-se em maior parte nas regiões Sul,
Sudeste e Centro-Oeste (BRASIL, 2014). No entanto, esta produção é insuficiente
para atender as exigências nacionais, ocasionando a importação de trigo. Os
principais fornecedores responsáveis por suprir a demanda de trigo do Brasil em
2013 foram os EUA, Argentina, Paraguai, Uruguai e Canadá, respectivamente
(ABITRIGO, 2013), que são regiões concentradas em zonas de clima temperado,
onde excesso de chuvas, aliado a temperaturas elevadas, favorece afecções e
pragas aos grãos (COLLARES, 2008), tornando-os mais vulneráveis à contaminação
por fungos.
Neste contexto, grãos de trigo são facilmente contaminados no campo, antes
mesmo da colheita ou durante o armazenamento, podendo prevalecer essa
contaminação em seus subprodutos após o processamento (SIEGEL; BABUSCIO,
2011), uma vez que o processo de moagem do grão de trigo favorece a
contaminação ambiental por fungos na farinha resultante com valores que podem
variar entre 102 e 104 UFC/g (ABDULLAH, et al, 1998; WEIDENBÖRNER, et a.,
2000, BERGHOFER et al, 2003; USUOGE et al., 2011; VICTOR et al., 2013).
Assim, condições inadequadas de armazenamento podem propiciar o
23
desenvolvimento fúngico e a síntese de micotoxinas na farinha (ALDRED; MAGAN,
2004).
Deste modo, a farinha é um dos principais veículos de contaminação do
produto final, bem como podem conferir risco aos trabalhadores que lidam com esta
matéria prima (BAATJIES et al., 2010), pois a introdução de conídios fúngicos no
ambiente das panificadoras, podem também contaminar os pães. O monitoramento
inadequado destas matérias-primas pode permitir que uma contaminação prévia por
micotoxinas na cadeia produtiva, chegue ao consumidor final (CRUZ, 2010;
DUARTE, et al., 2010, BOEIRA, 2012).
Ressalta-se que o processo de fermentação e a cocção podem não ser
eficientes para a inativação de micotoxinas que possam estar presentes no pão, pois
grande parte das micotoxinas tem um grau de termoestabilidade, bem como, durante
o processo de fermentação, as enzimas dos micro-organismos utilizados são
insuficientes para inativar as toxinas presentes (VALLE-ALGARRA et al., 2009).
3.2 Fungos e micotoxinas
Fungos são organismos eucarióticos cujos núcleos são dispersos em um
micélio continuo ou septado e nutrição obtida por absorção. São organismos
saprofíticos, parasitas facultativos ou biotróficos, podem ser unicelulares (leveduras)
ou multicelulares (fungos filamentosos). Localizam-se em abundância no solo, na
água e nos vegetais e se reproduzem por meios de ciclos teleomorfos e anamorfos
(TRABULSI et al., 2008). A maioria dos fungos é aeróbia estrita, contudo alguns
degradadores de grãos armazenados podem crescer em atmosfera contendo
somente 0,1 a 0,2% de oxigênio, ou em atmosfera contendo mais de 80% de dióxido
de carbono (TANIWAKI et al., 2009).
Esses micro-organismos desempenham papel significativo na vida humana
atuando como biodegradadores naturais no ambiente, no preparo de alimentos e
bebidas, na fabricação de antibióticos, e como fontes de álcoois, acetona e enzimas.
Todavia, podem ser indesejáveis quando colonizam os alimentos no campo
(fitopatogênicos) ou durante o armazenamento (saprófitos). Nesses momentos os
fungos liberam enzimas nos tecidos vegetais alterando as estruturas básicas e
formando produtos metabólicos que modificam características sensoriais. Algumas
espécies fúngicas têm capacidade de produzir e secretar compostos de baixo peso
24
molecular referidos como "metabólitos secundários" ou "micotoxinas" (BHAT et al.,
2010) que têm potencial toxicológico, podendo causar doenças ou morte quando
ingeridas ou inaladas pelo homem e os animais (BENETT; KLICH, 2003).
Os principais gêneros de fungos toxigênicos de campo são: Fusarium,
Alternaria e Cladosporium e os de armazenamento, Aspergillus e Penicillium
(ROGRÍGUEZ, 2010; DRUMMOND, 2012). É importante ressaltar que a presença do
fungo toxigênico em um substrato não implica necessariamente a presença de
micotoxinas, visto que apenas uma pequena porcentagem de cepas fúngicas possui
a capacidade genética de sintetizar micotoxinas e também a produção destes
metabólitos ocorre somente sob estritas condições ambientais (RODRÍGUEZ, 2010).
Embora não haja correlação direta entre o crescimento fúngico e a síntese
de micotoxinas, a prevenção do crescimento de fungos conduz eficazmente a
prevenção do acúmulo desses metabólitos tóxicos (GARCIA et al., 2009), uma vez
que elevadas contagens fúngicas são consideradas indicativo da presença de
micotoxinas no alimento (FAO, 2004).
O crescimento de fungos em alimentos e a produção de micotoxinas são
influenciados por fatores físicos, químicos e biológicos: atividade de água (aw),
temperatura, umidade relativa do ar, presença do patógeno em culturas sensíveis,
integridade física dos grãos, estresse causado na planta por condições climáticas
extremas, presença de invertebrados, composição do substrato e as condições de
armazenagem inadequadas (PRANDINI et al., 2009; GIMENO; MARTINS, 2011).
Dentre esses fatores, aw, umidade relativa do ar e temperatura são os principais
determinantes do crescimento fúngico (BOURAS et al., 2009; GARCIA et al., 2011).
Existem mais de 100 espécies fúngicas micotoxígenas, que podem produzir
mais de 500 diferentes tipos de micotoxinas, sendo algumas espécies produtoras de
mais de um tipo de toxina, que podem ser encontradas simultaneamente em um
único produto, assim como uma mesma micotoxina pode ser produzida por
diferentes espécies fúngicas. Os principais gêneros contaminantes de alimentos
produtores de micotoxinas são: Aspergillus, Penicillium e Fusarium (PEREIRA et al.,
2005; ROSA et al., 2006; SIMAS et al., 2007; SKRBIC et al., 2011) e podem ser
observados na Tabela 1.
25
Tabela 1 – Principais espécies fúngicas toxigênicas e micotoxinas de importância mundial.
Espécie de fungo Micotoxinas
Aspergillus parasiticus Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, Aflavininas, Ácido aspergílico, Ácido Kójico
Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 e B2, Ácido ciclopiazônico, , Aflavininas, Ácido aspergílico, Ácido Kójico, Paspalininas
Aspergillus ochraceus Ochratoxina A, Ácido penicílico, Xantomegnina, Viomeleina, Ácido Kójico
Aspergillus candidus Candidulina, Terfenilina, Xantoacina, Ácido Kójico
Aspergillus terreus Citreoviridina, Citocalasina, Citrinina, Patulina, Ácido terréico, Citreoviridina
Penicillium verrucosum Ochratoxina A, Citrinina
Penicillium roqueforti Patulina, Ácido penicílico, Roquefortina
Penicillium citrinum Citrinina
Penicillium viridicatum Xantomegnina, Viomeleim, Vioxantina
Fusarium verticillioides Fumonisina, Bovericina
Fusarium graminearum Deoxinivalenol, Zearalenona
Fusarium moniliforme Fumonisina B1
Fusarium proliferatum Fumonisina, Moniliformina, Bovericina, Fusaproliferina
Fonte: Pitt; Hocking, 2009; Algarra, 2010.
As micotoxinas mais frequentemente estudadas e de maior toxidade são:
aflatoxinas (AF), ocratoxina A (OTA), fumonisinas, deoxinivalenol (DON),
zearalenona (ZEA), toxina T-2 (T2) e outros tricotecenos (LAZICKA;
ORZECHOWSKI, 2010; SALEM; AHMAD, 2010; GIMENO; MARTINS, 2011), que
possuem certa estabilidade durante a maior parte das etapas de processamento
térmico de alimentos (FERRAZ et al., 2010; MANDA et al., 2009).
Entre as micotoxinas, as AF e OTA possuem maior preocupação, devido à
frequente ocorrência em alimentos e seus efeitos severos sobre a saúde humana e
animal (COPETTI et al., 2012). Alimentos com alto teor de carboidratos são mais
susceptíveis à multiplicação fúngica com produção de micotoxinas (IAMANAKA et
al., 2010), dentre eles o trigo, milho, arroz, aveia, nozes, leite, queijo, amendoim e
algodão (SOLEIMANY et al., 2012; SIEGEL; BABUSCIO, 2011).
O consumo de alimentos contaminados com micotoxinas tem sido associado
à micotoxicoses (GARCIA et al., 2011), devido as propriedades: imunossupressoras,
alergênicas, teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas (GARCIA et al., 2009;
KHOMUTOV et al., 2011). Os efeitos tóxicos dependerão da micotoxina ingerida, em
concentrações que variam de micrograma a miligrama por quilo (ONO et al., 2004).
26
A Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer (IARC, 1993) classifica as
micotoxinas quanto à carcinogenicidade em três grupos, demonstrados na Tabela 2.
Tabela 2 – Classificação das micotoxinas em grupos conforme a potencial carcinogênico em seres humanos.
Grupo Micotoxina
1 Carcinogênicas Aflatoxinas
2B Possivelmente carcinogênicas Ocratoxina A e fumonisinas
3 Não carcinogênicas Tricotecenos e zearalenona
Fonte: IARC (1993)
3.2.1 Aflatoxinas
Os estudos sobre as AF iniciaram-se na Inglaterra em 1960, a partir da
ocorrência de surtos epizoóticos, com óbito de aproximadamente: 100.000 perus,
20.000 patos e centenas de outras aves de criações domésticas. Inicialmente
quadro clínico foi denominado “Doença X dos Perus” por ter causa desconhecida, no
entanto, após análises microbiológicas e químicas, foi detectada a presença de
Aspergillus flavus no amendoim procedente do Brasil utilizado na ração das aves e
posteriormente foi constatado que esta espécie fúngica produzia um grupo de
compostos designados por aflatoxinas (BHAT et al., 2010; PAIVA, 2013).
Desde então, a partir de outras pesquisas científicas, considerou-se que as
AF seriam metabólitos tóxicos produzidos por cepas de fungos do gênero
Aspergillus, principalmente pelas espécies A. flavus, A. parasiticus e A. nomius
(KLICH; PITT, 1988; PITT, 1993; KLICH, 2007), que podem se desenvolver em
alimentos tais como: milho, amendoim, trigo, feijão, arroz, algodão, sorgo, frutas e
também em rações para animais (FACCA; DALZOTO, 2010; SCHMIDT-HEYDT,
2010). As espécies de Aspergillus: A. bombycis, A. arachidicola e A. pseudotamarii
também foram descritas como produtoras de AF (CALDERARI et al., 2013).
As AF consistem em um grupo com aproximadamente 20 substâncias,
classificadas na fluorescência sob luz ultravioleta a 365 nm e na sua mobilidade
durante a realização de cromatografia de camada delgada (CCD) em: B1 e B2 (blue-
azul) ou G1 e G2 (green-verde). Ainda pertencem a este grupo as aflatoxinas M1 e
27
M2 que são metabólitos hidroxilados das aflatoxinas B1 e B2, podendo estar
presentes no leite e produtos derivados obtidos de animais que ingeriram ração
contaminada com estas aflatoxinas (IAMANAKA et al., 2010).
São compostos tóxicos de natureza cristalina, termoestáveis, que podem
tolerar temperaturas até 200ºC, não sendo acometidas pelo frio. São relativamente
instáveis quando expostas à luz, particularmente à radiação ultravioleta. Além disso,
estas toxinas são solúveis em solventes polares, como clorofórmio e metanol e
insolúveis em gorduras e óleos, sendo destruídas na presença de amônia ou
hipoclorito (OPAS, 1983). As estruturas químicas das AF são muito semelhantes
entre si, por serem compostos químicos simples e de baixo peso molecular,
apresentando um núcleo central cumarínico ligado a uma estrutura bi-furanóide
(Figura 1) (KAWASHIMA, 2004; DRUMMOND, 2012).
Fonte: Zain, 2011.
Figura 1 – Estruturas químicas das principais aflatoxinas.
Dentre os efeitos tóxicos causados pelas AF, destaca-se a supressão do
sistema imunológico, por conseguinte, a diminuição da resistência a outras
enfermidades (TESSARI; CARDOSO, 2012). Devido à capacidade de ligar-se a
ácidos nucléicos e nucleoproteínas celulares, essas toxinas possuem elevada
toxicidade aguda e crônica, resultando em efeitos deletérios sobre a síntese de
proteína celular. A AFB1 é uma das substâncias mais tóxicas e sua ingestão por
humanos e animais pode causar hepatite tóxica, hemorragia, edema,
28
imunossupressão, carcinoma hepático e consequentemente a morte (NAKAI et al.,
2008; IDRIS et al., 2010; ZORZETE et al., 2011).
3.2.2 Ocratoxinas
A OTA foi isolada e identificada pela primeira vez em 1970, em amostras de
milho africano e está frequentemente relacionada a doenças renais de equinos e
suínos (MORGAVI; RILEY, 2007). Este metabólito secundário tóxico é produzido por
espécies de fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus e Penicillium (ABREU et
al., 2011), podendo afetar seriamente o desempenho e bem-estar dos animais, além
de ocasionar efeitos deletérios em humanos, devido a suas propriedades
nefrotóxicas (MULLER et al., 2004). A toxina é produzida pelos fungos: A.
ochraceus, A. alliaceus, A. mellus, A. niger e outras espécies do gênero Aspergillus.
Espécies do gênero Penicillium também podem produzir OTA, como: P. verrucosum,
P. viridicatum, P. cyclopium e P. variable (DRUMMOND, 2012).
Comumente encontrada em produtos armazenados, a ocratoxina já foi
detectada em diversos tipos de alimentos e bebidas, como: milho, cevada, trigo e
derivados, feijão, amendoim, grãos de café, vinho, grãos de soja, centeio, arroz,
sorgo, castanha do Pará, cacau e chocolate (KUMAGAI et al, 2008; GIMENO;
MARTINS, 2011; TURCOTTE; SCOTT, 2011; COPETTI et al., 2013).
A estrutura química da OTA é um derivado diidro-isocumarínico ligado pelo
grupo 7-carboxílico à L-β-fenilalanina por um grupo amida, como pode ser
observado na Figura 2 (RINGOT et al., 2006). Esta toxina é bastante solúvel em:
solventes orgânicos polares e solução aquosa de bicarbonato de sódio, sendo
fracamente solúvel em água (ABRUNHOSA, 2008). São classificadas como
Ocratoxina A (OTA), Ocratoxina B (OTB) e Ocratoxina C (OTC), sendo estas duas
últimas com menor poder de toxicidade, a qual está relacionada com molécula de
cloro na fórmula química.
29
Fonte: Freire et al., 2007.
Figura 2 – Estrutura química da ocratoxina A.
A fluorescência refletida pelas ocratoxinas quando expostas à luz ultravioleta
a 365 nm é usada para a revelação em cromatografia de camada delgada (CCD) e
para quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
(ABRUNHOSA, 2008). Neste contexto, a OTA e a OTC refletem fluorescência verde,
e a OTB reflete azulada (EFSA, 2006).
A OTA é um composto de fácil absorção e lenta eliminação pelo organismo,
persistindo por longos períodos na corrente sanguínea, devido à elevada afinidade
por proteínas do plasma, como a albumina (BOZZA, 2010). Dentre os efeitos
nocivos à saúde, a OTA destaca-se como nefrotoxina com ação imunosupressora,
genotóxica, teratogênica e neurotóxica, sendo classificada pela Agência
Internacional para Pesquisa do Câncer como um possível carcinogênico para
humanos (IARC, 1993).
Embora seja inviável eliminar totalmente a presença das micotoxinas nos
alimentos, é necessário um monitoramento eficaz para reduzir seus teores na
alimentação humana e animal. O conhecimento e controle da contaminação por
micotoxinas e sua distribuição é alvo de produtores, fabricantes e órgãos
investigadores e regulamentadores, devido ao impacto econômico e à necessidade
de melhorar a segurança alimentar e a saúde humana (CHELI et al., 2008).
3.3 Análise de micotoxinas em alimentos
As micotoxinas encontram-se nos alimentos em concentrações bastante
variadas, podendo ocorrer em concentrações traço, assim exigem métodos
analíticos com boa sensibilidade e especificidade, para adequada detecção e
30
quantificação (IAMANAKA et al., 2010). As principais técnicas para a determinação
de micotoxinas são divididas em métodos de triagem e métodos quantitativos.
Os métodos de triagem geralmente são baseados em técnicas mais
sensíveis e menos específicas, quando comparadas às metodologias padrão,
propostas pela AOAC. São exemplos de técnicas de triagem a cromatografia de
camada delgada (CCD) ou técnicas imunoquímicas como ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) (TURNER, 2009). Estes métodos têm por característica
serem rápidos, confiáveis, de fácil execução e viáveis economicamente. A CCD é
uma técnica na qual é possível analisar qualitativamente vários compostos
simultaneamente, podendo também ser empregada como método semi-quantitativo
(IAMANAKA et al., 2010). O método ELISA visa identificar um antígeno
desconhecido, por meio de kits que disponibilizam um anticorpo específico que se
ligará ao antígeno (toxina), gerando uma coloração de intensidade relacionada à
concentração de micotoxina presente (SILVA, 2009). Vale ressaltar que, para
propósitos legais, resultados positivos de um teste imunoquímico, devem ser
confirmados por um método de referência (AOAC, 2012).
As metodologias analíticas empregadas para determinação quantitativas de
micotoxinas em alimentos geralmente são compostas pelas etapas de extração,
purificação, separação, detecção, quantificação e confirmação (TURNER, 2009). As
principais técnicas quantitativas utilizadas são cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), e mais recentemente a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas (CL-EM).
A CLAE utiliza colunas de fase normal ou fase reversa, usadas para
separação e purificação da toxina, dependendo da sua polaridade. Os principais
espectros de detecção utilizados são radiação ultravioleta (UV) e fluorescência. A
utilização da fluorescência natural de algumas micotoxinas, como as AF, OTA e
citrinina, permitem alta especificidade e sensibilidade para detecção das mesmas
(CIGIĆ; PROSEN, 2009). A CL-EM é uma técnica preconizada, pois além de
oferecer maior confiabilidade, minimiza o chamado efeito de matriz, na análise de
micotoxinas. Este método possibilita a análise simultânea de várias micotoxinas,
implementação dos chamados métodos multi-toxinas, minimizando a necessidade
de várias etapas na preparação da amostra (IAMANAKA et al., 2010). Contudo,
qualquer que seja o método escolhido, esse deve ser reprodutível e apresentar
31
baixo limite de detecção (LOD), visto que os limites máximos permitidos para tais
compostos tóxicos são muito baixos (ROCHA et al., 2008).
3.4 Legislação para micotoxinas
A preocupação com alimentos contaminados por micotoxinas é considerada
um problema global, e se caracteriza como um risco que afeta diretamente a
segurança dos alimentos. Para proteger os consumidores dos efeitos nocivos
causados pelas micotoxinas em alimentos in natura e processados, e até mesmo em
rações para animais de abate e de estimação, vários países criaram legislações
estabelecendo limites considerados seguros para diversos produtos que estão
predispostos a contaminação de micotoxinas. Aspectos científicos, tais como a
disponibilidade de informações toxicológicas, conhecimento acerca da distribuição
das micotoxinas nos alimentos, além da metodologia analítica são fatores que
acarretam à elaboração dessas legislações. Também, devem ser considerados os
aspectos políticos e econômicos, principalmente com relação aos interesses
comerciais e aos impactos na disponibilidade da oferta de alimentos (FREIRE et al.,
2007).
Os contaminantes de alimentos vêm sendo avaliados pelos comitês dos
órgãos mundiais desde 1970. As resoluções adotadas a partir destas comissões
estabelecem os níveis a serem seguidos pela comunidade internacional para o
comércio dos seus produtos (RIBEIRO, 2007). Informações coligidas até o ano de
2003 evidenciam que cerca de 100 países já dispõem de legislação para
regulamentar os limites de micotoxinas em alimentos e rações (FAO, 2003).
Em 2011, foi publicada no Diário Oficial da União, a Resolução RDC nº 7,
pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) que dispõe sobre limites
máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em matérias-primas e alimentos prontos
para o consumo. Segundo essa legislação, em cereais e produtos de cereais, como
é o caso da farinha de trigo e do pão, o limite máximo tolerado de aflatoxina B1, B2,
G1 e G2, é de 5,0 μg.kg-1. Referente à OTA, esse limite corresponde a 20,0 μg.kg-1. A
legislação estabelece ainda o LMT de DON para farinha de trigo e produtos de
panificação (1250 μg.kg-1) e de zearalenona em trigo para posterior processamento
(400 μg.kg-1) (BRASIL, 2011).
32
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coleta das amostras
As amostras de farinha de trigo e pão tipo hot-dog foram adquiridas em duas
panificadoras (“A” e “B”) localizadas no município de Teresina, PI. Esses
estabelecimentos foram selecionados aleatoriamente a partir do grupo de
panificadoras de médio porte cujos proprietários assinaram Termo de Aceite para
participação da pesquisa em questão. O pão tipo hot-dog foi selecionado para este
estudo, por ser um alimento de preço acessível à população, consumido diariamente
por pessoas de qualquer faixa etária em, pelo menos, uma das refeições.
Semanalmente, foi coletada assepticamente uma amostra com 300 g de
farinha de trigo retirada da embalagem que estavam em uso pela panificadora e
também, uma amostra com 300 g de pães tipo hot-dog que foram elaborados com a
mesma farinha de trigo que foi amostrada. Este procedimento foi repetido por 15
semanas em cada estabelecimento pesquisado, com 30 amostras de farinha e 30 de
pães, totalizando 60 unidades experimentais.
As amostras foram recolhidas, individualmente, e encaminhadas ao
Laboratório de Análise de Alimentos, do Departamento de Farmacologia do Centro
de Ciências da Saúde e ao Laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos do
Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos (NUEPPA) do Centro
de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Federal do Piauí (UFPI), para
realização das análises.
4.2 Temperatura ambiental e umidade relativa do ar (URA)
No início e no final das coletas, foram efetuadas medições da temperatura
ambiente e da umidade relativa do ar (URA) utilizando um termohigrômetro digital
Inconterm®.
4.3 Análise da atividade de água (aw)
Para análise foram realizadas em triplicata as análises da atividade de água
(aw) das amostras por meio de equipamento portátil, modelo PawKit digital, marca
33
Decagon®, previamente calibrado. De cada amostra foram retiradas porções
individuais com aproximadamente 10 g que foram transferidas para depósito plástico
próprio do aparelho. Em seguida, após acoplamento do depósito e estabilização, foi
realizada a leitura direta no painel, conforme instruções do fabricante.
4.4 Contagem de fungos filamentosos e leveduras
A contagem de fungos filamentosos e de leveduras, expressa em unidades
formadoras de colônias por grama de alimento (UFC.g-1), foi realizada segundo
metodologia de diluição decimal seriada em placas (PITT; HOCKING, 2009). No
laboratório, foi retirada assepticamente uma porção com 25,0 g de cada amostra
que, em seguida foi homogeneizada em 225,0 mL de água peptonada a 0,1%,
previamente esterilizada, para o preparo da diluição 10-¹. A partir desta foi retirada
uma alíquota de 1,0 mL para adicionar em 9,0 mL de solução salina formando a
diluição de 10-2 e depois, preparou-se a diluição de 10-3.
De cada diluição foi transferida uma alíquota com 0,1 mL para placas de
Petri, com meio de cultivo agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) com
auxílio de alça de Drigalski esterilizada (KING et al., 1979). Em seguida, as placas
com DRBC foram incubadas a 25°C durante sete dias em estufas microbiológicas
com controle eletrônico de temperatura. Transcorrido tal período, todas as placas
foram observadas, sendo selecionadas para contagem aquelas que continham de 10
a 100 UFC.g-1 (DALCERO et al., 1997; DALCERO et al., 1998).
4.5 Isolamento e identificação fúngica
A identificação dos gêneros fúngicos foi realizada segundo Samson et al.
(2000), de acordo com suas características macrocroscópicas e microscópicas. As
colônias identificadas como Aspergillus spp. e Penicillium spp. foram subcultivadas
em tubos inclinados contendo Agar Extrato de Malte (MEA) e as de Fusarium spp.
foram repicadas em tubos com Agar Spezieller Nalvistoffarmer (SNA) e Agar Batata
Dextrose (BDA) para a posterior identificação das espécies.
As colônias do gênero Aspergillus spp. foram identificadas utilizando as
chaves de identificação descritas por Klich (2002) baseada na semeadura padrão
34
dos meios: Agar Extrato de Levedura Czapek (CYA) a 25°C e 37°C; Agar Extrato de
Levedura Czapek 20% Sacarose (CY20S) a 25°C e MEA a 25°C (Figura 3)
Posteriormente, em microtubos previamente esterilizados, preparou-se uma
suspensão de conídios em 0,5 mL de meio ágar semi-sólido constituído de 0,2% de
ágar-ágar e 0,05% de Tween® 80. Na sequência, uma agulha foi introduzida na
suspensão e o inóculo foi distribuído em três pontos equidistantes nas placas com
os diferentes meios e posteriormente foram incubadas por sete dias (PITT;
HOCKING, 2009). Em seguida, foram observadas as estruturas micromorfológicas e
as características macroscópicas das colônias fúngicas (diâmetro, textura, forma,
aspecto da superfície e do reverso, pigmentação dos conídios e pigmento solúvel,
produção e cor de exsudado) visando à identificação das espécies.
Fonte: Adaptado de Klich (2002).
Figura 3 – Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições de temperaturas (25 e 37°C).
As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Penicillium spp. foram
identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Pitt (2004),
baseadas na semeadura em três meios básicos: Agar Extrato de Levedura Czapek
(CYA) a 25°C, a 5°C e a 37°C; Agar Extrato de Malte (MEA) a 25°C; e Agar Nitrato
de Glicerol 25% (G25N) a 25°C (Figura 4). Para maior eficiência e aproveitamento
do sistema, inoculou-se as placas de Petri com duas cepas diferentes a serem
testadas; a preparação da suspensão de conídios e inoculação nos meios de cultivo
foi igual à utilizada para Aspergillus spp.
1 1
1
1 1
1
1 1
1
1 1
1
CYA 25ºC CYA 37ºC MEA 25ºC CY20S 25ºC
35
Fonte: Adaptado de Pitt (2004).
Figura 4 – Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N em três regimes de temperatura (5, 25 e 37°C).
As colônias fúngicas isoladas pertencentes ao gênero Fusarium spp. foram
identificadas pelo método de diluição em placa recomendado por Booth (1971). Após
subcultivo em meio BDA, realizou-se o cultivo monospórico que consiste em recolher
pequena quantidade de micélio da colônia subcultivada e agitá-lo em tubo com cerca
de 10 mL de água destilada esterilizada. A suspensão é então vertida sobre placa de
Petri contendo ágar-ágar 1,5% e homogeneizado em movimentos em forma de “8”
sobre a bancada. O sobrenadante é descartado e a placa é incubada a temperatura
ambiente inclinada em ângulo aproximado de 45°.
Após período de 16 a 18 horas, as placas são examinadas por microscopia
(x 30) em busca de conídios germinados isolados. Um único conídio por vez é então
recortado e transferido para o meio Agar Batata Dextrose (BDA) e também para o
meio Agar Folhas de Bananeira (BLA), modificando a metodologia original que
emprega o meio Agar Folhas de Cravo (CLA), conforme Keller (2009). Após
incubação por sete a 14 dias (foto período de 12 horas de luz branca e 12 horas de
luz negra), (Figura 5) as colônias foram identificadas usando critérios microscópicos
e macroscópicos segundo a chave taxonômica de Nelson et al. (1983).
37 ºC
CYA
25ºC
1 1
1
CYA
25ºC
1 1
1
MEA 5ºC
CYA
1
2 2
1
2 2
2
MEA 2 2
2
G25N
1
2 2
1
CYA 1
2 2
1
36
Fonte: Adaptado de Nelson et al. (1983) e Keller (2009).
Figura 5 – Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos diferentes meios de cultivo até sua identificação final.
4.6 Detecção e quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
4.6.1 Extração e purificação dos extratos
A extração e purificação dos extratos foram realizadas de acordo com a
metodologia descrita por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) e modificada por
Teixeira et al. (2008). Para extração foram utilizados 25,0 g de amostra, na qual se
adicionaram 70,0 mL de metanol e 10,0 mL de solução de cloreto de potássio 4,0%.
Em seguida a amostra foi submetida à agitação em liquidificador doméstico por
cinco minutos. Após a homogeneização foram adicionados 75,0 mL de solução
clarificante (sulfato de amônio 30%) e 7,5 g de celite. Posteriormente, a amostra foi
submetida novamente a agitação por cinco minutos, seguido de repouso de 20
minutos. Em seguida, o extrato resultante foi filtrado com auxílio de papel de filtro
Whatman n° 4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, E.U.A.).
Do filtrado foi retirada uma alíquota de 50 mL para um frasco tipo Becker,
seguida de adição de 50 mL de água destilada, essa mistura foi transferida para um
balão de decantação com capacidade para 500 mL, ao qual foram adicionados 20
Subcultivo em meio BDA
Cultivo Monospórico
BLA BDA
Classificação
Incubação: 7 a 14 dias (24°C) Luz branca: 12 h Luz negra: 12h
Colônia crescida NSA
37
mL de clorofórmio, em seguida agitou-se manualmente por cinco minutos. Decorrido
esse tempo, foi aberta a torneira do balão para retirada do líquido decantado que foi
recolhido para um frasco tipo Erlenmeyer com capacidade para 50 mL, depois foram
adicionados 20 mL de clorofórmio ao balão e procedeu-se mais uma agitação
manual com posterior retirada do líquido decantado, de forma a obter 35 mL da fase
clorofórmica no frasco tipo Erlenmeyer.
Em seguida, o solvente foi evaporado em banho-maria a 60 °C por 15
minutos. O extrato seco resultante foi suspenso em 1,0 mL de clorofórmio e depois
homogeneizado em agitador tipo Vortex. Após, a suspensão foi acondicionada em
frasco âmbar com capacidade de 4,0 mL para posterior evaporação do solvente em
capela de fluxo laminar. O extrato seco resultante foi armazenado em freezer
doméstico (-18°C) até o momento da análise de AFB1 e OTA.
4.6.2 Condições cromatográficas para detecção e quantificação de AFB1
A detecção e quantificação de AFB1 dos extratos foram realizadas por
CLAE, em um cromatógrafo SHIMADZU® modelo Prominence com detector de
fluorescência (excitação: 360 nm e emissão: 460 nm) modelo RF-10AXL SUPER,
loop de 20 µL, de acordo com a metodologia proposta por Trucksess et al. (1994).
As separações cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa de
sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo
Alto, EUA).
Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 µL de acetonitrila,
homogeneizado em agitador tipo Vortex, e filtrado com filtro Millex em polietileno
com membrana PTFE 0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). Em
seguida, foi retirada uma alíquota de 200 µL do extrato filtrado e acrescido de 700 µL
de solução derivatizante composta de ácido trifluoracético: ácido acético glacial:
água (20:10:70 v/v/v). A fase móvel utilizada foi acetonitrila: metanol: água (17:17:66
v/v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min-1. A curva padrão foi construída em diferentes
níveis de padrão de AFB1: 5,0 ng/mL, 10,0 ng/mL, 20,0 ng/mL e 50 ng/mL (Sigma
Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). O limite de detecção do método
analítico foi de 0,4 ng.g-1 e o limite de quantificação foi estabelecido como sendo três
vezes o limite de detecção (1,2 ng.g-1).
38
4.6.3 Condições cromatográficas para detecção e quantificação de OTA
A detecção e quantificação de OTA foram realizadas por CLAE em um
cromatógrafo SHIMADZU®, modelo Prominence com detector de fluorescência
(excitação: 330 nm e emissão: 440 nm) modelo RF-10AXL SUPER, loop de 20 µL,
conforme metodologia proposta por Scudamore e Mcdonald (1998). As separações
cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa de sílica gel (150 x
4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo Alto, EUA).
Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 µL de metanol,
agitado em Vortex e filtrado com filtros Millex em polietileno com membrana PTFE
0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). A fase móvel utilizada foi
acetonitrila: água: ácido acético (57:41:2 v/v) a uma vazão de 1,0 mL.min-1. A curva
padrão foi construída em diferentes níveis de OTA: 5,0 ng/mL, 10,0 ng/mL, 20,0
ng/mL e 50 ng/mL (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). O limite
de detecção do método analítico foi de 0,02 ng.g-1 e o limite de quantificação foi
estabelecido como sendo três vezes o limite de detecção (0,06 ng.g-1).
4.7 Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com dois
tratamentos (farinha de trigo e pão tipo hot-dog) e 15 repetições caracterizadas por
semanas em que foram realizadas as coletas.
Os resultados das contagens de fungos filamentosos e leveduras foram
transformados em log10(x+1). As médias dos resultados quantitativos foram testadas
quanto a normalidade, em seguida foram submetidas à análise de variância e teste
de Wilcoxon Mann-Whitney pelo pacote estatístico SigmaStat® v.3,5 (Systat
Software, San Jose, CA, 2005) com significância de 5,0%.
39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para o preparo dos pães foi verificado que as duas panificadoras
pesquisadas utilizavam a mesma marca de farinha de trigo, envasadas em saco de
algodão com 25 kg. Durante o processamento, a farinha utilizada permanecia na
embalagem original acondicionada sob estrados de madeira em temperatura
ambiente na área de produção. Para a formulação dos pães tipo hot-dog as
panificadoras utilizavam como ingredientes: farinha de trigo, água, açúcar, fermento,
cloreto de sódio, ovos, margarina e leite em pó, em proporções diferenciadas.
Os teores médios da temperatura ambiente nas panificadoras “A” e “B”
foram respectivamente: 32,6°C ± 2,7 e 31,1°C ± 2,5; e da umidade relativa do ar:
43,6% ± 17,6 e 44,3% ± 11,4. Temperaturas entre 25ºC a 30ºC e umidade ambiental
superior a 75% contribuem para a multiplicação de fungos deterioradores de
alimentos (SINGH; CHAUHAN, 2013). Deste modo, embora os teores médios da
temperatura ambiente verificados nas duas panificadoras fossem favoráveis para
multiplicação fúngica, a umidade relativa do ar registrada nas mesmas pode ter sido
um dos fatores limitantes para o crescimento dos fungos presentes nas amostras.
Outro fator que influencia no desenvolvimento fúngico é atividade de água
presente no alimento. Nas panificadoras “A” e “B” os valores de aw das amostras de
farinha de trigo e dos pães foram semelhantes (P>0,05) (Tabela 3). Os menores
valores de aw que favorecem o desenvolvimento de fungos filamentosos xerofílicos
e de leveduras osmofílicas são: 0,65 e 0,60, respectivamente (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
Neste contexto, nas amostras de farinha de trigo os teores médios de aw
verificados não foram propícios à germinação fúngica, porém, seus conídios podem
estar inativos (LIMA et al., 2007; GASHGARI et al., 2010) e por isso, sobreviver nas
baixas concentrações de aw encontradas. Caso essas farinhas venham a ser
armazenadas em ambientes que favoreçam o aumento da umidade relativa do ar em
1,0%, os conídios inativos podem germinar e ocorrer a proliferação de fungos
presentes e dependendo do caso, a síntese de micotoxinas (CABAÑAS et al., 2008;
GASHGARI et al., 2010).
40
Tabela 3 – Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pães tipo hot-dog produzidos em duas panificadoras de Teresina, PI.
a letras iguais em colunas e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de Mann-Whitney.
Produtos de panificação com valores elevados de aw podem favorecer a
multiplicação por fungos que estejam presentes na massa ou adquiridos pela
exposição ao ambiente durante a comercialização (FREIRE, 2011). Portanto, os
teores médios obtidos nos pães tipo hot-dog produzidos nas panificadoras “A” e “B”
(Tabela 3) possibilitariam o desenvolvimento dos fungos presentes nas amostras.
As contagens de fungos filamentosos e leveduras das amostras de farinha
de trigo e de pães tipo hot-dog da panificadora “A” foram semelhantes (P>0,05),
entretanto, na panificadora “B” a contaminação fúngica dos pães foi maior que a da
farinha de trigo (Tabela 4).
De um modo geral, células bacterianas vegetativas, fungos filamentosos e
leveduras são destruídos durante o processamento térmico do pão (FREIRE, 2011),
porém, apesar dos pães amostrados terem sido assados no forno das panificadoras,
as contagens observadas, especialmente na padaria “B”, podem ter ocorrido por
contaminação posterior causada por: contato dos pães com os conídios fúngicos em
suspensão provenientes da farinha de trigo no interior dos estabelecimentos
pesquisados; manipulação inadequada durante o resfriamento (FREIRE, 2011),
utensílios mal higienizados e pela resistência ao tratamento térmico
(WEIDENBÖRNER et al., 2000). Além disso, nas panificadoras pesquisadas os pães
ficavam expostos a venda em temperatura ambiente no interior de vitrines que
permitiam acesso a moscas, que são considerados como veículos de conídios.
Panificadoras/
Amostras
Atividade de água (aw)
Farinha de trigo (n=15) Pão tipo hot-dog (n=15)
A 0,52b ± 0,04 0,83a ± 0,03
B 0,50b ± 0,03 0,84a ± 0,01
41
Tabela 4 – Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha de trigo e pão tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina, PI.
Panificadoras/ Amostras
Contagem média de fungos filamentosos e leveduras
(UFC.g-1 em log10(x+1))
Farinha de trigo
CV% Pão tipo hot-
dog CV%
A 2,34b ± 1,15 0,49 2,39b ± 1,33 0,56
B 2,14b ± 1,24 0,58 3,78a ± 1,79 0,47
a letras iguais em coluna e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de Mann-Whitney.
UFC.g-1
em log10(x+1)
= unidades formadoras de colônias por grama, em logaritmos da base dez, acrescentados de uma unidade.
A Legislação brasileira vigente (BRASIL, 2001), não possui padrões
referentes ao limite de fungos filamentos e leveduras na categoria de farinhas e
produtos de panificação, no entanto, esta análise é relevante, visto que esses micro-
organismos são considerados indicadores da qualidade higiênica dos alimentos
(ZANATTA et al., 2010). A quantidade de fungos filamentosos e leveduras é um
parâmetro que deve ser observado pelas empresas alimentícias. Esses micro-
organismos quando se desenvolvem interferem na qualidade sensorial dos produtos
pelas alterações das características organolépticas e nutricionais. De uma forma
mais grave, certas espécies de fungos filamentosos em condições favoráveis de
umidade e temperatura podem produzir micotoxinas nas farinhas, e a presença
dessas substâncias tóxicas pode prevalecer em seus derivados, podendo causar
alterações biológicas prejudiciais à saúde do consumidor.
No total das amostras analisadas foram isoladas 66 cepas de fungos
filamentosos pertencentes a oito gêneros e, pode-se constatar que a variedade de
fungos foi maior na farinha de trigo do que nos pães (Tabela 5), provavelmente pela
ação do tratamento térmico dos pães. Porém, os gêneros isolados nas amostras de
pão também estavam presentes na farinha de trigo. Os gêneros mais comumente
encontrados em pães brasileiros são: Aspergillus, Chrysonilia, Cladosporium,
Curvularia, Eurotium, Fusarium, Penicillium, Rhizopus e Mucor, sendo as espécies
Aspergillus, Cladosporium e Penicillium as mais frequentes (FREIRE, 2011). A
maioria dos gêneros citados também foi isolada nas amostras de farinha de trigo
utilizadas nas panificadoras piauienses. De um modo geral, os panificadores
42
brasileiros adquirem essa matéria-prima das regiões: Sul, Sudeste e Centro-Oeste,
caracterizando certa uniformidade da micobiota presente nos ambiente de cultivo.
Tabela 5 – Ocorrência (%) de fungos filamentosos isolados em amostras de farinha de trigo
e pão tipo hot-dog adquiridas em panificadoras de Teresina, PI.
Farinha de trigo Pão tipo hot-dog
Gêneros fúngicos Números
de isolados
Ocorrência (%)
Números de
isolados
Ocorrência (%)
Cladosporium spp. 14 31,8 17 77,3
Aspergillus spp. 10 22,7 2 9,1
Penicillium spp. 12 27,3 2 9,1
Fusarium spp. 2 4,5 - -
Eurotium spp. 3 6,8 - -
Mucor spp. 1 2,3 - -
Byssoclamys spp. 1 2,3 1 4,5
Chrysonilia spp. 1 2,3 - -
Total 44 100 22 100
A presença de Aspergillus spp. e Penicillium spp. em gêneros alimentícios
variados, constitui um fator de risco à saúde humana por serem fungos
potencialmente toxigênicos, que podem produzir micotoxinas em condições
favoráveis de umidade e temperatura. A frequência de isolamento desses gêneros
nas amostras de farinha de trigo (Tabela 5) pode ser atribuída a manipulação
inadequada da matéria-prima ao longo da cadeia alimentar (VICTOR et al., 2013),
portanto, o conhecimento dos tipos de fungos contaminantes pode indicar em que
condições o produto está estocado, fornecendo subsídios na orientação da
estratégia adequada de armazenamento (TANIWAKI; SILVA 2001).
Embora o Fusarium spp. seja um gênero com prevalência significativa em
pesquisas com trigo e seus derivados (BERGHOFER et al., 2003; MALAKER et al.,
2008; GARCIA JÚNIOR et al., 2008; KOBAYASTI; PIRES, 2011; JOSHAGHANI et
al., 2013), foram isoladas apenas duas cepas (8,3%) de F. graminearum (Tabela 6)
nas amostras de farinha de trigo, apesar de ser um fungo de campo.
A baixa infecção de F. graminearum em trigo também foi observada em
pesquisas realizadas por outros autores (CARNEIRO, 2003; GARCIA, 2006;
43
ALMEIDA, 2006; ARINGOLI et al., 2012). Apesar da baixa incidência de Fusarium
spp. nas amostras estudadas, não se pode desconsiderar a hipótese destes fungos
terem colonizado os grãos de trigo antes da colheita e terem sido eliminados por
competição (FURLONG et al., 1995), uma vez que houve uma elevada porcentagem
de fungos do gênero Cladosporium spp., que competem com o Fusarium pela
superfície do substrato a ser colonizado, pelo alimento e umidade do ar (GARCIA
JUNIOR et al., 2008).
F. graminearum está frequentemente associado à giberela ou fusariose nos
grãos de trigo (CALORI-DOMINGUES et al., 2007), que além de causar danos à
cultura, os grãos infectados podem apresentar contaminação por micotoxinas (DON,
ZEA e T2), podendo ser tóxicas tanto para o homem quanto para os animais
(IAMANAKA et al., 2010, DRUMMOND, 2012).
Em relação aos demais gêneros fúngicos isolados, a incidência de
Cladosporium spp. foi a mais prevalente (Tabela 5). O crescimento desse fungo é
favorecido quando a umidade ambiental está elevada, associada com aumento do
fluxo de ar, visto que são facilmente disseminados pelo vento (ZOPPAS et al., 2011).
Neste contexto, apesar de terem sido isolados nas amostras em maiores
quantidades, a umidade relativa média das panificadoras (panificadora “A”: 43,6% ±
17,6 e panificadora “B”: 44,3% ± 11,4) durante o período do estudo, não favoreceu o
desenvolvimento desse fungo.
Cladosporium spp. é considerado um dos mais comuns e importantes
patógenos causadores de alergias em humanos (ALINGORI et al., 2012) e elevadas
concentrações de seus esporos podem provocar alergia crônica, rinite e asma pela
exposição prolongada. Além do mais, são capazes de produzir ácido
epicladospórico, podendo causar imunossupressão (ZENG, 2005; MAXIM, 2013).
A densidade relativa das espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e
Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães tipo hot-dog adquiridos
em panificadoras de Teresina, PI, são observadas na Tabela 6. As espécies A.
caespitosus e P. corylophilum, foram isolados na farinha de trigo e nos pães tipo hot-
dog (Tabela 6). A ocorrência de fungos, com destaque para o P. rugulosum isolado
apenas no pão pode ter sido proveniente de contaminações por conídios fúngicos
presentes no ambiente e pela presença de moscas nas panificadoras que poderiam
veiculá-los aos pães expostos.
44
Tabela 6 – Densidade relativa das espécies de Aspergillus, Penicillium e Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina, PI.
Espécies
Farinha de trigo Pão tipo hot-dog
Número de
isolados
Frequência (%)
Número de
isolados
Frequência (%)
A. candidus 3 12,5 - -
A. caespitosus 2 8,3 1 33,3
A. oryzae 2 8,3 - -
A. terreus 2 8,3 - -
A. versicolor 1 4,2 - -
P. corylophilum 6 25,0 1 33,3
P. fellutanum 2 8,3 - -
P. lividum 2 8,3 - -
P. decumbens 1 4,2 - -
P. paxilli 1 4,2 - -
P. rugulosum - - 1 33,3
F. graminearum 2 8,3 - -
Total 24 100 3 100
Nas amostras, não foram detectadas cepas de Aspergillus das seções Flavi
e Nigri com potencial capacidade para produção de AFB1 e OTA, embora esta
produção já tenha sido relatada em pesquisas com trigo e derivados (SOLIMAN,
2003; EFUNTOYE, 2004; CABAÑAS et al., 2008).
Não foram detectadas AFB1 e OTA nas amostras analisadas, portanto estão
de acordo com os limites máximos toleráveis recomendados pela legislação
(BRASIL, 2011). Porém farinhas de trigo que contenham micotoxinas podem
apresentar o risco destas também estarem presente nos pães, apesar das perdas
que podem ocorrer pela fermentação da massa, pelo processamento térmico
(SAMAR et al., 2001; PACIN et al., 2010) e pela diluição da concentração das
toxinas presentes devido a adição de outros ingredientes não contaminados à
massa (COPETTI et al., 2013).
45
Importante salientar que a presença de fungos micotoxigênicos no alimento
não implica obrigatoriamente na produção de micotoxinas (DINIZ, 2002; PEREIRA et
al., 2002; MURPHY et al., 2006; GARCIA et al., 2009), visto que, as condições para
a produção desses metabólitos tóxicos são mais restritivas que aquelas para o
crescimento de fungos (MAGNOLI et al., 2007). Neste contexto, a síntese de
micotoxinas por fungos do gênero Aspergillus é favorecida quando a umidade
relativa do ar é superior a 85% (QUEIROZ et al., 2006) e essa produção é muito
baixa ou inexistente quando os valores de atividade de água são inferiores a 0,85
(GIMENO; MARTINS, 2011). Assim, os teores médios de umidade relativa do ar
registrados nas panificadoras, bem como os valores médios de atividade de água
obtidos para farinha de trigo e pão tipo hot-dog (Tabela 3) eram desfavoráveis à
síntese desses metabólitos tóxicos. Dessa forma, sob os pontos micotoxicológicos
analisados tanto a farinha de trigo quanto os pães tipo hot-dog eram seguros para
consumo.
O conhecimento da micobiota fúngica e suas micotoxinas nos alimentos é
importante para obter informações inerentes à qualidade do produto e realizar ações
preventivas desde a produção até o armazenamento. Assim, para que haja o
controle dos fungos filamentosos e de seus metabólitos, é necessária a realização
de métodos que minimizem a multiplicação e também, utilização de técnicas para
detoxificar o susbtrato, reduzindo ou minimizando a níveis indetectáveis de
contaminação por micotoxinas nos alimentos.
Portanto, pode-se sugerir que a farinha de trigo utilizada para produção dos
pães tipo hot-dog era de boa procedência, e provavelmente foi produzida com o
sistema de boas práticas de fabricação na sua origem desde o campo até sua
distribuição.
46
6 CONCLUSÃO
A qualidade da farinha de trigo influencia os aspectos micológicos e
micotoxicológicos dos pães produzidos, na quantidade de fungos filamentosos e
leveduras e também na variabilidade das espécies fúngicas isoladas.
Foram identificados os gêneros Cladosporium spp., Penicillium spp. e
Aspergillus spp. na farinha de trigo e nos pães tipo hot-dog. Apenas na farinha
também foram isolados Fusarium spp., Mucor spp., Byssoclamys spp. e Chrysonilia
spp. Não foram isoladas cepas de Aspergillus das seções Flavi e Nigri
potencialmente toxigênicas.
A farinha de trigo e os pães tipo hot-dog não apresentaram AFB1 e OTA,
portanto são seguros para consumo sob o aspecto micotoxicológico analisado.
47
REFERÊNCIAS
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