diagnóstico molecular escherichia coli

E Q U I P E :

A L I N E V I T O R I A N O , D A I A N Y V A S C O N C E L O S , E C I A N E L O P E S ,

D E B O R A H C O S T A .

D I S C I P L I N A : B I O L O G I A M O L E C U L A R

P R O F . : V A L E S K A P O R T E L A

Escherichia Coli

E. Coli - Características

Foi descrito pela primeira vez em 1885, pelo pediatra

alemão Theodore Escherich.

Gram negativa.

Enterobacteriaceae.

Forma de bastonetes (bacilos).

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e

do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.

The Canadian Press, Published Wesnesday, February 3, 2016 3:53PM EST

E. Coli - Características

Pode ser móvel ou imóvel.

Apresenta metabolismo tanto fermentativo quanto

oxidativo.

Faz parte da microbiota intestinal.

Antígenos somáticos (O), flagelados (H) e capsulares (K).COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e

do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.

Linhagens particulares

E. coli comensal (colonizadores intestinais não-

patogênicos).

E. coli patogênica intestinal ou enteropatogênica

(categorias diarreiogênicas).

E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC)

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e

do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.

Infecções ou síndromes especificas (ExPEC)

E. coli uropatogênica (UPEC).

E. coli associada ao quadro de sepse (SEPEC).

E. coli associada ao quadro de meningite neonatal

(NEMEC)

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e

do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.

Infecções intestinais ou entéricas

E. coli enteropatogênica (EPEC).

E. coli enterotoxigênica (ETEC).

E. coli enteroinvasora (EIEC).

E. coli enteroagregativa (EAEC).

E. coli produtora de toxina Shiga (STEC).

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e

do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.

E. Coli Enteropatogênica (EPEC)

Importante nos primeiros anos de vida.

Transmissão – Contato direto.

Mecanismo – Eliminação de microvilosidades.

Diarréia Aquosa.

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

E. Coli Enteroxigénica (ETEC)

Diarréia do viajante.

Mecanismo – Semelhante a cólera.

Desequilibrio hidro-salino

Diarréia aquosa profunda.

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

E. Coli Enteroinvasora (EIEC)

Invasivo

Mecanismo – Semelhante ao da Shiguela

Disenteria – Diarréia com sangue e muco.

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

E. Coli Enteroagregativo (EAEC)

Formam biofilmes.

Adere o epitélio do intestino e causa desequilíbrio hidro-

salino.

Diarréia aquosa persistente ( >7 dias).

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

E. Coli Produtora de toxina Shiga (STEC)

Subgrupo ( EHEC).

Transmissão – Água, alimentação ; Direto ou indireto.

Mecanismo – libera toxina de Shiga no intestino grosso.

Surtos de diarréia sanguinolenta.

Pode causar SHU.

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

Diagnóstico

Exame de fezes.

Isolamento do microorganismos.

Caracterização fenotípica:

• Tipagem sorológica;

• Ensaios enzimáticos e de citotoxidade em cultura celular;

• Testes de sensibilidade.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do

Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013.

Técnicas Moleculares

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).¹

Eletroforese em campo pulsado (PFGE).¹

PCR Multiplex.²

RT-PCR.

1- COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de

Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p12-13, mar, 2013.

2- COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

Isolamento e Identificação

Meios de cultura de baixa seletividade:

• Ágar MacConkey;

• EMB/Teague.

Utilizadas para a diferenciação de colônias da E. coli

fermentadoras ou não de lactose.

Teste de Elisa

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de

Janeiro, 82f, Rio de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

Ágar MacConkey

Leitura:

• Cor Original: Rosa avermelhado.

• Colônias cor de rosa: fermenta-

doras de lactose.

• Colônias incolores: não fermen-

tadoras de lactose.

• Não há crescimento de cocos Gram-positivos.

Povilas Kavaliauskas, Vinius Universaty, March 31, 2015

Teste de Elisa

Povilas Kavaliauskas, Vinius Universaty, March 31, 2015

PCR

Amplifica uma sequência de DNA;

Obejetivo : tornar a sequência de DNA abundante e

disponível para diversas técnicas de biologia molecular.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio

de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

PCR – Etapas do Procedimento

Desnaturação Inicial

Desnaturação

Anelamento

Extensão

Extensão Final

Número de ciclos

94 – 96°C (3 – 5’);

94 – 94°C (30’’ – 2’);

55 – 64°C (30’’ – 2’);

72°C (30’’ – 2’);

(3 – 5’);

25-40.COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

PCR – Reagentes

Primer;

DNA molde;

Taq polimerase;

Solução tampão;

MgCl2;

dNTP;

H20. Herman Sabala da Fonseca, 2010

PCR – Etapas do Procedimento

Desnaturação

• Primeira etapa do processo;

• As cadeias de DNA são separadas pelo aquecimento a 95°C;

• As ligações de hidrogênio se rompem;

• Duração de 3 - 5 minuto.

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PCR – Etapas do Procedimento

Anelamento

• Segunda etapa do processo;

• Ocorre a formação de pontes de hidrogênio;

• O anelamento da sequência alvo e o primer ocorre após o

resfriamento a 55 °C;

• Duração de 45 segundos.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR – Etapas do Procedimento

Extensão

• Taq Polimerase se liga ao DNA template e começa a adicionar

nucleotídeos;

• Reação ocorre a 72°C;

• Duração de 1 a 2 minutos.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR

Her

man

Sab

ala

da F

onse

ca, 2

010

PCR – E. Coli

Não detecta a presença de E. coli, quando aplicada

diretamente nas amostras fecais.

Isolamento e identificação das amostras.

O produto amplificação é adicionada a PCR para

análise.

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PCR – E. Coli

Esta técnica apresenta dentre as suas vantagens facilidade e

rapidez de execução, baixo custo, especificidade e

sensibilidade.

Necessita de um pré-enriquecimento para aumentar a

sensibilidade da técnica.

Os resultados sugerem que a técnica reduz o tempo de

detecção do microorganismo

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR – STEC

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PFGE

Eletroforese em Gel de campo pulsado.

Tecnica mais utilizada para análise epidemiologica para

a maioria das bactérias patogênicas.

Deriva da eletroforese convencional do DNA, mas a

principal diferença é a repetida orientação do campo

eletrico.COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PFGE

Essa mudança provoca um re-arranjo da estrutura

conformacional da molécula, permitindo a sua migração

no gel.

Capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir

de diferentes municípios.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PFGE

Food safty news, august 31, 2009

PFGE – E. Coli

Sistemas empregados para a tipagem destes

microrganismos.

Este método molecular tem como base o estudo da

diversidade genética.

Permite investigar as relações de clonalidade entre

diferentes amostras.COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PFGE – E. Coli

Contribui para a elucidação dos aspectos biológicos e

epidemiológicos desses agentes infecciosos.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR Multiplex

É uma reação de amplificação;

Detecta múltiplas sequências-alvos numa mesma

amostra;

Vários pares de primers;

Desenvolvimento para detecção simultânea de vários

genes.COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR Multiplex

Vantagens:

• Diminuição da intensidade

e do período de trabalho

laboratorial.

• Redução do número de

reagentes.

• Redução dos custos.

Desvantagens:

• Redução da sensibilidade

de detecção.

COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

PCR Multiplex

Identificação e diferenciação de ETEC, EPEC e STEC via

amplificação simultânea de genes.

Associados à virulência comumente encontrados em

amostras de E.coli causadoras de diarréia.

Tipagem de Escherichia coli patogênicas causadoras de

diarréia.ANDRADE, G. I,; SANTOS, E. L. D. S.; COURA, F. M.. PCR multiplex para determinação de marcadores de virulência em escherichia coli isoladas de bovinos

com diarréia em Minas Gerais. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE BUIATRIA, VIII, 2009, Minas Gerais, Minas Gerais: Ciência Animal Brasileira, 2009, p.

436-441.

PCR Multiplex

Primier Biosoft, August 31, 2007

PCR Multiplex

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

Classificação molecular das categorias diarreiogênicas de E. coli

COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.