diagnÓstico “in vitro” - radioimunoensaio e elisa
Post on 30-Jan-2016
374 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISADIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA
TIREÓIDETSHAnti-receptor TSHT3 e T4 livresTBGCalcitonina TSH neonatal
FERTILIDADE Estradiol UltrasensívelProgesterona HCG Estradiol
MARCADORES TUMORAIS
PSA total
PSA livre
ENDOCRINOLOGIA
ACTH
Aldosterona
ReninaDIABETES
Insulina
Peptídio C
TOXICOLOGIA
FARMACOLOGIA
ALÉRGENOSAC DE ALERGIAS
DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS
Radioimunoensaio (RIA ou RIE)
Vantagens • Sensível, rápido e preciso• Análise quantitativa de reação Ag-AC• Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g)
Limitações• Alto Custo• Vida média dos reagentes (radioisótopos)• Risco operacional
Radioisótopos mais usados• 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias
Etapas do teste• Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas (padrões/calibradores)• Ensaio • Contagem da radiação: ou (contador de cintilação) ou γ (contador de radiação gama)• Controle de qualidade
Tipos de RIE• RIE direto de competição com Ag marcado• RIE direto de competição com AC marcado• Ensaio Imunorradiométrico (IRMA)
Radioimunoensaio
Princípio:
• Ac que reconhece especificamente o analisado
Soro com quantidadedesconhecida de analisado
eSoro com analisado
marcado I125
ACACACACAC
+ =
Precipitado com baixas contagensSoro tem muito analisado circulante
Precipitado comaltas contagensSoro tem pouco analisado circulante
RIE direto de competição com Ag marcado
• AC ligado ao suporte sólido• Adição do Ag marcado + amostra ou padrão• Lavagem para remoção Ag não ligado• Medida da radiação
Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação
Ag na amostra ou padrão = radiação
RIE direto de competição com AC marcado
• AG ligado ao suporte sólido• Adição do AC marcado + amostra ou padrão (Ag)• Lavagem para remoção AC não ligado ao Ag fixado ao suporte sólido.• Medida da radiação
Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação
Ag na amostra ou padrão = radiação
Ensaio Imunorradiométrico (IRMA)
• Quantidade fixa Ac no fixada no suporte• Adição da amostra (quantidade Ag desconhecida) ou padrão (quantidade Ag conhecida)• Incubação • Lavagem e remoção dos Ag não ligados• Adição do 2º AC (marcado) • Lavagem e remoção dos 2º AC não ligados• Medida da radiação
Resultados: Ag na amostra ou padrão = radiação
Enzimaimunoensaio
• Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática
Vantagens:• Alta sensibilidade• Reagentes estáveis e seguros• Rapidez
Exigências para a enzima ser usada no teste:• Alta atividade específica• Produto formado estável• Fácil quantificação• Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção• Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica,acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase,ribonuclease
Métodos:ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima)EMIT (Imunoensaio enzima multiplicado)Imunoblotting
ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima
Objetivo:• Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima
ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima
1. Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc)2. Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina,gelatina, caseína, etc).3. Diluição da amostra4. Lavagens entre os períodos de incubação5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática(ex. H2O2, ortotoluidina, ABTS e TMB).
top related