departamento de química, setor de química analítica · pdf...
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Métodos rápidos para a determinação de agrotóxicos em insumo farmacêutico ativo vegetal
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química, Setor de Química Analítica
Centro de Pesq. em Cromatografia e Espectrometria de Massas (CPCEM)
Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)
Renato Zanella
LARP-UFSM (www.ufsm.br/larp)
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)
Centro de Pesq. em Cromatografia e Espectrometria de Massas (CPCEM)
Laboratório de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)
Renato Zanella, Martha B. Adaime, Osmar D. Prestes
LARP
http://www.ufsm.br/larp
UFSM Total estudantes: 29055
Pós-graduação: 4980 (161 PPGQ)
LARP-UFSM: acreditado CGCRE/INMETRO - ISO/IEC 17025
Atuação: Desenvolvimento e aplicação de métodos para determinação de
agrotóxicos, medicamentos veterinários, hormônios, PCBs, fármacos,
Poluentes emergentes, POPs ... em alimentos, amostras ambientais ...
Áreas de interesse/Cooperações: Química, Agronomia, Alimentos, Saúde,
Veterinária, Biologia, Bioquímica, Engenharia Ambiental ...
3
Rede de Laboratórios de Resíduos e Contaminantes (RRC) Instituída pela Portaria Interministerial MAPA/MCT nº 902, de 22.09.2008.
Capacitação de laboratórios de ensaio e análise de resíduos e contaminantes em
produtos de origem vegetal e animal, destinados a consumo e processamento
contribuindo para a estruturação prioritária do Plano Nacional de Controle de Resíduos
e Contaminantes (PNCRC) e outros planos e programas oficiais, de forma a ampliar a
oferta de serviços e pessoal capacitado na área de resíduos e contaminantes
atendendo às normas internacionais.
Rede Nacional de Análises de Alimentos (RENALI) Chamada Pública MCT/FINEP - Ação Transversal - SIBRATEC - 01/2008.
Composta por 71 laboratórios. O Núcleo de Coordenação da RENALI-SIBRATEC possui
um representante da região Nordeste (LACEN-PE), um da região Sudeste (IAL-SP), e
representantes da região Sul (CIENTEC, UFSM/LARP e SENAI-SC).
O objetivo principal é apoiar as Micro, Pequenas e Médias empresas no atendimento às
demandas de prestação de serviço de metrologia, normalização e avaliação de
conformidade, visando a superação de exigências técnicas para o acesso aos
diferentes mercados, a proteção a saúde, assim como para atender demandas
estratégicas para o desenvolvimento do país.
4
“insumo farmacêutico ativo vegetal (IFAV): matéria prima
ativa vegetal, ou seja, droga ou derivado vegetal, utilizada no
processo de fabricação de um fitoterápico”
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA
DIRETORIA COLEGIADA
RESOLUÇÃO - RDC N 26, DE 13 DE MAIO DE 2014
Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro
e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos.
5
O Codex Alimentarius define agrotóxico como sendo
toda e qualquer substância utilizada com o propósito
de prevenir, destruir, atrair, repelir ou controlar
qualquer peste, incluindo espécies indesejáveis de
plantas ou animais
Agrotóxicos
http://www.codexalimentarius.net/pestres/data/reference/glossary.html
Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO)
6
Um pouco da história dos agrotóxicos
• Romanos, Gregos – enxofre e arsênio (insetos)
• Séculos XVI-XIX – Nicotina e piretro
• 1939 – Síntese do DDT. Combate malária, tifo, piolhos
• 1943 – Início da Revolução Verde: incremento no uso de
fertilizantes, irrigação e agrotóxicos - produtividade
aumentou.
• Organoclorados: proibidos desde 1970 na Suécia e
desde 1985 no Brasil.
7
1962: "Primavera Silenciosa“ de Rachel
Carson. Amplo uso do DDT poderia ser a
principal causa da redução populacional de
diversas aves. Primeira manifestação ecológica
contra o uso indiscriminado do DDT.
Organoclorados
Organofosforados
Carbamatos
Piretróides
Sulfoniluréias
Triazinas
…
Diferentes
propriedades
físico-químicas
> 1000 compostos > 100 classes
AGROTÓXICOS
8
Agrotóxicos AGRICULTURA
CONTAMINAÇAO DOS ALIMENTOS E MEIO
AMBIENTE
9
Como o meio ambiente é
contaminado por agrotóxicos ?
10
Deriva, evaporação/precipitação, uso indevido
APLICAÇÃO DIRETA
CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
11
Aspectos toxicológicos
Aspectos econômicos
12
Por que analisar resíduos e contaminantes
em alimentos e fitoterápicos?
Como analisar resíduos e contaminantes em
alimentos e em amostras ambientais?
Necessidade: Desenvolvimento de métodos sensíveis e abrangentes
(com inclusão de novos compostos) para determinação de resíduos e
contaminantes em matrizes diversas. Grande desafio atual !!!
13
Esquema genérico de uma análise
entrada saída
Informação
inicial
Coleta de
amostra
Preparo de
amostra Análise
cromatográfica
Análise
dos dados
Resultado
analítico
processo
HPLC, GC ...
14
• Desejável:
• Rápido
• Sensível
• Barato
• Fácil
Rapidez
Sensibilidade Custo
Facilidade
Desafio Analítico no Desenvolvimento de Métodos
15
16
Parte I Fundamentos do Preparo de Amostras
Cap. 1 - Introdução ao preparo de amostras
Cap. 2 - Princípios básicos do preparo de amostras
Cap. 3 - Precipitação de proteínas e hidrólise de conjugados
Cap. 4 - Planejamento de experimentos aplicado ao preparo de amostras
Parte II Técnicas Clássicas ou Convencionais
Cap. 5 - Extração líquido-líquido
Cap. 6 - Extração por headspace
Cap. 7 - Filtração e diálise
Parte III Técnicas de Extração em Fase Sólida
Cap. 8 - Princípios da extração em fase sólida
Cap. 9 - Dispersão da matriz em fase sólida
Cap. 10 - Preparo de amostras empregando polímeros de impressão molecular
Cap. 11 - Preparo de amostras empregando meios de acesso restrito (RAM)
Parte IV Técnicas Miniaturizadas
Cap. 12 - Microextração em gota única, imersão direta, headspace, microextração líquido-líquido-líquido
Cap. 13 - Microextração em gota diretamente suspensa e microextração em gota sólida
Cap. 14 - Microextração líquido-líquido dispersiva
Cap. 15 - Microextração em fase líquida com fibras ocas
Cap. 16 - Microextração em fase sólida
Cap. 17 - Microextração sortiva em barra de agitação
Cap. 18 - Microextração em sorvente empacotado (MEPS)
Parte V Técnicas Mecanizadas/Automatizadas
Cap. 19 - Técnicas com acoplamento e comutação de colunas
Cap. 20 - Automação do preparo de amostras em sistemas de análises em fluxo
Cap. 21 - Microextração em fase sólida no capilar acoplada à cromatografia líquida (in-tube SPME-LC)
Parte VI Outras Técnicas
Cap. 22 - Extração por fluido supercrítico (SFE)
Cap. 23 - Preparo de amostra empregando campo elétrico
Cap. 24 - QuEChERS
Cap. 25 - Preparo de amostras aplicado a biomacromolécula
Preparo de Amostras para Análise de Compostos Orgânicos. LTC, RJ, 2015
Preparo de amostra
GC-MS/MS e LC-MS/MS
Cromatografia acoplada à Espectrometria de Massas em série
limpeza do extrato
(clean-up)
Extração
17
Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,
hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais
Evolução dos Métodos Multirresíduo
Demanda crescente em analisar
um maior número de compostos
Reduzir o custo das análises
Grande variedade de matrizes
Desenvolvimento de Métodos
Multirresíduo Abrangentes
18
19
LC-MS/MS (triple quadrupole)
LC QTOF MS
(quadrupole time-of-flight)
Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,
hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais
GC-MS (ion trap) GC-MS/MS (triploquadrupole)
GC-ECD/NPD
20
Determinação de resíduos de agrotóxicos, medicamentos veterinários,
hormônios, PCBs, POPs ... em alimentos e amostras ambientais
21
Muito importante: equipe capacitada para estabelecer e aplicar métodos
multirresíduo de análise em diversas matrizes
Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de
Massas em série (LC-MS/MS)
22
Técnicas de Análise
Técnicas de Análise
Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de
Massas em série (GC-MS/MS)
Impacto Eletrônico Cromatografia Gasosa
23
Quantificação por LC-MS/MS
2.5 3.0 3.5 4.0 minutes
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
MCounts
Metomil
Tiametoxam
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 minutes
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00 2A
175 200 225 250 275 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
181
211
292
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 minutes
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
MCounts
90 100 110 120 130 140 150 160 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
88 106
163
24
qualidade necessária,
confiabilidade GARANTE
Validação de Métodos Analíticos
LINEARIDADE
PRECISÃO
EXATIDÃO
LOD / LOQ
EFEITO MATRIZ
ROBUSTEZ 25
Matrix effect
0
100000000
200000000
300000000
400000000
500000000
600000000
700000000
800000000
900000000
0 50 100 150 200
Carne suína
Fígado suíno
Carne de frango
Filé de peixe
Analytical curves from salbutamol prepared in solvent
and in blank matrix extract
LC-MS/MS
in solvent
26
Matrix effect
Solvent standard
Matrix matched
0
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
300000000
0 50 100 150 200
Are
a (
co
un
ts)
Concentration (µg L-1)
Solvent curve
Matrix matched
Comparison of the analytical curves obtained in solvent and in the
blank of the matrix for bisphenol A, as well as its chromatograms
GC-MS/MS
27
Revisões do método QuEChERS
28
Revisões do método QuEChERS
p. 355 – 379, 2012
Renato Zanella, Osmar D. Prestes, Caroline do A.
Friggi, Manoel L. Martins, Martha B. Adaime (2012).
An Overview About Recent Advances in Sample
Preparation Techniques for Pesticide Residues
Analysis in Cereals and Feedstuffs, Pesticides -
Recent Trends in Pesticide Residue Assay, Dr. R.P.
Soundararajan (Ed.), ISBN: 978-953-51-0681-4,
InTech, DOI: 10.5772/48752.
29
2003 (Original) 2007 (AOAC 2007.01) 2008 (CEN 15662)
Anastassiades et al. Lehotay et al. Anastassiades et al.
QuEChERS methods
Si NHNHPSA
30
Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-SPE)
NÃO NECESSITA:
Cartuchos e tubos coletores
Sistema de vácuo/pressão
Condicionamento
Controle de vazão
Solvente para eluição
Não há evaporação do solvente
Sulfato de Magnésio Remove o excesso de água da amostra
Amina primária/
secundária (PSA)
Remove ácidos orgânicos, ácidos graxos,
açúcares e pigmentos Antociânicos
Sorvente C18 Remove gorduras, esteróis e outros interferentes
não polares
Carbono Grafitizado
(GCB)
Remove os pigmentos da amostra
Remove pesticidas planares !!!
Sais e Sorbentes utilizados em d-SPE
31
32
Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-SPE)
Seleção depende do tipo de amostra
33
Exemplos de métodos analíticos
desenvolvidos no LARP-UFSM
34
35
Mariela S. Viera, Tiele M. Rizzetti, Manoel L. Martins,
Osmar D. Prestes, Martha B. Adaime, Renato Zanella
In this study, the QuEChERS method followed by ultra-high performance
liquid chromatographic coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC–
MS/MS) was developed for the determination of 73 pesticides in different
types of plants. A modified QuEChERS method optimized by a 23 full factorial
design was established. Results presented satisfactory recoveries that
ranged from 66 to 120%, with relative standard deviations (RSDs) ≤ 20%. The
method shown limits of detection (LOD) between 4.8 to 48 µg kg-1 and limits
of quantification (LOQ) between 16 to 160 µg kg-1. The proposed method was
applied to different kinds of plants and 20 pesticides residues were found and
quantified.
Multiresidue analysis of pesticides in plants by
QuEChERS method and ultra-high performance liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry
Prof. Dr. Renato Zanella
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF PESTICIDES AND ANTIBIOTICS RESIDUES
IN HONEY SAMPLES BASED ON ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY
Federal University of Santa Maria (UFSM)
Chemistry Department, Santa Maria - RS, Brazil
Research Center for Chromatography and Mass Spectrometry
Laboratory of Analysis of Pesticides Residues
36
37
Pesticides and antibiotics bees honey
Introduction
Pesticides, like neonicotinoids (imidacloprid, clothianidin, thiamethoxam, …), are
harmful to bees. They are associated with colony collapse disorder, resulting in low
pollination of food crops leading to a decrease of production.
Antibiotics, like macrolides and sulfonamides, are applied in bee colonies for the
treatment of bacterial diseases, leading to high residues in honey.
Goals
38
• Development and validation of a multiresidue method for
simultaneous determination of pesticides and antibiotics in honey
Modified QuEChERS for sample preparation
Determination by ultra-high performance liquid chromatography
with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)
• Method application in honey samples from different regions.
Experimental
39
Acephate Clorpirifós
etílico
Etrimfós Isoxaflutol Oxadixil Propoxur Tilosina
Acetamiprid Clorpirifós
metílico
Fempropatrina Lincomicina
cloridrato
Paraoxon
etílico
Salinomicin Tolclofós
metílico
Atrazine Clotianidina Fempropimorfe Linurom Ppenconazol Simazine Triadimefom
Azinfós etílico Diclorvós Fenarimol Malationa Picoxistrobina Sulfacloropiridazina Triazofós
Azinfós
metílico
Dietofencarbe Fipronil Mepaniprim Piraclostrobina Sulfadiazina Triclorfom
Azoxistrobina Difenoconazol Flusilazol Mepronil Pirazofós Sulfadimetoxina Trifloxistrobin
Boscalida Dimetoato Flutolanil Metacrifós Piridato Sulfametazina Triflumizol
Bromofós
etílico
Dimoxistrobina Fluvalinato Metalaxil Pirimetanil Sulfametoxazol
Carbaril Diniconazol Fosmet Metidationa Pirimicarbe Sulfaquinoxalina
Cardendazim Diurom Furazolidona Metolaclor Pirimifós etílico Sulfatiazol
Carbofuram Emamectina
benzoato
Hexaconazol Metsulfurom
metílico
Pirimifós
metílico
Tebuconazol
Carbofuram 3-
OH
Epoxiconazol Imazalil Mevinfós Profenofós Terbutilazina
Carboxim Eritromicina
ABC
Imidacloprid Monolinurom Profoxidim Tiacloprido
Ciproconazol Etofenprox Iprovalicarbe Ometoato Propargito Tiametoxam
79 pesticides and 13 antibiotics
40
UHPLC-MS/MS Xevo TQ Waters conditions
Column Acquity UPLC BEH C18 (100 x 2.1 mm, 1.7 μm);
ESI+/ESI-, capillar voltage: 2 kV;
Dessolvatation temperature: 500 °C;
Dessolvation gas (N2): 600 L h-1;
Spray flow-rate: 80 L h-1;
Colission gas (argon): 0.15 mL min-1;
Source temperature: 150 °C;
Injection volume: 10 μL.
Experimental
41
UHPLC-MS/MS parameters (SRM transitions, ...)
42
Evaluation of sample preparation
40 °C, 5 min
atrazine d5, Vortex 2 min
4 g MgSO4 +
1 g NaCl +
0.5 g C6H6Na2O7 1,5 H2O +
1 g C6H5Na3O7 2H2O
d-SPE Clean-up
PSA
C18
Oasis HLB
Florisil
5 mL McIlvaine buffer 0.1 mol L-1, pH 4
+ 5 mL acetonitrile
5 g sample
Vortex 2 min
Centrifugation
(2137 x g, 6 min)
Vortex 2 min
Spike
Experimental
Factorial design
EDTA, citric acid and
Na2HPO4 in water
Modified
QuEChERS
Results and discussion
43
Clean-up efficience with different sorbents
3328
2218
6
16
1
39
47 50
6067
72
86
2017 20
1419
4 5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Com
posto
s
R < 70% R 70-120% R > 120%
C18
PSA + C18
Florisil + C18
PSA + Florisil
OASIS HLB
PSA
Florisil
Nu
mb
er
of
co
mp
ou
nd
s
44
The proposed method
Results and discussion
45
• The developed method was effective for simultaneous
determination of pesticides and antibiotics in honey samples.
• Detection of the compounds using UHPLC-MS/MS provided
good sensitivity and selectivity.
• Method LOD from 0.03 to 0.6 μg kg-1
• The main feature is the simplicity in the execution of sample
preparation, combined with low solvent consumption and cost.
Conclusions
DETERMINAÇAO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS EM SUCO DE LARANJA
Resíduos de 40 compostos 48
Resíduos de 81 agrotóxicos
49
50
51
AGROTÓXICOS E COMPOSTOS RELACIONADOS EM AR:
TRAPEAMENTO EM SORVENTE POLIMÉRICO E USO DE GC-MS/MS
Samile Martel, Manoel L. Martins, Renato Zanella
Lab. de Análises de Resíduos de Pesticidas (LARP)
Depto. de Química, Univ. Federal de Santa Maria
Degradação química
Degradação biológica
APLICAÇÃO DE AGROTÓXICOS
INTRODUÇÃO
MANUAL
PULVERIZAÇÃO
MECÂNICA
AÉREA
TERRESTRE
MECÂNICA
TERRESTRE
Volatilização
Deriva
Lixiviação
Escoamento superficial
Transporte Transformação
Volatilização durante e após a aplicação.
Perda de 30 a 50% na aplicação
53
DISPOSITIVO DE AMOSTRAGEM
54
LOQ do método: 3 μg m-3 (34 compostos)
6 μg m-3 (14 compostos)
GC-MS/MS
48 AGROTÓXICOS E COMPOSTOS RELACIONADOS
http://www.ufsm.br/ppgq
55
www.redracal.org
Presidida pelo LARP-UFSM
Membro do Comitê Executivo
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