biomateriais – propriedades e avaliação
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Biomateriais – Propriedades e AvaliaçãoPROGRAMAÇÃO CURSO TNM-5783-2017
Viabilidade Celular | Patricia Santos Lopes | UNIFESP
O que são biomateriais?
https://www.researchgate.net/figure/Translational-quest-for-next-generation-biomaterials_fig1_307940875
Biomaterial
• O termo biomaterial engloba todos os
materiais usados para aplicações
médicas que estejam em interfaces
com sistemas vivos ou outros
sistemas desenvolvidos para uso
extra corpóreos
• Os biomateriais incluem metais,
cerâmicas, polímeros naturais
(biopolímeros), polímeros sintéticos
de estrutura simples ou complexas, e
compósitos
Avaliação da segurança desses biomateriais
ou biocompatibilidade
MÉTODOS PARA A AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE
• A avaliação da biocompatibilidade de
materiais e dispositivos consiste
numa sequência de testes que
incluem testes in vitro, testes ex-
vivo, in silico, in vivo (modelos
animais) e ensaios clínicos
• Os procedimentos e metodologias
detalhadas para estes testes, estão
disponíveis em publicações da ISO,
ASTM, NIH, FDA, ANVISA, OECD e
várias outras sociedades profissionais
https://en.uit.no/forskning/forskningsgrupper/gruppe?p_document_id=520078
BIOCOMPATIBILIDADE DO DISPOSITIVO
• A caracterização in vitro = é um pré-
requisito que deve ser avaliado antes
da avaliação de sua biocompatibilidade
final
• Materiais e dispositivos que não
passarem por estes pré-requisitos
não deveriam ser avaliados em sua
biocompatibilidade final.
ISO 10993 - Biological evaluation of medical devices
• ISO 10993-1:2009 Part 1: Evaluation and testing in
the risk management process
• ISO 10993-2:2006 Part 2: Animal welfare requirements
• ISO 10993-3:2003 Part 3: Tests for genotoxicity,
carcinogenicity and reproductive toxicity
• ISO 10993-4:2002/Amd 1:2006 Part 4: Selection of
tests for interactions with blood
• ISO 10993-5:2009 Part 5: Tests for in vitro
cytotoxicity
• ISO 10993-6:2007 Part 6: Tests for local effects after
implantation
• ISO 10993-7:2008 Part 7: Ethylene oxide sterilization
residuals
• ISO 10993-8:2001 Part 8: Selection of reference
materials (withdrawn)
• ISO 10993-9:1999 Part 9: Framework for identification
and quantification of potential degradation products
• ISO 10993-10:2010 Part 10: Tests for irritation and
delayed-type hypersensitivity
• ISO 10993-11:2006 Part 11: Tests for systemic toxicity
• ISO 10993-12:2012 Part 12: Sample preparation and
reference materials (available in English only)
• ISO 10993-13:1998 Part 13: Identification and
quantification of degradation products from
polymeric medical devices
ISO 10993 - Biological evaluation of medical devices
• ISO 10993-14:2001 Part 14: Identification
and quantification of degradation products
from ceramics
• ISO 10993-15:2000 Part 15: Identification
and quantification of degradation products
from metals and alloys
• ISO 10993-16:1997 Part 16: Toxicokinetic
study design for degradation products and
leachables
• ISO 10993-17:2002 Part 17:
Establishment of allowable limits for
leachable substances
• ISO 10993-18:2005 Part 18: Chemical characterization of materials
• ISO/TS 10993-19:2006 Part 19: Physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials
• ISO/TS 10993-20:2006 Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices
• ISO/TR 15499:2012 Guidance on the conduct of biological evaluation within a risk management process
• Citotoxicidade do extrato, direta ou indireta
• Sensibilização dérmica ou de mucosa
• Irritação cutânea primária, irritação cutânea
cumulativa ou irritação intradérmica
Preparação de amostras
ISO 10993-12
Preparação da amostra de acordo com a ISO 10993
Example of planning a film extraction for use in biological safety trials regarding the indirect cytotoxicity.
Positive controls: Films containing zinc diethyldithiocarbamate (SPU-ZDEC), dibutyldithiocarbamate (SPU-
ZDBC) and/or natural rubber latex. Negative control: gauze.
Biomaterais
Preparação dos extratos líquidos
Meios de extração:
a) Meio polar: Água, Solução salina fisiológica, Meio de cultura sem soro;
b) Meio não polar: óleo recém refinado com grau farmacopeico.
c) Meio adicional: Etanol/água; etanol/solução salina; PEG 400 diluído, DMSO (0,5%), Meio de cultura com soro (preferencial – não polar)
USAR O EXTRATO IMEDIATAMENTE SEM TRATAMENTO
Testes In vitroCitotoxicidadeToxicidade – nível celularISO 10993-5
Citotoxicidade
• Extrato – preferencialmente em meio de cultura com soro ou solução
fisiológica. Tempo de extração 37º C por 24h (impede a degradação do meio
de cultura e do soro). Pode ser feita apenas do extrato (100%) ou uma curva
de diluição.
• Direta – colocação da amostra sobre a monocamada de células ou células
em suspensão, ou colocação da células sobre o biomaterial.
• Indireta – utilização de ágar contendo as células e colocação das amostras
sobre o ágar.
Métodos de determinação da citotoxicidade
• 1. Exclusão do corante (Dye exclusion):
Trypan blue, eosina, Congo red,
erythrosine B;
• 2. Métodos colorimétricos (Colorimetric
assays): MTT, MTS, XTT, WST-1, WST-8,
LDH, SRB, NRU e Cristal violeta;
• 3. Métodos fluorimétricos (Fluorometric
assays): alamar Blue e CFDA-AM;
• 4. Método de luminescência
(Luminometric assays): ATP e real-time
viabilidade.
http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.71923
Quais as vantagens e
desvantagens de cada método?
A partir das amostras preparadas - plaqueamento
Ensaios Biológicos: citotoxicidade
Citoxicidade
CULTURA CELULAR
FIBROBLASTO DE
CAMUNDONGO BALB 3T3, L929,
CHO, QUERATINÓCITOS
HUMANOS ou outras células,
SUBCONFLUÊNCIA DE 80%
20000
CÉLULAS
/POÇO DA
PLACA DE
96 POÇOS.
Exemplo da disposição das concentrações
na placa e coloração após o uso do
Neutral Red (corante vital).
OECD 129 (2010)
Citotoxicidade
• Leitura em Microplate reader (Multiskan EX 355, Thermo Electron Corporation)
em 540nm (NR)
RESULTADOS
1E-3 0,01 0,1 1 10
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Via
bilid
ade
celu
lar (
%)
Concentração Dypterix alata (mg/mL)
solv
curvaA
curvaB
DOI: 10.1002/app.48763
ATLA 39, 189–196, 2011
Enquanto para substâncias químicas em geral o ideal é 90 % de viabilidade celular (IC10),
para os biomateriais , de acordo com a ISO 10993-5, o ideal é que o extrato (método
indireto), ou o material (método direto), apresentem no mínimo, 70% de viabilidade celular
(IC 30). Avaliação qualitativa é feita no método direto ou no indireto = morfologia das células
Resultados
DOI:
10.1557/jmr.2018.463
International Journal of Biological Macromolecules 152
(2020) 803–811
Avaliação Biológica : método direto e Adesão Celular
Amostras e
Lamínulas foram
encaixadas nos
poços da placa de
24 poços
Cultivo celular
2,5x104 céls/poço
Balb/c 3T3
24hFixação
DAPI
Amostras
transferidas para
uma nova placa
Avaliação Biológica : Adesão Celular
EP
ICLO
RID
RI
NA
CO
NT
RO
LE
Controle Epicloridrina
Scaffolds
C EA
B
Controles de
Células
D F
Amostras coradas com DAPI aumento de 100x. A: Controle de células, lamínula com células Balb/c 3T3 antes da ativação do fluoróforo.B: Controle de
células (mesmo campo de A) após ativação do fluoróforo. C: Scaffold Controle (quitosana) sem aplicação de células. D: Scaffold Controle (quitosana)
com aplicação de células. E: Scaffold Reticulado com Epicloridrina sem aplicação de células. F: Scaffold Reticulado com Epicloridrina com aplicação de
células.
Adesão e Proliferação Celular - Resultados
Testes in vitrotestes de sensibilização e irritação dérmica
ISO 10993-10
Irritação X sensibilização
• Irritação: Processo inflamatório que ocorre na área de contato com o produto, podendo ocorrer após a
primeira aplicação (irritação primária) ou com a continuidade do uso (irritação acumulada). É determinada
por um dano tecidual agudo ou crônico de intensidade variada. É dependente da concentração dos
ingredientes no produto final, da formulação como um todo, quantidade aplicada, frequência e modo de
aplicação (SAM-PAIO & RIVITTI, 2007).
• Sensibilização: Processo inflamatório que envolve mecanismo imunológico, do tipo celular, com tempo de
contato variável, de alguns dias ou mesmo alguns anos, até que o organismo reconheça um ou mais
ingredientes como alergênico. Em geral, é uma resposta que não ocorre nas primeiras aplicações, a não
ser que o indivíduo já se encontre sensibilizado a um dos ingredientes do produto, podendo aparecer em
outra área, diferente da área de aplicação. O processo alérgico pode decorrer tanto em função dos
ingredientes isolados, quanto da interação entre eles no produto, formando novo componente (SAMPAIO;
RIVITTI, 2007).
• As respostas de irritação e sensibilização do ponto de vista clínico são semelhantes, caracterizadas pela
ocorrência de um ou mais dos seguintes sinais clínicos: eritema, edema, pápula e pústula. Diferenciam-se
pelo fato da irritação ser dose dependente, enquanto que a sensibilização não: o indivíduo uma vez
sensibilizado desenvolverá a reação a toda exposição ao(s) ingrediente(s) (SAMPAIO; RIVITTI, 2007).
Modelos de Pele equivalentes
• Epiderme humana reconstruída – RHE (reconstructed human epidermis
• Queratinócitos humanos estratificados
• Episkin (L’óreal); Epiderm (Mattek )
• Modelo de pele completa – LSEs – living skin equivalentes
• Epiderme
• Derme
• Strata test (Stratatech – USA); Graftskin (Organogenesis); mattekepiderm ft (Mattek)
Conceitos Importantes
https://www.biocompare.com/3464-Tech-Insights/563796-More-Like-Life-Microporous-Membrane-Based-Culture-Systems/?arev=true
Transwell
https://www.biocompare.com/3464-Tech-Insights/563796-More-Like-Life-Microporous-
Membrane-Based-Culture-Systems/?arev=true
Episkin (L`Oreal) EpiDerm™ Skin Model
• suporte de colágenos
• queratinócitos de cultura
de 3 dias
• diferenciação em meio
ar/líquido
Modelo in house de Equivalente Dermo-epidérmico
Preparo da Derme
MOSCA, RC ; ISAAC, C. ; MATHOR, MB . The Mesenchymal Stem Cells Bioengineered Tissue Using Cobalt-60 Radiation. The Online Journal of Scientific Posters, v. 11, p. EP11682, 2012.
Preparo do Substituto
Colágeno Humano
Hidrogel
Gel de fibrina
Biomaterais para substituição da derme de cadáver
Testes de sensibilização
OECD 442C, D, E, A
Adverse outcome pathway” (AOP)
• Efeitos adversos – gerando os testes de segurança
• Uma AOP é um modelo que liga a exposição de uma
substancia aos efeitos tóxicos, por meio da
identificação da sequencia bioquímica de eventos
necessários para produzir o efeito tóxico
Diagrama de fluxo das vias associadas com a sensibilização cutânea
Fonte: adaptado de OECD, 2014.
AOP – Skin Sensitization
Skin Sensitization
• OECD TG 442C (2015) - Direct Peptide Reactivity Assay addressing the first
key event of the skin sensitization;
• OECD TG 442D (2018) – ARE - Nrf2 Luciferase Test Method addressing the
second key event of the skin sensitization.
• OECD TG 442E (2018) - In Vitro Skin Sensitisation - The third key event is
the activation of dendritic cells (DC) typically assessed by expression of
specific cell surface markers, chemokines and cytokines.
• The fourth key event is T- cell proliferation, which is indirectly evaluated in the
murine Local Lymph Node Assay (LLNA) (OECD 442 A, 2010).
In silico
• A metodologia in silico pode ser associada aos outros métodos in vitro de forma a produzir uma abordagem
ainda mais exata e precisa.
• Conhecimento acerca da estrutura de substâncias químicas e suas respectivas atividades e a semelhança
entre substâncias, é possível desenvolver relações de estrutura-atividade (quantitativas) [(Q)SARs],
capturá-las em ferramentas computacionais e predizer a atividade de um composto sobre o qual ainda não
se tem dados ou cujos dados são escassos a partir de outro composto parecido, porém sobre o qual já se
possui muitos dados (CRONIN et al., 2009; GRINDON et al., 2008).
• OECD vem trabalhando em conjunto com a European Chemicals Agency (ECHA), desde 2005, numa
ferramenta computacional, a OECD QSAR Toolbox.
• Predição do potencial de sensibilização cutânea = softwares já amplamente aceitos, como o DEREK
(Deductive Estimate of Risk from Existing Knowledge), TOPKAT (Toxicity Prediction by Komputer Assisted
Technology) e OASIS/TIMES (Tissue Metabolism Simulator) (GRINDON et al., 2008). Existem, ainda,
programas de computador capazes de estimar características físico-químicas, biofarmacêuticas, de
metabolismo e toxicidade de substâncias químicas como o ADMET Predictor™, da empresa americana
Simulations Plus (SIMULATIONS PLUS, 2020).
IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICAIn Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test
(OECD -431, 2004)
• Sistema teste: modelo in vitro de pele humana
• Princípio: substâncias corrosivas têm a capacidade de reduzir a viabilidade celular. Avaliar a capacidade da substância teste em penetrar no estrato córneo do modelo de pele humana*, por difusão ou erosão, e causar citotoxicidade nas camadas celulares inferiores.
• Corrosivo
• - viabilidade W 50%, após 3 min
• - viabilidade Y 50%, após 3 min e W
15%, após 1 hora
• Não-corrosivo:
• - viabilidade Y 50%, após 3 min
• - viabilidade Y 15%, após 1 hora
Corrosão/irritação dérmica
CORROSÃO/IRRITAÇÃODÉRMICA
• Definições:
• Corrosão dérmica: produção de danos irreversíveis a pele, como necrose visível
na epiderme e derme após aplicação da substância teste
• Irritação dérmica: produção de danos reversíveis na pele após aplicação da
substância teste
• Substâncias corrosivas são aquelas capazes de causar destruição visível ou
alterações irreversíveis em tecidos vivos no sítio de contato.
• Teste in vivo utiliza coelhos. Exposição de 3 minutos, 1 e 4 horas.
CORROSÃO/IRRITAÇÃODÉRMICA
• In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER): em
pele de rato
• In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test
• EPISKIN
• EpiDerm
IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICAIn Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test
• Sistema teste: modelo in vitro de pele humana
• Princípio: substâncias corrosivas têm a capacidade de reduzir a viabilidade celular.
Avaliar a capacidade da substância teste em penetrar no estrato córneo do modelo
de pele humana*, por difusão ou erosão, e causar citotoxicidade nas camadas
celulares inferiores.
EPISKIN™
• Modelo tridimensional da pele humana –
L`Oreal
• Substância aplicada sobre o material
• Líquidos – 50 L, sólidos – 20 mg
• 3, 60 e 240 minuto
• Viabilidade celular = MTT
• 35% de decréscimo na viabilidade celular
indica corrosividade na pele humana.
EpiDerm™
• MatTek Corporation
• Mecanicamente e funcionalmente parecida com o EPISKIN™.
• Líquidos e semi-sólidos = 50 L
• Sólidos = 25 mg + 25 L de água
• 3 e 60 minutos
• MTT
• Corrosivo se induzir 50% decréscimo de viabilidade celular em 3 minutos ou 85% a 60 minutos
TER em fragmentos de pele de rato
• Mede-se a resistência elétrica transcutânea após a aplicação da substância teste
• Materiais corrosivos provocam perda da integridade da função barreira do estrato córneo
• Pele de Ratos
• Líquido = 150 L; sólidos = 100 mg + 150 L de água
• 2 e 24 horas
ISO/TS 10993-20:2006 Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices
É possível montar um sistema
in vitro para avaliar a
imunotoxicologia dos
biomateriais ?
Skin Tissue Models. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00015-2
Novas abordagens
Hipóteses
Clinical Pharmacology: Advances and Applications 2016:8
163–176
Cultural evolution: Towards more predictive
in vitro models of biological systems
Making in vitro models more biologically relevant— and therefore
more predictive—requires continuous evaluation and redesign of
our ‘gold standard’ environments for cell and tissue culture
Ross Booth, Ph.D., Jun Park, Ph.D., Cindy Chen, Ph.D., Robin Clark, Ph.D., MilliporeSigma
Bioimpressoras
https://3dprintingindustry.com/news/biogelx-commences-
international-strategy-launching-3d-bioprinting-material-in-
brazil-163028/
Bioprinting – contrução de tecidos com
precisão de posicionamento das células
Electrospinning – tecidos funcionais
com materiais biocompatíveis
Conclusão
• Citotoxicidade primeiro teste biológico a ser realizado nos novos
biomateriais;
• Utilização de testes in vitro prioritariamente;
• Publicação com os testes in vitro = validação de métodos in vitro;
• Busca por novos testes alternativos ao uso de animais;
• In silico?
• Modelos imunotoxicológicos ?
• Bioimpressora?
Referências
• 3D bioprinting of skin tissue: From pre-processing to final product evaluation. 10.1016/j.addr.2018.07.016
• Construction of three-dimensional dermo-epidermal skin equivalents using cell coating technology and their utilization asalternative skin for permeation studies and skin irritation tests. DOI: 10.1089/ten.TEA.2016.0529
• Skin models for the testing of transdermal drugs. https://doi.org/10.2147/CPAA.S64788
• Advances in the Biofabrication of 3D Skin in vitro: Healthy and
• Pathological Models. doi: 10.3389/fbioe.2018.00154
• Alternatives to Biological Skin in Permeation Studies: Current Trends and Possibilities. doi:10.3390/pharmaceutics12020152
• Design and Fabrication of Human Skin by Three-Dimensional Bioprinting. DOI: 10.1089/ten.tec.2013.0335
• Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Constructs with Validated Morphology and Barrier Function. DOI:10.1089/ten.tec.2018.0318
• A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane InsertSystem for Multi-well Plates. URL: https://www.jove.com/video/56412. DOI: doi:10.3791/56412
• Immunocompetent human in vitro skin models. doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00015-2
Agradecimentos
Obrigada !!!!
patricia.lopes@unifesp.br
https://twitter.com/runawaylabbook/status/781509546728628224
https://www.glasbergen.com/ngg_tag/skin-cells/
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