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Aula de enzimologia

Tema

Fontes de enzimas industriais e perspectiva da enzimologia industrial

Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo – USPadriane@debiq.eel.usp.br

Sumário:

1) A natureza das enzimas2) Por que usar enzimas em processos industriais?3) Classes de enzimas4) Extratos vegetais5) Extratos animais6) Enzimas microbianas

3.1 Isolamento3.2 Metagenoma3.3 Evolução dirigida e Engenharia de Proteínas

Quais as principais formas de se aumentar a velocidade de reações?

•Aumento da concentração de reagentes

A velocidade de uma reação é proporcional às concentrações das espécies reagentes.

•Aumento da temperatura

Aumenta-se a movimentação térmica das moléculas e, consequentemente, aumenta-se a fração de moléculas com energia interna suficiente para atingir o estado de transição.

•Uso de catalisadores

Reduz-se a energia de ativação e, consequentemente, aumenta-se a fração de moléculas com energia interna suficiente para atingir o estado de transição.

O quê são enzimas?

São proteínas globulares que apresentam ação catalítica (aumentam a velocidade de reações químicas).

As enzimas:

• São sintetizadas pelas próprias células onde atuam;• Apresentam elevada especificidade de ação;• Podem ser expressas em maior ou menor quantidade, de acordo com as condições fisiológicas;• Apresentam atividade modulável, permitindo um ajuste fino do metabolismo

às necessidades celulares.

• As enzimas, como todos os catalisadores, são compostos capazes de aumentar a velocidade de reações químicas, sem alterar a proporção entre reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem serem efetivamente consumidos durante o processo.

• As enzimas aumentam a velocidade de reações químicas diminuindo a energia de ativação (quantidade de energia necessária para levar todas as moléculas de 1 mol de substância ao estado de transição).

• Não afetam o equilíbrio de reações.

Natureza das enzimas

A + B C + D

BAkv BA

DCK eq

velocidade equilíbrio

v relaciona-se com Eact

RT

Eact

ehTKk

Keq relaciona-se com ∆GeqKRTG ln

K – cte Boltzmanh – cte Planck

Por que usar enzimas em processos industriais?

Outros catalisadores em geral produzem:

•Reações inespecíficas podem resultar em baixo rendimento

• Altas temperaturas e/ou altas pressões, necessárias para acelerar as reações

• Produzem altos custos energéticos e podem requerer grandes volume de água de resfriamento

• Processos realizados a alta temperatura, pressão, acidez e alcalinidade necessitam de alto investimento e especialmente de equipamentos e sistemas de controle sofisticados

• Os subprodutos podem se difíceis de serem separados ou eliminados

•Impacto ambiental

Tudo isso pode ser diminuído usando enzimas

•Reações enzimáticas ocorrem em reações brandas de temperatura e pressão;

•são altamente específicas, envolvem reações rápidas e são realizadas por numerosas enzimas;

•Apenas pequenas quantidades de enzimas são requeridas nas reações químicas, mesmo em escala industrial, e portanto necessitam de pequeno espaço para armazenamento;

•Reações enzimáticas podem ser facilmente controladas e podem ser interrompidas rapidamente quando o grau de conversão de substrato é alcançado.

•Geram poucos resíduos – vantagem ambiental

•Desenvolvimento em genética e engenharia de proteínas aumentam a estabilidade, especificidade e o potencial de aplicação industrial.

Fontes de enzimas

As enzimas podem ser provenientes de:

• tecidos de organismos diferenciados (células vegetais e animais) papaína, extraída do latéx do mamoeiro, bromelina, obtida do talo do abacaxi

ficina, obtida do látex de figueiras proteinase, do sisal

amilases para a preparação de mostos de cerveja

renina usada na elaboração de queijos,

• microrganismos.

Classificação das enzimas em relação à reação catalisada (ENZYME COMMISSION)

NOMECLATURANOMECLATURA

Classes de enzimas Numero de subclasses

Tipo de reação

1. Oxidorredutases 20 Envolve o movimento de eletrons de uma molécula a outra. Em sistemas biológicos nós vemos a remoção de hidrogênio do substrato e as enzimas são chamadas desidrogenases.

2. Transferases 9 Envolve a transferência de grupos de átomos de uma molécula a outra

3. Hidrolases 12 Catalisa reações entre um substrato e a água. Moléculas grandes são quebradas em pequenas unidades.

4. Liases 7 Catalisam a adição de grupos a duplas ligações ou a formação de duplas ligações através da remoção de grupos.

5. Isomerases 6 Catalisam a transferência de grupos de uma posição a outra na mesma molécula.

6. Ligases 5 Ligam moléculas através de ligações covalentes..

O que significam os números do tipo “EC 2.7.1.1”?

Utilizando-se uma classificação proposta pela Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular.

Glicose + ATP Glicose-6P + ADPEnzima

Nome trivial: Hexoquinase

Nome Sistemático: ATP:glicose fosfotransferase (EC 2.7.1.1)

2: Transferase7: Fosfotransferase1: Fosfotransferase com grupo OH como aceptor1: Fosfotransferase com grupo OH da glicose como aceptor

Enzimas usadas em processos industriaisClasse Enzimas Industriais

1.Oxidorredutases PeroxidasesCatalasesGlucose oxidasesLacases

2.Transferases Frutosil-transferasesGlucosil-transferases

3.Hidrolases AmilasesCelulasesLipasesPectinasesProteasesPululanases

4.Liases Pectato liasesAlfa-acetolactoasedescarboxilases

5.Isomerases Glucose isomerase

6.Ligases No momento ainda não são usadas

Principais indústrias consumidoras de enzimas

Processo convencional para produção de enzimas

Perspectivas da Enzimologia Industrial

Tópicos:

• Estratégia de busca e descoberta de enzimas• Metagenoma• Mutação sitio dirigida• Evolução dirigida e Engenharia de Proteínas• Produção de enzimas com organismos geneticamente

modificados

Bacteria aerobia

Bacteria anaerobia

fungo

Como selecionar um bom catalisador?

Potencial biotecnológico dos fungos como degradadores de materiais lignocelulósicos

Enzimas microbianas Microrganismos:

1) Temperatura de crescimento:Psicrófilos - crescem abaixo de 20 oCMesófilos - 20 a 50 oCTermófilos - crescem acima de 55 oCHipertermófilos – crescem acima de 80 oC

2) pHAcidófilosNeutrófilosAlcalófilos 3) O2

Aeróbicos obrigatóriosAnaeróbicos obrigatóriosAnaeróbicos facultativosMicroaerófilos Aerotolerantes

4) Pressão osmótica (NaCl):HalotolerantesHalófilosHalófilos extremos

Estratégia de busca e descoberta de enzimas:

O conjunto catalítico de um microrganismo selvagem pode ser avaliado através de metodologias eficientes de:

1) seleção e/ou triagem da atividade enzimática para encontrar o biocatalisador ideal para o processo de interesse.

- O termo seleção é utilizado para técnicas que permitem o crescimento ou vantagem de sobrevivência aos organismos que apresentam a função enzimática de interesse

Enzimas termoestáveis Enzimas psicrófilasnArchae: temperaturas elevadas (~ 100 oC)

nAlta atividade catalitica e estabilidade em baixas temperaturas

nAlta salinidade nMaior flexibilidade – menos pontes dissulfeto e de hidrogênio

npH inferior a 2 ou superior a 10nEstresse nutricionalnExtremozimas – Taq polimerase

Enzimas de microrganismos extremófilos

O que é um bom catalisador?

Metagenoma

Hess et al., SCIENCE VOL 331 28 JANUARY 2011

37% foi a degradação de switchgrass no rúmen do animal em 72 h

Descoberta de genes relacionados à degradação de biomassa em genoma do rúmen de vaca

Atividade enzimática da comunidade microbiana:

Proteínas com alta identidade com enzimas não são as mais ativas

Os genes foram sequenciados e comparados com sequências de proteínas com potencial atividade de celulases (CAZy)

Mutagênese sítio dirigida - desenho racional

Requer conhecimento detalhado da estrutura da proteína – troca com precisão certos aminoácidos das enzimas

Nasrin Mollania, Khosro Khajeh , Bijan Ranjbar, Saman Hosseinkhani Enhancement of a bacterial laccase ∗thermostability through directed mutagenesis of a surface loop Enzyme and Microbial Technology 49 (2011) 446– 452

Mutação sítio dirigida aumentar a termoestabilidade de lacase

lacase de Bacillus sp. HR03

Substituição de Glu 188 por Lys e Arg (grupos positivos) ou por Ala

A - forma nativa; B - Glu-Lys C - Glu – Arg; D - Glu-Ala

Laccase foi expressa em E. coli, purificada (MM – 65 kDa)

Uma nova ponte salina foi formada entre Arg 188 e Glu 246

Termoestabilidade

Evolução dirigida

Exemplo de sucesso na evolução dirigida:

Enzima: mono-oxigenase de Bacillus megaterium

RH + O2 + NADH + H+ --- ROH + H2O + NAD+

Após dois ciclos de epPCR e 3 rodadas de StEP gerou cerca de 10.000 mutantes.

Após a triagem baseada no consumo de NADH, foi identificado um clone capaz de hidroxilar alcanos de cadeia curta, como propano e butano.

Esta aproximação em especial está relacionada à busca de uma enzima capaz de promover a hidroxilação de etano para gerar etanol

Produção de enzimas com organismos geneticamente modificados

Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provém de microrganismos que são um produto de programas de melhoramento genético

• Técnica:

Obter um fragmento de DNA que codifique a síntese de uma determinada enzima e introduzir este fragmento através de um vetor na célula hospedeira onde o código genético vai se reproduzir e se expressar.

As enzimas são produtos genéticos primários, o que torna muito atrativa

sua produção por esta via.

• Através dela pode-se conseguir:

- Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos;

- Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do

ponto de vista sanitário ou econômico;

-Melhorar o nível de produção e a pureza da enzima produzida.

• Problemática: estabilidade genética do microrganismo;

• Na prática: a reversão a estados sub-produtivos ou não-produtivos;

Exemplo: renina - protease de origem animal com alta demanda

Substituição por renina microbiana (de Mucor miehii): parcial.

Produção por tecnologia de DNA recombinante: Celltex, Genex, Genencor e Codon: produção de renina com cepas

de Escherichia coli (sem excreção); Genecor: produção de renina animal extracelular com cepas

Aspergillus nidulans. Outros centros: produção de renina com cepas de Saccharomyces

e Kluyveromyces. Gist-Brocades: renina animal produzida por cepas clonadas de

Kluyveromyces marxianus.

Produção de enzimas sintéticas

• Uma enzima, apesar de conter muitos aminoácidos, utiliza somente uma pequena porção destes no processo catalítico.

•Ex. Tripsina – 254 resíduos de aminoácidos, porém 3 aminoácidos são implicados no mecanismo de proteólise.•Os demais aminoácidos – importantes para formar o sitio de união ao substrato

•Construir uma enzima nova ainda é inviável – não é possível predizer a estrutura tridimensional

Pontos importantes:

- Utilização de enzimas mais que duplicou nos últimos anos

- Acesso a patentes

- Mercado de enzimas dividido em três segmentos:1) Enzimas técnicas – destinadas à indústria têxtil e de produtos de limpeza2) Enzimas para alimentos e bebidas3) Enzimas para ração animal

- O mercado de enzimas produzidas por tecnologia do DNA recombinante – plena expansão

Material para leitura:

1) Purificação de Produtos Biotecnológicos , Editora Manole, Adalberto Pessoa Jr, Beatriz Kilikian (coordenadores) . cap2 – Rompimento celular

2) Bioprospecting metagenomes: glycosyl hydrolases for converting biomass Biotechnology for biofuels Li et al, 2009; 2:10