aula 6 métodos de análise de proteínas
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MÉTODOS DE ANÁLISE DE PROTEÍNAS
BROMATOLOGIA PROFª MÁRCIA CRESTANI BIN
Avaliação de proteínas em alimentos
• Métodos químicos• Métodos físicos• Métodos biológicos• Métodos microbiológicos e
enzimáticos
MÉTODOS QUÍMICOS
• Métodos que analisam teor de C:
– digestão mais fácil do que para o nitrogênio;
– menores erros no resultado por causa da maior quantidade em relação ao nitrogênio;
– fator de correção mais constante que para o nitrogênio;
– maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos de outros componentes.
ANÁLISE DO N
ANÁLISE DO C
MÉTODOS QUÍMICOS
MÉTODO DE KJELDAHL
Johann Kjeldahl(1849-1900)
Desenvolveu em 1883 o processo básico para determinação de nitrogênio orgânico total. Os passos incluem:
-Digestão: H2SO4 a 350ºC-400ºC + catalisador
-Neutralização e destilação
-Titulação
-Conversão do teor de nitrogênio para teor de proteína
Esse método determina N orgânico total: N protéico e N não-protéico.
ANÁLISE DO N
Etapa de digestão
K2SO4: aumenta o ponto de ebulição do H2SO4 (de 337ºC para mais de 400ºC), torna a digestão mais eficiente;
CuSO4: Catalisador. Acelera o processo de oxidação da matéria orgânica.
Aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para a digestão até que o C e H sejam oxidados e o N da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia.
Microdigestor de Kjeldahl
Etapa de neutralização e destilação
Destilador
Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico e indicador, formando borato de amônia.
Destilador de Nitrogênio Kjeldahl
Etapa de titulação
O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl ou H2SO4) padronizada.
Etapa de titulação
Conversão do teor de N para proteína bruta
A maioria dos alimentos possui em média 16% de nitrogênio, portanto:
16g N ___ 100g proteínas 1g N ____ Xg
Xg = 100/16 = 6,25
é obtido pela multiplicação do teor de N total pelo fator de conversão (6,25).
O teor de proteína bruta de um alimento
O conteúdo de proteína para alimentos específicos pode utilizar fatores específicos:
Método de Kjeldahl
• Vantagens – Aplicável a todos os tipos de alimentos– Relativamente simples– Não é caro– Preciso. Trata-se de um método oficial para a
determinação de proteínas– Pode ser utilizado para análise de microgramas de
proteína (micro Kjeldhal)
• Desvantagens – Mede Nitrogênio orgânico total, não apenas
nitrogênio de proteínas– Demorado- Utiliza reagentes corrosivos.
Método de Kjeldahl
Outras possíveis fontes de N na amostra:
Métodos químicos por grupos
METODO DE BIURETO
• Substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas.
• A intensidade da cor é proporcional a quantidade de proteínas
METODO DE BIURETO
• Vantagens – Ser bastante específico por não apresentar problemas de
interferentes.– É simples, rápido e barato.– Por envolver uma reação com a ligação peptídica, o método
determina proteína, ao contrário do método de Kjeldahl que determina N total
• Desvantagens – A necessidade de uma curva de calibração tomada com um
padrão conhecido de proteína, por exemplo, uma proteína determinada por Kjeldahl.
– A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas, porém os desvios causados são menores do que em outros métodos colorimétricos
Métodos químicos por grupos
MÉTODO DO FENOL (Folin-Ciocalteau – Lowry)
• Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas;
• Reação colorimétrica envolve uma oxidação catalisada por cobre, de aas aromáticos por um reagente heteropolifosfato, desenvolvendo uma cor azul que vai ser medida num colorímetro e comparada com uma curva padrão.
Métodos químicos por grupos
ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
Proteínas possuem absorção UV em 280 nm devido à presença de tirosina, triptofano e fenilalanina
MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS
Medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente precipitante, como TCA, ferricianato de potássio e ácido sulfossalicílico
Métodos químicos por grupos
MÉTODOS DE DYE-BINDING
• Quando uma amostra é tratada com corante (excesso) que reage com proteína quantitativamente para formar um complexo insolúvel que pode ser separado. O excesso de corante não reagido em solução é medido colorimetricamente;
• Utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais e animais e laticínios;
• Boa correlação com o método oficial.
MÉTODOS FÍSICOS
• Não muito utilizados;
• Utiliza-se para avaliação da qualidade de proteínas e não da quantidade;
• Índice de refração, densidade específica, viscosidade; tensão superficial; condutividade; polarização.
MÉTODOS BIOLÓGICOS
Princípios importantes:
• Balanço de nitrogênio • Crescimento • Valor biológico da proteína• Digestibilidade da proteína
90 % urina10 % fezes
Nitrogênio ingerido
Nitrogênio excretado
INDIVÍDUO SAUDÁVEL + DIETA BALANCEADA
EQUILÍBRIO NITROGENADO
Balanço do Nitrogênio
Balanço de N BN = NI – (NF + NU)
Digestibilidade
Valor biológico
NPU
Crescimento
• PER: Quociente de eficiência protéica: ganho de peso pela quantidade de proteína ingerida em um grupo de ratos
• NPR: Quociente de eficiência líquida da proteína: ganho de peso expresso em gramas frente a um grupo controle que não recebeu proteína. Avalia a capacidade de sustentar o crescimento e capacidade de sustentar a manutenção do organismo através da proteína.
Crescimento
Simulam a perda de peso sem usar 2 grupos:
PI = peso inicial
PF = peso final
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
• Certos micro-organismos são usados para medir o valor nutritivo de proteínas.
• Baseia-se na avaliação de aminoácidos essenciais comuns entre homem e microorganismos.
• Verifica-se o crescimento de micro-organismos na presença da proteína teste.
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
• Utilizados para medir a digestibilidade e biodisponibilidade de aminoácidos essenciais. Utiliza pepsina, pancreatina.
• Simula in vitro as condições estomacais e intestinais para pesquisar a digestibilidade.
• Outro método a proteína é digerida por 3 enzimas (quimiotripsina, tripsina pancreática e peptidase intestinal suína).
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