anomalias cromossômicas no início do desenvolvimento de embriões zebuínos produzidos in vitro...

Anomalias cromossômicas no início do desenvolvimento de embriões

zebuínos produzidos in vitroRITA MARIA LADEIRA PIRES2, RAFAEL HERRERA ALVAREZ2, ANA CRISTINA

LIGORI2, LIA DE ALENCAR COELHO,2,3,ANTÔNIO CAMPANHA MARTINEZ2

Discente: Carolina de Souza StuchiDocente: Dra. M. Tercília V. de A. Oliveira

INTRODUÇÃO• Atualmente o Brasil ocupa um lugar de destaque no emprego de

tecnologias relacionadas à transferência de embrião (TE).

• Finalidade principal: multiplicação de animais que apresentam características genéticas de alto valor de mercado.

Líder Mundial: 25 mil transferências de embriões FIV por ano (Sociedade Internacional de Transferência de Embriões)

Introdução

Esses problemas têm sido atribuídos, entre outros, às alterações celulares de ordem genética e estrutural dos embriões.

Uso de embriões FIV

Melhora no processo de produção

Problemas

• Mortalidade embrionária precoce (abortos espontâneos);• produção de bezerros “gigantes”;• desvio da taxa de sexo (machos);• problemas de saúde dos bezerros nascidos.

Existem evidências de que manipulações e/ou os métodos de cultivo in vitro provocam alterações estruturais e funcionais nos embriões.

• Estudos mostram a existência de anomalias cromossômicas em embriões FIV e PIV bovinos de raças européias, mas não existem informações para as raças zebuínas.

• Considerando que as raças zebuínas representam a grande maioria da população bovina do Brasil e constituem o principal mercado das empresas de FIV no País, informações são importantes.

Objetivo: caracterizar a incidência de alterações cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento.

Introdução

≠

MATERIAL E MÉTODOSEmbriões FIV1. Ovários de fêmeas zebuínas (Nelore) foram coletados em um

frigorífico colocados em solução salina (NaCl a 0,9 %) + estreptomicina (100 μg mL-1) + penicilina (100 UI mL-1) transportados ao laboratório em uma caixa térmica (30 a 35⁰C).

2. Os oócitos foram aspirados dos folículos ovarianos no período de 4 h após o abate lavados em meio H-199, constituído de TCM suplementado com Hepes (25 mM) + piruvato (2,73 mM) + sulfato gentamicina (50 μg mL-1) + soro fetal bovino (5%) avaliados por critérios morfológicos (somente foram utilizados os que apresentaram um cumulus oophorus intacto).

Material e Métodos

3. Os oócitos selecionados foram colocados em meio B-199, constituído de meio TCM 199 suplementado com Hepes (16,79 mM) + bicarbonato de sódio (28,57 mM) + piruvato de sódio (2,73 mM) + sulfato de gentamicina (50 μg mL-1) + albumina sérica bovina-BSA (4 mg mL-1).

4. Maturação dos oócitos: Colocados em meio B-199 + estradiol 17β (1 μg mL-1) +

PMSG (20 UI mL-1) + hCG (10 UI mL-1) incubação durante 24h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2).

5. Fertilização in vitro: Após maturados, os oócitos foram lavados em meio H-199 +

TALP-FIV e distribuídos em gotas sob óleo mineral. Cada gota formada de 70 μL de meio TALP-FIV-PHE + 10 μL de suspensão de espermatozóides à concentração de 10X106 mL-1 + 20 μL de suspensão contendo 10-12 oócitos colocados por 18 a 21h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2) para a fecundação.

6. Os oócitos (presumivelmente fecundados) foram lavados transferidos para gotas de desenvolvimento, constituídas de 78 μL meio B-199-CEOB + 2 μL de fragmentos de células epiteliais de oviduto bovino + 20 μL de suspensão contendo 10 oócitos foram cultivados em estufa nas mesmas condições.

7. Ao alcançar os estágios de 2; 4; 8; 16 células e mórula compacta os embriões foram submetidos à análise citogenética.

Material e Métodos

Material e Métodos

Embriões PIV

• Os embriões foram obtidos de vacas Nelore superovuladas com FSH-LH.

1. A lavagem dos cornos uterinos foi realizada por via cervical, no dia 7 após a inseminação (com sêmen do mesmo touro usado nos embriões FIV).

2. Os embriões foram avaliados morfologicamente e em seguida foram submetidos ao processo de cariotipagem de forma semelhante aos embriões FIV.

Utilizadas Mórulas Grau I e II produzidas in vivo como controle da incidência de anomalias cromossômicas.

Material e Métodos

Análise cromossômica dos embriões

• Os embriões foram cultivados durante 8 a 12 horas em meio TCM + soro fetal bovino (10%) + colchicina (0,03 μg mL-1) transferidos para uma solução hipotônica de citrato de sódio 0,9% (10 minutos a 20⁰C).

• Fixados sobre uma lâmina, com metanol:ácido acético (3:1) e corados com Giemsa.

A análise cromossômica foi realizada em microscópio óptico.

Análise estatística de dados

Teste de Quiquadrado (χ2) com correção de Yates.

Coloração Usual com Giemsa

• Protocolo:

– Envelhecer as lâminas em estufa a 60⁰C por um dia;– Hidrólise em HCl 1N a 60 ⁰ C por 7 minutos;– Mergulhar as lâminas em água deionizada gelada;– Lavar as lâminas em água destilada por 10 minutos;– Levá-las a um borel com solução de tampão Sorensen de 1 a 2

minutos;– Mergulhar as lâminas em uma solução de Giemsa tamponada a 2%

por 5 minutos;– Por fim, lavar as lâminas em água deionizada e colocá-las para secar.

Permite a visualização e classificação dos cromossomos por grupos de acordo com o tamanho e a posição do centrômero.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

• 29,9% (32/107)dos embriões FIV analisados apresentaram anomalias cromossômicas.

• Os embriões PIV (mórulas) apresentaram uma incidência de 13,0% (3/23).

não evidenciaram diferenças significativas entre os

diferentes estágios de desenvolvimento precoce do embrião bovino (Figura 1).

Figura 1. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento (MoPIV = mórulas produzidas in vivo)

24,1%

32,1%39,1%

26,7% 25%

13%

Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

• Anomalias observadas: mixoploidia e poliploidia (para FIV e PIV).

• A mixoploidia apresentou diferentes rearranjos: – n/2n; 2n/3n; 2n/4n, 3n/4n;– Em mais de 80% dos casos existiu uma linhagem celular normal de 2n=60.

• A incidência de poliploidia (3n e 4n) dos embriões FIV:– 0,9 % nos estágios de mórula;– 10,3 % de 2 a 16 células.

Sugere que o desenvolvimento de embriões poliplóides é menor e aparentemente reprimido a partir do terceiro ciclo celular.

Resultados e Discussão

• As poliploidias podem ser explicadas por erros na fertilização:– penetração de mais de um espermatozóide no óvulo;– não expulsão do segundo corpúsculo polar;– fertilização de um óvulo diplóide por um espermatozóide.

• Dos 32 embriões FIV que apresentaram anomalias:– 19 (59,4%) eram do sexo feminino;– 13 (40,6%) do masculino (Figura 2).

Poderia eventualmente explicar o maior número de nascimento de bezerros machos oriundos de embriões FIV.

Resultados e Discussão

Figura 2. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV conforme o sexo do embrião

40,6%

59,4%

CONCLUSÃO

Aproximadamente um terço dos embriões zebuínos FIV apresentam anomalias cromossômicas e sua incidência independe do estágio de desenvolvimento embrionário.

Obrigada!