Anomalias cromossômicas no início do desenvolvimento de embriões

zebuínos produzidos in vitroRITA MARIA LADEIRA PIRES2, RAFAEL HERRERA ALVAREZ2, ANA CRISTINA

LIGORI2, LIA DE ALENCAR COELHO,2,3,ANTÔNIO CAMPANHA MARTINEZ2

Discente: Carolina de Souza StuchiDocente: Dra. M. Tercília V. de A. Oliveira

INTRODUÇÃO• Atualmente o Brasil ocupa um lugar de destaque no emprego de

tecnologias relacionadas à transferência de embrião (TE).

• Finalidade principal: multiplicação de animais que apresentam características genéticas de alto valor de mercado.

Líder Mundial: 25 mil transferências de embriões FIV por ano (Sociedade Internacional de Transferência de Embriões)

Introdução

Esses problemas têm sido atribuídos, entre outros, às alterações celulares de ordem genética e estrutural dos embriões.

Uso de embriões FIV

Melhora no processo de produção

Problemas

• Mortalidade embrionária precoce (abortos espontâneos);• produção de bezerros “gigantes”;• desvio da taxa de sexo (machos);• problemas de saúde dos bezerros nascidos.

Existem evidências de que manipulações e/ou os métodos de cultivo in vitro provocam alterações estruturais e funcionais nos embriões.

• Estudos mostram a existência de anomalias cromossômicas em embriões FIV e PIV bovinos de raças européias, mas não existem informações para as raças zebuínas.

• Considerando que as raças zebuínas representam a grande maioria da população bovina do Brasil e constituem o principal mercado das empresas de FIV no País, informações são importantes.

Objetivo: caracterizar a incidência de alterações cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento.

Introdução

≠

MATERIAL E MÉTODOSEmbriões FIV1. Ovários de fêmeas zebuínas (Nelore) foram coletados em um

frigorífico colocados em solução salina (NaCl a 0,9 %) + estreptomicina (100 μg mL-1) + penicilina (100 UI mL-1) transportados ao laboratório em uma caixa térmica (30 a 35⁰C).

2. Os oócitos foram aspirados dos folículos ovarianos no período de 4 h após o abate lavados em meio H-199, constituído de TCM suplementado com Hepes (25 mM) + piruvato (2,73 mM) + sulfato gentamicina (50 μg mL-1) + soro fetal bovino (5%) avaliados por critérios morfológicos (somente foram utilizados os que apresentaram um cumulus oophorus intacto).

Material e Métodos

3. Os oócitos selecionados foram colocados em meio B-199, constituído de meio TCM 199 suplementado com Hepes (16,79 mM) + bicarbonato de sódio (28,57 mM) + piruvato de sódio (2,73 mM) + sulfato de gentamicina (50 μg mL-1) + albumina sérica bovina-BSA (4 mg mL-1).

4. Maturação dos oócitos: Colocados em meio B-199 + estradiol 17β (1 μg mL-1) +

PMSG (20 UI mL-1) + hCG (10 UI mL-1) incubação durante 24h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2).

5. Fertilização in vitro: Após maturados, os oócitos foram lavados em meio H-199 +

TALP-FIV e distribuídos em gotas sob óleo mineral. Cada gota formada de 70 μL de meio TALP-FIV-PHE + 10 μL de suspensão de espermatozóides à concentração de 10X106 mL-1 + 20 μL de suspensão contendo 10-12 oócitos colocados por 18 a 21h em estufa (38,5⁰C e 5% de CO2) para a fecundação.

6. Os oócitos (presumivelmente fecundados) foram lavados transferidos para gotas de desenvolvimento, constituídas de 78 μL meio B-199-CEOB + 2 μL de fragmentos de células epiteliais de oviduto bovino + 20 μL de suspensão contendo 10 oócitos foram cultivados em estufa nas mesmas condições.

7. Ao alcançar os estágios de 2; 4; 8; 16 células e mórula compacta os embriões foram submetidos à análise citogenética.

Material e Métodos

Material e Métodos

Embriões PIV

• Os embriões foram obtidos de vacas Nelore superovuladas com FSH-LH.

1. A lavagem dos cornos uterinos foi realizada por via cervical, no dia 7 após a inseminação (com sêmen do mesmo touro usado nos embriões FIV).

2. Os embriões foram avaliados morfologicamente e em seguida foram submetidos ao processo de cariotipagem de forma semelhante aos embriões FIV.

Utilizadas Mórulas Grau I e II produzidas in vivo como controle da incidência de anomalias cromossômicas.

Material e Métodos

Análise cromossômica dos embriões

• Os embriões foram cultivados durante 8 a 12 horas em meio TCM + soro fetal bovino (10%) + colchicina (0,03 μg mL-1) transferidos para uma solução hipotônica de citrato de sódio 0,9% (10 minutos a 20⁰C).

• Fixados sobre uma lâmina, com metanol:ácido acético (3:1) e corados com Giemsa.

A análise cromossômica foi realizada em microscópio óptico.

Análise estatística de dados

Teste de Quiquadrado (χ2) com correção de Yates.

Coloração Usual com Giemsa

• Protocolo:

– Envelhecer as lâminas em estufa a 60⁰C por um dia;– Hidrólise em HCl 1N a 60 ⁰ C por 7 minutos;– Mergulhar as lâminas em água deionizada gelada;– Lavar as lâminas em água destilada por 10 minutos;– Levá-las a um borel com solução de tampão Sorensen de 1 a 2

minutos;– Mergulhar as lâminas em uma solução de Giemsa tamponada a 2%

por 5 minutos;– Por fim, lavar as lâminas em água deionizada e colocá-las para secar.

Permite a visualização e classificação dos cromossomos por grupos de acordo com o tamanho e a posição do centrômero.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

• 29,9% (32/107)dos embriões FIV analisados apresentaram anomalias cromossômicas.

• Os embriões PIV (mórulas) apresentaram uma incidência de 13,0% (3/23).

não evidenciaram diferenças significativas entre os

diferentes estágios de desenvolvimento precoce do embrião bovino (Figura 1).

Figura 1. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV em diferentes estágios de desenvolvimento (MoPIV = mórulas produzidas in vivo)

24,1%

32,1%39,1%

26,7% 25%

13%

Resultados e Discussão

Resultados e Discussão

• Anomalias observadas: mixoploidia e poliploidia (para FIV e PIV).

• A mixoploidia apresentou diferentes rearranjos: – n/2n; 2n/3n; 2n/4n, 3n/4n;– Em mais de 80% dos casos existiu uma linhagem celular normal de 2n=60.

• A incidência de poliploidia (3n e 4n) dos embriões FIV:– 0,9 % nos estágios de mórula;– 10,3 % de 2 a 16 células.

Sugere que o desenvolvimento de embriões poliplóides é menor e aparentemente reprimido a partir do terceiro ciclo celular.

Resultados e Discussão

• As poliploidias podem ser explicadas por erros na fertilização:– penetração de mais de um espermatozóide no óvulo;– não expulsão do segundo corpúsculo polar;– fertilização de um óvulo diplóide por um espermatozóide.

• Dos 32 embriões FIV que apresentaram anomalias:– 19 (59,4%) eram do sexo feminino;– 13 (40,6%) do masculino (Figura 2).

Poderia eventualmente explicar o maior número de nascimento de bezerros machos oriundos de embriões FIV.

Resultados e Discussão

Figura 2. Anomalias cromossômicas de embriões zebuínos FIV conforme o sexo do embrião

40,6%

59,4%

CONCLUSÃO

Aproximadamente um terço dos embriões zebuínos FIV apresentam anomalias cromossômicas e sua incidência independe do estágio de desenvolvimento embrionário.

Obrigada!