ana sofia oliveira carolina silveira caroline amurim katielle brauner maitê becker universidade...

METAGENÔMICA

Ana Sofia OliveiraCarolina SilveiraCaroline AmurimKatielle BraunerMaitê Becker

Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento

TecnológicoDisciplina de Genômica II

Abordagens...Histórico

Conceito e objetivo

Biblioteca genômica

Metagenômica Viral

Extração de DNA e contaminantes

Ferramentas

Aplicações biotecnológicas

Histórico

O termo “metagenômica” foi utilizado pela primeira vez por Jo Handelsman,

professora de biologia molecular e celular, em 1998.

John Craig Venter foi o pioneiro em pesquisas de metagenômica, realizou importantes coletas de amostras ambientais, com o objetivo de mostrar comunidades bacterianas presentes no mar de Sargaços.

O que é?

Análise genômica das comunidades de microrganismos de um

determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo

Genômica Microbiana X Metagenômica

GenômicaMicrobiana

• Os microrganismos podem ser estudados individualmente;

• Apenas 1% dos microrganismos podem ser cultivados em laboratório;

Metagenômica

• Pode identificar uma espécie, ou a comunidade como um todo;

• Identificação de novas espécies, genes ou moléculas;

Objetivo: Identificar genes funcionais e novas vias

metabólicas; Estimar a diversidade microbiana, permitindo o

estudo dos genomas em uma comunidade como um todo;

Compreender a dinâmica de uma população inteira;

Identificar biomarcadores úteis para classificar um tipo de processo ocorrido em ambientes específicos, como um ambiente poluído, por exemplo;

Montar o genoma de um organismo não cultivado;

Biblioteca Metagenômica

Conjunto de clones recombinantes que contém parte do DNA presente

em determinado ambiente ou amostra, não sendo possível garantir que todo o DNA de todas as espécies

estejam presentes na biblioteca.

Construção:

Pequenos insertos (<10kb): plasmídeos

Grandes insertos (25-40kb): cosmídeos

Maiores insertos ( 200kb): BAC

Análise:

Sequência

Atividade funcional

Sequência

Vantagem: não depende da

expressão dos genes clonados.

Desvantagem: quando quer analisar o gene completo, pode obter genes já conhecidos.

Análise funcional

Quando não encontra similaridade entre sequências.

Indicada para identificação de clones que expressem uma característica desejada.

Metagenômica Viral

Início em 2002.

Sequênciamento foi rápido pelo motivo que os tamanhos dos DNAs virais eram de 50kb.

Comparação:

3 amostras Sequenciamento GenBank (65%)

Conclusão: Enquanto as comunidades

bacterianas são bem conhecidas, as virais mostram ser relativamente não caracterizadas.

Clonagem da metagenômica viral:

Isolamento do DNA viral :

Filtragem Tratamento com DNAse Centrifugação com cloreto de césio

DNA viral é clonado em vetores e inserido em células hospedeiras.

CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA

Análise de impacto

O comprimento das subsequências

A métrica de distância usada para medir a similaridade das sequências

A estratégia de classificação (Normal ou hierárquica)

Classificação de sequenciamento

Sequenciamento pelo método de Sanger (Primeira geração):

Necessidade de clonar fragmentos Problema de clonagem Maior tempo e custo

Sequenciamento de genomas: Mascara a sequencia do vetor usado na

clonagem, todos os fragmentos de DNA são do mesmo organismo

Sequenciamento de Segunda geração: Direto, sem a necessidade de clonar os

fragmentos de DNA Menor tempo e custo Grande quantidade de sequência por

corrida

Extração da amostra

SOLO

ÁGUA SALGADA

MICROBIOTA HUMANA

Métodos para o isolamento de DNA

Indireta ou de fracionamento: Microrganismos separados do substrato

anteriormente a lise Estratégia usada para solos contendo

uma grande quantidade de contaminante Estresse mecânico no DNA genômico é

reduzido Possível perda de microrganismos Clonados em vetores como cosmídeos e

BAC

Direto: Adequados para vários tipos de solos Menos trabalhosos Maior rendimento de DNA de alto peso

molecular Microrganismos lisados no contexto do

substrato Clonagem em vetores plasmídeos ou fago Promotores fortes para facilitar a

expressão genica do fragmento clonado

Contamimantes

Co-extração de DNA (ácidos húmicos,...)

DNA extracelular de fungos, bactérias e células de plantas mortas

Propriedades de solubilidade similares ao DNA

Interferem negativamente na atuação da taq DNA polimerase

Afetam na eficiência de hibridização DNA-DNA

Afetam em processos de transformação do DNA

Ferramentas

Mudanças na variedade e estrutura de uma comunidade microbiana permite a identificação dos microrganismos de um certo ambiente.

• mRNA expressos.Metatranscriptoma

• proteínas expressas.Metaproteômica

Metaproteômica

Fornece a evidencia da expressão do gene sob uma determinada condição.

Exemplo: Genes devem ter sido transcritos e

traduzidos para produzir um produto da proteína para uma melhor avaliação da função microbiana.

Metatranscriptoma

Utiliza-se de microarrays para explorar a atividade bacteriana das espécies;

Correlaciona a presença de um gene e as características de um determinado ambiente;

Utilizada para descobertas de regiões do gene onde podem codificar produtos de interesse biotecnológico.

Metatranscriptoma

Exemplo: Enzimas utilizadas como biorreatores.

Arrays

São os arranjos filogenéticos, sequenciamentos de regiões gênicas conservadas que podem possibilitar a identificação dos gêneros estudados.

Microarrays

Consiste em um arranjo pré-definido de

moléculas de DNA, quimicamente ligados a uma base sólida.

Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucléicos provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado no array.

Luz = Hibridização

Microarrays

Microarrays

São usados para:

Quantificar a diversidade ambiental bacteriana;

Monitorar a expressão gênica;

Categorizar genes envolvidos em determinados processos.

Bioinformática

Gerenciamento, interpretação e distribuição do grande volume de

informações obtidas a partir de projetos genoma.

Taxonomia e filogenia.

Bioinformática

As sequencias de nucleotídeos serão comparadas com sequencias existentes no GenBank (principal banco de dados), que são acessadas através do NCBI

utilizando a ferramenta BLAST que auxilia na identificação da espécie do

DNA sequenciado.

Bioinformática

O NCBI foi criado para desenvolver ferramentas de bioinformática para armazenar e analisar todo o conhecimento sobre a biologia molecular, bioquímica e genética.

Áplicações da metagenomica

Aplicações biotecnológicas

Saúde Humana

com esta técnica pode localizar as bactérias nos nossos intestinos e descobrir a sua função, o que pode ajudar-nos a estudar algumas condições, tais como a obesidade e a diabetes.

Biorremediação

Agricultura

Interação entre bactérias e o solo;

Condução dessas comunidades para

um melhor aproveitamento e redução

de impactos ambientais.

Enzimas e biocombustíveis

Obrigada!