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USC

UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

ALTERAÇÕES DAS FIBRAS MUSCULARES ESTRIADAS ESQUELÉTICAS DESNERVADAS E

REINERVADAS EM DIFERENTES PERÍODOS

MARCELO MORGUETI

Bauru-2005

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Dissertação de Mestrado – Morgueti, M.

USC UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

ALTERAÇÕES DAS FIBRAS MUSCULARES ESTRIADAS ESQUELÉTICAS DESNERVADAS E

REINERVADAS EM DIFERENTES PERÍODOS

MARCELO MORGUETI

Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da USC - Universidade do Sagrado Coração, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, no Programa de Pós-graduação em Odontologia. Área de Concentração: Biologia Oral Orientador: Prof. Dr. Jesus Carlos Andreo

Bauru- 2005

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USC

UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO

NOTAS DA BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DO MESTRADO

MARCELO MORGUETI

ALTERAÇÕES DAS FIBRAS MUSCULARES ESTRIADAS ESQUELÉTICAS DESNERVADAS E REINERVADAS EM

DIFERENTES PERÍODOS

DATA DA DEFESA: ____/_____/_____

PROF. DR. JESUS CARLOS ANDREO

AVALIAÇÃO: _________________ ASSINATURA________________

PROF. DR. ANTONIO DE CASTRO RODRIGUES


PROFª. DRª. ANGELA M. O. KINOSHITA


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DEDICATÓRIAS

Á DEUS,

Pela presença constante em minha vida, sempre iluminando os melhores caminhos

a seguir. Tudo o que conquistei até hoje, foi pela força de SUA luz divina.

“SEM ELE NADA É POSSÍVEL”;

AOS MEUS PAIS,

DORIVAL E SÔNIA, pelos ensinamentos dados durante todos esses anos, que

auxiliaram na construção do meu alicerce de vida e são meus grandes exemplos e

apoio em todos os momentos;

AO MEU IRMÃO

LUCIANO, por todos esses anos de convivência e amizade entre nós como

alicerce de grande união;

Á FLÁVIA, minha companheira de todas as horas, pelo apoio, incentivo,

companheirismo, carinho e paciência. Sem sua ajuda este trabalho não se

realizaria, obrigada.

AO MARCOS E BRUNA, pelo carinho e compreensão. Que este trabalho lhes

sirva de exemplo para seus futuros.

4


AGRADECIMENTOS

AO PROF. DR. JESUS CARLOS ANDREO, orientador que sempre me recebeu

com atenção e carinho, transmitindo-me valiosos ensinamentos;

AO PROF. DR. ANTÔNIO CASTRO RODRIGUES, que juntamente com meu

orientador, colaborou na elaboração deste trabalho com dedicação e carinho;

Á PROF. DRA. ANGELA MITIE OTTA KINOSHITA, professora de Técnicas Físicas

Aplicadas ao Complexo Bucomaxilofacial da Universidade do Sagrado Coração –

Bauru, PARTICIPANTE DA MINHA BANCA DE DEFESA DE MESTRADO, o meu

muito obrigado pela participação ativa;

A UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO, na pessoa do Sr. Pró-Reitor de

Pesquisa e Pós-Graduação Dr. JOSÉ JOBSON DE ANDRADE ARRUDA, o meu

muito obrigada pela realização de mais um sonho;

A COORDENADORIA DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ORAL

PROF. DR. SÉRGIO CATANZARO, pela sua amizade, dedicação, ensinamentos e

orientação;

A SECRETARIA DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO, na pessoa da Srta. ANGELA

MORAES, pela dedicação durante o decorrer dos anos de curso;

À PROF.ª MARIA BEATRIZ DE BARROS MORAES TRAZZI, PRÓ-REITORA DE

AÇÃO COMUNITÁRIA E UNIMAR - UNIVERSIDADE DE MARÍLIA, pela dedicação

e presteza na correção deste trabalho;

5


AO PROF. DR. PADOVANI, Prof. da disciplina de Bioestatística da USC –

Universidade do Sagrado Coração – Bauru, pela presteza e dedicação na

confecção da parte estatística deste trabalho, o meu muito obrigado

AOS COLEGAS DO LABORATÓRIO DE HISTOLOGIA DA UNIVERSIDADE DO

SAGRADO CORAÇÃO – BAURU, pela elaboração da parte histológica deste

trabalho;

AOS MEUS COLEGAS DO MESTRADO, EM ESPECIAL À DANIELA VIEIRA

BUCHAIM E FÁBIO FREIRIA BARBOSA, pelo companheirismo e amizade durante

o curso;

AOS FUNCIONÁRIOS DO BIOTÉRIO, DA UNIVERSIDADE DE MARÍLIA,

UNIMAR, ROBERTO E NADIR, pela atenção dispensada durante a realização

deste trabalho;

A COORDENADORA DO CURSO DE FISIOTERAPIA DA UNIVERSIDADE DE

MARÍLIA, UNIMAR, PROF. DRA. CECÍLIA BARROS, pela compreensão durante

minhas ausências;

AO DIRETOR DO CURSO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DA UNIVERSIDADE DE

MARÍLIA – UNIMAR, PROF. DR. ARMANDO CASTELLO BRANCO JUNIOR, pela

compreensão durante o curso de mestrado;

Ao amigo SALVIANO OLIVEIRA, secretário da Pró-Reitoria da Graduação da

UNIMAR – Universidade de Marília, pela dedicação e desempenho na confecção

dos gráficos deste trabalho.

A TODOS QUE DE ALGUMA FORMA CONTRIBUÍRAM PARA A ELABORAÇÃO E

CONCLUSÃO DESTE TRABALHO, O MEU MUITO OBRIGADO.

6


“EMBORA NINGUEM POSSA

VOLTAR ATRÁS E FAZER UM

NOVO COMEÇO, QUALQUER UM

PODE COMEÇAR AGORA E

FAZER UM NOVO FIM”.

(CHICO XAVIER)

7


RESUMO

O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo experimental sobre a desnervação

e a reinervação do músculo sóleo de rato e observar sob critérios morfológicos e

morfométricos, em qual período pós reinervação pode se obter um melhor padrão

do referido músculo. Para isso foram utilizados vinte e sete animais, divididos

aleatoriamente em três grupos de nove cada um deles. No grupo G1(grupo zero

dia), foi realizada uma incisão entre o túber isquiático e o trocanter maior, onde o

nervo ciático foi dissecado e seccionado na altura do terço médio da coxa e

imediatamente submetido à técnica de reparo através da neurorrafia término

terminal. No grupo G2(grupo dez dias), o mesmo procedimento foi realizado, mas

após o seccionamento do nervo, foi colocado no coto proximal um tubo de

polietileno de fundo cego, fixado através de fio 6-0. Transcorridos dez dias os

animais foram novamente anestesiados para serem submetidos à reinervação

através da técnica descrita no grupo 1. No grupo G3 (grupo 30 dias), o mesmo

procedimento foi realizado, somente diferenciando o tempo e espera de trinta dias,

para se proceder a técnica de reparo. A sutura da pele foi realizada com o fio de

nylon 5-0. Os animais foram sacrificados com superdosagem de anestésicos

sempre decorridos 10 dias de reparo para todos os grupos. O músculo retirado foi

primeiramente colocado por alguns minutos em formol tamponado a 10% para dar

forma à estrutura e em seguida foi acondicionado em recipiente apropriado com

formol 10% por vinte e quatro horas. Após este período, os músculos foram

lavados em água corrente por mais vinte e quatro horas e novamente colocados

nos mesmos recipientes contendo álcool a 70%, até serem levados para

procedimentos laboratoriais de rotina. Os resultados obtidos mostraram o sucesso

da técnica de neurorrafia término terminal na recuperação do nervo periférico sem

perda tecidual, onde em todos os grupos, as fibras musculares se apresentaram

reinervadas e os fusos neuromusculares se mantiveram com seus números de

fibras intrafusais normais, compreendendo de 5 a 6 fibras em cada um fuso.

Palavras Chaves: desnervação, reinervação, músculo sóleo, neurorrafia término

terminal.

8


ABSTRACT

The objective of this work was to carry out an experimental study on the

desnervation and the reinervation of the rat muscle soleus and also observe under

morphologic and morphometric criteria, in which period after reinervation you can

get a better standard of the related muscle. In order for that, twenty seven animals

were used, aleatory divided in three groups of nine. In the group G1 (group zero

day), it was carried out an incision between the tuber ischiatic and the trochanter

bigger, where the sciatic nerve was dissected and sectioned in the height part of

mid-thigh and immediately submitted to the technique of repair through the

neurorhaphy terminus terminal. In the group G2 (group 10 days), the same

procedure was carried out, but after the nervous section it was placed in the stump

proximalis a polyethylene pipe of the blind fundus, fixed through wire 6-0. After ten

days, the animals were again anesthetized to be submitted the reinervation through

the described technique in group 1. In the group G3 (group 30 days), the same

procedure was carried out, only differentiating the time and the wait of 30 days, to

proceed the repair technique. The suture of the skin was made with the nylon wire

5-0. The animals had been sacrificed with superdosage of anesthetic, always after

10 days of repair to all groups. The removed muscle was first placed for some

minutes in formaldehyde at 10% , to give form to the structure and after it was

conditioned in appropriate container with formaldehyde 10% for twenty and four

hours. After this period, the muscles were washed in running water for twenty and

four hours and placed again in the same containers with alcohol 70%, until being

taken to laboratorial procedures of routine. The gotten results had shown the

success of the neurorrhaphy terminus terminalis in the recovery of the peripheral

nervous without tissue loss, where in all groups the muscle fiber presented

reinervation and the neuromuscular spindles, had kept with its normal intrafusal

fiber numbers, understanding of 5 to 6 fiber in each one spindle.

Key words: desnervation, reinervation, muscle soleum, neurorhaphy terminus

terminalis.

9


ÍNDICE

RESUMO ...................................................................................................................................7

ABSTRACT ...............................................................................................................................8

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................10

2. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................................11

3. PROPOSIÇÃO......................................................................................................................18

4-MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................19

4.1-AMOSTRA ........................................................................................................................19 4.2-PROCEDIMENTOS............................................................................................................19 Figura 1 - Depilação por tração manual dos pêlos da face lateral da coxa esquerda. ....................21 Figura 2 - Incisão entre o túber isquiático e o trocanter maior.....................................................21 Figura 3 - Nervo ciático dissecado na altura do terço médio da coxa. ..........................................22 Figura 4 - Injúria causada no nervo ciático. ...............................................................................22 Figura 5 - No coto proximal foi colocado um tubo de plástico rijo de fundo cego para prevenir a reinervação...............................................................................................................................23 Figura 6 - Técnica de reinervação através da neurorrafia término terminal..................................23 Figura. 7- Sutura local com o fio de nylon 5-0. ...........................................................................24

5. RESULTADOS.....................................................................................................................24

5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA ......................................................................................................25 Figura 8 – Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G1.................................................................................................................26 Figura 9 - Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G2.................................................................................................................27 Figura 10 – Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G3.................................................................................................................28 5.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA ....................................................................................................29 Figura 11 – Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G1....30 Figura 12 - Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G2. ...30 Figura 13 - Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G3....31 Figura 14 – Gráfico das médias dos animais de todos os grupos pesquisados.. .............................31

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................32

7. CONCLUSÕES.....................................................................................................................38

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................39

10


1. INTRODUÇÃO

As fibras musculares estriadas esqueléticas apresentam a forma de um

longo cilindro multinucleado quando examinadas em nível de microscopia óptica.

Tais fibras agrupadas paralelamente constituem os chamados fascículos de fibras

musculares, visíveis inclusive a olho nu em músculos de pouca espessura, por

exemplo, os músculos do bulbo ocular. Esses fascículos organizam-se de forma

variada em relação a seus tendões de tal forma que os músculos estriados

esqueléticos podem ser classificados de várias maneiras segundo este critério.

Os fascículos de fibras musculares juntos constituem o chamado ventre

muscular, estrutura de cor vermelha escuro, com capacidade contrátil que é

envolta por tecido conjuntivo que tem por função proteger, individualizar e permitir

um melhor deslizamento de um ventre muscular contra outro durante as contrações

de vários grupamentos musculares na realização de determinado movimento. Os

tecidos conjuntivos presentes nos músculos estriados esqueléticos constituem seu

estroma e são designados de diferentes maneiras para facilitar seu estudo.

Assim, a camada mais superficial, quando observada em corte

transversal é denominada epimísio; o septo que divide o ventre em fascículos é

denominado perimísio e finalmente há uma delicada trama de fibras reticulares que

envolvem cada fibra muscular denominada endomísio.

Conforme descrito os núcleos das fibras estriadas esqueléticas são

numerosos, podendo em certas fibras de alguns centímetros de comprimento,

conter centenas de mionúcleos. Os mionúcleos apresentam-se de forma alongada

sempre com seu maior eixo na direção do maior eixo da fibra muscular.

A posição das fibras musculares esqueléticas pode variar dependendo do

tipo de músculo e espécie de animal, muito embora na maioria dos mamíferos

adultos elas se localizem na periferia das fibras imediatamente abaixo do

sarcolema.

Com isso pareceu-nos de grande interesse avaliar os resultados da

desnervação e reinervação do músculo sóleo de ratos, de acordo com a literatura

especificada para podermos concluir qual é a melhor época de se realizar a

tentativa de reinervação, ou seja, imediatamente após a cirurgia de seu nervo

motor ou em um período posterior a tal lesão.

11


2. REVISÃO DE LITERATURA

De acordo com MAURO (1964), as células satélites ou mioblastos

apresentam a capacidade de se dividirem e de se fundirem na ausência de

inervação em meio de cultura e em vivo, porém a inervação é necessária para a

maturação e a manutenção das novas fibras (BISCHOFF, 1974; MUSSINI et al.,

1987; GULATI, 1988; WHALEN et al., 1990; SKETELJ et al., 1991; SESODIA &

CULLEN, 1991).

As fibras presentes em uma unidade motora pertencem sempre do mesmo

tipo, lembrando ainda que a modulação de tais fibras musculares esteja a cargo da

fibra nervosa. Vários experimentos têm comprovado tal fato, especialmente

experimentos envolvendo a inervação cruzada, “cross inervation” (BULLER et al.,

1965; MAMMAERTS et al., 1969 e BARANY & CLOSE, 1971). Assim, para alguns

autores o número de fibras musculares num determinado músculo é estabelecido

ao nascimento (CHYAKULAS & PAULY, 1965; MAXWEL et al., 1974) enquanto

que para outros, em condições de exercício programado, pode haver um discreto

aumento do número de fibras musculares em animais adultos (GONYEA et al.,

1986).

Com relação às características contráteis e o tipo de metabolismo, as

fibras musculares estriadas esqueléticas podem ser classificadas em três tipos já

consagrados pela literatura: FG (fast-twitch-glicolytic); FOG (fast-twitch-oxidative-

glycolitic) e SO (slow-twitch-oxidative) (PETER et al., 1972).

A porcentagem de células satélites em relação aos mionúcleos, em

músculos normais é de cerca de 8% (SCHMALBRUCH & HELLHAMER, 1977),

dobram dentro dos primeiros dez dias após desnervação e então diminuem para

menos de ¼ do normal.

O papel da inervação, todavia, não deve estar limitado a estes eventos

durante a regeneração muscular.

A capacidade proliferativa dos mioblastos em músculos jovens é nervo

dependente (BONNER, 1978, 1980, 1987), e a proliferação dos mioblastos em

meio de cultura é estimulada por fatores tróficos produzidos pelos nervos e

contidos em extratos embrionários normalmente adicionados a tal meio (OH &

MARKELONIS, 1980; BONNER & ADAMS, 1982; POPIELA et al. 1984).

12


Já no período senil e em determinadas patologias (DUBOWITZ, 1985;

ADACHI & SHER, 1990; DAL PAI et al., 1991) pode haver redução do número de

fibras musculares.

Em músculos de rãs as fibras musculares desnervadas por quase quatro

anos desaparecem totalmente (ANZIL & WERNIG, 1989).

As fibras musculares estriadas esqueléticas desnervadas atrofiam,

degeneram e eventualmente morrem sendo substituídas por novas fibras as quais

novamente degeneram. A força do músculo sóleo de rato desnervado declina em

escala logarítmica durante os quatro meses iniciais de desnervação ficando

constante a partir deste tempo até por seis meses. Isto sugere que a atrofia,

degeneração e perda de fibras de um lado e a formação de novas fibras do outro

lado estão balanceadas após quatro meses (AL-AMOOD et al., 1991;

SCHMALBRUCH et al., 1991).

Estas observações são importantes e relevantes para o entendimento das

alterações patológicas nas doenças musculares em humanos. Músculos

esqueléticos em pacientes com Distrofia de Duchenne não apresentam somente

necrose, mas também uma extensiva regeneração a qual, contudo não é

compensada pelo desgaste muscular, pois aquelas novas fibras que não se

estendem através da zona da placa motora nunca serão inervadas e desaparecem

(SCHMALBRUCH, 1992).

Por outro lado condições neuropatológicas crônicas podem causar quebra

e regeneração de fibras submetidas a carga de trabalho excessiva o que leva às

alterações miopatológicas secundárias (JENNEKENS, 1992).

SCHMALBRUCH & LEWIS (1994), estudaram as propriedades

morfológicas e fisiológicas no músculo sóleo do rato e compararam-nas com

aquelas de músculos desnervados experimentalmente. Assim o papel

desempenhado pelas células satélites na recuperação do músculo está

diretamente relacionado à sua capacidade proliferativa. Isto também explica a

diminuição no poder de contração após a desnervação que nos primeiros três

meses decresce logaritmicamente para se manter estável até aproximadamente

vinte e quatro semanas pós desnervação. Este processo tem sido atribuído à

exaustão do pool de células satélites no processo de regeneração (RODRIGUES &

SCHMALBRUCH, 1995).

13


MARQUES et al., (1996), estudaram o tempo de regeneração motora do

músculo EDL (extensor longo dos dedos), depois do nervo periférico ser

transeccionado e entubado. Em ratos adultos após transeccionado o nervo ciático

o coto proximal e o distal, foram suturados com um tubo de polietileno longo e no

espaço de duas a quarenta semanas, o músculo EDL, foi retirado e submetido ao

processo histoquímico para visualizar os locais ricos em colinesterase. Concluíram

que as fibras musculares apresentaram um aumento da concentração de colágeno

e fibroblastos nos locais onde ocorreram as sinapses. O processo de reinervação

começou após quatro semanas da implantação do tubo, e doze semanas após a

realização da cirurgia, toda junção neuromuscular voltou ao normal e de doze a

quarenta semanas toda a musculatura motora voltou a ser inervada.

YOSHIMURA & HARII (1997), estudaram os eventos celulares e

moleculares coincidentes com os músculos desnervados, principalmente a

mudança regenerativa, observando o papel das células satélites e a possibilidade

de apoptose como um mecanismo de perda durante a atrofia do músculo

desnervado. Concluíram que a maioria das células satélite se fundiu às fibras

desnervadas com o propósito de arrumá-las, ao invés de se fundirem e formarem

novas fibras como um mecanismo compensatório. Em relação a apoptose concluiu-

se que ela contribui para a perda de mionúcleos associados com a atrofia pela

desnervação.

De acordo com RODRIGUES (1998), a porcentagem de células satélites

rapidamente diminui no músculo sóleo de rato em regeneração desprovido de

inervação, como também que, a desnervação de músculos intactos causa a

degeneração e a perda de fibras, enquanto que o comportamento das células

satélites nestas condições não foi conhecido.

DEVOR & FAULKNER (1999), estudaram a hipótese específica após um

protocolo de prolongamento das contrações, onde as fibras recém regeneradas

foram tratadas com bupivacaina injetada nos músculos EDL de ratos jovens e

adultos. Os resultados demonstraram um déficit menor de força e também uma

menor quantidade de fibras danificadas nos músculos que não foram tratados com

a bupivacaina e ainda, que a regeneração das fibras musculares tanto nos animais

jovens como nos velhos requerem a mesma resistência para o dano causado.

14


DESGRANGES et al., (1999), estudaram um polímero sintético chamado

de RGTA (agente regenerador) que pode estimular tecidos quando aplicado no

local do dano por agentes diversos. Em músculos esmagados, o RGTA foi

utilizado para acelerar a regeneração e a reinervação e tanto a isquemia quanto a

desnervação o músculo EDL tratados com o RGTA diferiu em vários aspectos: o

pós-operatório foi diminuído e a área de tecido de fibrose no meio das fibras foi

reduzida; o número de fibras de músculos intactos foi maior que o dobro. Estes

resultados sugerem que o RGTA protege as fibras dos músculos degenerados e

preserva o estado diferenciado das fibras sobreviventes. Com isso ficou

demonstrado que o polímero pode prevenir algum tipo de dano resultante de

músculo em isquemia.

Recentemente, alguns pesquisadores têm proposto uma classificação

mais ampla levando-se em conta critérios mais específicos, e desta forma

classificando as fibras em unidades morfofuncionais (BEGO et al., 1996).

RODRIGUES et al., (1999), relataram que diferentes tipos de fibras

estriadas esqueléticas encontram-se na maioria das vezes espalhadas pelo ventre

muscular a chamada distribuição em mosaico, embora em alguns músculos de

alguns mamíferos, como o músculo sóleo do porco, por exemplo, encontramos

fibras do tipo SO agrupadas constituindo os chamados grupos metabólicos.

WANEK & SNOW (2000), realizaram uma pesquisa para entender porque

a atrofia muscular é limitada quando ocorre a imobilização do membro. O trabalho

foi realizado em ratos adultos no músculo sóleo, no qual o animal era imobilizado

com gesso durante duas a dez semanas. Após esse período os animais eram

sacrificados e o músculo sóleo examinado para evidenciar as fibras em

degeneração ou regeneração e quantificar os núcleos das células satélites.

Detectou a ocorrência de dano na fibra muscular secundária, inclusive uma atrofia

miofibular, com rompimento do disco e funções. O número de células satélites

diminuiu significantemente de 6,4% para 3,3% entre oito a dez semanas de

imobilização. Somente 1% das fibras parecia estar regenerado.

IJKEMA-PAASSEN et al., (2001), estudaram a morfologia do músculo e a

distribuição dos tipos de fibras depois do nervo ciático ter sido transeccionado no

membro de ratos.

15


Eles realizaram seccionamento do nervo ciático em 12 mm próximo a

bifurcação do nervo tibial e fibular, depois esse nervo era invertido e reimplantado

como um enxerto de nervo autólogo. Após um período de sete, quinze e vinte e

uma semanas, os músculos gastrocnêmio lateral, o tibial anterior e o músculo sóleo

foram dissecados e a distribuição dos tipos de fibras foi estudada. O estudo

demonstrou que depois de sete semanas as áreas seccionadas foram diminuídas

em todos os músculos. Nos músculos gastrocnêmios, tibiais anteriores e músculo

sóleo o número de fibras permaneceram inalterados. Por volta de sete a quinze

semanas o número de fibras tipo II diminuiu consideravelmente voltando ao normal

na 20ª-21ª semanas. Como resultados finais concluíram que a reinervação não

seletiva e os reajustes posteriores por regressão de inervação de vários nervos

servem em parte para explicar as mudanças nas distribuições da vários tipos de

fibras.

THIERRY LAUNAY et al., (2001), realizaram o estudo para demonstrar o

padrão de expressão do myf-5, o myod e o mrf4 (proteínas) durante a regeneração

do músculo sóleo em ratos depois de causar danos com o cardiotoxin, utilizando a

hibridação in situ e também para investigar a influência da inervação durante o

processo de degeneração e regeneração completa. Concluíram que nas

experiências de regeneração com o músculo sóleo desnervado o myf-5, o myod e

o mrf4 (proteínas) apareceram em células satélites derivadas de mioblastos

resultantes da primeira regeneração do músculo analisado.

MINAMOTO et al., (2001), avaliaram os aspectos e as mudanças

morfológicas na área e a incidência dos tipos de fibras musculares, quando

provocadas contusões periódicas no músculo tibial anterior de ratos. Foram oito

traumas sucessivos, um por semana, durante oito semanas, sendo avaliados

depois de quatro meses após a última contusão. Os resultados demonstraram que

o peso muscular era diminuído quando comparado ao músculo contralateral intacto

e mostrava presença abundante de fibras em “splitting” com núcleos centralizados,

principalmente, na porção profunda. Os músculos danificados apresentavam uma

incidência maior de fibras semidiferenciadas quando comparada aos músculos

intactos.

16


O estudo demonstrou que as fibras musculares eram principalmente

danificadas na porção profunda, provavelmente devido à compressão feita com a

tíbia; as contusões periódicas não mudaram a porcentagem do tipo I e II das fibras

musculares e as áreas que sofreram as contusões levaram quatro meses para se

regenerarem completamente.

MORACZEWSKI et al., (2002), estudaram através de um modelo de

regeneração induzido por regeneração à implicação de CPK (proteína quinase) em

conserto de músculo após um dano qualquer. Foi utilizado o músculo sóleo e o

músculo EDL que possuem regeneração muscular diferente. Após o

esmagamento, foi utilizada a atividade de CPK durante quatorze dias para se

analisar a regeneração muscular. A degeneração ocorreu logo após o

esmagamento e estavam associados à enzima em ambos os músculos lesados. A

reconstrução das fibras do músculo EDL era associada com um aumento da

atividade de CPK, onde por volta do sétimo dia o músculo se regenerava. Ficou

demonstrado que o CPK é utilizado no processo regenerativo em diferentes

tempos e locais e sugere que possua funções distintas. A eventual exaustão do

pool de células satélites pode ser responsável posteriormente pela ocorrência do

declíneo da força muscular como é visto na poliomielite.

A área da fibra (média da área seccionada transversalmente) em músculos

regenerados desnervados foi de 139 µm2 depois de dez dias; a força específica

nesses músculos foi normal. Mais tarde, com o início da degeneração e atrofia, a

força específica diminuiu. O tamanho médio da fibra foi somente de 26µm2 depois

de setenta dias.

Nesse período, sinais de quebra e fibras em regeneração imaturas foram

encontradas em ambos os modelos experimentais. Os músculos desnervados já

continham poucos miotubos aos dez dias e aos quarenta dias as fibras musculares

em regeneração já eram distintas.

Por outro lado a desnervação de alguns músculos após setenta dias,

triplica a porcentagem de células satélites enquanto que em outros diminuem para

a metade do normal. Isto vem demonstrar que a regeneração de músculos

desprovidos de inervação alcança seu alto grau de diferenciação estrutural e então

atrofiam, degeneram e desaparecem.

17


Tais fibras são substituídas por novas fibras, as quais não alcançam o

tamanho das originais, presumivelmente porque o pool de células satélites sem

inervação se torna exaurido.

A lenta e não sincronizada quebra das fibras musculares desnervadas do

músculo sóleo induzem a proliferação de células satélites como em músculos

necróticos; aqueles músculos que apresentem menos células satélites do que os

normais após setenta dias possam já estar entrando em processo de exaustão.

Investigações preliminares de músculos sóleos desnervados por sete

meses sugerem que o número de células satélites normalmente cai para menos de

quinze, isto é, para cerca de 10% do normal. Estes resultados indicam que a

proliferação de células satélites e a habilidade das fibras musculares para se

regenerarem é nervo dependente.

Assim, o fato de que músculos desnervados por longo período perderem a

sua capacidade de regeneração depois de reinervado pode ser devido à exaustão

do pool de células satélites muito mais do que por sua fibrose ou substituição das

fibras musculares por adipócitos.

Segundo DOLFINI et al., (2002), até dezesseis semanas após a

desnervação o músculo comporta-se de maneira oscilatória entre tentativas de

regeneração e degeneração, com o auxílio das células satélites e conseqüente

diminuição na quebra do DNA. Reafirmou-se a idéia de que neste período a perda

de fibras por um lado e a tentativa de regeneração de outro, estão equilibradas.

Estes autores sugerem frente a esses resultados que o melhor período para se

obter uma melhor recuperação de um músculo desnervado deve ser no período

onde é observada a menor quebra de DNA, ou seja, entre o décimo segundo e a

décima sexta semana pós desnervação.

De acordo com DAHLIN (2004), um dano causado no nervo periférico, tem

um impacto profundo na vida. Este dano é considerado complexo porque envolve

ambos componentes periféricos e centrais do sistema nervoso. Este dano pode

comprometer as células de Schwann em condicionamento regenerativo e

proliferativo respectivamente.

18


3. PROPOSIÇÃO

Foi propósito deste trabalho estudar experimentalmente o processo de

desnervação e reinervação do músculo sóleo de ratos e observar sob critérios

morfológicos e morfométricos, em qual período pós lesão ( zero, dez e trinta dias)

se pode obter um melhor padrão de recuperação desse músculo.

19


4-MATERIAL E MÉTODOS

4.1-AMOSTRA

Para desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados vinte e sete ratos

(Rattus novergicus albinus, Wistar) machos, com peso variando entre cento e

oitenta a duzentos gramas, procedentes do Biotério da Universidade de Marilia

(UNIMAR) SP.

Os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas e distribuídas

aleatoriamente em três grupos de nove animais cada, denominados de G1 (grupo

zero dia), G2 (grupo 10 dias) e G3 (grupo 30 dias).

4.2-PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS

O experimento foi realizado no Biotério da Universidade de Marilia

(UNIMAR), onde os animais receberam água e ração* livremente e foram mantidos

em ambiente controlado à temperatura de 20ºC e ciclos de doze horas de claro e

escuro.

Os animais foram anestesiados com ZOLETIL 50** na proporção de 0,1

ml para cada 100g.

Aplicada à anestesia intramuscular na coxa direita do animal foi realizada

a depilação por tração manual dos pêlos da face lateral da coxa esquerda (fig. 1).

A seguir, através de uma incisão entre o túber isquiático e o trocanter

maior, o nervo ciático foi dissecado e seccionado na altura do terço médio da coxa

(fig. 2 e 3).

No coto proximal foi colocado um tubo de plástico rijo de fundo cego nos

grupos G2 e G3 para prevenir a reinervação espontânea. Após o ato cirúrgico

todos os animais foram suturados com fio monofilamentar, não absorvível, 5-0***.

O primeiro grupo foi formado por nove animais denominados de G1(grupo

zero dias), que após terem seus nervos ciáticos seccionados, foram submetidos

20


imediatamente à reparação através da neurorrafia término terminal com o fio 6-0 e

a seguir foi realizada a sutura da pele utilizando o fio 5-0*** (fig. 4).

O segundo grupo foi formado por nove animais denominados de G2

(grupo 10 dias), que após terem seus nervos seccionados, tiveram seus cotos

proximais colocados em um tubo de polietileno de fundo cego, fixado através de fio

6.0***. Após este período (dez dias), os animais foram submetidos novamente à

anestesia e em seguida foi provocada à reparação através da técnica de

neurorrafia termino terminal (fig.5).

O terceiro grupo foi formado por nove animais denominados de G3

(grupo 30 dias), onde foi realizado o mesmo procedimento do grupo anterior,

somente diferenciando o tempo de permanência do tubo de polietileno de dez para

trinta dias.

Após a cirurgia de reparação do grupo G2(10 dias) e do G3(30 dias),

onde foi respeitado o período de 10 e 30 dias respectivamente, os animais foram

sacrificados oito semanas após, por superdosagem do anestésico Zoletil 50**

sendo que o grupo G1(grupo zero), no qual a reparação foi realizada

imediatamente, também foi respeitado este mesmo período (fig. 6).

A pele dos animais foi suturada com o fio de nylon 5-0 após os

procedimentos cirúrgicos (fig. 7).

Após o sacrifico, o músculo sóleo dos animais foram coletados e

preparados para processamento para microscopia de luz.

O músculo retirado foi primeiramente colocado por alguns minutos em

formol tamponado a 10% para dar forma à estrutura, e em seguida colocada em

recipiente apropriado com o mesmo fixador por vinte e quatro horas.

Após este período, os músculos foram lavados em água corrente por

mais vinte e quatro horas e novamente colocados em recipiente apropriado com

álcool a 70%, até ser levado para procedimentos laboratoriais de rotina.

*Nuvilab. Nutrimental

**Zoletil 50. Virbac

***Nylon 5-0. Shalon

***Nylon 6-0. Shalon

21


Figura 1 - Depilação por tração manual dos pêlos da face lateral da coxa esquerda.

Figura 2 - Incisão entre o túber isquiático e o trocanter maior.

22


Figura 3 - Nervo ciático dissecado na altura do terço médio da coxa.

Figura 4 - Injúria causada no nervo ciático.

23


Figura 5 - No coto proximal foi colocado um tubo de plástico rijo de fundo cego para prevenir a reinervação.

Figura 6 - Técnica de reinervação através da neurorrafia término terminal.

24


Figura. 7- Sutura local com o fio de nylon 5-0.

25


5- RESULTADOS

5.1 Análise Morfológica

Em todos os animais operados, foi observado macroscopicamente

resultado de sucesso no reparo do nervo ciático através da técnica de neurorrafia

termino terminal. Cabo de regeneração pôde ser encontrado em todos os animais

operados e uma leve fibrose, como era esperado foi constatado. Não foi observado

em nenhum dos animais operados qualquer evidência de necrose ou processo

inflamatório no local da cirurgia.

Em relação ao músculo sóleo, no grupo G1 (zero dia), suas fibras

apresentaram maiores áreas se comparadas às áreas das fibras dos demais

grupos. Outro fato que merece destaque em relação a esse grupo é a observação

de seus fusos neuromusculares. Todos os fusos dos músculos desse grupo

apresentaram em média 5 fibras intrafusais (fig. 8). Finalmente, pode ser

encontradas fibras com características poliédricas e com pouco tecido conjuntivo

entre seus fascículos.

Nos animais do grupo G2 (10 dias), as fibras musculares apresentaram-

se mais heterogêneas em relação a suas áreas. Um aumento bastante acentuado

de tecido conjuntivo, fibras colágenos também foram observadas. As fibras de

menor área encontravam-se preferencialmente localizadas na periferia do ventre

muscular (fig.9). Foram encontradas nesse grupo algumas fibras com mionúcleos

de posição central.

Finalmente, os animais do grupo G3 (30 dias), atrofia das fibras mais

intensa pode ser observada. Os fascículos apresentaram-se em maior número,

embora contendo menor número de fibras musculares em seu interior. A

heterogeneidade das fibras com relação às suas áreas foi mais intensa nesse

grupo. A invasão de tecido conjuntivo, especialmente tecido adiposo, pode ser

encontrada nesse grupo. Raramente fibras com áreas de aspecto normal puderam

ser encontradas (fig.10).

26


Figura 8 – Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G1. Note fuso com 5 fibras intrafusais. Fibras intrafusais poliédricas com mionúcleos em posição subsarcolemal.

27


Figura 9 - Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G2. Note o aparecimento de fibras de menores áreas agrupadas na periferia do músculo. Observe ainda um maior aumento de tecido conjuntivo entre os fascículos.

28


Figura 10 – Corte transversal das fibras musculares estriadas esqueléticas do músculo sóleo dos animais do grupo G3. Note a invasão de grande quantidade de tecido conjuntivo para o interior do músculo.

29


5.2 Análise Morfométrica

O grupo (G1) apresentou heterogeneidade na área das fibras,

principalmente no animal número três no qual se mostrou extremamente

aumentado em sua média. Para esse grupo foi encontrado um valor de 16,61

µm2 para a média geral de suas fibras (fig.11).

No grupo (G2) foi aferido valor médio da área de suas fibras de 14,99 µm2.

Este grupo apresentou-se mais homogêneo se comparado ao grupo anterior

(fig.12).

Para os animais do grupo (G3), foi constatado valor médio de suas fibras

menor do que dos grupos anteriores. Nesse grupo a média da área de suas fibras

foi de 5,63µm2. .Por outro lado foi observada uma heterogeneidade de suas fibras,

principalmente nos animais 07 e 08 do referido grupo (fig.13).

Tomando-se todos os animais de todos os grupos pesquisados,

observamos que a tendência das médias das áreas das fibras musculares é de

diminuição, sendo que nos períodos iniciais essa queda é mais intensa (fig.14).

30


11,4

6

18,0

9

9,82

16,1

4

10,4

4

13,3

4

15,6

6

19,5

6

20,2

5

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

µm2

Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Animal 7 Animal 8 Animal 9 Animais

GRUPO G2 ( 10 dias)

15,3

6

11,8

5

28,9

4

13,1

9

10,2

9

19,4

6

17,2

2

11,5

8

21,5

6

0 , 0 0

5 , 0 0

1 0 , 0 0

1 5 , 0 0

2 0 , 0 0

2 5 , 0 0

3 0 , 0 0

µ m 2

A n i m a l 1 A n i m a l 2 A n i m a l 3 A n i m a l 4 A n i m a l 5 A n i m a l 6 A n i m a l 7 A n i m a l 8 A n i m a l 9

A n i m a i s

G R U P O G 1 ( z e r o d i a )

Figura 11 – Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G1. Observe uma discrepância nos valores aferidos para o animal 3.

Figura 12 - Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G2. Observe uma maior homogeneidade para os valores obtidos. Não foi observado discrepância entre os valores obtidos.

31


4,59

4,24

2,75

2,15

1,50

3,34

13,8

5

13,0

9

5,17

0 , 0 0

2 , 0 0

4 , 0 0

6 , 0 0

8 , 0 0

1 0 , 0 0

1 2 , 0 0

1 4 , 0 0

µ m 2

An ima l 1 An ima l 2 An ima l 3 An ima l 4 An ima l 5 An ima l 6 An ima l 7 An ima l 8 An ima l 9

A n i m a i s

G R U P O G 3 ( 3 0 d i a s )

T a b e la Y = 1 0 1 , 2 6 2 0 5 - 0 , 0 1 9 7 6 X

1 6 , 6 1

1 4 , 9 9

5 , 6 3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15 2 0 2 5 3 0 3 5

D i a s P ó s C i r ú r g i a

µ m 2

Y e x p

Figura 13 - Gráfico de barras referentes às áreas de todos os animais pesquisado do grupo G3. Note uma homogeneidade para os animais 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e uma discrepância para os valores obtidos para os animais 7,8 e 9.

Figura 14 – Gráfico das médias dos animais de todos os grupos pesquisados. Observe uma queda nos valores obtidos principalmente para os animais do grupo G3.

32


6. DISCUSSÃO

Quando se discute o melhor momento para se tentar a recuperação de

um nervo e o músculo por ele inervado, deve-se levar em consideração

evidentemente, as alterações que ocorrem em ambos para se tentar estabelecer

em que momento o nervo e o músculo estão mais suscetíveis a um melhor padrão

de regeneração. Assim, relacionados aos nervos, é sabido que em suas fibras que

sofreram axotomia, a produção de NGF (neuro growth factor) atinge nível máximo

24 horas após e mantém níveis elevados de NGF pelo menos até duas semanas

após a lesão os músculos, ou melhor, as fibras musculares desnervadas sofrem

uma atrofia perdendo progressivamente massa tecidual. (RODRIGUES &

SCHMALBRUCH, 1995).

Há tempos vários pesquisadores discutem o melhor momento para se

tentar a reinervação em músculos que tiveram seus nervos motores seccionados.

Para alguns os músculos estariam mais aptos a receber novo contato do nervo

motor entre 12 e 16 semanas pós-lesão (DOLFINI, 2002) enquanto que para

outros, quando não há perda tecidual, quanto mais rápida for a tentativa de reparo

nervoso, melhor será o resultado de sua regeneração (RODRIGUES, 1998).

Um músculo desnervado por longo tempo, acima de 25 semanas,

apresenta redução significativa no número de células satélites (RODRIGUES &

SCHMALBRUCH, 1995), fato este importante para a recuperação do músculo

como um todo. Portanto músculos com tempos longos de desnervação podem

estar fadados a não apresentarem condições para uma possível reinervação.

33


A favor dessa idéia podemos encontrar um trabalho realizado por ANZIL

& WERNIG (1989) que procedeu a desnervação do músculo peitoral de rã e

observou, após quase 4 anos, a completa ausência de fibras musculares. No local

foi observada apenas e tão somente uma lâmina conjuntiva.

A idade do indivíduo evidentemente também é fator a ser considerado

nessa situação, lembrando que animais recém-nascidos apresentam uma queda

no número de células satélites muito mais pronunciada que nos animais adultos

(RODRIGUES et al., 2002).

Classicamente, a tentativa de reinervação de músculo, deve ser

realizada o mais rápido possível. No entanto, ao se analisar músculos

desnervados, podem perceber que morfologicamente tais músculos apresentam

fibras musculares com características de fibras jovens após 12 semanas de

desnervação. É sabido que os músculos estriados esqueléticos existem como

estruturas anatômicas muito antes de sua inervação. Os nervos desempenham

papel importante na modulação de tais fibras, alterando sua constituição, ou

melhor, modulando os diferentes tipos de fibras para melhor atender à demanda do

músculo. Se o raciocínio for feito levando-se em conta o desenvolvimento natural

dos músculos estriados esqueléticos, um pequeno retardo de algumas semanas

parece-nos mais acertado do que a tentativa imediata de reinervação.

Em nossa pesquisa realizamos experimentalmente lesão no nervo ciático

do rato (sem perda tecidual) com recuperação, através da técnica da neurorrafia

término terminal, em três tempos: imediatamente após a lesão; 10 dias após e 30

dias após. O músculo escolhido para análise morfológica de sua recuperação foi o

músculo sóleo.

34


A justificativa para tal escolha foi o fato do músculo sóleo ser

considerado um músculo postural, rico em fibras vermelhas (tipo SO e FOG),

portanto mais homogêneo se comparado a um músculo branco como o músculo

EDL (extensor longo dos dedos). O músculo sóleo recebe inervação exclusiva do

nervo ciático que foi seccionado conforme descrito anteriormente.

Os resultados apontam para o tempo imediato após lesão do nervo

(primeiro grupo), padrão de recuperação muscular mais próximo do normal. A

explicação para tal resultado deve estar no tempo necessário para que as fibras

nervosas em regeneração estabeleçam contato com as fibras musculares. Assim,

levando-se em conta que as fibras nervosas crescem em média de 1 a 3 mm por

dia e, que a distância entre o local da secção nervosa e o músculo sóleo foi de

aproximadamente 5 cm (ou 50 mm), os novos neuritos devem ter atingido as fibras

do músculo sóleo após 40 ou 50 dias (6 a 7 semanas) pós desnervado.

Esse resultado vem de encontro aos resultados obtidos por outros

pesquisadores que puderam observar um padrão para as fibras musculares

estriadas esqueléticas desnervadas, semelhantes àqueles observados por ocasião

da primeira inervação sofrida por elas.

Assim, fibras com núcleos centrais denominadas miotubos e uma baixa

ocorrência do fenômeno de apoptose nesse período viria a favorecer uma

reinervação mais facilitada.

Seguindo o mesmo raciocínio poderíamos então sugerir que na tentativa

de se reinervar um determinado músculo que fora alvo de uma desnervação e

onde não houve perda tecidual, ou seja, o nervo em questão tenha sofrido tão

somente sua secção (neurotomia), a neurorrafia término terminal deverá ser

realizada considerando-se em conta a distância da secção ao músculo alvo.

35


Como a fibra nervosa varia em sua velocidade de crescimento entre 1 a

3 mm2 por dia, seria razoável adotar-se em média um crescimento de 2 mm2 por

dia e assim estabelecer o melhor momento para se fazer o reparo nervoso.

Com relação ao músculo sóleo observado neste experimento, em nível

de microscopia óptica, foi observada a presença de duas áreas musculares

distintas; uma apresentando fibras musculares organizadas, de diâmetros

regulares entre si, e outra com fibras heterogêneas. Provavelmente estas

diferenças sejam devidas às características metabólicas diferentes de cada tipo de

fibra muscular. Essa desorganização vista ao microscópio óptico reflete as

alterações nucleares e citoplasmáticas que através da técnica de microscopia

eletrônica certamente seriam melhor observáveis.

Conforme foi mencionado anteriormente, o fenômeno de apoptose deve

ser levado em conta em pesquisas de regeneração tecidual. No caso de músculo

estriado esquelético normal, a quebra de DNA, que é um indicativo de apoptose,

pode ser devido ao próprio “turnover” do tecido. Assim, é comum observar-se tal

fenômeno mesmo em músculo normal.

Já o músculo lesado recorre a sua via de reparação, ou seja, às células

satélites que funcionam como verdadeiros mioblastos. Para a maioria dos

pesquisadores, a própria injúria muscular atua como estímulo que ativa as células

satélites. Essa ativação em nosso caso, muito provavelmente, foi desencadeada

direta ou indiretamente, pela desnervação, o que também foi observado em outras

pesquisas com músculo desnervado (ONTELL, 1975; SNOW, 1983; MCGEACHIE,

1989; BORISOV & CARLSON, 2000).

36


Assim, por um período a partir de aproximadamente 10 semanas pós

desnervação, o que certamente aconteceu, foram oscilações do músculo sóleo na

tentativa de regeneração, com o auxílio das células satélites e conseqüentes

diminuição na quebra do DNA.

LEWIS & SCHMALBRUCH (1994) observaram a diminuição do poder de

contração de músculo estriada esquelético após desnervação, encontrando que

nos primeiros três meses ocorre um decréscimo em escala logarítmica para depois

se estabilizar até aproximadamente 24 semanas pós desnervação, reafirmando a

idéia de que neste período a perda de fibras por um lado, e a tentativa de

regeneração por outro, estão equilibradas.

Em face dos resultados obtidos nesta pesquisa, e as informações

referentes à literatura supracitada, parece-nos pertinente inferir que a melhor época

para a reinervação de um músculo desenervado também seja, dentre outros

fatores, o período onde o fenômeno de apoptose, ou seja, onde ocorra a menor

quebra da cadeia de DNA. Quanto maior for o tempo de desnervação, maior o

declínio da quantidade de células satélites, sendo que após 30 semanas há uma

diminuição na porcentagem de tais células para menos de 1/5 de um músculo

normal. (Rodrigues & Schmalbruch, 1995).

Essa observação é coincidente com o aumento rápido da quebra do

DNA, que a partir de 16 semanas pós desnervação, passa a ser ascendente

(DOLFINI et al., 2002). Levando-se em consideração o fato de não ter sido

constatado em nenhum dos animais operados (desnervados) sinais de necrose; a

distância entre o local onde o nervo ciático foi seccionado experimentalmente e o

músculo pesquisado; a velocidade de regeneração das fibras nervosas; e os

37


resultados dos trabalhos consultados na literatura podem concluir que no protocolo

proposto por esta investigação o melhor período para o emprego da técnica de

neurorrafia término terminal do nervo ciático foi obtido nos animais do primeiro

grupo, ou seja, imediatamente após a secção do nervo.

38


7. CONCLUSÕES

1- Na recuperação de um músculo estriado esquelético que tenha sofrido

transecção total de seu nervo motor, é de fundamental importância

correlacionar à distância da lesão nervosa e o referido músculo.

2- O melhor momento para se restabelecer o contato entre o nervo em

regeneração e seu músculo é entre 6 e 7 semanas pós desnevação.

3- No modelo proposto, os melhores resultados foram obtidos nos animais

que sofreram reparo do nervo ciático imediatamente após a lesão.

39


8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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