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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA

CENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - CCBS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

LICENCIATURA PLENA E BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ALLANE MARIA LACERDA FERREIRA DE OLIVEIRA

CONSTRUÇÃO DO MAPA DE RESTRIÇÃO DO GENE DA TIREOPEROXIDASE

(TPO) A PARTIR DE MUTAÇÕES QUE CAUSAM HIPOTIREOIDISMO

CONGÊNITO

Campina Grande, PB

2012




CONGÊNITO

Trabalho de conclusão de Curso apresentado ao

Curso de Licenciatura e Bacharelado em

Ciências Biológicas da Universidade Estadual da

Paraíba em cumprimento às exigências para a

obtenção do grau de Licenciada e Bacharel em

Ciências Biológicas

Orientadora: Prof. Drª. Simone Silva dos Santos Lopes

Campina Grande, PB

2012

F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB

O48c Oliveira, Allane Maria Lacerda Ferreira de.

Construção do mapa de restrição do gene da

tireoperoxidase (TPO) a partir de mutação que causam

hipotireoidismo congênito [manuscrito] / Allane Maria

Lacerda Ferreira de Oliveira. – 2012.

65 f. : il. color.

Digitado.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Ciências

Biológicas) – Universidade Estadual da Paraíba, Centro de

Ciências Biológicas e da Saúde, 2012.

“Orientação: Profa. Dra. Simone Silva dos Santos Lopes,

Departamento de Biologia”.

1. Mutação. 2. Genética humana. 3. Hipotireoidismo.

I. Título.

CDD 21. ed. 576




CONGÊNITO

Orientadora: Prof. Drª. Simone da Silva dos Santos Lopes

MONOGRAFIA APROVADA EM: 21/08/2012

A Deus,

toda honra e toda glória seja dada a Ti,

que sempre esteve comigo.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, hoje mais do que nunca eu sei que se não fosse pela força que Senhor

esteve me dando todos esses anos eu não estaria aqui, não teria força pra prosseguir.

Agradeço-te infinitamente meu Deus. Tu és o motivo por qual ainda estou aqui!

As duas pessoas que mais contribuíram, incentivaram e acreditaram que eu seria capaz...

Mainha (Kleber Ferreira) e Vovó (Eliraci Oliveira), o que seria de mim se não fosse por todo

o apoio que sempre me deram, por toda dedicação e amor. Pela paciência que demonstravam

quando muitas vezes eu ligava chorando dizendo que não aguentava mais e queria ir pra

casa. Como sou grata a Deus por ter me presenteado com duas jóias raras que são vocês na

minha vida. Obrigada por tudo. Espero poder retribuir de alguma forma TUDO que sempre

fizeram por mim. Amo incondicionalmente!

Ao meu Pai (Antonio Silva) e meus irmãos (Klethonio e José Neto) por todo amor, carinho e

contribuição na minha jornada. Pela paciência comigo nos meus momentos de “estresse”.

Apesar das nossas brigas de irmãos, amo vocês, são uma parte de mim.

Ao meu namorado Jefferson Honório pelo amor e companheirismo, por estar sempre

presente na minha vida, me apoiando e incentivando a conquistar meus ideias, nossos ideais.

Cada dia tenho mais certeza que foi Deus quem te colocou na minha vida, pra me ajudar a

superar todos os obstáculos que a vida nos impõe, pra me dizer você precisa tentar, só assim

vai conseguir. Quantas vezes me irritei por você me mandar ir estudar, mais hoje diante de

tantas graças recebidas entendo que era Deus te usando para não permitir que eu desistisse.

Á toda minha família, Tios, primos, obrigada pela confiança e apoio.

A professora Simone Silva dos Santos Lopes pela oportunidade de trabalhar com aquilo que

eu sempre almejei, por todos os ensinamentos, todas as orientações, pela paciência nos

momentos das falhas. Só tenho a agradecer por ter compartilhado comigo tantos

ensinamento... de Biologia Molecular, humildade e dedicação.

A todos do Laboratório de Biologia Molecular e Genética-UEPB, especialmente à Rayssa,

Mayara1, Mayara2, Thuany, Tafnys, Bárbara e Renata por toda ajuda no desenvolvimento

do meu trabalho e principalmente pela amizade construída. E também as amizades que foram

cultivadas esses 4 anos, Àkyla, Suziane, Raquel, Rayssa, Daniella.

A banca examinadora pela gentileza e disponibilidade em aceitar o convite.

A Universidade Estadual da Paraíba e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico – CNPq, pelo apoio financeiro.

"Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no livro do tempo. Aquilo que

colocarmos nela, corre por nossa conta."

(Emmanuel, psicografado por Chico Xavier)

“Existe um tempo certo para cada coisa, momento oportuno para cada propósito debaixo do

Céu: Tempo de nascer, tempo de morrer; tempo de plantar, tempo de colher”.

(Eclesiastes 3:4)

RESUMO

O Hipotireoidismo Congênito (HC) é a causa mais comum de retardo mental prevenível em crianças, e se

deve a ausência ou deficiência na produção dos hormônios tireoidianos (HTs), sua incidência varia entre 1:

3.000 a 4.000. A enzima Tireoperoxidase (TPO) é uma enzima chave na biossíntese dos HTs, sendo responsável

por catalizar importantes reações, como a organificação do iodo para formação dos hormônios tireoidianos.

Vários estudos moleculares do gene TPO revelaram que existe uma grande heterogeneidade de defeitos ao

nível desta proteína. Diante disto, foi realizada uma análise “in sílico” no gene da tireoperoxidase para

identificar os sítios de restrição presentes nos 17 éxons e assim criar um Mapa de Restrição desse gene, além de

realizar um levantamento bibliográfico para a construção de uma tabela contendo todas as mutações descritas no

gene TPO até o momento. A Construção do Mapa de Restrição do gene TPO foi realizada utilizando como base

a sequência completa do RNA mensageiro (NCBI Ref. Seq: NM_000547.5) posteriormente, utilizou-se o

programa NEBcutter para conhecer as enzimas que possuem sítios de restrição e suas posições nos éxons da

sequência do DNA. Também foi realizada uma pesquisa bibliográfica para selecionar todos os artigos que

possuem mutações descritas no gene TPO para elaboração de uma tabela revisada e atualizada, além de elaborar

uma tabela contendo as mutações e as enzimas que possuem sítios no local de cada mutação descrita no gene

TPO, como contribuição científica para posteriores estudos com esse gene. Construi-se um Mapa de Restrição

do gene TPO e uma tabela com as enzimas que possuem sítios de restrição correlacionados com as mutações que

causam HC no gene TPO. Durante o levantamento bibliográfico das mutações descritas no gene TPO,

encontramos disparidades entre as posições descritas por cada autor e a sequência depositada no banco de dados

do GenBank que foi utilizado como base. Também foi construída uma tabela com as enzimas que podem ser

utilizadas na detecção de mutações no gene TPO, pois essas enzimas possuem sítios nesse gene, ou em alguns

casos as mutações eliminam sítios. A partir desse estudo conclui-se que é possível construir um Mapa de

Restrição do gene TPO com base na sequência analisada. No entanto, a investigação da literatura permitiu

verificar que as mutações descritas nos artigos referenciados podem não apresentar concordância com a

sequência do gene TPO presente no GenBank.

Palavras-chave: Mutações, TPO, Mapa de Restrição

ABSTRACT

The Congenital Hypothyroidism (CH) is the most common cause of preventable mental retardation in children,

and is due to absence or deficiency in the production of thyroid hormones (TH), his incidence varies between 1:

3,000 to 4,000. The enzyme thyroperoxidase (TPO) is a key enzyme in the biosynthesis of CH, being responsible

for catalyzing important reactions, such as organification of iodine for the formation of thyroid hormones.

Several molecular studies of the TPO gene revealed that there is a great variety of defects at the level of this

protein. Given this, an analysis was performed "in silico" of the mutation in the thyroperoxidase to identify the

restriction sites present in exons 17 and thus creating a restriction map of this gene, in addition to conducting a

literature review to build a table containing all TPO gene mutations described so far. Construction of restriction

map of the TPO gene was performed based on the complete sequence of the messenger RNA (NCBI Seq Ref:

NM_000547.5) then, the software used to meet enzymes was the NEBcutter which have restriction sites and

their positions exons in the sequence of DNA. We also performed a literature search to select all items that have

in the TPO gene mutations described for the preparation of a revised and updated the table, and draw up a table

containing the mutations and the enzymes that have sites on the site of each mutation described in the TPO gene

, as a scientific contribution to further studies with this gene. Build up a restriction map of the TPO gene and a

table with the enzymes which have restriction sites correlated with mutations in the TPO gene causing CH .

During the literature of the mutations described in the TPO gene, we found differences between the positions

described by each author and the sequence deposited in the GenBank database that was used as a base. Was also

constructed a table with the enzymes which may be used in detecting mutations in the TPO gene, as these

enzymes have sites in this gene, or some cases eliminate the mutation sites. From this study it is concluded that it

is possible to construct a restriction map of the TPO gene based on the sequence analyzed. However, research

literature has shown that the mutations described in the referenced articles may not show agreement with the

TPO gene sequence present in GenBank.

Keywords: Mutations, TPO, Restriction Map.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

DT – Disgenesia tireoidiana

HC – Hipotireoidismo congênito

HP – Hipotireoidismo primário

HTs – Hormônios tireoideanos

TG – Tireoglobulina

TPO – Tireoperoxidase

NIS- Simportador de sódio e iodeto

PIOD – Defeito parcial na organificação do iodeto

TIOD – Defeito total na organificação do iodeto

TRH – Hormônio liberador de tirotrofina

TSH – Hormônio tireo-estimulante

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição

SSCP- Polimorfismo de Conformação de fita simples

DGGE- Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação

BsrFI- Bacillus stearothermophilu

MseI- Micrococcus species

NarI - Norcardia argentinensis

HinP1I - Haemophilus influenzae

HpyCH4V - Helicobacter pylori

PhoI - Pyrococcos horikoshii OT3

XhoI - Xanthomonas holcicola

PaeR7I - Pseudomonas aeruginosa

TliI - Thermococcus litoralis

BssSI - Bacillus stearothermophilus

AscI - Arthrobacter species

Bfa I - Bacteroides fragilis

CviQ-I - Chlorella virus

HaeIII - Haemophilus aegypticus

AluI - Arthrobacter luteus

BglII - Bacillus globigii

PciI gene from Planococcus citreus

BsrGI - Bacillus stearothermophilus

RsaI - Rhodopseudomonas sphaeroides

HhaI - Haemophilus influenzae

SfoI - Serratia fonticola

KasI - Kluyvera ascorbata

MspI - Moraxella species

HpaII - Haemophilus parainfluenzae

NgoMIV- Neisseria gonorrhoeae

PvuII - Proteus vulgaris

MluI - Micrococcus luteus

FseI - Frankia species

NaeI - Nocardia aerocolonigenes

BamHI - Bacillus amyloliquefaciens

MluCI - Micrococcus luteus.

ClaI - Caryophanon latum

MspI - Moraxella species

Tsp509I - Thermus species

BmgBI - Bacillus megaterium

PspOMI - Pseudomonas species

NgoMIV - Neisseria gonorrhoeae

SacI - Streptomyces achromogenes

Eco53kI - Escherichia coli 53k

ApaLI - Acetobacter pasteurian

NlaIII - Neisseria lactamica

CviAII - Chlorella virus

FatI - Flavobacterium aquatile

PstI - Providencia stuartii

BsiWI - Bacillus species

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Éxon 1: Éxon com enzimas de restrição......................................................... 30

Tabela 2- Éxon 2: Éxon com enzimas de restrição........................................................... 31

Tabela 3 - Éxon 3: Éxon com enzimas de restrição........................................................... 31







Tabela 10- Éxon 10: Éxon com enzimas de restrição......................................................... 36







Tabela 17- Tabela contendo mutações e enzimas de restrição.......................................... 41

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1- Comparação entre o número de mutações e o número de enzimas de restrição

disponíveis em cada

éxon...................................................................................30

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Glândula Tireóide.........................................................................................13

Figura 2- Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide.............................................................14

Figura 3- Desenho esquemático com mutações descritas no Gene

Tireoperoxidase............................................................................................21

Figura 4- Desenho esquemático com enzimas disponíveis no Gene

Tireoperoxidase............................................................................................28

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 15

2. REFERENCIAL TEÓRICO............................................................................................ 17

2.1 Tireóide .............................................................................................................................. 17

2.2 Hipotireoidismo congênito...................................................................................................... 18

2.3 Tireoperoxidase .................................................................................................................. 20

2.4 Mutações no gene da Tireoperoxidase................................................................................ 22

2.5 Análise de Mutação............................................................................................................. 23

2.5.1 Enzima de restrição ............................................................................................................ 23

2.5.2 Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição.................................................. 24

2.5.3 Mapa de Restrição .............................................................................................................. 25

3. OBJETIVOS...................................................................................................................... 26

3.1 Objetivo Geral .............................................................................................................. 26

3.2 Objetivo Específico....................................................................................................... 26

4. METODOLOGIA.............................................................................................................. 27

4.1 Identificação das mutações descritas na literatura no gene TPO .................................. 27

4.2 Construção do Mapa de Restrição do gene TPO.............................................................. 27

4.3 Mutações identificadas e analisadas por RFLP na literatura ........................................ 28

5. RESULTADOS ................................................................................................................ 29

5.1 Mapa de restrição do gene TPO.......................................................................................... 29

5.2 Levantamento das enzimas de restrição e mutações no gene TPO............................... 40

6. DISCUSSÃO...................................................................................................................... 43

7. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 46

8. PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 47

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 48

APÊNDICES .................................................................................................................... 53

APÊNDICE A ................................................................................................................... 59

APÊNDICE B ................................................................................................................... 58

15

1. INTRODUÇÃO

A glândula tireóide é a primeira a se formar durante a embriogênese. Responsável pela

síntese dos hormônios tireoidianos (HTs), que atuam regulando uma variedade de processos

metabólicos. A redução ou ausência na produção desses hormônios pode ocasionar retardo no

desenvolvimento cognitivo e motor da criança, ocasionando uma desordem endócrina

denominada Hipotireoidismo Congênito (HC).

O HC é a causa mais comum, prevenível, de retardo mental em crianças, sua

incidência varia entre 1: 3.000 a 4.000 nascidos (RAMOS et al., 2008).

Vários estudos realizados permitiram a caracterização dos genes que são essenciais

para síntese e desenvolvimento normal dos hormônios tireoidianos. Dentre eles, um grande

número de mutações no gene da tireoperoxidase (TPO) foram identificadas em pacientes com

HC por disormonogênese, evidenciando que defeitos nesse gene são a causa mais comum no

HC (RODRIGUES, 2004).

Os estudos moleculares do gene TPO revelaram que existe uma grande variação

alélica e que são visíveis ao nível da proteína. Foram descritas nesse gene mutações do tipo

missense (o que leva uma alteração no códon, alterando a proteína), nonsense (mutação de

ponto em uma sequência de DNA que resulta em um códon de parada), de frameshift

(mutação causada por inserções ou deleções onde o número de pares de bases não é múltiplo

de três, causando alteração na fase de leitura da proteína) e de splicing (excisão inapropriada

de um íntron ou deleção parcial ou até total de um éxon) ao longo de todo o gene

(NOGUEIRA et al., 2010).

Diante da grande heterogeneidade das mutações do gene TPO é necessário a

realização de estudos de caracterização molecular nesse gene para estabelecer uma relação

entre o genótipo e fenótipo apresentado pelo paciente. Na genética humana, as técnicas de

Biologia Molecular tornaram-se fundamentais no diagnóstico de doenças, permitindo não só a

identificação do gene afetado, mas também da mutação responsável pela doença. A

disponibilidade da análise molecular tem possibilitado o diagnóstico pré-natal e a triagem

populacional para tais doenças.

Os estudos genéticos moleculares utilizam várias técnicas para analisar mutações no

gene. A primeira descoberta que permitiu o avanço da tecnologia do DNA recombinante foi a

descoberta das enzimas de restrição, elas são fabricadas naturalmente por microorganismos

16

para destruir o DNA de vírus invasores, reconhecem pontos específicos - sítios de restrição

no DNA duplo, local em que cortam as sequências de nucleotídeos, originando os fragmentos

conhecidos como extremidades coesivas, que podem se ligar a outras pontas de moléculas de

DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima. Cada extremidade pode se unir a outra,

desde que seja um palíndromo, isto é, uma região de DNA com repetições invertidas.

Algumas enzimas geram extremidades cegas, isto é, sem bases despareadas, nesse caso o

DNA não é capaz de se ligar a outra sequência. As enzimas de restrição são utilizadas para

realização da técnica RFLP- Polimorfismo do Comprimento de Fragmento de Restrição

(Restriction Fragment Length Polymorfism) elas digerem o DNA em sítios específicos do

fragmento amplificado pela PCR e os padrões são detectados pela mobilidade eletroforética,

essa técnica é útil na elaboração de mapas de restrição.

No Mapa de Restrição estão contidas todas as enzimas disponíveis para um segmento

de DNA e essas enzimas são utilizados no momento da análise de uma mutação.

Normalmente elabora-se um mapa de restrição para uma região de interesse de um

cromossomo. Eles são utilizados na comparação de alelos normais e afetados para uma

determinada mutação estudada.

Outras técnicas utilizadas para detecção de mutações são: Polimorfismo de

conformação de fita simples (Single-Stranded Conformational Polymorfism - SSCP) a qual

possibilita determinar os polimorfismos em DNA de fita simples; Técnicas de amplificação de

alvos-específicos- a PCR Real-time; e o Sequenciamento- o sequenciamento de ácidos

nucléicos permite determinar a ordem das bases nucleotídicas na molécula do DNA, a análise

de mutações no seqüenciamento automático se dá pela identificação de picos diferentes na

leitura. Como possuímos dois alelos, quando há alteração na seqüência, o que observamos são

dois picos na leitura no fragmento de DNA (SAEZ et al., 2008). Os resultados destas técnicas

podem ser favoráveis no diagnóstico e na avaliação do tipo de mutação observado nos

pacientes.

No presente estudo foi realizada uma análise “in sílico” no gene da tireoperoxidase

para identificar os sítios de restrição presentes nos 17 éxons e assim criar um Mapa de

Restrição desse gene, como contribuição científica para análise das mutações que estão

relacionadas ao Hipotireoidismo Congênito no gene da Tireoperoxidase. Além de realizar um

levantamento bibliográfico para construção de uma tabela atualizada das mutações descritas

no gene TPO.

17

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Tireóide

A tireóide está localizada no pescoço, na frente da traquéia e inferior à laringe. É

constituída por dois lobos unidos por um istmo e revestidos por uma cápsula conjuntiva

(Figura 1) (MOORE KL, 2004; FAGMAN et al., 2006).

Figura 1: Glândula Tireóide; Fonte: Libertas

http://www.libertas.com.br/site/index.php?central=conteudo&id=2977

A principal função da glândula tireóide é a produção dos hormônios triiodotironina

(T3) e tetraiodotironina (T4) realizado pelas células foliculares. Essas células são rodadas

pelo colóide, um material gelatinoso composto principalmente pela proteína tireoglobulina,

precursora dos hormônios tireoidianos (HTs) (GUYTON, 1992).

O mecanismo que envolve a síntese dos hormônios tireoidianos é controlado pelo eixo

hipotálamo- hipófise- tireóide (Figura 2). Os neurônios hipotalâmicos secretam a tireotropina

(TRH), um tripeptídeo que estimula a síntese e secreção do hormônio tireoestimulante (TSH),

ele é sintetizado na hipófise anterior e regula a síntese e secreção dos HTs. O TSH liga-se ao

seu receptor (TSHr) que se encontra localizado na membrana basolateral do tireócito e

estimula a liberação dos HTs.

http://www.libertas.com.br/site/index.php?central=conteudo&id=2977

18

Figura 2: Regulação da síntese e secreção dos hormônios da tireóide - Eixo hipotalâmico-hipofisário-tiróide

(Fonte: GREENSPAN, 2004. In RODRIGUES, 2004).

Segundo Rodrigues (2004), o TSH atua aumentando a transcrição dos genes essenciais

na hormonogênese coma a Tireoglobulina (TG), a Tireoperoxidase (TPO) e o Transportador

N a+ / I - (NIS), além de aumentar a produção de peróxido de hidrogênio, composto

indispensável na atuação da enzima TPO.

A produção dos hormônios TRH e TSH é controlada pelos níveis de T3 e T4 no

sangue, mecanismo de feedback negativo. Níveis elevados de T3 e T4 inibem a produção

de TSH e TRH que deixam de estimular os tireócitos diminuindo a síntese e secreção das

HTs. Outro fator que interfere na produção de HTs é a quantidade de iodo presente no

citoplasma, o excesso de iodo inibe o processo de iodização inibindo a síntese. Esse

mecanismo é conhecido como efeito Wolff-Chaikoff (VAISMAN, ROSENTHAL &

CARVALHO, 2004)

De acordo com Vaisman, Rosenthal & Carvalho (2003), a adequada produção dos

HTs depende do normal funcionamento das proteínas que são necessárias para a captação de

iodeto através da membrana dos tireócitos e sua incorporação à proteína aceptora, a

tireoglobulina, esta etapa é denominada organificação e depende da ação da enzima

Tireoperoxidade (TPO), principal enzima envolvida nesse processo.

2.2 Hipotireoidismo Congênito

O Hipotireoidismo Congênito (HC) é a uma doença endócrina que, afeta cerca

19

de 1: 3000 a 4000 recém-nascidos, causando retardo mental se tratamento ocorrer

tardiamente. ( GILLAM ;KOPP, 2001).

A deficiência é causada quando ocorre uma diminuição ou ausência na produção dos

hormônios tireoidianos. Os HTs são indispensáveis nos primeiros dias de desenvolvimento

da criança, confirmando a importância do diagnóstico precoce, para que o tratamento seja

iniciado mais rápido e possa evitar danos irreversíveis. Um recém-nascido não apresenta

sintomas específicos e a doença começa a se tornar grave no tempo em que a criança

permanece com déficit na produção HTs (AVBELJ et al, 2007).

A ausência dos HTs no início do desenvolvimento da criança pode ocasionar alguns

danos neurológicos, como deficiências nas funções cognitivas e coordenação motora

(NOGUEIRA et al., 2010).

O Programa de Triagem Neonatal é utilizado para detecção de algumas doenças

como Fenilcetonúria, Hemoglobinopatias, Fibrose Cística e Hipotireoidismo Congênito,

com o intuito de se estabelecer o diagnóstico precoce de tais doenças (BRASIL, 2003).

Gruters (1992) afirma que uma vez diagnosticado o HC, a terapia de reposição dos

hormônios tireoidianos deve ser iniciada até o primeiro mês de vida, pois durante esse

período, maiores são as possibilidades de evitar danos mentais e motores aos afetados.

De acordo com Foley (2000) o HC se classifica em quatro grupos principais:

1. Permanente - quando a ausência dos HTs ocorre durante toda vida do paciente.

2. Transitório - é diagnosticado precocemente (triagem neonatal) e desaparece

espontaneamente.

3. Primário - a tiróide não é capaz de produzir a quantidade suficiente dos hormônios

T3 e T4.

4. Secundário - Causado por doenças hipofisiárias ou hipotalâmicas (hipotireoidismo

hipotalâmico-pituitário), (RODRIGUES, 2004).

No Hipotireoidismo permanente esporádico os defeitos na organogênese da tireóide

são classificados como Disgenesia tireoidiana e ocorrem em aproximadamente 85% dos

casos de HC. A disgenesia tireoideana pode se apresentar com agenesia glandular (25% a

35% dos casos), definida como ausência de tecido tireóideo detectável; ectopia (40% a

60%), com tecido tireóideo encontrado desde a base da língua até o mediastino ou

hipoplasia (aproximadamente 5%), onde a glândula de tamanho reduzido se situa em

20

posição cervical normal e ainda ateriose que são defeitos na diferenciação inicial ou a

sobrevivência de células foliculares da tireóide (KNOBEL, NOGUEIRA & MEDEIROS-

NETO, 2001).

Os 10% dos casos de HC estão relacionados a defeitos da síntese hormonal causados

por disormonogênese e geralmente criam condições para fenótipo com presença do bócio e

grau variável de hipotireoidismo (PERONE et al., 2003). Esses defeitos são transmitidos na

maioria das vezes de forma autossômica recessiva, com exceção dos defeitos do receptor do

hormônio tireoidiano, que são autossômicos dominantes (KNOBEL; MEDEIROS, 2003). Os

5% restantes resultam da transferência de anticorpos maternos para o recém-nascido

(PERONE et al., 2003).

Os defeitos na síntese dos hormônios podem ser causados por mutações no gene

codificador para a proteína transportadora de iodeto (NIS), no gene pendrina (síndrome de

Pendred), no gene da tireoglobulina (TG), além de mutações que afetam o receptor de

hormônio tireóideo (resistência genética ao HT) ou aos vários defeitos no transporte de HT na

circulação periférica (RUBIO et al., 2008). No entanto, a forma mais comum resulta de

defeitos na organificação do iodo causado por mutações no gene da tireoperoxidase (TPO)

(RODRIGUES, 2004).

A causa mais comum de disormonogênese ocorre devido a alterações na enzima TPO.

De acordo com Menzalira (2010) três mecanismos podem alterar a atividade enzimática da

TPO:

1. Alterações na sequência correta de DNA, resultando em um códon de parada que

produzirá uma proteína incompleta conhecida como proteína truncada, essa proteína apresenta

expressão deficitária.

2. A troca de aminoácidos pode alterar a estrutura terciária da proteína, impedindo que

ela saía do retículo endoplasmático e perde sua função pela localização incorreta.

3. A substituição de um aminoácido que não altera a estrutura nem a localização da

proteína, mas a atividade da proteína permanece danificada.

2.3Tireoperoxidase

O gene da TPO humana (GenBank Acession number: NM_000547), localiza-se no

braço curto do cromossomo 2p2.5, está clonado e a sequência completa do RNAm possui

3146 nucleotídeos, composto de 17 éxons e 16 íntrons que se estendem por uma região de

21

aproximadamente 150 kb (ENDO et al., 1995). No banco de dados do GenBank estão

depositadas 7 isoformas do gene TPO, a mais atualizada foi a utilizada no nosso estudo

(NM_000547).

A expressão do gene da TPO ocorre principalmente na tireóide, traquéia e glândulas

salivares (AZA BLANC et al., 1993). Sua expressão é controlada pelo TSH através de

um sistema dependente de 3’5’-adenosina monofosfato cíclico (AMPc)/proteína quinase A

(GERARD et al., 1989) e também pelos fatores de transcrição, NKX2.1, FOXE1 e PAX8

que se ligam em sítios específicos do promotor, regiões TATAbox localizadas na posição -

25 do ponto de início da transcrição (ABRAMOWICZ et al., 1992).

A tireoperoxidase é sintetizada no retículo endoplasmático rugoso da célula e,

transferido para a membrana apical através do complexo de Golgi, onde irá catalisar os

processos de iodação e posteriormente o acoplamento de resíduos de tirosina na tiroglobulina

para formação dos hormônios da tireóide. É uma proteína glicosilada, com um grupo

prostético heme ligado à membrana, permanece localizada na membrana apical dos

tireócitos com o sítio catalítico exposto para o colóide (VAISMAN, ROSENTHAL &

CARVALHO, 2004).

A TPO possui 933 aminoácidos e peso molecular de 103 kDa é uma da principais

enzima envolvida na síntese dos hormônios tireoidianos (BAKKER et al., 2000), sendo

responsável por três reações:

A oxidação de íons iodeto (I-),

Iodação das tirosinas da TG e o

Acoplamento das tirosinas iodinizadas (acoplamento) para a formação dos hormônios

T4 e T3 (TAUROG A, 2000; LARSEN ET AL., 2003; VAISMAN; ROSENTHAL;

CARVALHO, 2004).

Já foram descritas outras isoformas de TPO encontrada em tireóides normais, chamada

TPO 2, apresenta 876 aminoácidos, e a TPO zanelli presente em doença de Graves que possui

929 aminoácidos. O papel dessas TPO ainda não foi esclarecido.

Várias mutações que atuam inativando ambos os alelos do gene da TPO, foram

identificadas em pacientes com HC, a grande da maioria localizada nos éxons 8, 9 e 10,

que contêm os resíduos de histidina de ligação heme, distais e proximais, que

22

correspondem à região catalítica da enzima. Alterações de seqüências nestes importantes

sítios podem, provavelmente, levar a inativação da TPO (PANNAIN et al., 1999).

2 .4 Mutações descritas no gene da Tireoperoxidase

A primeira mutação no gene TPO foi relatada por Abramowicz (1992). No estudo

realizado por Ris-Stalpers & Bikker (2010) foram descritas 61 mutações neste gene (como é

apresentado na Figura 3), essas mutações se disseminam por quase todo o gene variando entre

mutações missense, nosense, mutações no splicing e frameshift o que comprova sua elevada

heterogeneidade.

Figura 3: Mutações no gene TPO humano identificadas em pacientes com Hipotireoidismo Congênito.

(Fonte: RIS-STALPERS & BIKKER, 2010).

23

2.5 Análises de mutação

Para detecção de alterações genéticas envolvendo uma única base, ou grupos de bases,

são necessárias técnicas que comparem a forma mutante com a comum, dentre estas técnicas

podem destacar:

Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE) - esse método

utiliza uma eletroforese com gel de poliacrilamida desnaturante, ou seja, com uréia ou

formamida (substâncias desnaturantes). Nestas condições, ocorre a separação das moléculas

de DNA de acordo com sua temperatura de desnaturação. Os produtos são marcados por

coloração com brometo de etídio ou nitrato de prata para observar fitas homoduplex e

heteroduplex (ARIAS et al., 2003).

Polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) - essa técnica

possibilita a diferenciação de fragmentos de DNA de mesmo tamanho, a diferença de um

nucleotídeo na sequência do DNA altera o padrão de migração eletroforética (MOLINA;

TOBO, 2004). Na análise de SSCP, o DNA de fita dupla é desnaturado por calor na presença

de formamida e as fitas simples de DNA são analisadas por eletroforese em gel não

desnaturante de poliacrilamida (ARIAS et al., 2003).

Sequenciamento - O sequenciamento é realizado pela PCR utilizando, além

dos deoxinucleotídeos normais (dNTPs), os dideoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com

material fluorescente, uma cor para cada base, permitindo a detecção de diferentes fragmentos

durante a migração pela eletroforese capilar. Os fragmentos são lidos automaticamente por

lasers, com o auxílio de softwares para leitura dos dados (SAEZ, et al. ,2008)

2.5.1 Enzimas de restrição

As atuais técnicas utilizadas em Biologia Molecular tornaram-se possível graças à

identificação e purificação de enzimas nucleares. Entre elas destacam-se as enzimas de

restrição que reconhecem uma sequência específica de pares de bases de nucleotídeos e

clivam o DNA nesse sítio, gerando fragmentos de vários tamanhos que são separados e

analisados por eletroforese.

As enzimas são específicas e cada uma reconhece apenas o seu sítio de restrição

(HIRATA et al., 2006). Esses sítios são seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na

molécula de DNA.

24

As enzimas são isoladas de bactérias e sua função, descoberta nos anos 70, é destruir

vírus que invadem a bactéria, os bacteriófagos. Uma vez cortados, os fagos tornam-se

inofensivos. As bactérias se protegem de suas próprias enzimas de restrição através da

metilação do seu DNA. Este sistema, pelo qual as endonucleases de restrição reconhecem o

DNA exógeno pode ser considerado um sistema imune primitivo da bactéria. Como a enzima

evoluiu até obter este grau de especificidade, ainda é desconhecido. Em organismos mais

evoluídos, incluindo humanos, a metilação está associada à capacidade da célula de ligar e

desligar genes.

Já foram identificadas mais de 1000 enzimas de restrição. E elas são nomeadas de

acordo com o nome da bactéria da qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o

gênero e as outras duas à espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica

a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de

restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de

transferência de resistência RI (NASCIMENTO et al., 2003).

2.5.2 Polimorfismo dos Comprimentos de Fragmento de Restrição (RFLP)

Em muitas doenças genéticas, o alelo causador da doença pode estar muito próximo a

um sítio de reconhecimento de uma enzima de restrição particular. Sabe-se que variações nas

sequências de DNA ocorrem aleatoriamente através do genoma inteiro e podem está

associadas a uma doença específica. Estas alterações de bases resultam na perda de um sítio

de restrição existente ou de aquisição de um novo sítio (HIRATA; HIRATA, 1999)

Este é o princípio em que se baseia a técnica de RFLP (Polimorfismo dos

Comprimentos de Fragmento de Restrição). Estes polimorfismos de fragmentos de restrição

(RFLP) podem ser facilmente testados em indivíduos, facilitando estudos com grandes

populações para identificação de polimorfismos (BOTSTEIN et al., 1980).

Alguns polimorfismos no genoma podem ser detectados pela comparação de mapas de

restrição de diferentes indivíduos, observado a mudança na mobilidade eletroforética do

padrão de fragmento produzido pela clivagem com a enzima de restrição (LEWIN, 2001). A

base para o polimorfismo entre os alelos são as diferentes mutações que podem ocorrer na

sequência de DNA. Os Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP)

representam a ausência ou presença de sítios de reconhecimentos de enzimas de restrição em

diferentes indivíduos (GRIFFITHS, et al., 2006).

25

Muitas vezes uma mutação responsável por uma doença específica remove um sítio de

restrição que está normalmente presente no gene. Ou, ao contrário uma mutação ocasional

associada a uma doença altera a sequência normal, criando um sítio de restrição para uma

determinada enzima. É o que ocorre no íntron 3 do gene TPO, mutações nesse lócus criam um

novo local de corte para a enzima AluI, diferindo no padrão de bandeamento de um indivíduo

que não apresenta essa mutação. Também ocorre no éxon 8 que cria um local de corte para a

enzima DdeI.

Os RFLP são herdados como características genéticas simples obedecendo às leis

mendelianas de herança. Se for demonstrado em estudos que um gene produtor de uma

doença está ligado a um RFLP, este pode, então, fornecer um meio de detectar o gene

defeituoso sem efetivamente conhecê-lo (HIRATA; HIRATA, 1999).

2.5.3 Mapas de restrição

Os mapas de restrição são construídos para fornecer uma caracterização do genoma,

como por exemplo, o tamanho completo do genoma, número de sítios de restrição por enzima,

posição relativa desses sítios, e em comparação com outras espécies, a determinação de

regiões mais ou menos conservadas desse genoma. A posição de sítios de restrição no mapa

serve como um marcador que pode auxiliar na definição de espécies e na determinação das

relações filogenéticas entre espécies próximas (ARIAS et al., 2003).

O mapa de restrição construído durante o trabalho apresentado poderá ser utilizado na

análise de mutação dos pacientes que possuem HC por disormonogênese tratados no Hospital

Universitário Alcides Carneiro (HU).

26

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Construir um mapa de restrição do gene da Tireoperoxidase (TPO) para correlacionar os

sítios de restrição e as mutações descritas que causam Hipotireoidismo Congênito (HC).

3.2 Objetivos específicos

Buscar na literatura as principais mutações no gene TPO que causam HC;

Identificar sítios de restrição nos 17 éxons do gene TPO para construção de um Mapa

de Restrição;

Investigar as enzimas descritas na literatura utilizadas na identificação de mutações no

gene TPO presente na literatura;

Correlacionar as mutações descritas na literatura com a sequência do GenBank e criar

uma tabela com as enzimas atualizada.

27

4. METODOLOGIA

4.1 Identificação das mutações descritas na literatura no gene TPO e construção de um

Mapa de Restrição

Foi realizado um levantamento bibliográfico, com dados obtidos através de uma busca

na literatura nos bancos de dados como Portal Capes que possui livre acesso as revistas

conceituadas como: Science, Nature, Clinical Endocrinology. Foram selecionados todos os

artigos que possuem mutações descritas no gene TPO para elaboração de uma tabela. Essa

tabela foi comparada com a tabela apresentada na dissertação de Menzalira (2010) e o artigo

publicado por Ris-Stalpers (2010), para contrapor as mutações com os respectivos artigos,

além de verificar a veracidade das tabelas apresentadas.

Com base nesse estudo foi elaborado um mapa de restrição com a utilização do

programa NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/), esse programa esta disponível no

site da empresa comercial New England BioLabs, responsável por comercializar enzimas para

a realização de pesquisas. As mutações descritas foram confirmadas na sequência do gene

TPO disponível do GenBank (NCBI Ref. Seq: NM_000547.5) e também utilizada pelos

autores que descreveram as mutações.

4.2 Construção do Mapa de Restrição do gene TPO

Inicialmente utilizou-se a sequência completa do RNAm (NCBI Ref. Seq:

NM_000547.5) do gene TPO para conferir e separar a sequência referente a cada éxon, para

posterior utilização desse sequência na construção do mapa de restrição, essa sequência foi

utilizada por ser a sequência de maior comprimento depositada no GenBank. A sequência

referente a cada éxon (1 a 17) do gene TPO foi copiada e colada na caixa de texto do

programa NEBcutter disponível no site BioLabs (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php),

este programa é uma ferramenta utilizada para reconhecer os sítios de restrição de enzimas e

suas posições nos éxons da sequência do DNA. Selecionou-se as opções para obtenção de um

mapa no formato linear que apresentasse todas as enzimas com sítios no éxon, independente

de serem comercializadas ou não. As imagens com as sequências específicas foram

arquivadas para análise no momento da construção do mapa de restrição. Também utilizamos

o programa WEBcutter (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) para confirmar as enzimas que o

programa NEBcutter apresentou para cada éxon.

http://tools.neb.com/NEBcutter2/

http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php

http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

28

Na construção do mapa foram excluídas as enzimas que possuem sítios degenerados, o

que significa que eles contêm um ou mais pares de bases que não são especificamente

definidos. Um exemplo é a enzima BsrFI que reconhece o sítio RCCGGY, onde na posição

representada por R pode está uma base A (Adenina) ou G (Guanina) e na posição Y pode está

uma base C (Citosina) ou T (Timina). Essas enzimas foram excluídas, pois caso ocorresse

uma alteração na posição degenerada a mesma não seria detectada pela enzima no momento

da análise de restrição.

4.3 Mutações identificadas e analisadas por RFLP na literatura

Durante a revisão descrita no tópico 3.2 os artigos que utilizaram a técnica RFLP

foram selecionados para posterior elaboração de uma tabela contendo as mutações e as

enzimas que possuem sítios no local da mutação ou em regiões próximas, sítios que são

criados ou eliminados na presença de uma alteração na sequência do gene TPO.

29

5. RESULTADOS

5.1 Mapa de Restrição do gene TPO

A figura 4 apresenta as enzimas que estão disponíveis nos respectivos éxons, essas

enzimas poderão ser utilizadas para analisar e/ou confirmar a presença de mutações no gene

TPO, uma vez que as mutações poderão criar ou eliminar os sítios de restrição presentes nos

éxons. Essa é uma maneira de facilitar a identificação e confirmação de mutações no gene

TPO. Esse mapa de restrição poderá ser utilizado como uma ferramenta no momento da

análise do gene TPO em pesquisas posteriores.

Figura 4: Desenho esquemático com enzimas disponíveis no Gene Tireoperoxidase. O número de enzimas disponíveis nos éxons

está representado abaixo.

A comparação entre o número de mutações e o número de enzimas de restrição

disponíveis em cada éxon foi realizada e está apresentada no gráfico 1.

30

Gráfico 1: Comparação entre o número de mutações e o número de enzimas de restrição disponíveis em

cada éxon.

As tabelas abaixo apresentam a descrição dos 17 éxons presentes no gene TPO, estão

apresentadas as enzimas e seus sítios de restrição e as posições em que ocorrem os cortes no

gene.

O éxon 1 do gene TPO apresenta 90 nucleotídeos e sete enzimas possuem sítios de

restrição nesse segmento. Até o momento nenhuma mutação foi descrita nesse éxon.

Tabela 1- Éxon 1:

Enzima Sítios de restrição Posição no éxon

MseI 5'... T T A A ... 3'

3'... A A T T ... 5'

8

KasI 5'... G G C G C C ... 3'

3'... C C G C G G ... 5'

12

NarI 5'...G G C G C C... 3'

3'...C C G C G G... 5'

13

HinP1I 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

13

SfoI 5'... G G C G C C ... 3'

3'... C C G C G G ... 5'

14

HhaI 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

15

HpyCH4V 5'... T G C A ... 3'

3'... A C G T ... 5'

58

31

O éxon 2 possui 94 nucleotídeos, representados da posição 91...185 no gene. Uma

mutação foi descrita nesse éxon, uma duplicação da posição 31 á posição 50, resultando em

uma mutação do tipo frameshift (Bikker et al., 1994). Nove enzimas possuem sítios de

restrição nesse segmento.

Tabela 2 - Tabela Éxon 2:

Enzima Sítio de restrição Posição no éxon

HinP1I 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

1

HhaI 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

3

PhoI 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

34

HaeIII 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

34

HpyCH4V 5'...T G C A... 3'

3'...A C G T... 5'

38

XhoI 5'...C T C G A G... 3'

3'...G A G C T C... 5'

63

TliI 5'... C T C G A G ... 3'

3'... G A G C T C ... 5'

63

PaeR7I 5'...C T C G A G... 3'

3'...G A G C T C... 5'

63

TaqI 5'... T C G A ... 3'

3'... A G C T ... 5'

64

O éxon 3 possui 84 nucleotídeos, está representado na posição 186...270, sete enzimas

possuem sítios de restrição e apenas uma mutação foi descrita nesse éxon. A mutação descrita

na posição c.157G>C, está apresentada no artigo como ocorrendo no éxon 3 , no entanto essa

posição encontra-se no éxon 2 (NIU, et al. 2002).

Tabela 3 - Éxon 3:


32

BssSI 5'... C A C G A G ... 3'

3'... G T G C T C ... 5'

9

BfaI 5'...C T A G... 3'

3'...G A T C... 5'

18

HinP1I 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

40

HhaI 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

42

AciI 5'... C C G C ... 3'

3'... G G C G ... 5'

54

CviAII 5'...C A T G... 3'

3'...G T A C... 5'

58

CviQI 5'... G T A C ... 3'

3'... C A T G ... 5'

61

HpyCH4V 5'... T G C A ... 3'

3'... A C G T ... 5'

73

O éxon 4 possui 169 nucleotídeos iniciando na posição 271...440, apenas uma enzima

possui sítio de restrição nesse segmento e duas mutações foram descritas. A mutação

c.292C>A descrita por Neves (2008) causa uma substituição da Leucina por uma Isoleucina

causando defeito total na incorporação do iodeto (DIIT).

Tabela 4- Éxon 4:


AciI 5'... C C G C ... 3'

3'... G G C G ... 5'

65

O éxon 5 possui 132 nucleotídeos e está representado na posição 441...573, cinco

enzimas possuem sítios de restrição, apenas duas mutações foram descritas nesse éxon. A

mutação c.387delC descrita por (Rivolta et al., 2003) é do tipo frameshift e resulta em um

códon de parada originando uma proteína truncada. Essa mutação está descrita na posição do

éxon 4.

Tabela 5- Éxon 5:


33

BglII 5'... A G A T C T ... 3'

3'... T C T A G A ... 5'

7

DpnI 5'...G A T C... 3'

3'...C T A G... 5'

9

PciI 5'...A C A T G T... 3'

3'...T G T A C A... 5'

30

HaeIII 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

100

AluI 5'... A G C T ... 3'

3'... T C G A ... 5'

113

O éxon 6 possui 129 nucleotídeos, está representado na posição 574...703, este

possui o maior número de enzimas com sítios disponíveis (10), mas apenas uma mutação foi

descrita. A mutação 613C>T dá origem a um códon de parada na proteína (R175X), causando

a perda de uma parte catalítica da enzima. Além de eliminar um sítio de restrição para a

endonuclease BsaXI , que está presente na ausência da mutação, a técnica de RFLP foi usada

para identificar essa mutação (AVBELJ et al., 2007).

Tabela 6- Éxon 6:


KasI 5'... G G C G C C ... 3'

3'... C C G C G G ... 5'

10

NarI 5'... G G C G C C ... 3'

3'... C C G C G G ... 5'

11

HinP1I 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

11

SfoI 5'...G G C G C C... 3'

3'...C C G C G G... 5'

12

HhaI 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

13

PhoI 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

25

HaeIII 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

25

BsrGI 5'... T G T A C A ... 3'

3'... A C A T G T ... 5'

98

CviQI 5'... G T A C ... 3'

3'... C A T G ... 5'

99

RsaI 5'... G T A C ... 3'

3'... C A T G ... 5'

100

34

O éxon 7 possui 206 nucleotídeos e está representado na posição 704...910, possui

sete enzimas com sítios disponíveis, e três mutações já foram descritas nesse éxon. A mutação

c.796C> T [p.Q266X], gera uma proteína truncada de 265 aminoácidos, que provoca a perda

da parte catalítica da enzima. Assim, grande parte de um dos principais domínios funcionais

da TPO é eliminado (BELFORT et al., 2012).

Tabela 7- Éxon 7:


PciI 5'... A C A T G T ... 3'

3'... T G T A C A ... 5'

11

AciI 5'... C C G C ... 3'

3'... G G C G ... 5'

53

TaqI 5'...T C G A... 3'

3'...A G C T... 5'

91

BstUI 5'... C G C G ... 3'

3'... G C G C ... 5'

105

AluI 5'... A G C T ... 3'

3'... T C G A ... 5'

132

MspI 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

204

HpaII 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

204

O maior comprimento esta presente no éxon 8, este possui 518 nucleotídeos e está

representado na posição 911...1429, possui sete enzimas com sítios disponíveis, e também

apresenta o maior número de mutações descritas, apresentando 17 ao longo do éxon. Os éxons

8, 9 e 10 codificam para a parte catalítica da enzima e são os locais mais freqüentes de

inativação causados por mutações (AVBELJ et al., 2007). Uma análise “in sílico” realizada

por Neves, 2008 detectou que a estrutura secundária da proteína pode ser alterada pela

presença do ácido glutâmico na posição 319 localizada em regiões de ligação de cálcio

alterando a conformação da proteína e função da enzima, ocasionada pela mutação 1046G>A

presente no éxon 8.

Tabela 8- Éxon 8:

35


NgoMIV 5'... G C C G G C ... 3'

3'... C G G C C G ... 5'

11

NaeI 5'... G C C G G C ... 3'

3'... C G G C C G ... 5'

13

FseI 5'... G G C C G G C C ... 3'

3'... C C G G C C G G ... 5'

15

BsrBI 5'... C C G C T C ... 3'

3'... G G C G A G ... 5'

46

MluI 5'... A C G C G T ... 3'

3'... T G C G C A ... 5'

148

BfaI 5'... C T A G ... 3'

3'... G A T C ... 5'

180

PvuII 5'... C A G C T G ... 3'

3'... G T C G A C ... 5'

191


nove enzimas com sítios disponíveis e 10 mutações já foram descritas. O éxon também

codifica uma parte catalítica da enzima. A mutação 1496delC origina um códon de parada

resultando em uma proteína TPO truncada, essa proteína não apresenta uma parte da

transmembrana e não pode ser adequadamente inserido na membrana apical (DELADOEY et

al., 2008).

Tabela 9- Éxon 9:


BamHI 5'... G G A T C C ... 3'

3'... C C T A G G ... 5'

22

StuI 5'... A G G C C T ... 3'

3'... T C C G G A ... 5'

39

CviQI 5'...G T A C... 3'

3'...C A T G... 5'

50

RsaI 5'... G T A C ... 3'

3'... C A T G ... 5'

51

AluI 5'... A G C T ... 3'

3'... T C G A ... 5'

175

HpaII 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

199

SmaI 5'... C C C G G G ... 3'

3'... G G G C C C ... 5'

200

36

HpyCH4V 5'... T G C A ... 3'

3'... A C G T ... 5'

212

NcoI 5'... C C A T G G ... 3'

3'... G G T A C C ... 5'

231

O éxon 10 possui 170 nucleotídeos e está representado na posição 1689...1859,

possui seis enzimas com sítios disponíveis e 10 mutações já foram descritas nesse éxon. A

mutação 1842 G>A (Arg584Gln) está presente no sítio catalítico da enzima TPO, essa região

é altamente conservada nas diferentes espécies, essas mutações alteram a conformação da

proteína e a função da enzima (NEVES, 2008)

Tabela 10- Éxon 10:


StuI 5'... A G G C C T ... 3'

3'... T C C G G A ... 5'

18

PvuII 5'...C A G C T G... 3'

3'...G T C G A C... 5'

58

Tsp509I 5'... A A T T ... 3'

3'... T T A A ... 5'

100

MluCI 5'... A A T T ... 3'

3'... T T A A ... 5'

100

HpaII 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

145

MspI 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

145

O éxon 11 possui 237 nucleotídeos, está representado na posição 1860... 2097

possui seis enzimas com sítios disponíveis, e oito mutações já foram descritas nesse éxon. A

substituição 1978 G>C no éxon 11 resulta na substituição de ácido glutâmico por glutamina

na posição 660 (Gln660Glu). Esta mutação já foi descrita em seis famílias portuguesas e duas

brasileiras (DELODEY et al., 2008).



37

ApaI 5'... G G G C C C ... 3'

3'... C C C G G G ... 5'

177

ClaI 5'... A T C G A T ... 3'

3'... T A G C T A ... 5'

120

BspDI 5'... A T C G A T ... 3'

3'... T A G C T A ... 5'

120

BseYI 5'... C C C A G C ... 3'

3'... G G G T C G ... 5'

130

AluI 5'...A G C T... 3'

3'...T C G A... 5'

143

PspOMI 5'... G G G C C C ... 3'

3'... C C C G G G ... 5'

173


sete enzimas com sítios disponíveis, mas apenas duas mutações foram descritas. A delT na

posição 2243/2244 é causada por uma mutação Frameshift, que gera um códon de parada na

posição 718 originando uma proteína truncada, essa mutação foi descrita pela primeira vez em

pacientes holandeses (BAKKER et al.,2000).



HpyCH4IV 5'... A C G T ... 3'

3'... T G C A ... 5'

28

BmgBI 5'... C A C G T C ... 3'

3'... G T G C A G ... 5'

15

AluI 5'... A G C T ... 3'

3'... T C G A ... 5'

42

NcoI 5'... C C A T G G ... 3'

3'... G G T A C C ... 5'

101

Tsp509I 5'... A A T T ... 3'

3'... T T A A ... 5'

124

MluCI 5'... A A T T ... 3'

3'... T T A A ... 5'

124

StuI 5'... A G G C C T ... 3'

3'... T C C G G A ... 5'

178

O éxon 13 possui 170 nucleotídeos, está representado na posição 2307...2477,

também possui dez enzimas com sítios disponíveis, e cinco mutações descritas. A mutação

tipo frameshift localizada na posição 2243insT foi primeiro relatada em pacientes de Taiwan

com defeito total na organificação do iodo (NIU et al.,2002).

38



ApaLI 5'...G T G C A C... 3'

3'...C A C G T G... 5'

38

HinP1I 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

61

BstUI 5'... C G C G ... 3'

3'... G C G C ... 5'

63

HhaI 5'... G C G C ... 3'

3'... C G C G ... 5'

63

NgoMIV 5'... G C C G G C ... 3'

3'... C G G C C G ... 5'

81

NaeI 5'... G C C G G C ... 3'

3'... C G G C C G ... 5'

83

Eco53kI 5'... G A G C T C ... 3'

3'... C T C G A G ... 5'

97

SacI 5'... G A G C T C ... 3'

3'... C T C G A G ... 5'

99

HaeIII 5'...G G C C... 3'

3'...C C G G... 5'

105

PhoI 5'... G G C C ... 3'

3'... C C G G ... 5'

105

O éxon 14 possui 131 nucleotídeos e está representado na posição 2478...2609,

possui cinco enzimas com sítios disponíveis, e nove mutações descritas. Uma substituição na

posição 2512 leva a troca de um aminoácido cistina por uma serina, esta mutação foi descrita

em pacientes portugueses (RODRIGUES et al, 2005).



HinP1I 5'...G C G C... 3'

3'...C G C G... 5'

81

BstUI 5'... C G C G ... 3'

3'... G C G C ... 5'

83

HhaI 5'...G C G C... 3'

3'...C G C G... 5'

83

MspI 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

129

39

HpaII 5'...C C G G... 3'

3'...G G C C... 5'

129

O éxon 15 possui 99 nucleotídeos e está representado na posição 2610...2709, este

possui quatro enzimas com sítios disponíveis, apenas três mutações descritas. A mutação de

ponto presente no éxon 15 (2669G>A (G860R)) é responsável por criar um novo sítio de

restrição para a enzima BclI. Essa alteração é primeira que resulta em uma substituição de

aminoácido na região transmembranar da enzima TPO (AVBELJ et al., 2007).



FatI 5'... C A T G ... 3'

3'... G T A C ... 5'

27

CviAII 5'... C A T G ... 3'

3'... G T A C ... 5'

28

NlaIII 5'... C A T G ... 3'

3'... G T A C ... 5'

31

TaqI 5'... T C G A ... 3'

3'... A G C T ... 5'

74

O éxon 16 possui 129 nucleotídeos, está representado na posição 2710..2839 e não

apresenta enzimas disponíveis. Cinco mutações já foram descritas nesse éxon. A mutação

2738 C>T foi descrita pela primeira vez em pacientes brasileiros (Neves, 2008), esses

pacientes apresentam defeito total na organificação do iodo.

Éxon 16

Não há sítios de restrição com enzimas disponíveis. E 4 mutações já foram descrtitas

nesse éxon.

O éxon 17 possui o segundo maior cumprimento com 306 nucleotídeos e esta

representado na posição 2840...3146, possui cinco enzimas com sítios disponíveis, e nenhuma

mutações foi descrita nesse éxon.



40

MspI 5'... C C G G ... 3'

3'... G G C C ... 5'

14

HpaII 5'...C C G G... 3'

3'...G G C C... 5'

14

PstI 5'... C T G C A G ... 3'

3'... G A C G T C ... 5'

70

BsiWI 5'... C G T A C G ... 3'

3'... G C A T G C ... 5'

97

BfaI 5'... C T A G ... 3'

3'... G A T C ... 5'

168

5.2 Levantamento das enzimas de restrição e mutações no gene TPO

Muitos autores (AMBRUGGER et al., 2001; AVBELJ et al., 2007; RIVOLTA et al.,

2007; RODRIGUES et al., 2005; WU et al., 2002;) utilizaram as enzimas de restrição como

uma maneira de confirmar a presença de uma mutação presente no gene TPO.

Estudos realizados com pacientes na Eslovênia, Bósnia e Eslováquia observaram

mutações no gene TPO que eliminavam os sítios de restrição para a endonuclease BsaXI, essa

análise foi realizada através da técnica de RFPL, e também indentificou mutações no éxon 8

(P280P) que eliminou o sítio de restrição para endonucleases NaeI e a mutação no éxon 11

(G667S) que eliminou o sítio de restrição da enzima HphI (AVBELJ et al, 2007).

Outro estudo realizado com pacientes Chineses utilizou a análise com enzimas de

restrição para confirmar a presença de mutações na sequência do gene TPO. Em um dos

pacientes foi detectado a presença de uma mobilidade eletroforética anormal no éxon 13, essa

mutação foi confirmada com a utilização de enzimas de restrição (WU et al, 2002).

Com base na revisão realizada, os artigos que utilizaram a técnica RFLP foram

selecionados e usados na elaboração da Tabela 17. Na tabela estão presentes os éxons com a

mutação e a enzima utilizadas na verificação. A mutação c.180-47A>C está descrita no éxon

3 (Rodrigues et al.,2004), no entanto a posição 180 está presente no éxon 2 e não condiz com

a sequência do GenBank.

41

Tabela 17- Tabela apresenta todas as mutações e respectivas enzimas utilizadas na comprovação ou

detecção descritas na literatura, reunidas após uma análise “in sílico”.

Éxon Mutação Enzima Referência

3 c.180-47A>C AluI (C) Rodrigues et al., 2004

6 c.613C>T BsaXI (E) Avbelj at al, 2007

8 1183_1186dupGGCC DdeI (C) Rodrigues et al., 2005

8 c.1159G>A Apa I (C) Rivolta et al,2007

8 1227delGGCC NaeI (C) Bakker et al, 2000

8 c.930 G>A NaeI (E) Avbelj et al, 2007

8 1273_1276dupGGCC NaeI (C) Avbelj et al, 2007

9 c.1463T>C MspI (C) Ambrugger, et al. 2001

9 1519_1539del BsaXI (E) Avbelj et al, 2007

9 c.1477G>A HaeIII(C) Wu et al, 2002

10 C1708C>T MslI (C) Tenebrum et al,2007

11 2033G>A DdeI (C) Pannain et al,1998

11 c.2089G>A HphI (E) Avbelj et al, 2007

13 c.2386G>T NaeI (C) Wu et al, 2002

14 2585G>A TaqI Pannain et al, 1999

15 c.2669G>A BclI (C) Avbelj et al, 2007

13 2268insT HincII (C) Niu et al., 2005

Legenda: C (Cria sítio de restrição); E (Elimina sítio de restrição)

A primeira mutação descrita no gene TPO foi uma duplicação do segmento CCGG no

éxon 8 apresentada por Abramowicz et al (1992), essa mutação encontra-se descrita em várias

populações apresentando uma elevada incidência. Analisando os dados que apresentam

mutações descritas no gene TPO, observou-se que até o momento já foram descritas 74

mutações que ocorrem ao logo de todo o gene, e tem maior incidência nos éxons 8, 9, 10

(responsáveis por codificar o sítio catalítico da enzima TPO).

A tabela apresentada no Apêndice A foi construída utilizando como base as tabelas

apresentadas na dissertação de Menzalira (2010) e no artigo científico publicado por Ris-

Stalpers (2010), a averiguação nos 38 artigos referenciados apresentou discordância com as

tabelas apresentadas nos trabalhos supracitados, pois nos respectivos trabalhos as posições em

que as mutações estão apresentadas não estão em concordância com os artigos de origem,

diferindo na posição da maioria das mutações, apesar de citar como base para descrição a

mesma sequência do GenBank (NCBI Ref. Seq: NM_000547.5) utilizada nos artigos.

42

No Apêndice A, apresenta-se a tabela revisada e atualizada, na qual se encontram 43

mutações missense (ocasionadas pela substituição de apenas uma base), 7 mutações nonsense

(que originam um códon de parada, formando uma proteína truncada), 5 mutações que afetam

o mecanismo de splicing, 16 mutações frameshift, com duas sendo deleções e 3 mutações

neutras que não ocasionam dano a nível de proteína.

As mutações missense, nonsense e as deleções revisadas foram verificadas na

sequência do gene TPO e a maioria apresentou discordância na posição da base, pois onde

eles indicam conter um tipo de base apresenta outra. Das 52 mutações revisadas apenas 22

estão em concordância com a sequência do gene TPO. A partir dessas 22 mutações foi

elaborada uma tabela presente no apêndice B com as enzimas que possuem sítios de restrição

na sequência normal do gene, essas enzimas possuem sítios em locais próximos da mutação.

Na presença das mutações esses sítios podem ser eliminados e não haverá corte no fragmento

o que possibilita uma verificação da ocorrência de uma mutação nessa posição. A mutação

também pode criar um local de corte para uma nova enzima de restrição. A tabela apresentada

no Apêndice B possui os sítios de restrição presentes na sequência normal do gene TPO e

sítios formados ou eliminados na presença da mutação.

43

6. DISCUSSÃO

Para a construção do Mapa de Restrição do gene TPO utilizamos como sequência base

a mesma descrita nos artigos encontrados durante o levantamento bibliográfico (GenBank

Acession number: NM_000547), os resultados apresentaram muitas enzimas disponíveis em

cada éxon, as que não são comercializadas ou possuem sítios degenerados foram excluídas no

momento da construção. Esse mapa será muito importante para futuras pesquisas com o gene

TPO, pois a utilização de enzima de restrição é uma ferramenta acessível e rápida na detecção

de mutações, muitos autores utilizam as enzimas como uma forma de confirmar uma mutação.

Em estudos realizados em Taiwan um paciente foi caracterizado por SSCP e apresentou uma

migração eletroforética anormal no éxon 9, com o sequenciamento observou-se que esse

paciente apresentava uma substituição de guanina por adenina na posição 1477, e essa

alteração elemina o sítio de restrição da enzima HaeIII, esse estudo utilizou a enzima HaeIII

para determinar a segregação do alelo na família e sua frequência de alelos na população em

geral (Wu et al., 2002), por se tratar de uma ferramenta mais acessível que o sequenciamento.

Dessa forma, evidencia-se a importância da construção de mapas de restrição para outras

doenças genéticas, pois conhecendo as enzimas que podem ser utilizadas em uma análise de

RFLP o produto dos fragmentos digeridos pode ser comparado com o de pacientes normais e

que possuem a doença, facilitando a descoberta da natureza da mutação, correlação genótipo-

fenótipo e utilização no diagnóstico de doenças genéticas.

Em outro estudo realizado uma mutação cria um sítio de restrição para a enzima MspI

no éxon 9, uma análise de restrição foi realizada na família desse paciente para observar se

algum parente também apresentava a referida mutação (AMBRUGGER et al., 2001). A

grande heterogeneidade alélica do gene TPO e o fato das características das mutações serem

específicas para diferentes populações permitem a utilização do mapa de restrição para a

realização de triagem das mutações nas famílias analisadas.

A princípio o Mapa de Restrição seria construído para as mutações descritas no gene

TPO, no entanto a posição de nucleotídeos dessas mutações diferiram da sequência disponível

no GenBank o que dificultou a construção do mapa para as mutações encontradas. Das

mutações que as sequências coincidiram construímos uma tabela com as enzimas que

possuem sítios próximos ou dentro do sítio da mutação, essas enzimas poderão ser utilizadas

diretamente na análise da respectiva mutação, facilitando a detecção da mutação.

44

A partir desse levantamento também foi elaborada uma tabela com todas as enzimas

que já foram confirmadas como ferramenta na análise de restrição do gene TPO, essas

enzimas estão confirmadas em experimentos descritos na literatura. No caso dos exemplos

supracitados.

Também foi construída uma Tabela atualizada contendo todas as mutações descritas

no gene TPO relacionadas ao HC.

De acordo com o nosso estudo a maioria das mutações apresentaram disparidade entre

a sua posição descrita e a sequência do GenBank indicada por cada autor, fato que dificultou a

construção do Mapa de Restrição para essas mutações, das 52 mutações (missense, nonsense e

deleções) descritas até o momento apenas 22 estavam em concordância com a sequência do

GenBank.

No artigo de Rivolta (2007) uma deleção descrita na posição 215 (c.215delA) está

descrita como presente no éxon 4, o autor citado afirma utilizar como base a mesma sequência

do GenBank (NM_000547) na qual foi realizada a análise “in sílico” do trabalho apresentado,

nossa análise na sequência de gene TPO indica que o nucleotídeo presente na posição 215

pertence ao éxon 3, essa mutação é do tipo frameshift e resulta em um códon de parada no

aminoácido 86 da proteína (p.Q72fsX86). Segundo Belfort (2012) a mutação do tipo

missense na posição 1784(c.1784G>A) esta presente no éxon 11, embora utilize a mesma

sequência do GenBank usada na análise apresentada.

Para a construção dessa tabela (Apêndice A) tomamos como base as tabelas

apresentados nos artigos de Ris-Stalpers (2010) e a dissertação de Menzalira (2010),

realizamos uma verificação entre as mutações apresentadas por esses autores e os artigos

referenciados e constatamos que muitas mutações apresentadas não estavam em concordância

com o autor citado, como a mutação c.1994G>A presente no éxon 11 citada na dissertação de

Menzalira (2010) como descrita por Nascimento (2003), durante a constatação no respectivo

artigo observamos que não há descrição para tal mutação. Outro fato observado foi que

algumas mutações estão descritas pelo autor citado em outras posições, mas com o mesmo

efeito a nível da proteína é o que ocorre na mutação apresenta da no artigo de Ris-Stalpers

(2010) ele indica a mutação na posição 1597 (c.1597G>T) que causa uma mudança de

aminoácido na posição 533, essa troca de aminoácido é apresentada no artigo como ocorrendo

devido a uma mutação na posição 1687 e causada pela mesma substituição de nucleotídeo.

45

As divergências supracitadas foram encontradas mesmo a maioria dos autores

afirmando ter utilizado a mesma sequência do gene TPO, essas discordâncias podem ter

ocorrido devido a atualizações na sequência apresentado no Genbank, pois com a realização

de novas pesquisas no gene TPO, novos sequenciamento são realizados em pacientes e

controles e os dados desses resultados são depositados no banco de dados do Genbank. Ou de

alguma forma, pode ter ocorrido erros no momento das anotações das mutações ou

consolidação dos resultados.

46

7. CONCLUSÃO

A partir dessa sequência foi possível construir um mapa de restrição que poderá ser

utilizado em estudos posteriores e uma tabela com as enzimas de restrição utilizadas na

detecção de mutações no gene TPO. Esse mapa é fundamental em futuras pesquisas, pois

permitem analisar o tipo de mutação de forma mais rápido e acessível, tendo em vista que as

enzimas possuem um baixo custo comparado ao do sequenciamento, à utilização também é

essencial para o aconselhamento genético das famílias investigadas.

A investigação de literatura realizada nesse estudo permitiu verificar que as mutações

descritas nos artigos referenciados por Menzalira (2010) e Ris-Stalpers (2010) não apresentam

na sua totalidade concordância com a sequência do gene TPO presente no GenBank, sendo a

mesma que a maioria dos autores (alguns autores não descrevem a sequência que utilizaram

como base) afirmam ter utilizado para nomear as mutações encontradas por cada um.

O presente trabalho realizou um levantamento bibliográfico para construção de um

Mapa de Restrição para os 17 éxons presentes no gene TPO com a finalidade de auxiliar em

futuras pesquisas com esse gene.

47

8. PERSPECTIVAS

O mapa de restrição do gene TPO e as enzimas desenvolvidas nesse trabalho poderão

ser utilizadas em estudos posteriores com enzimas de restrição para análise de mutação no

gene TPO e a partir da sua publicação poderão ser utilizadas em futuros estudos para a

triagem das mutações e o uso no aconselhamento genético.

48

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627-635, 2002

53

APÊNDICES

APÊNDICE A: Com todas as mutações descritas na literatura no gene TPO. As mutações

foram comparadas coma sequência do GenBank (NM_000547), alguma estão em

discordância mas estão listadas na tabela.

Éxon

cDNA Proteína Tipo de

alteração

Referência

2 c.31_50dup E17DfsX77 Frameshift Bikker et al., 1994

3 c.157G>C A53P Missense Niu et al., 2002

4 c.215delA Q72fsX86 Frameshift Rivolta et al., 2007

4 c.292C>A Leu68Ile Missense Neves, 2008

4 c.439G>C GG/gt-GC/gt Afeta

splicing

Bakker et al., 2000

5 c.387delC N129KfsX208 Frameshift Rivolta et al., 2003

5 c.391T>C S131P Missense Rodrigues et

el.,2005

6 c.613C>T R175X Missense Avbelj et al.,2007

7 c.703C>T Q235X Nonsense Pfarr et al., 2006

7 c.796C>T Q266X Nonsense Belfort et al., 2012

7 c.808G>A Asp240Asn Missense Kotani et al.,1999

7 c.2000G>A G667D Belfort et al., 2012

8 c.843delC A282RfsX36 Frameshift Wu et al.,2002

8 c.965C>T S292F Missense Tenenbraum-

Rakover et al.,2007

54

8 c.920A>C N307T Missense Rivolta et al., 2003

8 c.930G>A P280P Neutra Avbelj et al., 2007

8 c.940C>T R314W Missense Fuchs et al., 2008

8 c.943C>T Q315X Nonsense Alper et al., 2010

8 c.1066G>A Ala326Thr Missense Bakker et al., 2000

8 c.1046G>A Gly319Glu Missense Neves, 2008

8 c.1159G>A G387R Missense Rivolta et al., 2007

8 c.1222G>A E378K Missense Tajima et al., 2005

8 c.1274A>G N425S Missense Rodrigues et al.,

2005

8 c.1297G>A V433M Missense Rivolta et al., 2003

8

1338G>C Q446H

Missense Simm et al., 2009

8 c.1367C>G Ala426Gly Missense Neves, 2008

8 c.1425delC Q446RfsX5 Frameshift Bakker et al., 2000

9 c.1429A>T I447F Missense Bikker et al., 1997

9 c.1447T>G Tyr453Asp Missense Bikker et al., 1997

9 c.1463T>C Leu458Pro Missense Ambrugger et al.,

2001

9 c.1477G>A G493S Missense Wu et al., 2002

9 c.1496C>T P499L Missense Rivolta et al., 2003

55

9 c.1496delC Pro499Argfs2X Frameshift Deladoey et al.,2008

9 c.1519_1539del A477_N483del Frameshift Avbelj et al.,2007

9 c.1562G>A Arg491His Missense Ambrugger et al.,

2001

9 1597G>T G533C

c.1687G>T G533C Missense Kotani et al.,2003

9 c.1671 G>T Trp527Cys Missense Bakker et al., 2000

10 c.1780C>A L564I Missense Nascimento et

al.,2003

10 c.1768+1G>A Sítio de

splicing

Bakker et al., 2000

10 +1 intron 10 AG/gt3AG/at Afeta

splicing

Bakker et al., 2000

10 c.1708C>T Arg540stop Nonsense Bikker et al., 1997

10 1808–13del Asp574/Leu575d

el

Frameshift Kotani et al.,2003

10 c.1842G>A Arg584Gln Missense Neves et al., 2008

10 c.1858G>A Gly590Ser Afeta

splicing

Bikker et al., 1997

11 c.1942G>A Val618Mat Missense Neves et al., 2008

11 c.1784G>A R595K Missense Belfort et al., 2012

11 c.1955insT Phe653Valfs15X Frameshift Deladoe y et al.,

2008

11 c.2084G>A R665Q Missense Nascimento et al.,

2003

56

11 c.2033 G >A R648Q Missense Pannain et al., 1999

11 c. 2068C>G Q66OE Missense Santos et al., 1999

11 c.2083C>T R665W Missense Umeki et al.,2002

11 c.2089G>A G667S Missense Avbelj et al., 2007

12 2243_2244delT F718X Nonsense Bakker et al., 2000

12 c.2167C>T Arg693Trp Missense Bakker et al., 2000

13 c.2268insT E756X Nonsense Niu et al., 2002

13 c.2268-2269insT Asp796Tyr Frameshift Wu et al., 2002

13 c.2386G>T Asp796Tyr Missense Wu et al., 2002

13 c. 2401G>A G771R Missense Umeki et al., 2002

13 c.2243delT V748GfsX50 Frameshift Niu et al., 2002

14 c.2413delC H805WfsX27 Frameshift Wu et al., 2002

14 c.2421dupC C808LfsX72 Frameshift Bikker et al., 1995

14 c.2422T>C C808R Missense Rivolta et al., 2003

14 c. 2565C>T C825C Neutra Avbelj et al., 2007

14 c.2485G>A Glu 799 Lys Missense Bikker et al., 1997

57

14 c.2512delT C838AfsX1 Frameshift Bakker et al., 2000

14 c.2512T>A C838S Missense Rodrigues et al.,

2005

14 c.2505insC Frameshift Bikker et al.,1995

VS15-

exon16

c.2619_2622del ? Deleção Tajima et al,2005

15 2619G>A W873X Nonsense Simm et al., 2009

15 c.2669G>A G860R Missense Avbelj et al.,1997

16 c.2738C>T Pro883Leu Missense Neves, 2008

16 c.2748G>A Q916Q Neutra/Sítio

splicing

Rodrigues et

al.,2005

16 c.2815G>A Ala909Thr Missense Neves, 2008

16 c.2863dup10pb A909fsX49 Missense Neves, 2008

58

APÊNDICE B- Tabela com mutações confirmadas na sequência do gene TPO com sítios próximos

da região da mutação.

Mutação Enzima Sítio

215 del A X X

292C>A X X

613C>T

(S)

(C)

CviKI-1

A mutação elimina

esse sitio e não cria

nenhum

5'... R G C Y

... 3'

3'... Y C G R

... 5'

808G>A

(S)

(C)

BstUI

Elimina o sítio da

enzima acima e

cria para:

HpyCH4IV

5'...C GC G... 3'

3'...G CG C... 5'

5'... A CGT ... 3'

3'... TGC A ... 5'

843delC X X

613C>T

(S)

(C)

CviKI-1

A mutação elimina

o sítio de restrição

da enzima acima e

não cria sítio.

5'... R G C Y

... 3'

3'... Y C G R

... 5'

59

930G>A

(S)

(C)

BstUI

AciI

SacII

Na presença da

mutação, os sítios

de restrição são

eliminados, criando

um sitio de

restrição que não

está

comercialmente

disponível

RdeGBI

5'... C C G C ... 3'

3'... G G C G ... 5'

5'...C C G C A G... 3'

3'...G G C G T C... 5'

5'... C G C G

... 3'

3'... G C G C

... 5'

5'... C C G C G G ... 3'

3'... G G C G C C ... 5'

c.943C>T Não há enzimas

disponíveis

c.965C>T

(S)

EaeI

EagI

CviKI-1

5'...Y G G C C R... 3'

3'...R C C G G Y... 5'

5'...R G C Y... 3'

3'...Y C G R... 5'

5'... C GGCC G ... 3'

3'... GC CGG C ... 5'

60

PhoI

HaeIII

AspCNI

AciI

Na presença da

mutação todos os

sítios de restrição

apresentados acima

são eliminados

5'... GG CC ... 3'

3'... CC GG ... 5'

5’...GGCC...3’

3’...CCGG...5’

5'... GCCGC ... 3'

3'... CGGCG ... 5'

5'...C C G C... 3'

3'...G G C G... 5'

c.1297G>A Não há enzimas

disponíveis

c.1425delC

(S)

Sau3AI

MboI

DpnII

BfuCI

DpnI

Na presença da

mutação todos os

5'...

G A T C

... 3'

3'...

C T A G

... 5'

5'...

G A T C

... 3'

3'...

C T A G

... 5'

5'...

G A T C

... 3'

3'...

C T A G

... 5'

5'...

G A T C

... 3'

3'...

C T A G

... 5'

5'...

G A T C

... 3'

3'...

C T A G

... 5'

61

(C)


apresentados acima

são eliminados,

criando um sitio

para a enzima

EcoRV

5'... G A T A T C

... 3'

3'... C T A T A G

... 5'

c.1429A>T Não há enzimas

disponíveis

c.1562G>A

(S)

(C)

EaeI

GdiII

CviKI-1

PhoI

HaeIII

Elimina todos os


acima e cria um

novo:

TaqI

5'...

Y G G C C R

... 3'

3'...

R C C G G Y

... 5'

5'...

C G G C C R

... 3'

3'...

G C C G G Y

... 5'

5'...

R G C Y

... 3'

3'...

Y C G R

... 5'

5'...

G G C C

... 3'

3'...

C C G G

... 5'

5'...G G C C... 3'

3'...C C G G... 5'

5'...

T C G A

... 3'

3'...

A G C T

... 5'

c.1942G>A Não há enzimas

disponíveis

62

c.2033 G >A

(S)

PspOMI

Sau96I

PhoI

HaeIII

Na presença da

mutação todos os


apresentados acima

são eliminados.

5'... G G G C C C

... 3'

3'... C C C G G G

... 5'

5'...

G G N C C

... 3'

3'...

C C N G G

... 5'

5'...

G G C C

... 3'

3'...

C C G G

... 5'

5'...G G C C... 3'

3'...C C G G... 5'

c.2084G>A

(S)

HpyCH4III

Na presença da

mutação o sítio de

restrição

apresentado acima

é eliminado.

5'...A C N G T... 3'

3'...T G N C A... 5'

c. 2401G>A Não há enzimas

disponíveis

c.2413delC

(S)

PhoI

5'...

G G C C

... 3'

3'...

C C G G

... 5'

63

BsskI

HaeIII

MspI

HpaII

Na presença da

mutação todos os


apresentados acima

são eliminados.

5'...

C C N G G

... 3'

3'...

G G N C C

... 5'

5'...

G G C C

... 3'

3'...

C C G G

... 5'

5'...

C C G G

... 3'

3'...

G G C C

... 5'

5'...

C C G G

... 3'

3'...

G G C C

... 5'

c.2485G>A

(S)

HpyCH4III

Na presença da


restrição

apresentado acima

é eliminado,

criando sítios para

as enzimas:

BsrGI

CviQI

RsaI

5'...

T G C A

... 3'

3'...

A C G T

... 5'

5'...

T G T A C A

... 3'

3'...

A C A T G T

... 5'

5'... G TAC ... 3'

3'... CAT G ... 5'

5'... G T A C ... 3'

3'... C A T G ... 5'

64

c.2738C>T

(S)

Hpy188I

Na presença da


restrição

apresentado acima

é eliminado.

5'... T C N G A

... 3'

3'... A G N C T

... 5'

Legenda: C- com mutação; S- Sem mutação

allane maria lacerda ferreira de oliveira …dspace.bc.uepb.edu.br/jspui/bitstream/123456789/671...o...

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