A necessidade de produção de um kit nacional para distribuição na rede

pública de saúde

Profª Drª Adele Caterino-de-Araujo

Instituto Adolfo Lutz de São Paulo

Ensaios sorológicos – HTLV-1/2

S e m i n á r i o E s t a d u a l e m H T L V

Rio de Janeiro – Brasil / 19 a 22 de setembro de 2012

Triagem EIA (Murex HTLV-I+II, Abbott; Biolisa HTLV-I+II 5.0, Biokit; Gold Elisa HTKLV-I+II, REM)

CMIA (Archtect rHTLV-I/II, Abbott)

Confirmatórios WB 2.4 (Abbott)

INNOLIA (Innogenetics)

PCR (in house)

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EIA de 3a geração – disponíveis no mercado nacional

(custo: até R$ 5,00 por orifício)

Murex HTLV-I + II, Abbott Peptídeos sintéticos env gp46 HTLV-I e HTLV-II+ rgp21 HTLV-II, conjugado os mesmos Ags env* + rgp21 HTLV-I* peroxidase, TMB, 450 nm. Detecta IgG, IgM e IgA

BioELISA HTLV-1+2 5.0, Biokit Três proteínas recombinantes de HTLV-1 e HTLV-2, conj. uma proteína de fusão tripla*peroxidase, OPD, 492nm. Detecta IgG, IgM e IgA

Gold Elisa HTLV-1/2, REM Antígenos recombinantes HTLV-1 e HTLV-2, conj. mesmos Ags* peroxidase, OPD, 492nm. Detecta IgG, IgM e IgA

Ensaios sorológicos – HTLV-1/2

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ARCHITECT rHTLV I/II, AbbottSistema Automatizado Partículas magnéticas cobertas com rgp21 (HTLV-I e HTLV-II) e peptídeos sintéticos de gp46 (HTLV-I) e gp46 (HTLV-II).Detecta anticorpos IgM e IgG

Resultados Preliminares em Bancos de Sangue:

N =  32.660 EIA Ortho = 0,08%CMIA Abbott = 0,34%

Ensaios sorológicos – HTLV-1/2

Proteínas externas de envelope de HTLV-1 eHTLV-2 (gp46) e transmembrana (gp21)

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MTA-1 aa162-209 Id epitopes aa188-193K55 aa162-205 Id epitopes aa183-199

p21e aa397-430 GD21 aa361-404

Ensaio de Western blot

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HTLV Blot 2.4Lisado HTLV-I+rgp46-I(MTA-1)+rgp46-II(K55) + GD21Diagnostic Biotechnology, DBL, 1995Subsequentemente Genelabs e Abbott

Ensaio confirmatório e discriminatório

(custo: até R$ 250,00 por tira)

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Ensaio de Western blot 2.4

p24

CSrgp46-Irgp46-II

p53

p36

p32p28p26

p19

GD21

gp21

Neg

ativo

HTL

V-1

HTL

V-2

HTL

V

Inde

term

inad

o a

Inde

term

inad

o b

Inde

term

inad

o c

HTL

V-1

e H

TLV-

2

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INNO-LIA HTLV-I/II assay, Innogenetics

Tiras de nylon cobertas com proteínas recombinantes rp19, rp24, rgp21

(HTLV-I e HTLV-II) + peptídeos sintéticos gp46-I (HTLV-I), gp46-II (HTLV-

II) e p19-I (HTLV-I)

Resultados de acordo com a intensidade das bandas:

Ensaio imunocromatográfico – HTLV-1/2

(custo: até R$ 250,00 por tira)

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Ensaio imunocromatográfico – HTLV-1/2

Ensaio imunocromatográfico – HTLV-1/2

INNO-LIA COMO TESTE CONFIRMATÓRIO PARA INFECÇÃO PELOS VÍRUS HTLV-1/2, UMA BOA ESCOLHA?

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Disposição das bandas do ensaio INNO-LIA ™ HTLV I/II

LiRAS® (Line Reader & Analysis Software)

Danielly Paula Alvarenga Silva

TC-PAPOrientador: Elizabeth de los Santos Fortuna

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Ensaio imunocromatográfico – HTLV-1/2

48% positivas28% Ind.24% negativas

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Ensaios moleculares – HTLV-1/2

Reação em cadeia da polimerase (PCR)Ensaios de PCR e hibridização ou nested-PCR

PCR para segmentos conservados tax ou pol

O uso de primers específicos para HTLV-1 e HTLV-2 permite discriminar o vírus

O uso de primers comuns para HTLV-1 e HTLV-2 necessita de análise por RFLP

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Ensaios moleculares – HTLV-1/2

PCR - Restriction fragmewnt lenght polymorphism analysis

Região tax enzima: Taq I HTLV-1 –

HTLV-2 +

HTLV-I HTLV-2

159

RFLP tax HTLV-1 e -2

(custo: até R$ 35,00)

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Threshold

Ensaios moleculares – HTLV-1/2

PCR em tempo real(pol ou tax)

TaqManSYBER Green

(custo: até R$ 45,00)

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O que precisamos fazer?

Comparar a sensibilidade e especificidade, valor preditivo positivo e negativo de testes de diagnóstico laboratorial disponíveis no mercado nacional (ELISA, Western Blot e INNOLIA)

Padronizar a PCR e nested-PCR para o diagnóstico confirmatório

Padronizar a detecção da carga proviral (PCR em tempo real): região tax ou pol e sistema TaqMan ou SyberGreen

Sequenciar e caracterizar os HTLV-1 e HTLV-2 que circulam no Brasil e desenvolver um kit contendo proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos (gp46, gp21, p19, p24) que representem melhor esses isolados

Produzir um kit para o diagnóstico confirmatório usando os conhecimentos obtidos.

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Lembrar!

Das particularidades de cada região geográfica

Da infra-estrutura laboratorial

Das populações a serem avaliadas

Do custo / benefício de cada teste