A Expressão de Colágeno VI A Expressão de Colágeno VI durante o desenvolvimento do durante o desenvolvimento do coração de Zebrafish (coração de Zebrafish (Danio Danio

reriorerio))

Aluno:Aluno: Deivid Augusto da Silva Deivid Augusto da Silva

Orientador:Orientador: Gregory Thomas Kitten Gregory Thomas KittenLaboratório do Desenvolvimento e Matriz Laboratório do Desenvolvimento e Matriz

ExtracelularExtracelular

ICB – UFMGICB – UFMG

Dezembro - 2005Dezembro - 2005

EstruturaEstrutura

Importância do Zebrafish como modeloImportância do Zebrafish como modelo Colágeno VIColágeno VI Desenvolvimento do coraçãoDesenvolvimento do coração ResultadosResultados DiscussãoDiscussão

Vantagens do Zebrafish Vantagens do Zebrafish como modelocomo modelo

Ovos transparentesOvos transparentes Fertilização externaFertilização externa Desenvolvimento rápidoDesenvolvimento rápido Alta fecundidadeAlta fecundidade Pequeno tamanho – Não necessita de um Pequeno tamanho – Não necessita de um

sistema circulatório eficiente para desenvolver-sistema circulatório eficiente para desenvolver-sese

Capacidade de expressar mutações induzidasCapacidade de expressar mutações induzidas

Ovos transparentes e Ovos transparentes e pequeno tamanhopequeno tamanho

(http://pharyngula.org/images/larvae.jpg)

Estágios do desenvolvimento Estágios do desenvolvimento embrionárioembrionário

Fotos do desenvolvimento

Animação do Animação do desenvolvimentodesenvolvimento

C1C1 C2C2

C1C1 C2C2

C1C1 C2C2

N1N1

N1N1

N1N1

N9N9 C3C3 C4C4C5C5

N5N5

0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 30000 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

1(VI)1(VI)

2(VI)2(VI)

3(VI)3(VI)

Domínios da molécula de colágeno VIDomínios da molécula de colágeno VI

CHU et al., 1990CHU et al., 1990

aaaa

Colágeno tipo VI

3

1

2

Colágeno tipo VI: das cadeias à microfibrilaColágeno tipo VI: das cadeias à microfibrila

Monômero

Dímero

Tetrâmero

Microfibrila

Aspectos do Aspectos do desenvolvimento desenvolvimento cardíacocardíaco

Especificação de cada tipo celular: 16 hpf

Endocárdicas X miocárdicas

Atriais X ventriculares

Migração celular e formação do tubo cardíaco na linha mediana

Remodelamento do tubo cardíaco com a formação do coração funcional

o células ventriculares

o células atrias

o células do miocárdio

o células do endocárdio

Especificação das células precursoras

Formação de grupos laterais

As células endocárdicas migram mais medialmente que as miocárdicas

Forma-se uma estrutura em forma de funil com 22 hpf

Coração tubular com 24 hpf – batimentos cardíacos

Looping com 36 hpf

(Satainier D.Y., 2001)

Formação cardíaca

Os precursores ventriculares estão marcados em verde e as atriais em vermelho

As células ventriculares migram medialmente em relação às células atriais

A fusão ocorre primeiramente na região posterior

Na seqüência, há a fusão na área anterior, formando um alo central.

Coração tubular com 24 hpf(Glickman e Yelon, 2002)

Formação dos Coxins Formação dos Coxins endocárdicosendocárdicosDe 1 a 2% dos nativivos apresentam alguma doença cardíaca congênita (HCD)

Algumas das malformações cardíacas são devidas à problemas na formação dos coxins

Alterações na expressão de colágeno VI são associadas à malformações

Processo extensivamente estudado em outros modelos, mas o zebrafish apresenta vantagens, como a expressão de mutações induzidas

Fornece um sistema simplificado da função gênica

A-B As células endocárdicas no canal AV são cúbicas, enquanto as restantes são pavimentosas

C-D Expressam Dm-grasp, molécula de adesão superficial da superfamília das Igs.(Beis et al., 2005)

Com 55 hpf, as células cúbicas continuam expressando Z01, molécula associada a tight junctions, marcadora de tecido epitelial.

Com 60 hpf, há diminuição na expressão de Z01, indicando a ocorrência de transformação epitélio-mesenquimal

Durante esse processo, observa-se a migração das células endocárdicas pela ECM em direção aos miocárdicos

Com 7 dpf, as valvas estão completamente formadas

No coração adulto, observa-se a presença de 4 válvulas na valva atrioventricular

(Beis et al., 2005)

ResultadosResultados

Limitações: Limitações: • Dificuldade em obter cortes que contenham o Dificuldade em obter cortes que contenham o

coração e que estejam em uma boa orientaçãocoração e que estejam em uma boa orientação

• O microscópio confocal ter ficado estragado O microscópio confocal ter ficado estragado durante quase todo o semestredurante quase todo o semestre

Forte marcação em uma área externa ao Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser coração parecendo ser Hatching glandHatching gland contidas no pericárdiocontidas no pericárdio

Colágeno VI – 48 hpf - Aumento 40 X

A: Marcação para colágeno VI

B: Morfologia

C: Controle

D: Imagem sobreposta de A em B

A

B D

C

Colágeno VI – 48hpf - Aumento 63 X

A

B

C

D

A: Marcação para colágeno VI

B: Morfologia

C: Controle

D: Imagem sobreposta de A em B

Imunofluorescência do coração inteiro – Col. VI – 75 hpf

DiscussãDiscussãoo

Forte marcação em uma área externa ao coração Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser parecendo ser Hatching glandHatching gland contidas no contidas no pericárdiopericárdio

Por quê no coração inteiro houve marcação ???Por quê no coração inteiro houve marcação ???

Necessidade de testar outros anticorpos Necessidade de testar outros anticorpos

Aprimorar técnicas de dissecaçãoAprimorar técnicas de dissecação

PerspectivasPerspectivas Boas perspectivas, uma vez que em outros Boas perspectivas, uma vez que em outros

modelos já existem trabalhos semelhantesmodelos já existem trabalhos semelhantes

Entender a marcação de Entender a marcação de hatching glandhatching gland

Quando houver padronização das técnicas, Quando houver padronização das técnicas, fazer imunofluorescência e fazer imunofluorescência e whole mountwhole mount para para outros colágenos.outros colágenos.

(Kolker S. J., 2000)

Perspectivas e objetivos

AgradecimentosAgradecimentos

À Deus, pela saúde e perseverançaÀ Deus, pela saúde e perseverança Aos meus pais e familiaresAos meus pais e familiares À Cristiane, pelo carinho e amor incondicionaisÀ Cristiane, pelo carinho e amor incondicionais Ao Greg, pelos ensinamentos e paciência de um verdadeiro Ao Greg, pelos ensinamentos e paciência de um verdadeiro

mestremestre Ao pessoal do laboratório, em especial a Elisandra e a LorenzaAo pessoal do laboratório, em especial a Elisandra e a Lorenza À Cleida, pela oportunidade e exemplo de organizaçãoÀ Cleida, pela oportunidade e exemplo de organização Aos fornecedores de ovos de ZebrafishAos fornecedores de ovos de Zebrafish Aos colegas do PAD pelos momentos vividosAos colegas do PAD pelos momentos vividos E ao povo brasileiro, pelo financiamento.E ao povo brasileiro, pelo financiamento.

Obrigado pela Atenção!Obrigado pela Atenção!