UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA

GAMETOGÊNESE EM ZEBRAFISH (Danio rerio) KNOCKOUT PARA O GENE DE REPARO DE DNA mlh1.

Belo Horizonte – MG 2007

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2

MARCELO DE CASTRO LEAL

GAMETOGÊNESE EM ZEBRAFISH (Danio rerio) KNOCKOUT PARA O GENE DE REPARO DE DNA mlh1.

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biologia Celular

da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito

parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências

(Biologia Celular).

Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas – UFMG

2007

3

Esta tese foi realizada no Laboratório de Biologia Celular do Departamento de

Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG e no Laboratório de

Endocrinologia do Departamento de Biologia da Universidade de Utrecht – Holanda,

sob as orientações do Prof. Dr. Luiz Renato de França e do Prof. Dr. Rüdiger W.

Schulz, e com o auxílio das seguintes instituições:

- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES);

- Universidade de Utrecht – Holanda.

4

Ao meu querido avô

Lúcio Fonseca de

Castro, que serviu

como exemplo de

conduta ética

durante a vida e pela

grande amizade, à

Perseverança e à

Determinação, sem

as quais jamais teria

alcançado este

objetivo, dedico este

trabalho.

5

AGRADEÇO

Ao Prof. Dr. Luiz Renato de França, por ter sido responsável por minha formação

científica, pela contagiante paixão pela ciência e pela verdadeira amizade.

Ao Prof. Dr. Rüdiger W. Schulz, pelos valiosos ensinamentos, pela amizade e por ter

me aturado durante mais de dois anos em seu laboratório. Valeu Prof. Antena.

Ao Prof. Dr. Jan Bogerd, pelos momentos de descontração e pela amizade.

Ao Prof. Dr. Dirk G. de Rooij, pelas sábias dicas durante o desenvolvimento do meu

projeto.

À minha querida Ana Viveiros e seus filhos Amanda e Felipe por me receberem tão

bem como novo membro da família.

À coordenadora da Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG, Prof. Dra.

Annamaria Ravara Vago e à ex-coordenadora, Prof. Dra. Walderez Ornelas Dutra,

pelo apoio administrativo e amizade durante o desenvolvimento da pesquisa que

originou a presente tese.

Ao Corpo Docente da Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG, pelos importantes

ensinamentos.

À Secretária do Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular, Iraídes, pela amizade e

importante colaboração.

A todos os colegas e amigos do laboratório de Biologia Celular.

Aos meus colegas de Pós-Graduação em Biologia Celular da UFMG e do Grupo de

Endocrinologia e Metabolismo da Universidade de Utrecht – Holanda.

MUITO OBRIGADO!!!!!

6

SUMÁRIO

1. Introdução e Revisão de Literatura.................................................................12

Peixes Teleósteos.......................................................................................................12

Zebrafish (Danio rerio).............................................................................................12

Estrutura Testicular e Espermatogênese em Teleósteos............................................15

Regulação Hormonal da Espermatogênese em Teleósteos.......................................17

Células de Sertoli e Desenvolvimento Testicular em Teleósteos..............................18

Espermatogônias em Teleósteos................................................................................20

Meiose e Genes de Reparo de DNA..........................................................................23

Geração de Animais Knockout para o Gene de Reparo de DNA mlh1.....................26

2. Objetivos.............................................................................................................29

2.1. Objetivo Geral..................................................................................................29

2.2. Objetivos Específicos.........................................................................................29

3. Artigo 1. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and

Aneuploid as Well as Triploid Progenie in Females – Feitsma et al., 2007……31

4. Artigo 2. Meiosis can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking

the mismatch repair gene mlh1 – Leal et al., 2007……………………….….41

5. Discussão..............................................................................................................64

6. Conclusão.............................................................................................................69

7. Referências Bibliográficas...................................................................................71

7

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Zebrafish (Danio rerio). Fonte: ZFIN e Oregon Zebrafish

Laboratories....................................................................................................................13

FIGURA 2. Esquema ilustrando o processo espermatogênico em peixes

teleósteos.........................................................................................................................16

FIGURA 3. Esta figura mostra a distribuição das principais vias e fatores envolvidos

na auto-renovação e diferenciação das espermatogônias tronco nos

peixes...............................................................................................................................22

FIGURA 4. Esta figura mostra o procedimento utilizado para a geração de animais

mutantes para o gene de reparo de DNA mlh1................................................................27

8

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AMH = hormônio anti-Mülleriano

BrdU = 5-bromo-2-deoxyuridina

DHP = 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (progestina)

DNA = ácido desoxirribonucleico

E2 = estradiol-17β

FSH = hormônio folículo-estimulante

GDNF = fator neurotrófico derivado de células da linhagem glial

GDSF = fator de crescimento derivado do soma

IGF-I = fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I

IGF-Ir = receptor para fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I

LH = hormônio luteinizante

mlh1 = gene homólogo de MutL 1 (em zebrafish)

Mlh1 = proteína homóloga de MutL 1 (em zebrafish)

Mlh3 = proteína homóloga de MutL 3 (em zebrafish)

MMR = mismatch repair

msh2 = gene homólogo de MutS 2 (em zebrafish)

msh4 = gene homólogo de MutS 4 (em zebrafish)

msh5 = gene homólogo de MutS 5 (em zebrafish)

msh6 = gene homólogo de MutS 6 (em zebrafish)

mutSγ = complexo heterodimérico formado por MutS 4 e MutS 5

11-KT = 11-cetotestosterona

PD-ECGF = fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta

qPCR = reação em cadeia de polimerase quantitativa

9

RNA = ácido ribonucleico

RPA = proteína de replicação A

SPGA = espermatogônia do tipo A

SNP = polimorfismo de único nucleotídeo

SPGB = espermatogônia do tipo B

SYCP1 = proteína do complexo sinaptonêmico 1

T = testosterona

10

RESUMO

O mlh1 é um gene membro da maquinaria de reparo (MMR) do DNA, sendo também

essencial para a estabilização de crossing-overs durante a primeira divisão meiótica.

Recentemente, mostramos que machos de zebrafish mutantes para o gene mlh1 são

completamente inférteis devido ao bloqueio em metáfase I, enquanto as fêmeas são

férteis, mas originam progênie aneuplóide. Posteriormente, estudamos a fertilidade de

machos com background mais “limpo” após dois cruzamentos com uma das linhagens

parentais (TL) dos primeiros mutantes (AB/TL). Nestes machos, nós observamos, pela

primeira vez em vertebrados, que mutantes para mlh1 eram capazes de fertilizar

pequeno número de ovócitos (aproximadamente 0,4%) de fêmeas wild-type. O exame

histológico do testículo revelou que todos os estágios (cistos) espermatogênicos

anteriores a espermátides (espermatogônias, espermatócitos primários e espermatócitos

secundários) estavam significativamente aumentados nos mutantes, enquanto a fração

representada pelas espermátides e espermatozóides estava altamente reduzida (1,8 mg

nos wild-types vs. 0,1 mg nos mutantes). Esta é uma clara diferença em relação a

machos em background AB/TL, nos quais espermatócitos secundários e células pós-

meióticas estavam ausentes. Isto indica que nestes machos (background TL) existe um

“atraso” em ambas as divisões meióticas ao invés de completo bloqueio durante a

primeira divisão meiótica. Ovócitos fertilizados com espermatozóides destes mutantes

desenvolveram-se em embriões mal-formados e aneuplóidicos, o que faz deste fenótipo

masculino muito mais semelhante ao que foi previamente descrito para fêmeas

mutantes. Esta observação indica que crossing-overs são essenciais para o processo

meiótico, mas que aparentemente divisões meióticas podem ocorrer sem os mesmos,

sugerindo que estes mutantes (background TL) poderão representar um modelo

experimental bastante adequado para se estudar mecanismos celulares responsáveis

pelas divisões meióticas sem a estabilização através de crossing-overs.

Palavras-chave: enzima de reparo de DNA Mlh1; testículo; espermatogênese,

fertilidade masculina; aneuploidia

11

ABSTRACT

Mlh1 is a member of DNA mismatch repair (MMR) machinery and is also essential for

stabilization of crossovers during the first meiotic division. Recently, we showed that

zebrafish mlh1 mutant males are completely infertile due to a block in metaphase I,

while females are fertile but have aneuploid progeny. When studying fertility in males

in a twofold more inbred background however, we observed low numbers of fertilized

eggs (approximately 0.4%). Histological examination of the testis revealed that all

spermatogenic stages prior to spermatids (spermatogonia, primary spermatocytes and

secondary spermatocytes) were significantly increased in the mutant while the total

weight of spermatids and spermatozoa were highly decreased (1.8 mg in wild-type vs.

0.1 mg in mutants). This is clearly different from the outbred males of a previous study,

where secondary spermatocytes or postmeiotic cells were absent. This indicates that

there is a delay of both meiotic divisions rather than a complete arrest during meiosis I

in these males. Eggs fertilized with mutant sperm develop as malformed embryos and

were aneuploid, which makes this male phenotype much more similar to that previously

described in mutant females. This indicates that crossovers are still essential for a proper

meiosis, but that meiotic cell divisions can progress without it, suggesting that this

mutant is a suitable model to study the cellular mechanisms of completing meiosis

without crossover stabilization.

Keywords: DNA repair enzyme Mlh1; testis; spermatogenesis; male fertility;

aneuploidy

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

12

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

1.1. Peixes Teleósteos

Os peixes pertencem à classe de vertebrados que apresenta maior variação com

relação à estratégia reprodutiva, tamanho de gametas, mecanismos de fertilização e

cuidados com a prole (Jamieson, 1991; Mattei, 1991; Harvey e Carolsfeld, 1993; Burns

et al., 1995). Esse fato pode ser atribuído, em parte, à grande diversidade existente nesta

classe que apresenta atualmente cerca de 30 mil espécies, distribuídas nos mais variados

ambientes aquáticos. Os teleósteos representam aproximadamente 96% de todos os

peixes (Froese e Pauly, 2007). O processo espermatogênico nestes peixes não difere

muito do que é observado nos demais vertebrados, sugerindo que mecanismos de

controle deste evento foram conservados durante o processo evolutivo. Apesar destes

aspectos citados, é muito importante conhecer as particularidades relacionadas à

biologia reprodutiva destes vertebrados, devido, por exemplo, ao grande potencial

econômico representado pela piscicultura no mercado mundial de alimentos. Além

disto, algumas espécies de teleósteos são modelos biológicos experimentais bastante

utilizados nas áreas de reprodução, genética e melhoramento como, por exemplo, o

zebrafish (Danio rerio) (Feitsma et al., 2007; Leal et al., 2007).

1.2. Zebrafish (Danio rerio)

O zebrafish (Danio rerio – Figura 1) é um peixe teleósteo (apresenta esqueleto

ósseo) de água doce originário da Ásia Central, sendo encontrado principalmente na

Índia (Engeszer et al., 2007). Esta espécie tem se tornado um modelo experimental

muito importante tanto na área biomédica como em pesquisa básica, principalmente

devido às suas vantagens freqüentemente mencionadas tais como: pequeno porte, fácil

13

manejo, fertilização externa, elevada taxa reprodutiva e fácil estudo em biologia do

desenvolvimento, pelo fato de apresentar embrião transparente (McGonnell e Fowkes,

2006; Feitsma et al., 2007). Este teleósteo possui vida média em torno de 3 anos, sua

primeira maturação ocorre com 3 meses de vida e se reproduz na temperatura média de

26-28oC, por cerca de 18 meses. A fêmea desta espécie pode desovar cerca de 100-200

ovos semanalmente (McGonnell e Fowkes, 2006).

O seqüênciamento recente do genoma do zebrafish, disponibilizado no site

www.ensembl.org/Danio_rerio/index.html e também no site ZFIN, abriu enormes

possibilidades para que estudos na área de genética sejam desenvolvidos neste teleósteo,

propiciando inclusive a geração de excelentes modelos transgênicos na área de biologia

da reprodução. Especificamente nesta área, o zebrafish já vem sendo utilizado como

modelo experimental em estudos envolvendo a função testicular e sua regulação

endócrina (McGonnell e Fowkes, 2006).

Figura 1. Zebrafish (Danio rerio). Fonte: ZFIN e Oregon Zebrafish Laboratories.

14

1.3. Estrutura Testicular e Espermatogênese em Teleósteos

Os testículos de peixes estão localizados na cavidade celomática, dorsalmente ao

tubo digestivo, ventralmente ao mesonefro e ventro-lateralmente ao longo da bexiga

gasosa, encontrando-se presos à parede abdominal e à bexiga gasosa pelo mesórquio.

Macroscopicamente, os testículos da maioria dos teleósteos estudados são órgãos pares,

podendo estar parcial ou totalmente fundidos entre si, apresentam usualmente tamanho

similar entre o direito e o esquerdo e são freqüentemente alongados, embora existam

outras formas como lobulados e foliáceos (Le Gac e Loir, 1999).

À semelhança de outros vertebrados, o testículo de peixes teleósteos exerce as

funções de produção de gametas (espermatogênica) e endócrina (esteroidogênica),

possuindo para isto dois compartimentos principais: (a) o compartimento intertubular ou

intersticial, no qual, além de vasos, nervos, células e fibras do tecido conjuntivo, as

células de Leydig com função esteroidogênica estão localizadas; e (b) o compartimento

dos túbulos seminíferos onde se encontram células somáticas (de Sertoli e peritubular

mióide) e células germinativas que irão formar os espermatozóides após passarem por

processo bastante complexo e altamente organizado – denominado de processo

espermatogênico (Billard, 1990; Koulish et al., 2002; Vilela et al., 2003). Este processo

é um dos sistemas auto-renováveis mais produtivos do corpo animal, no qual milhões de

espermatozóides são produzidos diariamente por grama de testículo, a partir das

espermatogônias tronco (Courot et al., 1970; Clermont, 1972; Ortavant et al., 1977; de

Rooij e Russell, 2000).

Baseado em características morfológicas e funcionais, o processo espermatogênico

pode ser dividido em três fases: (a) fase proliferativa ou espermatogonial, na qual as

espermatogônias passam por sucessivas e rápidas divisões mitóticas; (b) fase meiótica

ou espermatocitária, onde o material genético é duplicado, recombinado e segregado,

15

sendo esta fase muito importante para a diversidade genética entre membros da mesma

espécie; e (c) fase de diferenciação ou espermiogênica, na qual as células haplóides

formadas se transformam em células altamente especializadas e estruturalmente

equipadas para alcançar e fertilizar os oócitos (Russell et al., 1990; Sharpe, 1994).

Na maioria das espécies de peixes, o processo espermatogênico ocorre no interior

de estruturas denominadas espermatocistos, ou cistos (Billard, 1970; Grier, 1975), os

quais são formados quando prolongamentos das células de Sertoli envolvem uma única

espermatogônia primária ou do tipo A (Grier, 1993; Pudney, 1993; 1995) (Figura 2).

As células germinativas derivadas de uma única espermatogônia primária dividem-se

sincronicamente para constituir um clone isogênico de células germinativas que é

envolvido por número variado de células de Sertoli, dependendo do tipo de cisto

(espermatogonial, espermatocitário e de espermátides) (Vilela et al., 2003, Cardoso,

2007). Portanto, diferente de mamíferos (Russell et al., 1990), na espermatogênese

cística as células de Sertoli estão em contato com apenas um tipo específico de célula

germinativa durante a evolução do processo espermatogênico. Estes cistos encontram-se

apoiados na túnica própria dos túbulos seminíferos, que é formada por camada acelular

denominada de membrana basal e pelas células peritubulares mióides (Koulish et al.,

2002). Em teleósteos, a seqüência das células espermatogênicas, a partir da

espermatogônia até a formação de espermatozóides, segue o seguinte esquema:

espermatogônias indiferenciadas espermatogônia primária (do tipo A ou

diferenciada) espermatogônias do tipo B (em torno de 7 gerações em tilápia e 8

gerações em zebrafish) espermatócitos primários espermatócitos secundários

espermátides espermatozóides. Estes últimos, após abertura das junções entre as

células de Sertoli, são liberados no lume dos túbulos seminíferos (Miura, 1999; Le Gac

e Loir, 1999; Schulz e Miura, 2002; Schulz, 2003). Usualmente, a disposição da

16

cromatina nuclear e o tamanho do núcleo, aliado ao número de células germinativas por

cisto, são parâmetros utilizados como referências para se distinguirem os diferentes

tipos espermatogoniais (Matta et al., 2002; Vilela et al., 2003; Cardoso, 2007). Vale

ressaltar que, à semelhança de mamíferos, existem consideráveis diferenças em relação

ao número de gerações de espermatogônias diferenciadas em peixes (Billard, 1969;

Billard, 1990; Miura, 1999; Schulz e Miura, 2002).

Figura 2. Esquema ilustrando o processo espermatogênico em peixes teleósteos. Observe o arranjo cístico do epitélio seminífero. O cisto é formado quando uma espermatogônia tronco (SG) é completamente envolvida por projeções citoplasmáticas das células de Sertoli (SE). O desenvolvimento clonal das células germinativas ocorre no interior do cisto e é composto por quatro fases principais: auto-renovação de espermatogônias tronco, proliferação espermatogonial, meiose e espermiogênese. Os espermatozóides (SZ) são liberados no interior do lúmen tubular (L) através de um processo que envolve o remodelamento das junções das células de Sertoli e abertura do cisto (espermiação). Embora não mostrado no esquema, as células germinativas estão conectadas por pontes citoplasmáticas devido à incompleta citocinese. BM = Membrana basal; SC = espermatócitos; SGB = espermatogônias do tipo B e ST = espermátides. (Modificado de Nóbrega R.H. e Quagio-Grassiotto I, Cell and Tissue Research – submetido)

B

17

1.4. Regulação Hormonal da Espermatogênese em Teleósteos

À semelhança dos mamíferos o testículo de teleósteos também é regulado pelo

eixo hipotálamo-hipófise. Desta forma, o controle endócrino da espermatogênese em

peixes parece não diferir substancialmente do observado para os demais vertebrados (Le

Gac e Loir, 1999; Bhattacharya, 1999). No entanto, o fato de existir aproximadamente

três dezenas de milhares de espécies de peixes, que conforme já foi citado, habitam os

mais variados ambientes aquáticos e que apresentam diversificadas estratégias

reprodutivas, pode tornar mais complexa a regulação fina da função testicular neste

grupo de vertebrados.

Em mamíferos já está bem estabelecido que o hormônio folículo-estimulante

(FSH) e os esteróides, principalmente andrógenos, são os hormônios mais importantes

na regulação da espermatogênese (Russell et al., 1990). À semelhança de mamíferos,

em teleósteos os receptores para FSH e esteróides sexuais são expressos nas células de

Sertoli (Schulz e Miura, 2002), que ao produzirem diversos fatores de crescimento são

responsáveis pela intermediação hormonal importante para o desenvolvimento das

células germinativas. Por exemplo, estudos desenvolvidos em enguias japonesas

(Anguilla japonica) mostram que os esteróides sexuais estimulam a divisão das

espermatogônias tronco, não alterando, no entanto, a proliferação de espermatogônias

diferenciadas, as quais se dividem sob o estímulo das gonadotrofinas, da 11-

cetotestosterona (11-KT) e do fator de crescimento ativina B, secretado pelas células de

Sertoli (Miura et al., 1992; Schulz e Miura, 2002).

Além do hormônio luteinizante (LH), o FSH também estimula a esteroidogênese

em teleósteos. Assim, o fato de o FSH ser a gonadotrofina detectada no plasma de

salmonídeos sugere que o aumento nos níveis desta glicoproteína pode ser suficiente

18

para iniciar o processo espermatogênico, através da ativação das funções das células de

Sertoli e da produção da 11-KT (Schulz e Miura, 2002). Trabalho recente em enguias

japonesas também corrobora o fato do FSH induzir espermatogênese através da

produção de andrógenos (Ohta et al., 2007). Também de acordo com Schulz e Miura

(2002), a testosterona (T) parece exercer efeito feed-back na esteroidogênese

dependente de FSH, sugerindo a necessidade de balanço adequado entre a produção de

T e 11-KT. Já as fases meiótica e espermiogênica da espermatogênese são bastante

dependentes da secreção de andrógenos regulada pelo LH. Através do controle da

composição do plasma seminal, como por exemplo pH, as progestinas que também são

reguladas pelo LH parecem desempenhar importante papel na maturação, capacitação e

aquisição de motilidade por parte dos espermatozóides (Morisawa e Morisawa, 1986).

Além das progestinas serem importantes fatores durante a espermiação e maturação

espermática, a progestina DHP (17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one) é importante para

a iniciação da meiose em enguias japonesas (Miura et al., 2006).

1.5. Células de Sertoli e Desenvolvimento Testicular em Teleósteos

Em mamíferos já é sabido que as células de Sertoli desempenham papel

fundamental na diferenciação, desenvolvimento e função testiculares e na expressão do

fenótipo masculino (Tilmann e Capel, 2002). Em todas as espécies de mamíferos

investigadas até o presente momento, proliferação de células de Sertoli não é observada

após a puberdade (França e Russell, 1998; Sharpe et al., 2003), e a atividade mitótica

pós-natal destas células cessa durante a primeira onda espermatogênica, quando

espermatócitos primários estão proliferando ativamente (Russell et al., 1989; Orth,

1993; França et al., 2000). Estes eventos coincidem com a formação da barreira de

célula de Sertoli, lúmen tubular e um elaborado citoesqueleto que são marcadores

19

morfológicos e funcionais da diferenciação da célula de Sertoli (Russell et al., 1989;

França et al., 2000; Hess e França, 2007).

Diferentemente dos mamíferos, o testículo da grande maioria dos teleósteos cresce

continuamente após os mesmos terem atingido a maturidade sexual, acompanhando o

aumento do peso corporal. Este aspecto sugere fortemente que, também diferentemente

dos mamíferos, as células de Sertoli em peixes proliferam continuamente nos animais

adultos (De Felice e Rasch, 1969; Grier, 1993; Koulish et al., 2002; Schulz et al., 2005).

No entanto, muito pouco é sabido em relação à proliferação de células de Sertoli em

peixes teleósteos. Para algumas espécies de peixes é citada a ocorrência de degeneração

de todas ou algumas células de Sertoli durante o processo de espermiação ou liberação

de células germinativas maduras por estas células somáticas (Prisco et al., 2003). Desta

forma, estas células precisam ser repostas para manter a capacidade de suportar ondas

espermatogênicas subseqüentes. Além disso, em muitas espécies de peixes, ciclos de

desenvolvimento com mudanças de mais de cinqüenta vezes do peso testicular ocorrem

durante estações reprodutivas anuais sucessivas (Schulz, 1984). Isto pode estar

associado com ondas recorrentes anuais de proliferação de células de Sertoli. Pelo

menos em dois modelos experimentais investigados recentemente (tilápias –

Oreochromis niloticus e bagres africanos – Clarias gariepinus) (Vilela et al., 2003;

Schulz et al., 2005), no nosso laboratório e no laboratório do Dr. Rüdiger Schulz na

Holanda, proliferação de células de Sertoli em peixes sexualmente maduros foi

observada, principalmente àquelas associadas com cistos de espermatogônias. Estes

achados abrem mais ainda o leque de possibilidades sobre a proliferação das células de

Sertoli em peixes e requerem estudos detalhados sobre os mecanismos de regulação

desta proliferação. Uma vez mais, à semelhança de mamíferos os trabalhos

desenvolvidos com o bagre africano sugerem importante participação do FSH neste

20

processo (Schulz et al., 2005). Portanto, a cada período reprodutivo dos teleósteos, a

proliferação das células de Sertoli provavelmente é o fator primário responsável pelo

aumento do testículo e da produção espermática (Schulz et al., 2005).

Da mesma forma que existem poucos dados disponíveis na literatura sobre a

proliferação das células de Sertoli em peixes durante a fase de desenvolvimento

testicular pós-natal e na fase adulta, a literatura também é escassa quanto aos aspectos

relacionados com a evolução morfofuncional e quantitativa do processo

espermatogênico em peixes, bem como a respeito da eficiência das células de Sertoli

(Billard, 1969; Billard, 1986; Vilela et al., 2003; Schulz et al., 2004).

1.6. Espermatogônias em Teleósteos

À semelhança de outros vertebrados, pouco é sabido a respeito das espermatogônias

tronco de peixes. Alguns autores consideram que as espermatogônias primárias ou do

tipo A são as espermatogônias tronco (Miura, 1999; Schulz e Miura, 2002). Nos peixes,

estas espermatogônias são as maiores células da linhagem germinativa (Miura, 1999;

Schulz e Miura, 2002), apresentando as seguintes características morfológicas: núcleo

volumoso contendo cromatina finamente granular, um ou dois nucléolos, e citoplasma

com grande quantidade de “nuages”, que é um material elétron-denso formado por

ribonucleoproteínas e RNAs (Miura, 1999; Quagio-Grassiotto e Carvalho, 1999; Schulz

e Miura, 2002).

Com exceção de alguns dados ainda incipientes disponíveis para a enguia

japonesa (Anguilla japonica) (Miura et al., 2002; Miura et al., 2003; Miura e Miura,

2003; Miura et al., 2006), praticamente não existem estudos sobre os nichos

espermatogoniais em peixes. Conforme mostra a Figura 3 na página 11, na enguia

japonesa dois fatores são considerados como fortes candidatos na regulação da auto-

21

renovação e diferenciação das espermatogônias tronco: 1) o PD-ECGF, fator de

crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta, também conhecido como

eSRS34 (eel Spermatogenesis Related Substance 34) ou “fator de renovação das

espermatogônias tronco”; e 2) o AMH que é o hormônio anti-Mülleriano, também

conhecido como eSRS21 (eel Spermatogenesis Related Substance 21) ou “substância

inibidora da espermatogênese”. A Figura 3 mostra ainda que, sob a influência do

estradiol-17β (E2), as células de Sertoli produzem o PD-ECGF, que estimula a

renovação das espermatogônias tronco. No entanto, quando se adiciona anticorpo

específico anti-PD-ECGF à co-cultura de células de Sertoli/células germinativas, a auto-

renovação das espermatogônias tronco induzida pelo E2 é bloqueada (Miura et al.,

2003). Outros experimentos ilustrados na Figura 3 mostram que o hormônio anti-

Mülleriano (AMH), produzido pelas células de Sertoli, é responsável pela inibição da

diferenciação espermatogonial e pelo bloqueio da proliferação das espermatogônias do

tipo B (Miura et al., 2002; Miura et al., 2006). A expressão deste hormônio é reprimida

pela 11-KT (11-cetotestosterona), que em peixes é o principal andrógeno sintetizado

pelas células de Leydig. Outros fatores como o IGF-I e a activina B mostrados na

Figura 3 parecem também intervir na diferenciação e proliferação espermatogonial. Na

enguia japonesa, por exemplo, sob influência da 11-KT as células de Sertoli produzem a

activina B que estimula a proliferação das espermatogônias B, porém sem iniciar a

meiose. Já o IGF-I induz a síntese de DNA nas espermatogônias de truta arco-íris

(Onchorhynchus mykiss), e permite continuidade da espermatogênese induzida pela 11-

KT na enguia japonesa (Loir, 1994; Le Gac et al., 1996; Miura e Miura, 2003). Em

síntese, os dados disponíveis para a enguia japonesa sugerem que a sobrevivência das

espermatogônias tronco dos peixes ocorre em função do balanço adequado de fatores

provenientes dos nichos. Pelo fato dos nichos espermatogoniais serem dinâmicos e com

22

elevada plasticidade ao longo do desenvolvimento do indivíduo, os mesmos devem

sofrer influência de diversos fatores (externos e internos). Dentre os quais podem ser

citados, por exemplo, o fotoperíodo, a temperatura, o pH e a concentração iônica da

água que provavelmente resultam na determinação da sazonalidade reprodutiva.

Portanto, a melhor compreensão dos mecanismos regulatórios dos nichos requer a

investigação dos mesmos em várias espécies de teleósteos. Talvez, uma abordagem que

poderá ajudar na elucidação deste aspecto é a investigação dos desreguladores

endócrinos poluentes tais como estrógenos e antiandrógenos, que afetam a reprodução

dos peixes (McGonnell e Fowkes, 2006).

Figura 3. Esta figura mostra a distribuição das principais vias e fatores envolvidos na auto-renovação e diferenciação das espermatogônias tronco nos peixes. SPGA = espermatogônia do tipo A; SPGB = espermatogônia do tipo B; E2 = estradiol-17β; PD-ECGF = fator de crescimento de célula endotelial derivado de plaqueta; 11-KT = 11-cetotestosterona; AMH = hormônio anti-Mülleriano; IGF-I = fator de crescimento semelhante à insulina do tipo I; → = sinal estimulatório; ┴ = sinal inibitório (Modificado de Miura e Miura, 2003).

23

1.7. Meiose e Genes de Reparo de DNA

A meiose é a divisão celular através da qual se originam células haplóides a

partir da divisão inicial de células tronco diplóides. Este processo consiste de duas

etapas ou divisões, sendo a primeira, meiose I, a divisão reducional. Os dois homólogos

de cada cromossomo separam-se nesta etapa. Na maioria dos organismos eucarióticos,

durante a prófase da primeira divisão meiótica, ocorre recombinação de cromossomos

homólogos (crossing-overs), sendo este processo fundamental para a formação de

bivalentes estáveis. Esta estabilidade é necessária para o alinhamento adequado dos

cromossomos, subseqüente conexão com as fibras do fuso em metáfase I, e posterior

divisão celular.

Durante a prófase I são reconhecidos cinco diferentes estágios, baseados na

disposição da cromatina: leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese (Hunt e

Hassold 2002; Marcon e Moens 2005). Em leptóteno ocorre um grande número de

quebras na fita dupla de DNA em cada cromossomo (Marcon e Moens 2005). Nesta

fase os cromossomos homólogos ainda encontram-se separados, mas inicia-se a busca

por homologia. A sinapse, que é uma associação de cromossomos homólogos pela

ligação de proteínas do complexo sinaptonêmico, inicia-se em zigóteno e completa-se

em paquíteno. Durante a sinapse, as quebras na fita dupla de DNA são reparadas.

Apenas uma fração, em média uma ou duas quebras na fita dupla de DNA por par, é

reparada através de recombinação homóloga com uma cromátide não irmã do

homólogo. Estas regiões de crossing-overs tornam-se evidentes em diplóteno, quando o

término da sinapse acontece. Finalmente, em diacinese, os crossing-overs são

estabilizados através de quiasmata, os quais são os únicos locais que mantém o par de

cromossomos homólogos unidos.

24

O envolvimento de genes de reparo a danos ao DNA na meiose foi inicialmente

observado em camundongos, e os knockouts para diversos destes genes apresentaram

problemas de fertilidade (Wei et al., 2002). As proteínas MMR (DNA mismatch repair)

atuam como complexos heterodiméricos (mutS e mutL) em meiose, da mesma forma

que atuam em erros de replicação em células mitóticas (Kolas et al., 2005). No entanto,

o complexo mutS que atua na recombinação, mutSγ, consiste dos genes msh4 e msh5,

genes que aparentemente não apresentam nenhuma função no reparo de erros no DNA

(Wei et al., 2002). O complexo mutSγ se liga em foci do DNA em conjunto com a

proteína de replicação A (RPA) durante a sinapse, nas fases de zigóteno e paquíteno (De

Vries et al., 2005; Marcon e Moens, 2005). A freqüência deste foci em mamíferos é de 5

a 10 vezes superior ao número final de crossing-overs (Kneitz et al., 2000). O MSH4 e

MSH5 promovem sinapse, tendo em vista que camundongos mutantes para estes genes

apresentam problemas neste processo (De Vries et al., 1999; Edelmann et al., 1999;

Kneitz et al., 2000). Como resultado deste aspecto, ambos os sexos não possuem

gametas e conseqüentemente são estéreis. Este fenótipo é muito semelhante para

animais knockout para uma das proteínas do complexo sinaptonêmico, SYCP1 (De

Vries et al., 2005). Em contraste, msh4 e msh5 em Caenorhabditis elegans não atuam

antes do estágio de paquíteno e são essenciais para o crossing-over, função esta

desempenhada pelo mlh1 em mamíferos (Zalevsky et al., 1999; Kelly et al., 2000).

O complexo mutL envolvido na meiose também difere do complexo mutL

MMR e consiste do MLH1 e MLH3, embora um pequeno papel para o MLH3 tenha

sido reportado em MMR (Harfe et al., 2000; Cannavo et al., 2005). O complexo

MLH1/MLH3 está presente em distintos foci nos elementos em sinapse durante o

estágio de paquíteno, e num estágio posterior à formação do complexo MSH4/MSH5.

Após a ligação do MLH3 no complexo sinaptonêmico, o MLH1 é recrutado (Lipkin et

25

al., 2002; Kolas et al., 2005). Os foci de MLH1/MLH3 coincidem em tempo, número e

posição com os presumíveis sites de crossing-over (Marcon e Moens, 2003; Moens,

2006). A hipótese é de que este complexo (MLH1/MLH3) estabiliza um número

limitado de locais de recombinação para reparo através de crossing-over, enquanto

outros locais serão reparados por diferentes mecanismos. Tanto camundongos knockout

para mlh1 quanto para mlh3, apresentam fenótipo semelhante em relação ao processo

meiótico (Baker et al., 1996; Edelman et al., 1996; Woods et al., 1999; Eaker et al.,

2002; Lipkin et al., 2002). Nestes casos ambos os sexos são estéreis. No entanto, em

machos não existe a produção de espermatozóides, enquanto em fêmeas ocorre a

produção de ovócitos que raramente completam a meiose (Edelmann et al., 1996;

Woods et al., 1999; Lipkin et al., 2002). Os problemas ocasionados pela ausência de

mlh1/mlh3 ocorrem numa fase mais avançada do processo meiótico quando comparados

aos ocasionados por ausência de msh4 e msh5. O processo sináptico ocorre

normalmente, mas a freqüência de crossing-overs é reduzida drásticamente (Baker et

al., 1996; Guillon et al., 2005) e os cromossomos se apresentam principalmente como

univalentes ao invés de bivalentes em metáfase I (Baker et al., 1996; Woods et al.,

1999).

Conforme mencionado anteriormente, o zebrafish constitui um excelente modelo

para o estudo em pesquisas biomédicas, incluindo o estudo do desenvolvimente

embrionário inicial. Esta vantagem aplica-se também aos estudos relacionados ao

processo meiótico, embora não tenham sido realizadas investigações mais detalhadas

nesta área. Nos presentes trabalhos, foi utilizado um procedimento recentemente

desenvolvido no Hubrecht Laboratory/Utrecht/Holanda, através do qual foram gerados

animais knockout para mlh1 (Wienholds et al., 2003; Wienholds e Plasterk, 2004).

Conforme mencionado anteriormente, machos e fêmeas de camundongo mutantes para

26

o gene mlh1 são estéreis, apresentando problemas durante a meiose e hipogonadismo.

Além disto, zebrafish machos mutantes (background AB/TL) para mlh1 também são

inférteis apresentando bloqueio em metáfase I. Por outro lado, zebrafish fêmeas para o

mesmo gene são férteis (Harma et al., 2007). Pelo fato de que um background genético

mixto – como AB/TL no primeiro trabalho – pode algumas vêzes afetar a expressão

fenotípica de uma mutação, foi re-avaliado no segundo trabalho a histologia testicular

de mutantes para mlh1 após dois cruzamentos com a linhagem parental TL (Leal et al.,

2007).

1.8. Geração de Animais Knockout para o Gene de Reparo de DNA mlh1

Inicialmente machos adultos de zebrafish em background (linhagem) TL foram

expostos ao agente indutor de mutações aleatórias em espermatozóides ENU (N-ethyl-

N-nitrosurea). Em seguida estes machos foram cruzados com fêmeas wild-type da

mesma linhagem (TL). Desta forma foi criada uma biblioteca de 10 mil animais F1

dispostos em tanques contendo 32 animais cada. Nos animais de cada tanque foram

realizados pequenos cortes na barbatana para extração de DNA, representando, desta

forma, uma amostra por tanque (cada amostra é referente a 32 animais). Em seguida foi

realizado PCR utilizando dois amplicons específicos para os éxons 2-4 e 8-10 do gene

mlh1 do zebrafish, respectivamente, para selecionar uma possível mutação neste gene

para o grupo de animais de cada tanque. Após a detecção da mutação, foi realizado

novo PCR em cada animal (32 animais) do tanque que apresentou amostra positiva para

a mutação. Após a seleção do animal mutante (1 animal entre 10.000), foi realizado

cruzamento do mesmo com fêmea de linhagem AB e os animais assim gerados (F2)

foram cruzados entre si para a seleção de animais homozigotos para a mutação no gene

mlh1. Esta seleção foi realizada através de genotipagem por amplificação e

27

resseqüênciamento, utilizando-se para isto de primers específicos para o éxon 10 deste

gene. Conforme o esperado, 25% da prole mostrou-se homozigota para a mutação

(linhagem AB/TL), sendo estes animais utilizados no primeiro trabalho (Feitsma et al.,

2007) (Figura 4). Para a produção de animais mutantes em linhagem TL, o animal

fundador do primeiro trabalho (em background TL) foi cruzado com fêmea de mesma

linhagem (TL). O procedimento utilizado foi desenvolvido no Laboratório Hubrecht –

Holanda em trabalhos anteriores (Wienholds et al., 2003; Wienholds e Plasterk, 2004).

.

Figura 4. Esta figura mostra o procedimento utilizado para a geração de animais mutantes para o gene de reparo de DNA mlh1. Esta ilustração foi retirada de material apresentado no Simpósio “Fish Models in Utrecht: An Interdisciplinary Symposium” realizado no Laboratório Hubrecht – Utrecht – Holanda em maio de 2007 e apresentado por Harma Feitsma e Marcelo de Casto Leal.

28

2. OBJETIVOS

29

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Baseado no que foi exposto anteriormente, o objetivo geral do presente projeto

foi o de se avaliar o controle genético, através do gene de reparo de DNA mlh1, da

gametogênese utilizando-se o zebrafish (Danio rerio) como modelo vertebrado

experimental.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Artigo 1. Caracterizar o fenótipo testicular e do ovário de zebrafish mutantes

(background AB/TL) para o gene de reparo de danos ao DNA mlh1 (Feitsma et al.,

2007).

• Artigo 2. Caracterizar o fenótipo testicular e o compartimento espermatogonial de

animais mutantes para o gene de reparo de danos ao DNA mlh1 num background

mais “limpo” (background TL) (Leal et al., 2007).

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3. ARTIGO 1 (Feitsma et al., 2007)

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3. ARTIGO 2 (Leal et al., 2007)

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Decision Letter (CTR-07-0301.R3)

From: ctr@uni-hd.de

To: r.w.schulz@uu.nl

Cc: SutovskyP@missouri.edu

Subject: CTR-07-0301.R3

Body: Manuscript No. CTR-07-0301.R3 Title : Meiosis can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking the DNA mismatch repair gene mlh1 By: Leal, Marcelo; Feitsma, Harma; Cuppen, Edwin; Franca, Luiz; Schulz, Rüdiger Dear Dr. Schulz, We are pleased to inform you that your manuscript CTR-07-0301.R3, entitled "Meiosis can be completed in male zebrafish (Danio rerio) lacking the DNA mismatch repair gene mlh1", has been accepted for publication in CTR. The manuscript will now be forwarded to the publisher, from whom you will shortly receive information regarding the correction of proofs and fast online publication. In addition to the normal publication process, Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. If you wish to explore this option, please visit www.springer.com/openchoice. Best wishes and thanks, Prof. K. Unsicker Coordinating Editor CTR Prof. Peter Sutovsky Section Editor CTR

Date Sent:

31-Oct-2007

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5. DISCUSSÃO

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5. DISCUSSÃO

Em nosso primeiro trabalho foi reportado que zebrafish machos knockout para a

proteína de reparo de DNA Mlh1 eram inférteis, devido ao bloqueio e morte por

apoptose durante a primeira divisão meiótica. Em decorrência deste aspecto, as células

germinativas mais avançadas (espermatócitos secundários, espermátides e

espermatozóides) estavam ausentes (Harma et al., 2007). Este fenômeno foi explicado

pela falta de quiasmata, estrutura que normalmente mantém os cromossomos

homólogos unidos. Nestes mutantes (mlh1-/-), os cromossomos de espermatócitos

primários estavam, desta forma, presentes como univalentes, o que impediu o

alinhamento dos mesmos na região equatorial da célula durante a metáfase I, a posterior

ligação com o fuso meiótico e finalmente a divisão celular. No entanto, em fêmeas

mutantes para o mesmo gene (mlh1-/-) a falta de quiasmata não bloqueou a divisão

celular, mas ocasionou segregação cromossômica aleatória, resultando em progênie com

números cromossômicos aneuplóides ou triplóides. Diferenças sexuais também foram

observadas em diversos modelos murinos knockouts para genes relacionados ao

processo meiótico (Hunt e Hassold, 2002). Estas diferenças sexuais foram relacionadas

a diferenças gerais básicas entre este processo em machos e fêmeas. Em mamíferos, a

gametogênese masculina é um processo contínuo e altamente regulado. Em contraste, as

fêmeas possuem uma única e programada onda gametogênica, com produção limitada

de ovócitos. Em peixes, no entanto, as oogônias estão presentes em ovários de fêmeas

adultas (Higashino et al., 2002; Grier et al., 2007) permitindo, desta forma, maior

fertilidade, típica em fêmeas de muitas espécies de teleósteos.

No segundo trabalho (Leal et al., 2007), foi mostrado que zebrafish mutantes

para Mlh1 num background mais “limpo” (após dois cruzamentos do animal fundador

AB/TL com animais TL) são parcialmente férteis. Diferente de machos AB/TL para a

65

mesma mutação, que são totalmente inférteis com bloqueio em metáfase I (Feitsma et

al., 2007), os machos em background TL não apresentaram bloqueio completo do

processo espermatogênico nesta fase. Nestes animais (background TL), ocorreu

acúmulo de todos os tipos celulares pré-meioticos e meióticos (espermatogônias,

espermatócitos primários e espermatócitos secundários), bem como células em processo

apoptótico, apresentado como conseqüência um número muito baixo de células pós-

meióticas (espermátides e espermatozóides). Este pequeno número de células pós-

meióticas está associado ao baixo índice de fertilização observado nestes animais. Um

maior número de espermatócitos secundários (expresso em mg) nos mutantes em

relação aos animais wild-type indicam que estas células não são células que

“escaparam” do check-point da primeira divisão meiótica, mas que as divisões meióticas

estavam retardadas. O fenótipo meiótico destes machos é, desta forma, marcadamente

diferente do que foi encontrado no trabalho anterior (Feitsma et al., 2007).

Adicionalmente, foi mostrado que o baixo número de células germinativas que

completaram a meiose e a espermiogênese (em background TL) eram espermatozóides

aneuplóides, pelo fato dos mesmos gerarem progênie aneuplóide após a fertilização de

ovócitos de fêmeas wild-type. Este fenômeno foi mostrado através de três diferentes

maneiras: 1) a fertilização de ovócitos de fêmeas albinas resultou, algumas vezes, em

embriões sem pigmentação devido a perda do alelo paternal; 2) o seqüênciamento de

polimorfismos para mlh1 na progênie mostrou a perda ou a duplicação do alelo paternal;

e 3) a contagem de cromossomos de células embrionárias revelou números diferentes de

50, número este presente em zebrafish wild-type. Em conjunto, estas evidências

indicaram que mesmo na ausência de Mlh1 o processo espermatogênico ainda pôde ser

concluído por um número limitado de células germinativas, mas certamente de forma

anormal. Os problemas durante a primeira divisão meiótica são provavelmente

66

decorrentes da presença de cromossomos univalentes, como previamente descrito

(Feitsma et al., 2007). Enquanto alterações observadas durante a segunda divisão

meiótica estão, possivelmente, relacionados com a presença de aneuploidia, já presente

nesta fase. Esta observação é consistente com o grande número de espermatócitos

primários e secundários positivos para histona H3 no testículo dos mutantes, o que é um

idicativo de que a maioria das células estava bloqueada em metáfase (Leal et al., 2007).

As fêmeas mutantes para mlh1 em background TL apresentaram comportamento

semelhante às fêmeas mutantes AB/TL em relação à fertilidade e ao número de

embriões fenotipicamente anormais. Em mutantes da linhagem TL, tanto fêmeas quanto

machos responderam aos problemas na meiose sendo, desta forma, altamente

comparáveis entre si e muito diferentes de vertebrados superiores (camundongos). A

determinação desta baixíssima taxa de fertilização pode ser experimentalmente viável

apenas em peixes, como o zebrafish e o medaka (Oryzias latipes) pelo fato destas

espécies produzirem grande quantidade de ovócitos. No entanto, no nosso

conhecimento, nenhum espermatozóide ou outras células em estágios posteriores à

meiose I foram observadas em camundongos knockout para este mesmo gene. Também,

em fêmeas de camundongos mutantes, os ovócitos dificilmente foram capazes de

finalizar a meiose (Edelmann et al., 1996; Woods et al., 1999; Lipkin et al., 2002). Isto

sugere que, especificamente em zebrafish, ou talvez em vertebrados inferiores, as

divisões meióticas são menos restritivas. Como mostramos no primeiro trabalho,

zebrafish machos triplóides também são capazes de completar o processo meiótico,

formando espermatozóides (Feitsma et al., 2007).

A diferença na fertilidade masculina entre as duas linhagens de zebrafish

(AB/TL e TL) que usamos não possui uma explicação plausível até o presente

momento. Uma possível hipótese é de que as linhagens apresentam background

67

genético modificador que pode, por exemplo, diminuir ou aumentar a restritividade dos

checkpoints meióticos. Alternativamente, a divergência entre os cromossomos

homólogos pode resultar numa menor capacidade de completar o processo meiótico. Em

leveduras, foi observado que elevados níveis de polimorfismos diminuem a freqüência

de recombinação (Borts e Haber, 1987). Em conjunto com uma severa redução na

recombinação pela ausência de Mlh1, as células precisam estar abaixo de um certo

limiar a partir do qual a meiose é completamente bloqueada. Desta forma, poderá ser

muito interessante realizar o cruzamento destes mutantes (em background TL) com

mutantes para genes de reparo do DNA que não são essenciais para a formação de

crossing-overs, mas que estão envolvidos no reparo de seqüências heteroduplex que se

originam durante a recombinação meiótica, como o msh2 e msh6 (Borts et al., 2000;

Radford et al., 2007). Evidências experimentais para ambas possibilidades necessitariam

de experimento de longa duração, através de cruzamentos com diferentes linhagens, o

que poderia certamente ser realizável utilizando-se o zebrafish como modelo

experimental. No entanto, estes experimentos estão além dos objetivos dos presentes

trabalhos. Independentemente das explicações que forem evidenciadas, ambos os sexos

de mutantes mlh1 da linhagem TL constituem modelos interessantes para a investigação

dos mecanismos celulares que permitem à conclusão de ambas as divisões meióticas na

ausência da proteína Mlh1 por parte das células germinativas mutantes.

68

6. CONCLUSÃO

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6. CONCLUSÃO

No primeiro trabalho (Feitsma et al., 2007), foi mostrado que a necessidade do

mlh1 para o processo de recombinação gênica em zebrafish machos é similar ao

observado em mamíferos. Neste estudo, também foi observado parada do processo

espermatogênico em metafase I, em zebrafish machos. Este resultado corrobora o que

foi evidenciado em camundongos mutantes para o mesmo gene (mlh1).

Surpreendentemente, em todos os animais mutantes (em background TL –

segundo trabalho – Leal et al., 2007) o processo espermatogênico pôde ser concluído

qualitativamente, embora apenas raros espermatozóides fossem formados. Portanto, este

é o primeiro estudo mostrando que as células germinativas de animais machos mutantes

para o gene mlh1 podem completar as duas divisões meióticas e formar

espermatozóides. Estes resultados sugerem que mecanismos celulares alternativos

devem direcionar a adesão ao fuso meiótico e a segregação cromossômica.

Ainda neste último estudo, ficou evidenciado acúmulo de espermatogônias

diferenciadas. Desta forma, iremos investigar, utilizando-se de imunohistoquímica para

BrdU (marcador de células em proliferação) e de PCR em Tempo Real quantitativo

(qPCR) para fatores tais como AMH, PD-ECGF, GDNF, IGF-I, IGF-Ir e GSDF (fatores

envolvidos na fase proliferativa da espermatogênese), se este aumento está relacionado

à uma maior taxa proliferativa ou ao simples acúmulo celular ocasionado pelas

alterações observadas durante a meiose.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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