a experiência da embrapa milho e sorgo com análises de...
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A experiência da Embrapa Milho e Sorgo com análises de
solo cultivado com milho transgênico
Francisco Adriano de Souza
Embrapa Milho e Sorgo - CNPMS
Porque nos devemos zelar pela saúde do solo ?
1. Nos solos ocorrem processos chave para equilíbrio da vida no planeta, em sua maioria mediados por comunidades microbianas
• Purificação e armazenamento de água • Decomposição/Mineralização • Fixação biológica de Nitrogênio • Ciclagem de Nutrientes
2. Tipicamente, existem 40 milhões de células bacterianas/g de solo (Whitman et al. 1998), totalizando uma massa que excede a biomassa de plantas e animais no planeta (Hogan 2010)
3. Fonte de biodiversidade
Porque devemos monitorar as comunidades microbianas no solo ?
1. Microrganismos são praticamente onipresentes e reagem rápido à alterações químicas e físicas no ambiente
2. Alterações em comunidades microbianas são muitas vezes precursoras de mudanças na saúde e na vitalidade do ambiente como um todo.
3. Comunidades microbianas exercem funções essenciais para a funcionamento do sistema solo-planta
4. Existem metodologias bem estabelecidas para o estudo de comunidades microbianas
Background da Equipe do CNPMS em Microbiologia do Solo
• Fixação Biológica de Nitrogênio
• Micorrizas
• Microrganismos Promotores do Crescimento de Plantas
• Controle Biológico
• Solubilizadores de Rochas
• Monitoramento qualidade do solo
– Atividade Enzimática
• Banco de Germoplasma
Background em Microbiologia do Solo
• Acesso a diversidade microbiana
–Domínio de metodologia clássicas, baseadas em técnicas dependentes de cultivo;
–Domínio de técnicas moleculares – independentes de cultivo
Detecção de alterações em comunidades de microrganismos por técnicas moleculares
Porcentagem de distribuição de clones de Fungos Micorrízicos Arbusculares recuperados de 4 bibliotecas e
sua identidade filogenética por BLAST (Fonte – Gomes não publicado
Projetos
• Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros-praga, predadores e organismos não-alvo
– Líder: Simone Martins Mendes
• 2010-2012
• Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos
– Líder: Fernando Hercos Valicente
• 2/1/2011 a 30/12/2014
Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-
alvo
• Objetivos/Hipóteses
• Hipótese 1: A utilização de plantas de milho Bt não afeta a incidência e atividade de organismos não-alvo
• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera
• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo
• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)
• Hipótese 2: Restos vegetais de plantas Bt podem afetar a comunidade microbiana do solo e apresentar distintas taxas de decomposição, alterando a ciclagem de nutrientes
• Decomposição e ciclagem de nutrientes a partir de resíduos de plantas Bt
Projeto 1: Impacto da utilização do milho Bt em lepidopteros praga, predadores e organismos não-
alvo
• Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas
transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F
• Atividade Enzimática
• Perfil Metabólico de Comunidades
Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase
0,15 g Agitação
Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura
400 nm
SOLO
0,5 g
1,0 g SOLO
Agitação
Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B
Centrifugação Reagente C e D
Leitura
Incubação
660 nm
100μl
SOLO
Extração/
Diluição
Centrifugação (4000g, 15’)
Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG
Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases
Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana
Figura 1: Ilustração da determinação da atividade da urease e arginase
0,15 g Agitação
Reagente A e C + Incubação 37ºC + Reagente D e E Centrifugação Leitura
400 nm
SOLO
0,5 g
1,0 g SOLO
Agitação
Reagente A + Incubação 37ºC + Reagente B
Centrifugação Reagente C e D
Leitura
Incubação
660 nm
100μl
SOLO
Extração/
Diluição
Centrifugação (4000g, 15’)
Inoculação em placas ECOPLATES - BIOLOG
Figura 2: Ilustração da determinação da atividade das fosfatases
Figura 3: Ilustração da determinação da diversidade funcional da comunidade microbiana
Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F
Efeito local predominante, não ocorrendo diferença significativa
entre as variedades de Milho Bt avaliadas e sua isolínea
Qualidade biológica do solo rizosférico de plantas transgênicas de milho, expressando proteínas CryAb e Cry1F
Efeito local predominante, não ocorrendo diferença significativa
entre as variedades de Milho Bt avaliadas e sua isolínea
Perfil Metabólico de Comunidades Microbianas - BIOLOG EcoPlates™
• Esta abordagem tem sido eficaz na detecção de alterações espaciais e temporais
em distintas comunidades microbianas.
– Mede a capacidade da comunidade em metabolizar 31 fontes de carbono distintas, por ensaio, em triplicata
– Incubação a 27 C por até ~ 120 horas, com avaliações diárias
– Leitura colorimétrica Simples
Tabela 1. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Número de substratos utilizados (S), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) em 72 horas de incubação para amostras de solo não rizosférico e rizosférico de 3 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, em solo de várzea e cerrado
• Projeto 2: Impacto ambiental de milho transgênico expressando toxinas de Bacillus thuringiensis sobre a entomofauna, microbiota do solo e produção de grãos
• Objetivos
• A utilização de plantas de milho Bt não afeta a a estrutura e a função de comunidades microbianas do solo incidência e atividade de organismos não-alvo
• Impactos de toxinas Bt sobre a estrutura e função de comunidades bacterianas na rizosfera
• Diversidade funcional da comunidade bacteriana do solo
• Diversidade genética da microbiota através de eletroforese em gel de gradiente (DGGE), T-RFLP e clonagem/sequenciamento
• Projeto 2: Delineamento Experimental
Blocos casualizados com 4 repetições
• Ano 1 Safra 2010/2011 – 12 tratamentos
• Ano 2 Safra 2011/2012 – 18 tratamentos
• (Janeiro de 2012)
• O experimento plantado na mesma posição ano após ano
• Duas Localidades – Sete Lagoas e Janaúba
• Duas épocas de amostragem – 30 e 45 dias após plantio
• Tratamentos
• Milho Bt
• Isolinha
• Isolinha + tratamento químico
Experimento Janúba ano 2 – Safra 2011/2012
• Projeto 2: Parâmetros Avaliados
Micorrizas
• Taxa de colonização radicular
• Diversidade molecular da comunidade colonizando raízes (T-RFLP)
Fixadores de Nitrogênio
• Diversidade molecular genes Nif (DGGE)
Comunidade Bacteriana Total
• Diversidade molecular da comunidade por 16S rRNA (DGGE)
Perfil Metabólico da Comunidade Bacteriana
• BIOLOG – Ecoplates
Decomposição palhada Milho Bt
• Ensaios in vitro
Tabela 2. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Sete Lagoas Ano 2 – Safra 2011/2012
Atividade H E
Genótipo Coleta 1
Coleta 2
Coleta 1
Coleta 2
Coleta 1
Coleta 2 MON 810 16.59 Aa 21.71 Bb 3.30 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.98 ns
Isolinha 1 + Q 18.89 Aa 18.04 Aa 3.38 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns
Isolinha 1 16.55 Aa 20.43 Ab 3.33 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns
Bt11 16.92 Aa 21.50 Ab 3.29 ns 3.41 ns 0.96 ns 0.99 ns
Isolinha 2 + Q 16.94 Aa 21.26 Ab 3.28 ns 3.39 ns 0.96 ns 0.99 ns
Isolinha 2 21.59 Aa 18.27 Aa 3.38 ns 3.37 ns 0.99 ns 0.99 ns
HERCULEX 16.72 Aa 21.20 Ab 3.32 ns 3.38 ns 0.97 ns 0.99 ns
Isolinha 3 + Q 18.94 Aa 22.05 Ab 3.36 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns
Isolinha 3 17.65 Aa 16.75 Aa 3.33 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns
MON8034 15.22 Aa 21.52 Bb 3.32 ns 3.41 ns 0.97 ns 0.99 ns
Isolinha 4 + Q 18.29 Aa 19.83 Ab 3.30 ns 3.42 ns 0.96 ns 1.00 ns
Isolinha 4 21.09 Aa 23.12 Ab 3.37 ns 3.40 ns 0.98 ns 0.99 ns
DKB390 CINCO 14.89 Aa 16.25 Aa 3.19 A 3.39 B 0.94 ns 0.99 ns
Isolinha 5 17.62 Aa 16.25 Aa 3.36 ns 3.42 ns 0.98 ns 1.00 ns
Isolinha 5 + Q 20.33 Aa 20.13 Ab 3.38 ns 3.39 ns 0.98 ns 0.99 ns
IMPACTO VIPTERA 17.27 Aa 18.53 Aa 3.32 ns 3.39 ns 0.97 ns 0.99 ns
Isolinha 6 10.87 Aa 17.65 Ba 3.14 ns 3.38 ns 0.92 A 0.98 B
Isolinha 6 + Q 19.35 Aa 20.64 Ab 3.37 ns 3.38 ns 0.98 ns 0.99 ns
Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5% Letras minúsculas comparam médias entre colunas (genótipos) – Scott-Knott a 5%
Tabela 3. Atividade metabólica (Total – BIOLOG - Ecoplates), Diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) e Equitabilidade – E de amostras de solo rizosférico de 6 genótipos de milho transgênicos e não transgênicos, no Município de Janaúna, MG Ano 2 – Safra 2011/2012
Atividade H E
Genótipo Coleta 1
Coleta 2
Coleta 1
Coleta 2
Coleta 1
Coleta 2 MON 810 16.66 A 21.01 B 3.42 ns 3.39 ns 1.00 ns 0.99 ns
Isolinha 1 + Q 17.17 A 19.76 A 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns
Isolinha 1 13.19 A 20.58 B 3.38 A 3.41 B 0.99 ns 0.99 ns
Bt11 14.12 A 18.09 B 3.41 B 3.37 A 0.99 ns 0.98 ns
Isolinha 2 + Q 14.38 A 20.93 B 3.42 ns 3.41 ns 1.00 ns 0.99 ns
Isolinha 2 15.39 A 18.83 A 3.40 ns 3.38 ns 0.99 ns 0.98 ns
HERCULEX 16.92 A 20.45 A 3.42 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 3 + Q 14.90 A 20.02 B 3.40 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 3 15.55 A 19.21 A 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns
MON8034 13.89 A 20.57 B 3.40 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 4 + Q 14.31 A 19.98 B 3.41 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 4 15.06 A 22.15 B 3.40 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns
DKB390 CINCO 16.14 A 18.70 A 3.41 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 5 15.23 A 21.02 B 3.40 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 5 + Q 17.46 A 20.02 A 3.41 ns 3.40 ns 0.99 ns 0.99 ns
IMPACTO VIPTERA 18.03 A 20.46 A 3.41 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 6 13.62 A 20.27 B 3.39 ns 3.41 ns 0.99 ns 0.99 ns
Isolinha 6 + Q 16.85 A 21.17 B 3.40 ns 3.39 ns 0.99 ns 0.99 ns
Letras maiúsculas comparam médias entre coletas – Scott-Knott a 5%
Conclusões • Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas,
não tem causado mudanças significativas na atividade das enzimas Arginase, Fosfatase ácida e alcalina e Urease;
• Projeto 1: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, não causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas;
• Projeto 2: O cultivo de milho Bt, nas condições avaliadas, causou mudanças significativas no perfil metabólico de comunidades microbianas amostradas da rizosfera das plantas no município de Sete Lagoas, mas não em Janaúba.
• Em sua maioria causando aumento na atividade metabólica da comunidade microbiana
Equipe
• Dra. Christiane Abreu de Oliveira Paiva
• Dra. Eliane Aparecida Gomes
• Dr. Francisco Adriano de Souza
• Dr. Ivanildo Evódio Marriel
• M.Sc. Ubiraci Gomes de Paula Lana
Obrigado pela Atenção!!!