a electroforese capilar num laborat ório de gen ética · capilar, em sequenciador autom ático,...

A A ElectroforeseElectroforese Capilar num Capilar num LaboratLaboratóório de Genrio de Genééticatica

Instituto de GenInstituto de Genéética Mtica Méédica dica Faculdade de Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraUniversidade de Coimbra

Luís Mesquita


Objectivos:Objectivos:

�� Conhecer os princConhecer os princíípios laboratoriais da pios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilar.capilar.

�� Descrever a tDescrever a téécnica de cnica de SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger

-- TTéécnicacnica

-- AnAnááliselise

-- AplicaAplicaççõesões

-- Outras metodologias de sequenciaOutras metodologias de sequenciaççãoão

�� Descrever a tDescrever a téécnica de Ancnica de Anáálise de fragmentoslise de fragmentos

-- TTéécnicacnica

-- AplicaAplicaççõesões

A separaA separaçção depende:ão depende:

-- Tempo de migraTempo de migraççãoão

-- TemperaturaTemperatura

-- ForForçça ia ióónica do tampãonica do tampão

-- Intensidade do campo elIntensidade do campo elééctricoctrico

-- Viscosidade do meioViscosidade do meio

ELECTROFORESE CAPILARElectroforeseElectroforese éé separaseparaçção de partão de partíículas carregadas por aplicaculas carregadas por aplicaçção ão

de um campo elde um campo elééctrico. ctrico.

O capilar O capilar éé o suporte so suporte sóólido, com 25 a 100lido, com 25 a 100µµm de diâmetro interno, m de diâmetro interno,

que contque contéém a fase estacionm a fase estacionáária (polria (políímero)mero)

PrincPrincíípios laboratoriais da pios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilarcapilar

Os Os áácidos cidos nucleicosnucleicos migram para o ânodo porque a pH neutro migram para o ânodo porque a pH neutro têm carga negativa.têm carga negativa.

A velocidade de migração é inversamente proporcional ao tamanho dos fragmentos gerados.

PrincPrincíípios laboratoriais da pios laboratoriais da electroforeseelectroforese capilarcapilar

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: T: Téécnicacnica

TerminadoresTerminadores:: ddNTPddNTP marcados marcados fluorimetricamentefluorimetricamente onde na posionde na posiçção 3ão 3’’ da da

desoxirribosedesoxirribose um grupo OH um grupo OH éé substitusubstituíído por um H, impossibilitando o do por um H, impossibilitando o

formaformaçção de uma ligaão de uma ligaçção ão fosfodiesterfosfodiester e a continuae a continuaçção da reacão da reacçção de ão de

polimerizapolimerizaçção. ão.

ddCTP

A C G T

1 -Fazendo uma reacção para cada terminador

1 2

2 – Uma só reacção com os 4 terminadores marcados com diferentes fluorocromos

Direcção da migração na electroforese -

+



�� AmplificaAmplificaçção da sequência alvo por PCRão da sequência alvo por PCR

�� PurificaPurificaçção do produto PCRão do produto PCR

–– EliminaEliminaçção de primersão de primers

–– EliminaEliminaçção de saisão de sais

�� Protocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaççãoão

�� PurificaPurificaçção da PCR de sequenciaão da PCR de sequenciaççãoão

–– EliminaEliminaçção de primersão de primers

–– EliminaEliminaçção de ão de terminadoresterminadores ((ddNTPsddNTPs) não incorporados) não incorporados

�� ElectroforeseElectroforese capilarcapilar

�� InterpretaInterpretaçção dos dadosão dos dados


ApApóós a amplificas a amplificaçção da sequência alvo por PCRão da sequência alvo por PCR

�� Controlo da amplificaControlo da amplificaçção com electroforese em ão com electroforese em gel de agarose a 2 gel de agarose a 2 –– 3%3%

�� PurificaPurificaççãoão

Isolar a banda

Protocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaççãoão

��Adequar a quantidade de produto PCR ao nAdequar a quantidade de produto PCR ao nºº de de pbpb

��Isolar bandas se necessIsolar bandas se necessááriorio

��PurificaPurificaççãoão

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: : TTéécnicacnica

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: T: Téécnica cnica Protocolo de sequenciaProtocolo de sequenciaççãoão

4min60º

5seg50º 25x

10seg96º

1min96º

Normal

- PCR enhancer: DMSO a 5%- Terminadores: Aumento

4min60º

10seg50º 35x

25seg98º

1min98º

Sequências difíceis

�� Protocolo normal:Protocolo normal:

–– Produtos PCRProdutos PCR

–– PlasmPlasmíídeosdeos

�� Sequências difSequências difííceis:ceis:

–– Estruturas secundEstruturas secundáárias rias shRNAshRNA

–– ConteConteúúdo em G e Cdo em G e C

–– Regiões Regiões homopolimhomopolimééricasricas

–– Regiões repetitivasRegiões repetitivas

Protocolos de sequenciaProtocolos de sequenciaççãoão

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: An: Anáálise lise computacional dos resultadoscomputacional dos resultados

Raw data

SequenciaSequenciaççãoão: An: Anáálise computacional dos lise computacional dos resultadosresultados

Sequenciação de um plasmídeo


•• CorrecCorrecçção dos dados obtidosão dos dados obtidos

-- SequencingSequencing analysisanalysis ((AppBioAppBio))

•• Gerar uma sequencia consenso, entre Gerar uma sequencia consenso, entre

a sequencia F e R.a sequencia F e R.

-- SeqScapeSeqScape ((AppBioAppBio))

-- NCBI (alinhamento de 2 NCBI (alinhamento de 2 seqseq))

-- Outros softwaresOutros softwares


�� Comparar a sequência Comparar a sequência obtida, com outras obtida, com outras publicadaspublicadas

–– NCBI NCBI –– BlastBlast

–– ManualManual

–– SeqScapeSeqScape ((AppBioAppBio))

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SequenciaSequenciaççãoão: An: Anáálise manual dos resultadoslise manual dos resultados

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: An: Anáálise lise computacional dos resultados computacional dos resultados

Formatos (Formatos (SequencingSequencing file file formatsformats))

Formato GenBank

- Uma sequência no formato GenBank pode conter várias sequências.- Uma sequência no formato GenBank começa com uma linha contendo a palavra “LOCUS”.

- O início da sequência, está marcado com a palavra "ORIGIN" - O fim da sequência está marcado está marcado com duas barras "//“.- Tem 60 nucleotidos por linha em grupos de 10.

Exemplo:

LOCUS AB000263 368 bp mRNA linear PRI 05-FEB-1999DEFINITION Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin like peptide, complete cds.ACCESSION AB000263ORIGIN

1 acaagatgcc attgtccccc ggcctcctgc tgctgctgct ctccggggcc acggccaccg61 ctgccctgcc cctggagggt ggccccaccg gccgagacag cgagcatatg caggaagcgg

121 caggaataag gaaaagcagc ctcctgactt tcctcgcttg gtggtttgag tggacctccc181 aggccagtgc cgggcccctc ataggagagg aagctcggga ggtggccagg cggcaggaag241 gcgcaccccc ccagcaatcc gcgcgccggg acagaatgcc ctgcaggaac ttcttctgga301 agaccttctc ctcctgcaaa taaaacctca cccatgaatg ctcacgcaag tttaattaca361 gacctgaa

//

SequenciaSequenciaççãoão pelo mpelo méétodo de todo de SangerSanger: An: Anáálise lise computacional dos resultados computacional dos resultados

Formatos (Formatos (SequencingSequencing file file formatsformats))

Formato FASTA

- Uma sequência no formato FASTA pode conter várias sequências.

- Cada sequência começa , com uma linha descritiva e dados

informativos.

- O formato FASTA começa sempre com o sinal ">" na primeira

coluna.

Exemplo:

>AB000263 |acc=AB000263|descr=Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin like peptide, complete cds.|len=368ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCCCCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGCCTCCTGACTTTCCTCGCTTGGTGGTTTGAGTGGACCTCCCAGGCCAGTGCCGGGCCCCTCATAGGAGAGGAAGCTCGGGAGGTGGCCAGGCGGCAGGAAGGCGCACCCCCCCAGCAATCCGCGCGCCGGGACAGAATGCCCTGCAGGAACTTCTTCTGGAAGACCTTCTCCTCCTGCAAATAAAACCTCACCCATGAATGCTCACGCAAGTTTAATTACAGACCTGAA

SequenciaSequenciaççãoão: Aplica: Aplicaççõesões

-- SequenciaSequenciaççãoão do genoma humano;do genoma humano;

-- SequenciaSequenciaçção de outros ão de outros genomasgenomas com aplicacom aplicaçção na ão na biologia, filogenia, alimentabiologia, filogenia, alimentaçção, ão, zootzootéécniacnia e outros.e outros.

-- Controlo de PCR, Controlo de PCR, RFLPsRFLPs, , etcetc (confirma(confirmaçção de outras ão de outras metodologias) metodologias)

-- IdentificaIdentificaçção de microorganismos (vão de microorganismos (víírus, bactrus, bactéérias e rias e fungos)fungos)

É o único método que descreve a sequência nucleotídica completa


-- FarmacogenFarmacogenééticatica ((NAT2NAT2 e a e a acetilaacetilaççãoão da da IsoniazidaIsoniazida, resistência a , resistência a

antiretroviraisantiretrovirais na SIDA)na SIDA)

-- TipagemTipagem HLA de alta resoluHLA de alta resoluçção para transplantesão para transplantes

-- Pesquisa de mutaPesquisa de mutaçções em DNA de doentes/possões em DNA de doentes/possííveis portadores veis portadores --

particularmente particularmente úútil nas situatil nas situaçções ões monogmonogéénicasnicas com com

heterogeneidade heterogeneidade alaléélicalica ((BRCA1BRCA1//22; HNPCC, ; HNPCC, ……))

-- IdentificaIdentificaçção de mutaão de mutaçções em tumores: para avaliaões em tumores: para avaliaçção ão

prognprognóóstica e selecstica e selecçção terapêutica (ão terapêutica (exex: muta: mutaçções do ões do EGFREGFR e e kRASkRAS

e cancro do pulmão)e cancro do pulmão)

-- IdentificaIdentificaçção de alteraão de alteraçções ões epigenepigenééticasticas: metila: metilaçção das regiões ão das regiões

promotoraspromotoras


MetilaMetilaççãoão

- Metilação de C em resíduos CpG nas regiões promotoras- Silenciamento transcricional

- Conversão da citosina metiladas a uracil com bissulfito

Antes do bisulfito

Após bisulfito

SequenciaSequenciaççãoão: Outros m: Outros méétodos de todos de sequenciasequenciaççãoão

Outros métodos de sequenciação:- Maxam – Gilbert- 454 Life Sciences/Roche- Illumina- Solid/Applied Biosystems

MassivelyMassively parallelparallel sequencingsequencing

AnAnáálise de fragmentos: Tlise de fragmentos: Téécnicacnica

Gerar produtos marcados Gerar produtos marcados fluorimetricamentefluorimetricamente

�� PCR de amplificaPCR de amplificaçção, com um dos ão, com um dos primersprimers marcados.marcados.

�� Sondas especSondas especííficas para a região em estudo.ficas para a região em estudo.

AnAnáálise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: Aplicaççõesões

�� Rastreio de mutaRastreio de mutaççõesões

�� AnAnáálise de lise de STRsSTRs ((ShortShort Tandem Tandem RepeatsRepeats))

�� Pesquisa de Pesquisa de IndelsIndels ((InsertionsInsertions//DelectionsDelections))

�� MultiplexMultiplex LigantionLigantion--dependentdependent ProbeProbe AmplificationAmplification (MLPA)(MLPA)

–– Estudo de RNA de proteEstudo de RNA de proteíínas inflamatnas inflamatóóriasrias

–– Cancro hereditCancro hereditááriorio

–– FarmacogenFarmacogenóómicamica

–– CromossomopatiasCromossomopatias; ; ……

�� OLA (OLA (OligonucleotideOligonucleotide LigationLigation AssayAssay))

AnAnáálise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: AplicaççõesõesMMéétodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaççõesões

�� IndicaIndicaçções: heterogeneidade ões: heterogeneidade alaléélicalica e e gengenééticatica

�� AnAnáálise lise conformacionalconformacional–– HAHA--CAE (CAE (HeteroduplexHeteroduplex analysisanalysis--capillarycapillary arrayarray

electrophoresiselectrophoresis) )

–– SSCP (SSCP (SingleSingle strandstrand conformationconformation polymorphismpolymorphism

–– etcetc

Desvantagens:Desvantagens:-- nnºº de amostras muito grandede amostras muito grande-- PolPolíímero mero ““ConformationConformation AnalysisAnalysisPolymerPolymer”” (CAP)(CAP)

AnAnáálise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: AplicaççõesõesMMéétodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaççõesões

Métodos de rastreio: DGGE, SSCP, HAHA--CAECAE

Para identificar o segmento suspeito

Fragmentos génicos

correspondentes aos exões

PCR

Sequenciação do segmento suspeito

Normal

Cancro hereditário da mama

MMéétodos de rastreio todos de rastreio de mutade mutaçções: HAões: HA--CAECAE

Seq. normais

Identificação de um perfil de migração anómalo

MMéétodos de rastreio de mutatodos de rastreio de mutaçções: SSCPões: SSCP

MMéétodotodo maismais usadousado

GTA GTA GTA ACTGTTA......AGCATTATCC

GTA GTA GTA GTA GTA ACTGTTA......AGCATTATCC

(GTA)n, n=3

(GTA)n, n=5

primer primer

primer primer

AnAnáálise de fragmentos: Aplicalise de fragmentos: AplicaççõesõesCCaracterização de STRs

• PCR com um primer marcado

• Electroforese capilar em condições desnaturantes:

- Diluição da amostra em água

- Diluição da amostra em formamida

- Desnaturação 96ºC 3min

- 4ºC sobre gêlo 3min

266 pb + nx4

(TTTA)n

STRsSTRs ((ShortShort Tandem Tandem RepeatsRepeats) ) CYP19CYP19 (TTTA)n(TTTA)n (intrão 4) identificado por electroforese (intrão 4) identificado por electroforese capilar, em sequenciador automcapilar, em sequenciador automáático, de produtos de PCR obtidos utilizando o primer tico, de produtos de PCR obtidos utilizando o primer proximalproximal marcado com 6FAM. Amostra de marcado com 6FAM. Amostra de heterozigotoheterozigoto, sendo vis, sendo visííveis a azul dois picos de veis a azul dois picos de 302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repeti302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repetiçções, respectivamente. Utilizouões, respectivamente. Utilizou--se o marcador se o marcador de peso molecular de peso molecular ““500 LIZ500 LIZ““ (picos a laranja).(picos a laranja).

SequenciaSequenciaçção que confirma a existência de 12 ão que confirma a existência de 12 repetirepetiçções TTTA correspondendo a um fragmento ões TTTA correspondendo a um fragmento de 314pb de um indivde 314pb de um indivííduo duo homozigotohomozigoto..

AnAnáálise de fragmentos: lise de fragmentos: Caracterização de STRs

AnAnáálise de fragmentos: lise de fragmentos: STRsSTRs

Identifiler

AplicaAplicaççõesões

–– Estudos de associaEstudos de associaçção ão

–– Medicina Forense Medicina Forense

–– Controlo de transplantes Controlo de transplantes medulares medulares

–– Controlo de linhas Controlo de linhas celularescelulares

AnAnáálise de fragmentos: Pesquisa de lise de fragmentos: Pesquisa de IndelsIndels

AplicaAplicaçção: Pesquisa de ão: Pesquisa de delecdelecççõesões (9 a 24pb) do (9 a 24pb) do exãoexão 19 do 19 do EGFR EGFR em em carcinoma epidermcarcinoma epidermóóide do pulmãoide do pulmão

Tecido normalTecido tumoral

del15 15 pbpb

Pao W et al. PNAS 2004;101:13306-13311

AnAnáálise de fragmentos: Pesquisa de lise de fragmentos: Pesquisa de IndelsIndels

Delecções no exão 19 do EGFR de NSCLCs sensíveis aos ITKs, gefitinib ou erlotinib

AnAnáálise de fragmentos: MLPAlise de fragmentos: MLPA

�� Estudo Estudo quantitativo do nquantitativo do nºº de cde cóópias pias mmúúltiplas sequências (DNA ltiplas sequências (DNA ou RNA) em simultâneoou RNA) em simultâneo

�� BaseiaBaseia--se na utilizase na utilizaçção de sondas especão de sondas especííficas para cada ficas para cada sequência, com prolongamentos comuns a todas as sondas, sequência, com prolongamentos comuns a todas as sondas, desenhados de modo a criar sequências de dimensões desenhados de modo a criar sequências de dimensões diferentes;diferentes;

�� Os Os primersprimers são universais e vão ligarsão universais e vão ligar--se aos prolongamentos se aos prolongamentos das sondasdas sondas

�� As sequências são identificadas pelo seu comprimento As sequências são identificadas pelo seu comprimento especespecíífico;fico;

�� A intensidade do sinal vai ser proporcional ao nA intensidade do sinal vai ser proporcional ao nºº de cde cóópias da pias da sequência alvosequência alvo


Electroforese capilar em condições desnaturantes:- Diluição da amostra em formamida- Desnaturação 96ºC 3min- 4ºC sobre gêlo 3min

/cDNA

�� AplicaAplicaççõesões

–– Estudo de expressão Estudo de expressão ggéénicanica (RNA)(RNA)

exex: prote: proteíínas inflamatnas inflamatóóriasrias

–– IdentificaIdentificaçção de ão de delecdelecççõesões e duplicae duplicaçções em genes responsões em genes responsááveis veis

por doenpor doençças hereditas hereditááriasrias

exex: cancro da mama heredit: cancro da mama hereditáário, rio, neurofibromatoseneurofibromatose; ;

-- IdentificaIdentificaçção de ão de delecdelecççõesões e duplicae duplicaçções em genes de ões em genes de metabolismometabolismo

exex: : farmacogenfarmacogenóómicamica

–– IdentificaIdentificaçção de ão de delecdelecççõesões e duplicae duplicaçções ões cromosscromossóómicasmicas

ex. atraso mental de causa desconhecidaex. atraso mental de causa desconhecida



Reacção multiplex:- cDNA de 45 proteínas inflamatórias

Análise do BRCA1 por MLPA

A diminuição da altura dos picosidentifica delecções

AnAnáálise de fragmentos lise de fragmentos –– MLPA: aplicaMLPA: aplicaçção ao cancro da mama hereditão ao cancro da mama hereditááriorio

AnAnáálise de fragmentos : MLPAlise de fragmentos : MLPA

Diagnóstico de microdeleção de novo

em 1p

Com sonda marcada e primers específicos de sequência s de regiões subteloméricas de vários cromossomas

AnAnáálise de fragmentos: lise de fragmentos: OligonucleotideOligonucleotide LigationLigation AssayAssay(OLA)(OLA)

DeterminaDetermina çção das 31 mutaão das 31 muta çções mais frequentes do gene ões mais frequentes do gene CFTR, CFTR, presentes presentes nana mucoviscidosemucoviscidose , por OLA, por OLA

É realizada uma PCR multiplex a que se segue a ligaçã o de sondas. As sondas são desenhadas de modo a que as sequências mutadas e não mutadas se distingam por diferentes comprimentos e diferentes fluorescências.

Mutação em heterozigotia em local de splicing


Objectivos:Objectivos:

�� Analisar Analisar electroferogramaselectroferogramas

�� Identificar mutaIdentificar mutaççõesões

Analisar Analisar electroferogramaselectroferogramas

�� TroubleshootingTroubleshooting

Dyeblobs

Regiões difíceis



Pouca descriminação perto dos primers

Múltipla ligação de primer



Pouco DNA, DNAses, primer ineficaz


Sobreposição de múltiplos picos: dois produtos PCR não detectáveis em gel de agarose a 1,5%

NAT2NAT2 GenotipagemGenotipagem

DNA NAT2 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferas e)

Genebank accession: NT_030737

6102361 tacctataat tagtcacacg aggaaatcaa atgctaaa gt atgatatgtt tttatgtttt 6102421 gtttttcttg cttag [gggat catggacatt gaagcatatt ttgaaagaat tggctataag 6102481 aactctagga acaaattgga cttggaaaca ttaactga ca ttcttgagca ccagatccgg 6102541 gctgttccct ttgagaacct taacatgcat tgtgggca ag ccatggagtt gggcttagag 6102601 gctatttttg atcacattgt aagaagaaac cggggtgg gt ggtgtctcca ggtcaatcaa 6102661 cttctgtact gggctctgac cacaatcggt tttcagac ca caatgttagg agggtatttt 6102721 tacatccctc cagttaacaa atacagcact ggcatggt tc accttctcct gcaggtgacc 6102781 attgacggca ggaattacat tgtcgatgct gggtctgg aa gctcctccca gatgtggcag 6102841 cctctagaat taatttctgg gaaggatcag cctcaggt gc cttgcatttt ctgcttgaca 6102901 gaagagagag gaatctggta cctggaccaa atcaggag ag agcagtatat tacaaacaaa 6102961 gaatttctta attctcatct cctgccaaag aagaaaca cc aaaaaatata cttatttacg 6103021 cttgaacctc gaacaattga agattttgag tctatgaa ta catacctgca gacgtctcca 6103081 acatcttcat ttataaccac atcattttgt tccttgca ga ccccagaagg ggtttactgt 6103141 ttggtgggct tcatcctcac ctatagaaaa ttcaatta ta aagacaatac agatctggtc 6103201 gagtttaaaa ctctcactga ggaagaggtt gaagaagt gc tgaaaaatat atttaagatt 6103261 tccttgggga gaaatctcgt gcccaaacct ggtgatgg at cccttactat ttagaataag 6103321 gaacaaaata aacccttgtg tatgtatcac ccaactca ct aattatcaac ttatgtgcta

6103381 tcagatatcc tctctaccct cacgttattt tgaagaaaat cctaaacatc aaatactttc 6103441 atccataaaa atgtcagcat ttattaaaaa acaataac tt tttaaagaaa cataaggaca 6103501 cattttcaaa ttaataaaaa taaaggcatt ttaaggat gg cctgtgatta tcttgggaag 6103561 cagagtgatt catgctagaa aacatttaat attgattt at gttgaattc ] Segmento 1 Segmento 2 111T>C 191G>A 282C>T 341T>C 434A>C 481C>T 590 G>A 803A>G 845A>C 857G>A

Base nº 1 [DNA=RNA]

Identificar mutaIdentificar mutaçções: Casos prões: Casos prááticosticos


Polimorfismo/Mutação em homozigotia

DUPLICADO DUPLICADO SequenciaSequenciaççãoão -- casos casos prprááticosticos

Polimorfismo/Mutação em heterozigotia

Wild-typeaaaatt cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga


Escreva qual o alelo mutado.


Mutantaaaatt cccgtcgcta tcaagacatctccga

Del15pbDel15pb

Wild typeaatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat




Mutantaatgcacctggttcttttactatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat

c.2231_2259dup20. c.2231_2259dup20. FrameshiftFrameshift

Wild-typeagaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgtatgaaaata attcaaacag tactatagct



Mutantagaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgaaaata attcaaacag tactatagct

c.5374_5377delTATG. c.5374_5377delTATG. FrameshiftFrameshift



BRCA2 - c.2624A>G. p.K1132K.

Wild type:

ttt gaa ttt act cag ttt aga aaa cca agc tac ata ttg cag aag agt

F E F T Q F R K P S Y I L Q K S

Mutada:

ttt gaa ttt act cag ttt aga aag cca agc tac ata ttg cag aag agt

F E F T Q F R K P S Y I L Q K S

Como classifica a mutação?

MutaMutaçção em local de ão em local de splicingsplicing no gene no gene LCA5LCA5associada associada àà amauroseamaurose congcongéénita de nita de LeberLeber

Doente Pai saudável

Qual é a mutação?

A doença é dominante ou recessiva?

Causa frequente de défice visual grave congénito. Situação monogénica com heterogeneidade genética, com mutações descritas em mais de 13 genes .

A mutação localiza-se na última base do exão 6. Como poderemos verificar se interfere com o splicing?

RT-PCR para caracterização do mRNA(continuação)

Exão 7Exão 7 Exão 6Exão 6

A sequenciação do produto de RT-PCR mostrou que a mutação levou à utilização de um segundo local de splicing, localizado no intrão 6, do que resultou a inserção de 5 bases (GTATG) do intrão 6, efeito de frameshift e a criação de um codão stop prematuro.

a electroforese capilar num laborat ório de gen ética · capilar, em sequenciador autom ático,...

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