Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde 

Instituto de Bioquímica Médica                   

A degradação de heme em Aedes aegypti e seus papéis fisiológicos no intestino médio. 

                   

Luiza de Oliveira Ramos Pereira  

 2008 

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II 

LOMBADA 

LUIZA

 DE O

LIVEIR

A 

RAMOS P

EREIR

A 

 A degrad

ação de h

eme em

 Aedes aegypti e 

seus papéis fisiológicos n

o intestin

o médio.

UFRJ 

2008 

III 

   

A degradação de heme em Aedes aegypti e seus papéis fisiológicos no intestino médio. 

    

Luiza de Oliveira Ramos Pereira   

    

Tese  de  Doutorado  apresentada  ao  Programa  de  Pós‐graduação  em Química  Biológica,  do  Instituto  de  Bioquímica  Médica,  Universidade Federal  do  Rio  de  Janeiro,  como  parte  dos  requisitos  necessários  à obtenção do título de Doutor em Química Biológica. 

   

Orientadora: Gabriela de Oliveira  aiva e Silva PProfessora  Adjunta  do  Instituto  de  Bioquímica édica ­ IBqM ­ UFRJ M

    Co­orientador:  Pedro Lagerblad Oliveira Professor Titular do Instituto de Bioquímica Médica ­ IBqM ­ UFRJ 

      Rio de Janeiro 

 Abril de 2008 

     

IV 

         

P  de Oliveira Ramos 

A degradação de heme em A ológicos no intestino médio 

ereira, Luiza 

edes aegypti e seus papéis fisi

P   

ereira. Rio de Janeiro, 2008.Número de páginas fls. 154 

 Dissertação (Doutorado em Química Biológica)/UFRJ/Instituto de Bioquímica 

Médica/Programa de Pós‐Graduação em Química biológica, 2008.  

Orientadora: Gabriela de Oliveira Paiva e Silva. Co‐orientador: Pedro Lagerblad de Oliveira. 

 Referências bibliográficas: f. 106‐121 

 ti.  2. Heme oxigenase.  3. Biglutamini1. Aedes aegyp l‐biliverdina. 

 I. Paiva‐Silva, Gabriela de Oliveira. I 

I. Universidade Federal do Rio de Janei o de Bioquímica Médica, Programa de Pós‐Graduação em Química Biológica. 

ro, Institut

III. Título.  

  

V 

FIXA DE APROVAÇÃO  A degradação de heme em Aedes aegypti e os papéis desta via no intestino médio. 

 Luiza de Oliveira Ramos Pereira 

 Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós‐graduação em Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro ‐ UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica. 

 

Aprova a por: d  

________________________________________________________________ Luis Eduardo Soares Netto 

Doutor em Ciências Biológicas (Bioquímica) pela Universidade de São Paulo em 1992 e Professor Associado da USP do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva/Instituto de Biociências/USP. 

Membro Externo  

________________________________________________________________ Luciano de Andrade Moreira 

Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas pela UFV e Centre of Plant Breeding and Reproduction Research (CPRO‐DLO), Holanda em 1998 e Pesquisador Associado do Centro de Pesquisas René 

Rachou/FIOCRUZ/Laboratório de Malária. Membro Externo 

 ________________________________________________________________ 

Mário Alberto Cardoso da Silva Neto Doutor em Química Biológica pelo ICB, Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1996 e Professor 

Adjunto do Instituto de B oquímica Médica/UFRJ. iMembro Interno 

 ________________________________________________________________ 

Marcius da Silva Almeida Doutor em Química Biológica pelo ICB, Universidade Federal do Rio de Janeiro em 2001 e Professor 

Adjunto do Instituto de B oquímica Médica/UFRJ. iRevisor e Suplente Interno 

 ________________________________________________________________ 

Alexandre Afranio Peixoto Doutor em Genética pela Universidade de Leicester, Reino Unido em 1993 e Pesquisador Titular do Instituto Oswaldo Cruz/Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/FIOCRUZ/Laboratório de 

Biologia Molecular de Insetos. Suplente Externo 

 ________________________________________________________________ 

Gabriela de Oliveira Paiva e Silva Doutora em Química Biológica pelo ICB, Universidade Federal do Rio de Janeiro em 2001 e Professora 

Adjunta do Instituto de B oquímica Médica/UFRJ. iOrientadora 

 ________________________________________________________________ 

Pedro Lagerblad Oliveira Doutor em Química Biológica pelo ICB pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1990 e Professor 

Titular  do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ. Co­orientador 

Rio de Janeiro, 9 de Abril de 2008. 

VI 

                O  presente  trabalho  foi  realizado  no  Laboratório  de  Artrópodes  Hematófagos  do Instituto  de  Bioquímica  Médica  da  Universidade  Federal  do  Rio  de  Janeiro,  sob  a orientação da Professora Gabriela de Oliveira Paiva e Silva e co‐orientação do Professor Pedro Lagerblad de Oliveira, na vigência de auxílios concedidos pela FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de  Janeiro), pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento  Científico  e  Tecnológico),  PADCT‐CNPq  (Programa  de  Apoio  ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico), PRONEX (Programa de Apoio a Núcleos de Excelência),  John  Simon  Guggenheim  Memorial  Foundation  e  HHMI  (Howard  Hughes Medical  Institute). Parte deste  trabalho  foi  realizada no  laboratório do Dr. Anthony A. James  na  Universidade  da  Califórnia  em  Irvine,  EUA,  sob  supervisão  do  Dr.  Osvaldo Marinotti. 

VII 

                               

Dedico  esta  conquista  aos  amigos  de verdade,  aqueles  que  aparecem  quando  o resto do mundo desaparece. 

VIII 

AGRADECIMENTOS  Agradeço a Deus. Aquele que percebo quando olho para a natureza, através da ciência. Agradeço  a minha mãe,  ao  Rodolfo  e  aos  queridos  amigos  que,  com  seu  amor,  apoio, incentivo  e  paciência,  foram meus melhores  cúmplices  de  sonhos,  dúvidas,  loucuras  e realizações. E ao meu pai por ser o meu melhor exemplo. Agradeço  aos meus  orientadores  Gabriela  e  Pedro  pelas  discussões,  apoio  e  por  toda paciência.  

 Agradeço ao Marcos, Marcus e Aurélio pelas discussões sobre as medidas de atividade antioxidante e PCR em tempo real. Agradeço  a  todos  do  laboratório  de  Artrópodes  Hematófagos  pelo  bom  convívio  por todos estes anos. Agradeço  à  Clara  por  todos  os  “mega”  experimentos  a  quatro mãos  em  que  batemos 

C t     entos 3

recordes  de  P Rs  fei os  por  dia. Sou  grata também  pelos  experim com  infecção viral e captação de ZnPP pela C6/ 6.  Agradeço  ao  Flávio  e  ao  José  Henrique  pela  colaboração  nos  experimentos  com microscopia de fluorescência. Agradeço à Hanna pela colaboração nos experimentos com paraquat e à Raquel Senna pelos experimentos iniciais com Plasmodium galinaceum. 

e   Agradeço  ao Alexandre  ao Antônio pelo desenho dos “primers” para PCR em  tempo real, e também à Carla pelas planilhas e dicas sobre as análises estatísticas. Agradeço  ao  Osvaldo  e  a  todos  do  laboratório  do  Dr.  Anthony  A.  James  da  UCI  pelo suporte  e  por  todos  os  ensinamentos,  especialmente  à  Judy  que  torna  o  trabalho infinitamente eficiente por lá. Agradeço a todos os membros da banca: Luis Netto, Luciano Moreira, Mário e Alexandre ela  disposição  em  ler  este  trabalho  e  por  virem  até  aqui  discutí‐lo  comigo  e  assim, nriquecê‐lo. Agradeço também, e especialmente, ao Marcius pela cuidadosa revisão. pe  

IX 

RESUMO   PEREIRA, Luiza de Oliveira Ramos. A degradação de heme em Aedes aegypti e os papéis desta via no intestino médio. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa de Pós‐graduação em Química Biológica,  Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, 2008.  A  digestão  do  sangue  resulta,  entre  outros  fenômenos,  no  aparelho  digestivo  dos artrópodes  hematófagos,  na  liberação  de  grandes  quantidades  do  grupamento prostético  da  hemoglobina  (heme),  uma  molécula  com  grande  potencial  oxidativo.  A degradação  enzimática  do  heme  Já  foi  descrita  em  diversos  organismos,  incluindo 

da  pela  hemplantas,  bactérias  e  mamíferos.  Esta  reação  é  catalisa e  oxigenase, produzindo monóxido de carbono, íon ferroso e biliverdina IXα. Diante da grande importância epidemiológica do mosquito Aedes aegypti, e da escassez de estudos sobre a degradação do heme neste inseto, buscamos identificar e caracterizar 

i médio  eesta  via  no  ntestino  das  fêmeas.  N ste  tecido  acontece,  primordialmente,  a liberação de grandes e tóxicas quantidades de heme. Ao  longo  da  digestão,  grandes  quantidades  de  um  pigmento  verde  são  produzidas  e liberadas para o lúmen intestinal das fêmeas, atingindo valores máximos em 24h após a alimentação  com  sangue,  o  que  está  de  acordo  com  a  fase  crítica  da  proteólise.  Este pigmento é, posteriormente, excretado ao final deste processo. O pigmento purificado de A. aegypti apresenta um espectro de absorção de luz semelhante aos já descritos para os isômeros de biliverdina. Por outro lado, se mostrou menos hidrofóbico que a biliverdina IXα, o que indicava modificações químicas nesta molécula. Por ESI‐MS este pigmento foi estruturalmente caracterizado como um isômero alfa de biliverdina modificado por dois resíduos  de  glutamina.  Esta  via  que  gera  esta  biglutaminil‐biliverdina  passa  pela degradação do heme, catalisada pela heme oxigenase, expressa pelo epitélio  intestinal, seguida por subsequentes adições de glutaminas.  Observamso que a heme oxigenase é expressa em diferentes tecidos da fêmea adulta de A.  aegypti.  A  dieta  protéica/distensão  abdominal,  assim  como  a  digestão  em  si representam sinais importantes para disparar a sua transcrição. Ao contrário de outras heme  oxigenases  já  descritas,  a  presença  de  ROS,  concomitante  a  do  sangue,  inibe  a expressão  deste  gene.  Conjuntamente,  nossas  observações  sugerem  a  presença  de mecanismos  distintos  na  regulação  transcricional.  Especulamos  que  o  cenário  da igestão do sangue deve ter imposto uma importante fonte de pressão seletiva, ao longo a sua evolução deste inseto. dd   

X 

ABSTRACT   PEREIRA, Luiza de Oliveira Ramos. A degradação de heme em Aedes aegypti e os papéis desta via no intestino médio. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa e Pós‐graduação em Química Biológica,  Instituto de Bioquímica Médica, Universidade ederal do Rio de Janeiro – UFRJ, 2008. dF  Among  other  phenomenons,  blood  digestion  results,  in  the midgut  of  hematophagous animals,  in  the  release  of  the  hemoglobin prosthetic  group  (heme),  a molecule with  a high  oxidative  potential.  Heme  enzymatic  degradation  has  already  been  described  in 

l ction  is catalseveral organisms,  including plants, bacterias and mamma s. This rea yzed by heme oxygenase and results in carbon monoxide, ferrous ion and biliverdin IXα. Acording  to  the enormous epidemiologic  relevance of  the mosquito Aedes aegypti  and the absence of studies about the heme degradation in this insect, we intended to identify and characterize this pathway in its female midgut. This tissue is the first site of a huge heme release. During  the  digestion,  it  was  observed  that  a  large  amount  of  a  green  pigment  is produced and secreted to the intestinal lumen of females, reaching maximum values 24h after blood meal, according to the critical phase of proteolysis. This pigment is excreted at  the  end  of  this  process.  The  spectrum  of  the A.  aegypti purified  pigment was  very similar  to biliverdin  isomers  spectra. On  the other hand,  it was  less hydrophobic  than biliverdin IXα, which indicated a chemical modification in this molecule. By ESI‐MS the mosquito  pigment  was  structural  characterized  as  an  alpha  isomer  of  biliverdin modified  by  two  glutamine  residues.  The  pathway  that  generates  this  biglutaminyl‐

ase exprebiliverdin passes by the heme degradation, catalyzed by heme oxygen ssed  in the midgut epithelium, followed by two glutamine subsequent additions. We observed that heme oxygenase is expressed in different tissues of A. aegypti female. In the midgut and ovaries  its expression is  induced by blood feeding. Heme oxygenase induction  responds  to  the  digestion  itself  and  also  protein  diet/intestinal  distention. Different from other heme oxygenase systems it reduces expression in the presence of ROS,  when  it’s  concomitant  to  blood.  Our  observations  suggest  that  this  gene transcription control seems to respond to different stimuli. One can speculate  that  the blood  digestion  scenario  must  have  been  imposing  an  important  selective  pressure, during the evolution of this insect. 

XI 

3.8 Silenciamento da expressão      3.8.1 Preparação da dupla fit      3.8.2 Injeção nos mosquitos 

SUMÁRIO  

  1 INTRODUÇÃO 

pti 

16 

1.1 O mosquito Aedes aegypti  16 1.2 Dengue e a importância epidemiológica do Aedes aegy

 digestão do sangue gicos 

18 1.3 A hematofagia e a 22 1.4 O heme: características químicas e papéis fisioló 26 1.6 Os radicais livres 

ção de radicais livres eme e defesas antioxidantes em artrópodes

28 1.7 O papel do heme na forma 30 1.8 Mecanismos de detoxificação do h 32 1.9 A enzima heme oxigenase 

 

35 6       1.9.1 Diferentes isoformas de HO 

      1.9.2 Atividades “HO‐like”e  degradação  do  heme  e  seus 

337 

      1.9.3  Papéis  fisiológicos  associados  à  via  drodutos      1.9.4 Regulação da expressão gênica de HO‐1 p

 9 2 3

  4 

 OBJETIVOS  2 

ÉTODOS COMPLEMENTARES 

  7 4

 3 MATERIAIS E M 

heme (ZnPP) pelo epitélio intestinal  

 48 

3.1 Os mosquitos ogo do 

P 

48 3.2 Ensaio de captação de um anál 49       3.2.1 Alimentação artificial com ZnP 49 

0       3.2.2 Dissecção dos mosquitos       3.2.3 Microscopia de fluorescência 

nos mosquitos Culex 

550 

3.3 Caracterização preliminar do gene de HO quinquefasciatus e Anopheles gambiae      3.3.1 Extração de RNA total 

anscribed Polymerase Chain Reaction” ou Reação em 

 1 551 

      3.3.2 rtPCR (“Retro TrCadeia da Polimerase por Retro Transcrição) 

ulex quinquefasciatus 

 51 

3.4 5’ e 3’RACE da HO de C

O

53 5 3.5 5’RACE da heme oxigenase das diferentes cepas de Aedes aegypti 

3.6 Efeito da infecção por Plasmodium galinaceum na expressão relativa da AaHção 

556 

      3.6.1 Alimentação dos mosquitos nos hospedeiros infectados e manutendo ciclo 

edida de expressão 

 56 

      3.6.2 Dissecção dos mosquitos, extração do RNA e mrelativa de AaHO 

 56 8 3.7 Efeito de CoPP sobre a expressão relativa da AaHO 

     3.7.1 Alimentação dos mosquitos pressão 

558 

      3.7.2 Dissecção dos mosquitos, extração do RNA e medida de ex

or RNA de interferência relativa de AaHO 

 da AaHO pa de RNA 

 58 59 59 60 

XII 

      3.8.3 Medida dos níveis de expressão da AaHO        

60 3.8.4 Medida da oviposição  61 

3.9 Ensaios para testar a capacidade antioxidante da AaBV 

V 

62 2       3.9.1 A purificação do pigmento de A. aegypti por HPLC 

ração do padrão de biliverdina alfa e quantificação da AaB6

      3.9.2 Prepa 62        3.9.3 Medida da atividade antioxidante por proteção da oxidação da  B‐ficoeritrina       3.9.4 Medida da capacidade antioxidante por imunodetecção de proteínas arboniladas 

 63 

4  c

 6

  4 RESULTADOS  

me em Aedes 

  6 6

4.1 Identificação e caracterização da via de degradação do he

tinal aegypti 

o heme pelo epitélio intes

 67 

4.2 Captação de um análogo d 68 4.3 Caracterização da heme oxigenase de Aedes aegypti 

de AaBV 

76 4.4 HO em outros mosquitos 

da AaHO e a produção  RNA de interferência 

78 4.4 A digestão do sangue, a expressão .5 Silenciamento parcial da AaHO por.6 Capacidade antioxidante da AaBV 

81 4 0 

4 84 9 

 DISCUSSÃO  5 

 BIBLIOGRAFIA 

  5 9

 6 

pêndice 1 

 06 1

 A 

pêndice 2 

 22 1

 A 

 131  

XIII 

L ISTA DE ABREVIATURAS 

A. aegyp ti ti BV ou AaBV: biliverdin

alfa B

a isolada de Aedes aegypA. aegypti HO ou AaHO: heme oxigenase identificada em Aedes aegypti  

V: biliverdina alfa (padrão) ARE: "antioxidant responsive element” ou elemento responsivo a antioxidante  Bach1: “BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1”. BTB é um Fator de trasncrição 1 do tipo zíper de leucina com domínios BTB e CNC. BTB é o domínio responsável por o onsável pela interação com o DNA cara

ligomerizações e CNC ou “Cap'n' collar” é o domínio resp família de fatores de transcrição. 

BH oxytoluene” ou hidroxitolueno butilado cterístico destaT: “butyl

bp:ated hydr

es B­P rina  

 pares de bas

BR:E: B‐ficoerit bi

BV:lirrubina 

cDN plementar  biliverdina A: ác

CO:ido desoxiribonucleico com

 CoP IX 

 monóxido de carbonoP I rfirina 

DH: d  X: cobalto portopoengue hemorrágica

DMSO: dimetilsulfóxido DPE: s o  início da trasn

  “downstream core promoter element” ou elemento promotor  localizado apócri

EPR: nética de elétrons ção 

ESI­ “electron paramagnetic resonance” ou ressonância paramag

ria de massa por pulverização de elétrons GFP

MS: espectromet: “

HO: hgreen fluorescent protein” ou proteína verde fluorescente e

HO­ ores me oxigenase 

superiHPL

1: heme oxigenase 1, isoforma indutível, em eucariotos C: cr a  r alta peromatografi  líquida em fase eversa de  formance 

Inr: “initiator” ou nucleotídeo onde a transcrição é iniciada Keap1:  “ke cl h‐like  ECH‐associated  protein  1  (ECH,  erythroid  cell‐derived)”  ou  proteína  1 derivada de célula eritróide com um domínio Kelch Maf:  “v­maf  musculoaponeurotic  fibrosarcoma  (avian)  oncogene  homolog".  Originalmente  foi descoberto  como um oncogene de  fibrosarcoma músculo  aponeurótico,  homólogo  ao do  vírus aviário a  família multigê

  AS42.  Depois  descobriu‐se  que  havia  homólogos  celulares  que  compõe  um

MAPK:  mitógenos  nica (c­maf) 

se” ou proteían quinase ativada porMAR mento responsivo a proteínas Maf 

 “mitogen‐activated protein kinansive element” ou ele

mRNE: “Maf respoA: ácido ribonucleico mensageiro 

nm: nanômetros Nrf2   erythroid‐2  related  factor  2”  ou  fator  nuclear  relacionado  ao  fator eritr

:  “nuclear  factoró

OH•: radical ide‐2 

PCRhidroxila 

da polimerase PK  ou proteína quinase C 

: reação em cadeia ase C”

PMC: “protein kin: M

R•: raatriz peritrófica di

RNA co cal alquil  

leiRNA

: ácido ribonucse

RO•: ra: ribonuclease 

ROOdical alcoxil 

ROO

•: radical peroxil H: hidroperóxido orgânico 

ROS: “reactive oxygen species” ou espécies reativas de oxigênio 

XIV 

rtPCR erase chain reaction” ou reação em cadeia da polimerase por trans

: “retro transcriptase polym

SBTIcrição reversa : inibid

SDSor de tripsina de soja 

sódio SDS  poliacrilamida na presença de SDS 

: dodecil sulfato de ­PAG

UA: unidE: eletroforese em gel deade arbitrária 

ZnPP IX: zinco portoporfirina IX 

XV 

LISTA DE FIGURAS  Figura 1: O ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti. 

 do vetor Aedes aegypti e das epidemias de dengue.  1980 e 2007. 

Figura 2: Distribuição mundialFigura 3: Crescimento dos casos de dengue e DH nas Américas entreFigura 4: Matriz peritrófica de A. aegypti. 

oporfirina IX). Figura 5: A estrutura da molécula de heme (ferriprotFigura 6: Geração de estresse oxidativo por ferro ligado ao heme ou livre. Figura 7: Via de degradação do heme em mamíferos. 

fatores de trasncrição e a sua relação Figura 8: Regulação d gene de HO‐1 por diversos com diferentes estados patológicos. Figura 9: Ligação de Maf aos “enhancers” de HO‐1. Figura  10:  Cinética  de  captação  de  ZnPP‐globina  pelo  epitélio  intestinal  de  fêmeas  de Aedes aegypti observada por microscopia de fluorescência. 

C  Figura 11:  inética de captação de ZnPP‐albumina pelo epitélio intestinal de fêmeas de Aedes aegypti observada por microscopia de fluorescência. Figura  12:  Cinética  de  captação  de  ZnPP‐globina  pelo  epitélio  intestinal  de  fêmeas  de Aedes aegypti observada por microscopia de fluorescência, com intervalos menores. 

mento  das  sequência   porção  5’  do  transcrito  de  HO  das  diferentes Figura  13:  Alinha scepas de Aedes aegypti. Figura 14: HO de Culex quinquefasciatus. 

or outros mosquitos. Figura 15: HO é expressa pFigura 16: CoPP não induz a expressão de AaHO. Figura 17: A infecção com Plasmodium gallinaceum não induz a expressão de AaHO. Figura 18: Redução na expressão de HO por injeção de dsRNA é tecido específica. Figura 19: A  redução na  expressão de HO no  intestino médio  se mantém ao  longo do tempo e aumenta com a alimentação com sangue. 

am a expressão de Figura 20: A injeção de veículo além da injeção de dsRNA controle ativ

as. HO no intestino médio. 

ição de fême pelo ABAP. 

Figura 21: A injeção de dsRNA não afeta a oviposroxilFigura 22: Reação de geração de radicais pe

ç gFigura 23: Derivatiza ão  rupamentos carbonil. Figura 24: AaBV é um antioxidante solúvel. 

e  da  AaBV  por  imunomarcação  de Figura  25:  Medida  da  capacidade  antioxidantroteínas carboniladas. igura 26: Análise da região promotora da AaHO. pF  LISTA DE TABELAS 

e induzem e r ã   dade de HO‐1.  Tabela 1: Condições qu   xp ess o ou ativi

O  e  RP  de  Culex  q inquefasciatus  e  Anopheles Tabela  2:  Iniciadores  para  PCR  de  H ugambiae. Tabela 3: Iniciadores para RACE de HO de Culex quinquefasciatus. abela 4: Iniciadores para RACE de AaHO das diferentes cepas. abela 5: Iniciadores para PCR mole da síntese de dupla fita de RNA. TT 

16 

1 INTRODUÇÃO 

 

1.1 O mosquito Aedes aegypti 

 

Os mosquitos são classificados na família Culicidae, subordem Nematocerca, ordem 

Diptera. Esta, por sua vez, se subdivide em três sub‐famílias, onde Culicinae  se destaca 

como a maior. Nesta sub‐família, estão classificados inúmeros gêneros, em sua maioria 

representados por espécies de hábito hematófago (Kettle, 1995; Consoli & de Oliveira, 

1997).  O  gênero Aedes,  maior  da  sub‐família  Culicinae,  agrupa  espécies  abundantes  e 

poss  uma distribuiui ção mundial (Matheson, 1932). 

O Aedes aegypti  é um mosquito urbano de hábito diurno,  amplamente distribuído 

em regiões tropicais e subtropicais. Esta espécie pode ser reconhecida pelo tórax curvo 

com característico bandeamento branco, também presente nos tarsos.  

As  fêmeas adultas procuram locais com água  limpa para a oviposição, assim como 

recipientes com água armazenada, tanto pela ação das chuvas, como para uso doméstico 

(Matheson, 1932). É durante a estação chuvosa, que a população atinge elevados níveis. 

Assim como todos os mosquitos, esta espécie sofre uma metamorfose completa. Dos 

ovos postos na água ou em superfícies úmidas, emerge uma  larva aquática e capaz de 

alimentar‐se.  Esta,  quando  madura,  gera  uma  pupa  também  aquática,  que  não  se 

alimenta. Desta emerge, ao final do ciclo, um adulto alado (Matheson, 1932), como está 

ilustrado na figura 1. Machos e fêmeas alimentam‐se de néctar e sucos vegetais, porém 

estas  últimas  também  apresentam  como  hábito  alimentar  a  hematofagia,  necessária 

para a ovogênese. 

 

 

17 

 

 

 

 

 

 

 

 

adulto alado

ovos

pupa

estágios de larva

 

 

 

Figura 1: O ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti (www.ac‐reunion.fr). 

18 

1.2 Dengue e a importância epidemiológica do Aedes aegypti 

 

A  febre  amarela  e  a  dengue  podem  ser  consideradas  viroses  re‐emergentes, 

especialmente  nas  últimas  décadas.  Elas  são  transmitidas  por  mosquitos  do  gênero 

Aedes,  sendo  o  Aedes  aegypti  o  principal  transmissor  antropofílico  (WHO,  1997).  No 

Brasil,  este  é  o  único  vetor  conhecido  da  febre  amarela  urbana  e  também  é  o  único 

transmissor do dengue (Consoli & de Oliveira, 1997). A disseminação do Aedes aegypti 

em  nosso  país  se  iniciou  através  dos  navios  que  atracavam  em  portos  brasileiros, 

originando diversas epidemias, tendo sido a primeira delas reportada no século XVI, em 

Reci yfe (Schatzma r, 2000). 

A  partir  da  década  de  setenta,  a  distribuição  e  a  densidade  das  populações  do 

mosquito  expandiram‐se dramaticamente nas  áreas  tropicais  e  subtropicais de  todo o 

mundo,  especialmente em áreas urbanas  (figura 2). A  erradicação deste mosquito nas 

Américas foi alcançada no início do século XX, mas, infelizmente não foi mantida. Tanto 

pela  falta  de  recursos  em  campanhas,  quanto  pelo  crescimento  urbano  conturbado  e 

tamb m a ié  falta de s neamento básico, o Aedes aegypt  reinfestou diversos países. 

A  dengue  é  causada  por  quarto  sorotipos  virais  distintos  antigenicamente.  A 

virulência, assim como o potencial epidêmico, é variável para os diferentes sorotipos. A 

ampla  distribuição  destes,  associada  também  ao  crescimento  exacerbado  das 

populações do vetor levou não só ao aumento na prevalência da doença, como também 

de  uma  forma  mais  severa,  denominada  dengue  hemorrágica  ou  febre  hemorrágica 

(DH). Esta forma da doença, que além dos sintomas típicos como febre e dores no corpo, 

causa  lesões hemorrágicas,  hematúria  e  trombocitopenia,  sendo  fatal  em até 20% dos 

casos, em determinadas regiões (Gubler, 1998). 

 

19 

 

 

Figura 2: Distribuição mundial do vetor Aedes aegypti e das epidemias de dengue. Áreas infestadas com o mosquito Aedes aegypti (bege) e áreas com Aedes aegypti e casos epidêmicos de dengue (vermeho) (CDC – www.cdc.org – 2005). 

 

 

A prevalência global da dengue cresceu muito nos últimos tempos. Hoje essa doença 

é  endêmica  em mais  de  cem  países  na  África,  Américas,  Mediterrâneo  Leste,  Sudeste 

Asiático  e  Pacífico  Oeste  (CDC,  2008).  A  febre  amarela  também  é  considerada  uma 

importante  questão  de  saúde  pública  na  maior  parte  da  África  e  na  América  do  Sul, 

mesmo existindo uma vacina efetiva, segura e amplamente distribuída (Monath, 1994). 

Desde o século XVIII até meados do século XX, as epidemias de dengue ocorreram 

esporadicamente nas Américas. Entretanto, esta doença tem se tornado endêmica desde 

1970. Desde a introdução, na década de 90, do sorotipo 3 do vírus na América Central, a 

doença  vem  crescendo  assustadoramente.  A  cada  década  os  casos  de  dengue,  e 

infelizmente também os da febre hemorrágica, crescem de uma média de 50.000 por ano 

em 1

970 para 200.000 em 1990 (figura 3). 

Segundo a Organização Mundial de Saúde, casos de dengue já foram registrados em 

mais de cem países, infectando cerca de 50 milhões de pessoas por ano. No Brasil, quase 

20 

400.000 casos de dengue  foram reportados no ano de 2001. Em 2007, mais de 60.000 

casos  foram  notificados  oficialmente  somente  no  Município  do  Rio  de  Janeiro, 

caracterizando mais um surto epidêmico (SINAN‐RJ, 2007). 

Uma  vacina  contra  a  dengue  ainda não  está disponível  ao  público. Desta  forma,  a 

estratégia  mais  eficaz  para  reduzir  a  disseminação  desta  doença  é  o  controle  das 

populações do mosquito  transmissor. A  sua  capacidade de  transmitir  parasitos de um 

hospedeiro  vertebrado  para  outro,  depende  do  hábito  de  alimentar‐se  de  sangue.  É 

desta  forma  que  as  fêmeas  obtém  os  nutrientes  necessários  para  a  ovogênese  e, 

consequentemente, para a manutenção da espécie. Assim, durante o repasto sanguíneo 

elas  podem  inocular  no  hospedeiro  vertebrado,  o  homem,  patógenos  adquiridos  em 

alimentações  anteriores  (Schoepp,  e  cols.,  1990).  Considerando  a  importância 

epidemiológica  deste  mosquito,  conhecer  mais  profundamente  os  processos 

relacionados  à  sua  fisiologia  pode  gerar  importantes  ferramentas  para  o 

desenvolvimento de estratégias de controle populacional. 

 

 

 

 

 

 

 

 

21 

ano

Núm

ero

de c

asos

repo

rtado

s

 

A

B

Figura 3: Crescimento dos casos de dengue (A) e DH (B) nas Américas entre 1980 e 2007 (CDC ‐ www.cdc.org; PAHO ‐ Nov. 30, 2007). 

 

22 

plexos “tenase”, protrombinase e fator tecidual/FVIIa (Champagne, 2004). 

O canal digestivo dos insetos é formado por uma camada de epitélio simples, com a 

lâmina  basal  voltada  para  a  hemocele.  Em  mosquitos,  este  canal  é  dividido  em  três 

regiões:  intestino  anterior,  associado  à  ingestão,  condução  e  estoque  do  alimento, 

especialmente  do  néctar;  intestino  médio,  responsável  pela  digestão  e  absorção;  

1.3 A hematofagia e a digestão do sangue 

 

O  hábito  de  alimentar‐se  de  sangue  aparece  em  diferentes  grupos  taxonômicos, 

como  mamíferos,  artrópodes  e  helmintos  (Lehane,  1991).  Utilizar  uma  fonte  de 

nutrientes  tão  rica  como  o  sangue,  representa  também  uma  série  de  desafios,  que 

começam por encontrar a presa. Fêmeas de mosquitos zoofílicos, geralmente possuem 

receptores  para  CO2  e  octenol,  liberados  pela  respiração  e  em  fluidos  corpóreos.  Por 

outro  lado, os mosquitos antropofílicos respondem ao ácido  lático e outros compostos 

presentes  no  suor  (Torres‐Estrada & Rodriguez,  2003). Nas  antenas  de Aedes aegypti, 

por exemplo, já foram identificados receptores para o lactato (Ribeiro, 1996). 

Mais  adiante  está  o  desafio  de  encontrar  o  sistema  vascular,  e  durante  a 

alimentação,  neutralizar  os  mecanismos  de  agregação  plaquetária,  coagulação  e 

vasoconstrição (Stark & James, 1996). Para assegurar a fluidez do sangue necessária, a 

saliva  de  artrópodes  hematófagos  abriga  vários  componentes  anti‐hemostáticos.  Estas 

moléculas incluem peptídeos com ação vasodilatadora, como maxadilan (Lerner e cols., 

1991) e prostaglandinas  (Ribeiro e cols., 1992).  Já  inibidores da agregação plaquetária 

incluem óxido nítrico, apirases, moléculas que sequestram ADP e uma série de peptídeos 

e proteínas que  interagem especificamente com  integrinas  (Francischetti e cols.,  2000; 

Champagne, 2004). Anticoagulantes abrangem uma grande variedade de inibidores que 

interagem  com  a  trombina  e  fator  Xa,  assim  como  proteínas  que  interrompem  os 

com

23 

intestino  posterior,  envolvido  na  excreção  e  eliminação  de  material  não  digerido;  e, 

finalmente,  túbulos  de  Malpighi  (Romoser,  1996).  O  intestino  médio,  de  origem 

endodérmica,  não  é  recoberto  por  cutícula.  Porém,  na  grande  maioria  dos  insetos,  é 

revestido por uma estrutura acelular, composta por quitina, proteoglicanos e proteínas, 

chamada  matriz  peritrófica  (PM),  que  envolve  o  alimento,  separando‐o  do  epitélio 

(Petters,  1992).  A matriz  peritrófica  representa  uma  importante  defesa  para  o  inseto, 

contra agentes químicos,  físicos e biológicos (Richards & Richards, 1977; Peters, 1992; 

Abedi  &  Brown,  1962).  Esta  estrutura  não  está  apenas  associada  ao  processo  de 

digestão, mas  aos  ciclos  de  invasão  e  transmissão de muitos  agentes  patogênicos,  dos 

quais  os  insetos  são  vetores  (Berner  e  cols.,  1983;  Tellan,  1996).  A  variação  na 

refratoriedade  tem  sido  bastante  relacionada  às  diferenças  no  tempo  de  formação, 

maturidade e espessura da matriz peritrófica (Billingsley & Rudin, 1992; Shahabuddin e 

cols.,  1995).  Foi  também  descrito,  em Aedes  aegypti,  o  papel  da matriz  peritrófica  na 

detoxificação do heme (Pascoa e cols., 2002), através da sua  ligação à uma proteína do 

tipo  D p cmucina ( even ort e  ols., 2006). 

Existem  dois  tipos  de  matrizes  peritróficas  que  diferem,  basicamente,  na 

composição  química,  espessura  e  secreção.  Diferentes  tipos  de  matrizes  podem  ser 

produzidos  nos  diversos  estágios  do  desenvolvimento,  assim  como  ocorre  nos 

mosquitos. As fêmeas adultas sintetizam uma matriz mais espessa, que é secretada por 

células  ao  longo  do  epitélio  intestinal,  em  resposta  à  ingestão  de  alimento  (Petters, 

1992). Uma ilustração esquemática é mostrada na figura 4. 

 

 

 

 

24 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura  4: Matriz  peritrófica  de  A.  aegypti  (Fonte:  Biology  of  Disease  Vectors,  capítulo  19, página 321). 

 

 

A  ingestão  de  sangue  dispara,  no  trato  intestinal  destes  organismos,  inúmeros 

eventos, que resultam, em última análise, na disponibilização dos nutrientes necessários 

para a ovogênese. O grande aumento na atividade proteolítica é um fenômeno bastante 

importante  neste  contexto  (Noriega  &  Wells,  1999;  Lu  e  cols.,  2006).  Algumas 

modificações expressivas se traduzem em reestruturação morfológica já evidenciada no 

trato  digestivo  de  algumas  espécies  de  mosquitos  como  Culex  quinquefasciatus  e 

Anopheles gambiae (Okuda e cols., 2007; Sodja e cols., 2007). 

Aminopeptidases,  carboxipeptidases  (exopeptidases)  e  tripsinas  (endopeptidaes) 

participam da digestão em Aedes aegypti (Edwards e cols., 2000; Noriega & Wells, 1999; 

Noriega e cols., 2002). A proteólise maciça é dividida em duas fases, marcadas por duas 

diferentes tripsinas. As primeiras horas após a alimentação é marcada pela presença de 

pequenas quantidades de uma tripsina precoce. A expressão desta enzima é regulada na 

transcrição,  que  ocorre  após  a  emergência  do  adulto,  e  é  controlada  pelo  hormônio 

juvenil.  Os  transcritos,  porém,  somente  são  traduzidos  em  resposta  ao  aumento  no 

intestino anterior

intestino médio

PM

intestino posterior

25 

“pool” de aminoácidos do intestino médio (Noriega, e cols., 1999; Noriega, e cols., 2001). 

Já a segunda fase da digestão, que ocorre entre 8 e 36 horas após alimentação, é marcada 

pela  presença  de  grandes  quantidades  da  tripsina  tardia,  cuja  expressão  é 

transcricionalmente regulada. Este é a principal responsável pela digestão das proteínas 

sanguíneas, evento que  tem um ponto máximo entre 8 e 36 h após a alimentação com 

sangue  (Noriega  &  Wells,  1999;  Lu  e  cols.,  2006).  A  quantidade  e  a  fonte  protéica 

ingerida  também  parecem  ser  importantes  na  regulação  da  expressão  desta  enzima 

(Noriega, e cols., 1994). 

Com a digestão da proteína sanguínea mais abundante, a hemoglobina, e a ruptura 

de  sua  cadeia  polipeptídica,  o  seu  grupamento  prostético,  heme,  é  então  liberado  no 

lúmen intestinal em concentrações extremamente elevadas. Com a diurese, posterior à 

alimentação  com  sangue,  a  concentração  desta  molécula  se  eleva  ainda  mais.  Neste 

contexto,  o  heme  propaga  a  formação  de  radicais  livres,  amplificando  a  produção  de 

espécies muito tóxicas, o que representa um grande desafio oxidativo para este tecido. 

 

26 

1.4 O heme: características químicas e papéis fisiológicos 

 

O heme é uma metaloporfirina constituída por um anel tetrapirrólico de estrutura 

rígida e planar, onde os quatro anéis pirrólicos são unidos por pontes de meteno (α, β, γ 

e δ) (Moore, 1980), como indicado na figura 5. A coordenação com metais de transição, 

capazes de variar o seu estado de oxidação, permite que as metaloporfirinas participem 

de  várias  reações  de oxiredução,  fundamentais  na  fisiologia  celular. Um bom exemplo 

são  as  reações  de  transferência  de  elétrons,  que  acontecem  durante  o  processo  de 

respiração  celular,  envolvendo  os  citocromos,  presentes  na  membrana  interna 

mitocondrial (revisto em Ponka, 1999). Na maior parte das hemeproteínas, o heme está 

coordenado pelo  ferro  a  apenas um  ligante da  cadeia polipeptídica permitindo,  assim, 

que  a  outra  coordenação  possa  ser  utilizada  na  ligação  de  outras  moléculas,  como 

acontece  com  o  oxigênio  na  hemoglobina  e  mioglobina  (Maines,  1997).  Além  destas 

funções, o heme é o grupamento prostético de diversas enzimas, como a catalase, uma 

enzima antioxidante (Lewis, 1954) e a guanilato ciclase, uma hemeproteína envolvida na 

prod

ução de GMP cíclico, um importante segundo mensageiro (Ignarro e cols., 1984). 

Apesar destes diversos papéis vitais, o heme também pode gerar efeitos deletérios. 

Quando  em  concentrações  micromolares,  o  heme  pode  participar  da  formação  de 

radicais  livres,  espécies  químicas  altamente  reativas.  Estas  espécies  reativas  podem 

promover reações de peroxidação  lipídica (Tappel, 1955) e, direta ou  indiretamente, a 

oxidação de ácidos nucléicos (Aft & Mueller, 1983), lipídeos e proteínas (Vincent e cols., 

1989).  A  alteração  estrutural  destas  moléculas,  portanto,  pode  comprometer 

severamente  as  suas  funções  biológicas.  Já  em  concentrações  milimolares,  além  da 

formação de radicais livres, por sua característica anfifílica, ele é capaz de particionar‐se 

para o interior de bicamadas fosfolipídicas, alterando a permeabilidade e a organização 

27 

de  suas  moléculas  constituintes,  podendo  em  casos  extremos,  gerar  a  lise  celular 

(Schmitt e cols., 1993).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 5: A estrutura da molécula de heme  (ferriprotoporfirina  IX). No  heme,  os  quatro anéis pirrólicos estão unidos por pontes meteno α, β, γ  e δ. Ao anel porfirínico resultante está ligado, por coordenação, o átomo de ferro central.  

α

β

γ

δ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

28 

1.6 Os radicais livres 

 

Radicais livres são espécies dotadas de existência independente que contém um ou 

mais  elétrons  desemparelhados.  Estas  espécies  podem  ser  geradas  de  várias  formas. 

Pela perda de um elétron por uma entidade não radicalar, pelo ganho de um elétron por 

este mesmo tipo de espécie, ou ainda por fissão homolítica, onde uma ligação covalente 

é  quebrada  e  o  par  de  elétrons  compartilhados  é  separado  entre  os  dois  produtos 

(Halliwell  &  Gutteridge,  1999).  Estas  espécies  químicas  apresentam  alta  reatividade 

(Halliwell, 1993).  

Há radicais de nitrogênio, como o óxido nítrico (NO•) e o peroxinitrito (ONOO•), e 

radicais orgânicos como o alcoxil (RO•) e o peroxil (ROO•), entre vários outros (Halliwell 

& Gutteridge, 1999). Além destes,  existem radicais  livres derivados do oxigênio,  como 

superóxido (O2•) e hidroxil (OH•). Estes, assim como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e 

outras moléculas oxigenadas não radicalares, mas  tóxicas por sua alta reatividade, são 

denominadas espécies reativas de oxigênio ou “reactive oxygen species” (ROS).  

Diversos  trabalhos  vem  associando  a  geração  destas  espécies  com  respostas  a 

estresse,  apoptose,  envelhecimento  e  morte.  O  balanço  de  ROS  é  um  dos  fatores 

importantes  na  manutenção  das  vias  de  crescimento  celular  que  podem  incorporar 

proliferação, apoptose e senescência. Os níveis  intracelulares de ROS são influenciados 

por  um  grande  número  de  estímulos  endógenos,  como  citocinas,  e  agentes  exógenos, 

como  carcinógenos  físicos  e  químicos,  e  são  controlados  por  diversas  enzimas 

antioxidantes.  O  equilíbrio  redox  ou  os  níveis  de  ROS  podem  alterar  cascatas  de 

transdução de sinal e induzir mudanças em fatores de transcrição que mediam respostas 

celulares a estresse (revisado em Adler e cols., 1999). 

29 

Por outro  lado, ROS são produzidas em condições  fisiológicas normais,  através de 

diversos  processos,  nos  organismos  aeróbios.  Na  respiração  celular,  a  redução 

incompleta  do  oxigênio  à  água  pode  gerar  radicais  superóxido  e  hidroxil  (Halliwell  & 

Gutteridge,  1999).  Em  macrófagos,  ROS  modulam  funções  celulares,  tanto 

desempenhando  um  papel  de  segundo  mensageiro  como,  em  baixas  concentrações, 

ativando vias de sinalização, que resultam em diversas respostas fisiológicas, tais como 

proliferação  celular,  expressão  gênica  e  apoptose  (Forman  &  Torres,  2001).  Algumas 

células produzem peróxido de hidrogênio e o utilizam como segundo mensageiro para 

transdução  e  amplificação  de  sinal  (Bae  e  cols.,  1997;  Mahadev  e  cols.,  2001).  Foi 

proposto recentemente também que esta mesma molécula promove ativação linfocitária 

(Reth, 2002). Observou‐se inicialmente que a ativação de neutrófilos resulta no aumento 

maciço do consumo de oxigênio não mitocondrial, por um processo denominado “burst” 

oxidativo,  como  um  efetivo  mecanismo  de  destruição  de  patógenos  invasores.  Mais 

tarde,  estas  observações  foram  relacionadas  à  presença  de  uma  NADPH  oxidase 

fagocítica, também expressa em eosinófilos e macrófagos. Esta enzima gera superóxido 

tran ferindo elétrons do NADPH ao oxigênio (revisado por Babior,1999). s

 

 

30 

cies.  

É  importante  considerar  ainda que  a  toxicidade  associada  ao heme pode  também 

estar relacionada à sua capacidade de amplificar a formação de radicais livres, na cadeia 

de  peroxidação  lipídica,  iniciada  por  espécies  radicalares  originadas  de  outros 

1.7 O papel do heme na formação de radicais livres 

 

O heme pode participar da propagação de radicais livres através do átomo de ferro 

central,  exercendo  assim,  um  papel  pró‐oxidante  (Tappel,  1955;  Gutteridge  &  Smith, 

1988).  Na  maioria  das  vezes,  os  efeitos  deletérios  do  heme  tem  sido  relacionados  a 

reações de peroxidação  lipídica que, além dos peróxidos orgânicos, produzem radicais 

de  grande  toxicidade.  Alguns  estudos  já  demonstraram  que  os  radicais  livres  gerados 

pelo heme podem promover a oxidação de lipídios, proteínas e DNA (Tappel, 1955; Aft & 

Mueller, 1983).  

Os  efeitos  pró‐oxidantes  do  heme  livre  e  hemeproteínas,  pode  ser  atribuído,  em 

parte,  à  formação  de  estados  hipervalentes  no  ferro  central.  A  oxidação  de 

oxihemoglobina, com peróxido de hidrogênio, produz este estado de oxidação do átomo 

de fe a olécula derro presente n  m  heme da hemoglobina (Giulivi & Davies, 1990). 

A  degradação  do  heme  pode  liberar  o  átomo  central  de  ferro,  que  assim  como 

outros metais  de  transição,  pode  gerar  espécies  radicalares  altamente  reativas  (figura 

6).  Como  acontece  na  reação  de  Fenton,  onde  o  Fe+2  reduz  o  peróxido  de  hidrogênio 

gerando  o  radical  hidroxil  (OH•).  O  heme  pode  induzir  peroxidação  lipídica  pela 

decomposição  de  peróxidos  orgânicos,  ao  invés  do  peróxido  de  hidrogênio  –  H2O2, 

gerando radicais alcoxil (RO•) e o peroxil (ROO•) (Kalyanaraman e cols., 1983; Van der 

Zee  e  cols.,  1996).  Uma  das  características  da  formação  de  radicais  livres  é  que  as 

reações  acontecem  em  cadeia,  amplificando  e  generalizando  o  efeito  deletério  destas 

espé

31 

processos, como a formação de superóxido pela enzima NADPH oxidase e a respiração 

mitocondrial (revisado por Babior,1999; Halliwell & Gutteridge, 1999). 

 

 

 

Figura  6:  Geração  de  estresse  oxidativo  por  ferro  ligado  ao  heme  ou  livre.  Através  da reação de Fenton o ferro pode gerar radicais hidroxil (OH•), que por sua vez podem iniciar uma cadeia  de  peroxidação  lipídica  removendo  elétrons  de  outras  moléculas  como  ácidos  graxos insaturados (RH), gerando radicais alquil (R•). Por outro lado, a formação de radicais pelo heme corresponde à conversão de hidroperóxidos orgânicos de baixa reatividade (ROOH) em radicais alcoxil  (RO•)  e  peroxil  (ROO•)  extremamente  reativos  (figura  retirada  de  Graça‐Souza  e  cols., 2006). 

 

 

Diante  do  potencial  do  heme  em  participar  de  reações  de  formação  de  ROS, 

podemos  concluir  que  hematofagia  além  de  uma  rica  fonte  de  nutrientes  necessários 

para a ovogênese representou também um grande desafio oxidativo para os organismos 

ocupantes  deste  nicho  tão  peculiar.  Podemos  especular  que  diversos  mecanismos  de 

defesa  selecionados  durante  a  evolução  destes  artrópodes  hematófagos  contribuíram 

para o grande sucesso adaptativo observado nos dias de hoje. 

32 

1.8 Mecanismos de detoxificação do heme e defesas antioxidantes em artrópodes 

 

Como  resposta  ao  estresse  oxidativo  associado  ao  heme,  íons  ferro  ou  cobre,  são 

encontradas,  nos  mais  diversos  organismos,  inúmeras  defesas  antioxidantes  que 

resultam,  de  alguma  forma,  na  redução  dos  efeitos  deletérios  gerados  pelos  radicais 

livres. Elas compreendem agentes capazes de remover cataliticamente radicais  livres e 

outras espécies reativas, como as enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase; 

proteínas que minimizam a viabilidade dos pró‐oxidantes como os íons ferro e cobre e o 

heme, como as transferrinas e metalotioneínas; proteínas que sejam capazes de proteger 

biomoléculas  de  danos,  inclusive  oxidativos,  como  as  proteínas  de  choque  térmico; 

moléculas  de  baixo  peso  molecular  que  atuam  como  “scavengers”  de  radicais  livres, 

como  a  glutationa, α‐tocoferol  (vitamina  E),  bilirrubina,  ácido  úrico  e  ácido  ascórbico 

(vita a l imin  C) (Halliwe l & Gutter dge, 1999).  

Em  artrópodes,  inúmeras  enzimas  antioxidantes  já  foram  descritas,  como  por 

exemplo,  a  catalase  no  carrapato  bovino Rhipicephalus  (Boophilus) microplus  (Citelli  e 

cols.,  2007),  além  de  superóxido  dismutase  e  catalase  no  barbeiro  Rhodnius  prolixus 

(Paes  e  cols.,  2001)  e  glutationa  peroxidase  que,  neste  mesmo  inseto,  possui  grande 

atividade  na  hemolinfa  e,  portanto,  na  forma  extracelular, mas  não  intracelular,  como 

nos vertebrados (Paes & Oliveira, 1999). Artrópodes fitófagos podem adquirir na dieta 

potentes  antioxidantes,  como  tocoferol,  caroteno  e  flavonóides  (Carlson  e  cols.,  1967; 

Rothschild e cols., 1975). Massivas quantidades de urato (dez vezes maiores do que no 

plasma  humano)  foram  encontradas  na  hemolinfa  de  R.  prolixus.  A  inibição  de  sua 

síntese gerou acúmulo de produtos de peroxidação lipídica, demonstrando o seu papel 

como potente antioxidante de baixo peso molecular neste contexto (Graça‐Souza e cols., 

33 

, 1999).  

Mais  recentemente,  a  formação  de  agregados  em  estruturas  subcelulares  foi 

descrita  em Boophilus microplus.  Neste  caso,  porém,  o  heme  não  parece  participar  de 

1999). Além disso, vem sendo propostas funções antioxidantes para a matriz peritrófica 

e a trealose (Felton & Summers, 1995). 

Em artrópodes,  já  foram descritos diversos mecanismos eficientes na redução dos 

efeitos  tóxicos  associados  ao  heme.  A  ligação  desta  molécula  a  proteínas  específicas 

acarreta,  dentre outros  efeitos mediados por heme  livre,  a diminuição na peroxidação 

lipídica. Um exemplo é a proteína  ligadora de heme, RHBP, descrita e caracterizada no 

inseto Rhodnius  prolixus  (Oliveira  e  cols.,  1995;  Dansa‐Petretski,  e  cols.,  1995).  Esta  é 

abundante na hemolinfa, e tem como função o transporte de heme do aparelho digestivo 

a outros tecidos, como coração (Paiva‐Silva, 2002) e ovários (Machado e cols., 1998). A 

HeLp  (heme‐lipoproteína),  identificada  no  carrapato  Boophilus microplus,  é  capaz  de 

ligar  6  moléculas  adicionais  de  heme  além  das  2  já  presentes  em  sua  estrutura  e, 

provavelmente  tem  um  importante  papel  no  transporte  da  hemolinfa  para  os  tecidos 

(May ‐a Monteiro e cols., 2000).  

A  ligação  do  heme  à matriz  peritrófica  em Aedes aegypti,  ameniza  os  seus  efeitos 

deletérios (Pascoa e cols., 2002). Este fato é devido à sua ligação a uma proteína do tipo 

mucina (Devenport e cols., 2006). 

Um mecanismo recorrente para detoxificação do heme é a formação de cristais ou 

agregados  de  heme,  que  terminam  por  retirar  esta  molécula  de  solução,  diminuindo 

assim, a sua reatividade. Além dos parasitas do gênero Plasmodium, onde a formação de 

agregados  já  havia  sido  descrita  (Slater  &  Cerami,  1992).  O  processo  de  formação  de 

agregados de heme, conhecidos como hemozoína, foi caracterizado também no parasita 

Schistosoma mansoni (Oliveira e cols., 2000) e no hemíptero Rhodnius prolixus (Oliveira e 

cols.

34 

uma  estrutura  cristalina  ou  polimérica,  mas  de  um  agregado  compartimentalizado, 

denominado  hemossoma,  presente  nas  enormes  células  digestivas  deste  organismo 

(Lara e cols., 2003). 

Um  importante  mecanismo  na  detoxificação  do  heme  é  a  sua  degradação 

enzimática. A degradação enzimática do heme já foi descrita em diversos organismos, e 

está associada a reação catalisada pela enzima heme oxigenase, que resulta na produção 

específica do isômero alfa de biliverdina (Galbraith, 1999). 

 

35 

1

 

.9 A enzima heme oxigenase 

A  heme  oxigenase  (HO)  catalisa  o  primeiro  passo  e  também  a  etapa  limitante  da 

degradação  do  heme. A  abertura  enzimática  do  anel  porfirínico,  pelo  ataque  à  ligação 

meteno α, gera quantidades equimolares de biliverdina IXα, CO e  ferro  livre (figura 7) 

(Otterbein e cols., 2000). Para esta  reação,  são utilizadas  três moléculas de oxigênio e, 

pelo menos, sete elétrons fornecidos pelo NADPH e citocromo P450 redutase (Yoshida  e 

cols.,  1980;  Maines,  1988;  Pond  e  cols.,  1999).  Em  mamíferos,  a  biliverdina  gerada  é 

rapidamente  convertida em bilirrubina, pela  enzima  citossólica biliverdina  redutase,  e 

transportada  dos  diferentes  tecidos  até  o  parênquima  hepático,  em  associação  com  a 

albumina.  Neste  tecido,  a  hidrofóbica  bilirrubina  é  então  modificada  pela  adição  de 

resíduos  carregados,  gerando  formas  mono  e  di‐glucuronidadas,  hidrossolúveis,  que 

podem ser excretadas na bile e nas fezes (Billing e cols.,  1957). 

A reação catalisada pela HO é crucial para diversos processos, como a reutilização 

do  ferro  e  a  sinalização  celular  em mamíferos,  a  síntese de pigmentos  essenciais  para 

captação  de  luz  em  cianobactérias  e  plantas  superiores,  e  a  aquisição  de  ferro  por 

bactérias  patogênicas.  Em  todos  estes  processos,  a  heme  oxigenase  desempenha 

mecanismos semelhantes para participar de vias tão diversas (Wilks, 2002). Esta enzima 

foi,  inicialmente,  descrita  como  uma  função  oxigenase  de  uma  mistura  microssomal 

hepática  (Tenhunen  e  cols.,  1969).  Mais  tarde,  foram  identificadas  três  diferentes 

isoformas, produtos de três genes distintos (Galbraith, 1999). 

 

 

 

 

36 

 

 Figura 7: Via de degradação do heme em mamíferos. O anel porfirínico do heme é quebrado pela  enzima  heme  oxigenase  (HO)  formando  biliverdina,  CO  e  ferro.  A  biliverdina  formada  é posteriormente reduzida à bilirrubina pela biliverdina redutase (BVR) (Kirkby & Adin, 2006). 

 

 

1.9.1

 Diferentes isoformas de HO 

HO‐1  e  HO‐2  catalisam  reações  idênticas,  apesar  de  apresentarem  diferenças  nas 

estruturas  primárias,  peso  molecular,  termoestabilidade  e  afinidade  pelo  substrato 

(Ryter & Tyrrell, 2000). Estas isoformas atuam de maneiras distintas na proteção contra 

injúria tecidual. HO‐1, que tem sua expressão induzida em situações de estresse (Maines, 

1997; Galbraith, 1999), é bastante expressa em células ricas em retículo endoplasmático 

rugosos,  como  o  fígado,  pulmão  e  baço.  Nestes  órgãos,  a  degradação  do  heme  está 

envolvida com a destruição de hemácias senescentes  (Tenhunen e cols., 1970). HO‐1 é 

37 

responsiva  ao  estresse  gerado  por  radicais  livres  e  também por  hipoxia,  entre  outros 

estímulos.  A  sua  indução  protege  completamente  o  rim  isquêmico  contra  a  patologia 

tecidual,  o  que  envolve  a  rápida  inativação  do  heme,  derivado  da  desnaturação  das 

heme‐proteínas. No caso de injúrias teciduais severas, a HO‐1 é induzida e é colocalizada 

com cGMP e oncogenes pro‐apoptóticos (Maines & Panahian, 2001).  

HO‐2, por outro  lado, é expressa constitutivamente em testículos, algumas regiões 

do  cérebro,  tecido  muscular  e  endotélio  vascular  e  parece  responder  à  presença  de 

glicocorticóides  (Maines, 1997). Esta  isoforma possui  resíduos de cisteína ausentes na 

HO‐1.  Em  outras  heme‐proteínas,  como  citocromo  P450  e  óxido  nítrico  sintase,  a 

cisteína é o ligante axial para o ferro do heme seguida por uma prolina, localizadas entre 

resíduos positivamente  carregados e hidrofóbicos,  formando domínios  regulatórios de 

heme  ou  “heme  regulatory  motif”  (HRM).  As  poucas  proteínas  que  possuem  estes 

domínios tem uma função regulatória de heme/oxigênio na célula (revisado em Maines, 

2005). 

Posteriormente,  foi  descrita  a  isoforma  HO‐3.  Para  esta,  que  apresenta  baixa 

atividade  de  degradação  de  heme,  tem‐se  sugerido  uma  função  na  regulação  de 

processos  mediados  por  este  grupo  prostético.  HO‐3,  assim  como  HO‐2,  possui  dois 

ítios adicionais de ligação de heme, HRM (Galbraith, 1999; Ryter & Tyrrel, 2000). s

 

1.9.2 Atividades “HO­like” 

Enzimas com atividade heme oxigenase já foram descritas em diversos organismos, 

tais  como  Arabidopsis  thaliana,  uma  planta  (Muramoto  e  cols.,  1999)  e  em  bactérias, 

como  a  cianobactéria  Corynebacterium  diphtheriae,  causadora  da  difteria  (Schmitt, 

1997). Nestes casos, apesar da baixa similaridade na sequência primária, a conformação 

38 

tridimensional, assim como o mecanismo de catálise, parecem ser conservados (Yoshida 

& Mi t 0gi a, 200 ). 

A  heme  oxigenase  encontrada  em  Pseudomonas  aeruginosa  também  apresenta 

diferenças estruturais. Nesta, os resíduos polares, que interagem com os propionatos do 

heme  e  são  responsáveis  pelo  alinhamento  correto  desta molécula  no  sítio  catalítico, 

estão ausentes. O resultado foi a quebra das pontes de meteno δ e β, gerando biliverdina 

IX δ (70%) e biliverdina IX β (30%), e não o isômero alfa (Caignan e cols., 2002).  

Um  homólogo  de  heme  oxigenase  humana  foi  clonado  a  partir  de  cDNA  de 

Drosophila  melanogaster.  A  enzima  recombinante  foi  capaz  de  gerar,  in  vitro,  os 

isômeros de biliverdina IX δ e β, além do α. Os estudos de ressonância paramagnética de 

elétrons  ou  “electron  paramagnetic  resonance”  (EPR)  revelaram que  o  ferro  do  heme 

não está envolvido na sua  ligação à enzima. Desta  forma, os autores especularam que, 

apesar de agir como heme oxigenase, a estrutura do sítio catalítico desta enzima deve 

apresentar  algumas  diferenças  em  relação  às  HOs  até  então  descritas  (Zhang  e  cols., 

2004). 

As biliverdinas  já  foram identificadas no  tegumento, hemolinfa e ovos de diversos 

insetos.  O  isômero  α  é  característico  de  insetos  hemimetábolos,  como  Odanata, 

Plasmida,  Orthroptera  e  Mantodea.  Ao  contrário,  nas  lepidópteras  (holometábolos), 

como  a  mariposa  Manduca  sexta,  é  encontrado  o  isômero  gama  de  biliverdina, 

denominado pterobilina. Além destes, outros pigmentos derivados da fotodegradação da 

biliverdina  γ  foram  identificados.  Estes  são  denominados  neopterobilinas  e  são 

prod o a auzid s enzim tic mente nas lepidópteras (Urich, 1990). 

Nos  insetos,  as  biliverdinas  geralmente  são  encontradas  em  associação  com 

proteínas, das quais diversas  já  foram descritas,  e  são classificadas em  três grupos: as 

39 

insecticianinas, as cianoproteínas e as cromoproteínas. Estas podem ser encontradas no 

tegumento,  hemolinfa  e/ou  ovos  de  diferentes  insetos,  e  parecem  estar  associadas  à 

camuflagem (Saito, 2001). O inseto hematófago Rhodnius prolixus produz um isômero γ 

de biliverdina, modificado pela adição de duas cisteínas através dos grupamentos vinis. 

A sua produção responde positivamente ao aumento dos níveis hemolinfáticos de heme, 

e negativamente ao análogo desta molécula, a Sn‐protoporfirina IX, descrito na literatura 

omo um inibidor clássico da HO (Paiva‐Silva e cols., 2006).  c

 

1.9.3 Papéis f sioló icos assoc ados à via de degradação do heme e seus produtos 

Cada  vez  mais  os  papéis  citoprotetores  desta  via  tem  sido  reconhecidos  e 

demonstrados nos mais diferentes modelos. Sabe‐se que a presença de  íons ferro  livre 

pode gerar, em diversos sistemas biológicos, a rápida formação de espécies reativas de 

oxigênio, como os radicais hidroxil e superóxido. Assim, o papel antioxidante da reação 

catalisada pela heme oxigenase depende de mecanismos de sequestro ou transporte de 

ferro, desempenhados por enzimas como a  ferritina e a  transferrina,  respectivamente. 

As tendências pró‐oxidantes do íon ferro são rapidamente neutralizadas pela síntese da 

enzima ferritina, um sistema de estocagem celular do íon ferro (Galbraith, 1999), que já 

foi  descrito  em  diversos  organismos,  inclusive  no mosquito A.  aegypti  (Geiser  e  cols., 

2003). Neste mosquito, foi recentemente descrita uma forma secretada da cadeia pesada 

da  ferritina,  que  parece  ter  um  papel  crucial  na  proteção  contra  a  sobrecarga  do  íon 

ferro

i g i    

 decorrente da alimentação com sangue (Geiser e cols., 2006).  

Da mesma forma, os efeitos citoprotetores e os papéis regulatórios relacionados aos 

produtos  da  reação  catalisada  pela  HO  –  biliverdina/bilirrubina  e  CO  vêm  sendo 

desvendados em diversos trabalhos nas últimas duas décadas. 

40 

Como o produto  final da degradação do heme em mamíferos,  a bilirrubina  (BR) é 

geralmente  considerada  potencialmente  tóxica,  ou  seja,  um  resíduo  lipossolúvel  que 

precisa ser excretado.   

De  fato,  elevados  níveis  plasmáticos  desta  molécula  já  foram  associados  com 

doenças,  como acontece na  icterícia em neonatos,  conhecida  como  “jaundice”, onde os 

seus  altos  níveis  séricos  levam  à  deposição  cerebral  em  regiões  específicas  (Gourley, 

1997), gerando disfunção neurológica (Schenker e cols., 1966).  

Por  outro  lado,  o  papel  da  BR  como  um  importante  antioxidante  plasmático  vem 

sendo  reconhecido  (Gopinathan e  cols.,  1994).  Stocker  e  colaboradores demonstraram 

que  esta  molécula  foi  capaz  de  atuar  como  “scavenger”  de  radicais  peroxil  gerados 

quimicamente  em  soluções  e  em  lipossomas  multilamelares.  Além  disso,  esta 

característica aumentou quando as tensões de oxigênio experimentais foram reduzidas 

de  20%  (ar  normal)  para  2%  (concentração  fisiologicamente  relevante).  Estes  dados 

reforçaram o papel benéfico da BR como um antioxidante fisiológico capaz de quebrar a 

cadeia de  geração de ROS  (Stocker  e cols.,  1987). No mesmo ano,  este  grupo publicou 

dados  que  revelavam  o  papel  antioxidante  da  BR  associada  à  albumina,  sugerindo  o 

papel  antioxidante  deste  sistema  tanto  no  plasma  quanto  no  espaço  extra‐vascular 

(Stocker & Ames, 1987). Concentrações micromolares de um modelo conjugado de BR e 

biliverdina (BV) inibiram significativamente e de forma dose dependente a oxidação de 

lipossomas de  fosfatidilcolina. Ao contrário, antioxidantes hidrossolóveis como o ácido 

ascórbico e glutationa reduzida não  foram capazes de promover o mesmo efeito nesse 

sistema (Stocker & Peterhans, 1989). BR e BV se mostraram importantes “scavengers” 

de peroxinitrito, um produto extremamente tóxico e instável da interação de superóxido 

com NO (Kaur e cols., 2003). 

41 

zimas PKC (Falchuk e cols., 2002). 

O monóxido de carbono (CO) foi considerado, até pouco tempo atrás, um poluente 

tóxico  presente  no  ar,  por  conta  da  grande  afinidade  com  que  se  liga  à  hemoglobina, 

cerca  de  245  vezes  maior  que  a  o  oxigênio.  A  única  reação  que  produz  CO 

endogenamente  é  a  da  HO  (Ryter  e  cols.,    2006).  Muitos  estudos  vêm  demonstrando 

importantes  e  benéficos  efeitos  fisiológicos  relacionados  a  este  gás.  O  CO  provoca 

BR  e  BV  possuem  forte  atividade  antioxidante  voltado  para  os  radicais  peroxil, 

hidroxil  e  peróxido  de  hidrogênio.  Estes  pigmentos  contêm  um  extenso  sistema  de 

ligações duplas conjugadas e átomos de hidrogênio reativos que provavelmente contam 

para as  sua  capacidade antioxidante. De  fato, o potencial  redox do  sitema BV/BR é da 

mesma ordem de grandeza que o de NADP/NADPH, o sistema redox mais amplamente 

utilizado para transferência de elétrons em compartimentos celulares (MacLean e cols., 

2007).  Um  trabalho  recente  propõe  que  o  mecanismo  pelo  qual  a  BR  atua  como  um 

antioxidante frente ao radical peroxil em um ambiente polar, deve incluir a transferência 

de  átomo  de  hidrogênio  (de  grupamentos  N‐H),  como  acontece  nos  antioxidantes 

fenólicos, como a vitamina E. Entretanto, a transferência simples de elétrons para estas 

espé  cies radicalares não é descartada (Chepelev e cols., 2006). 

Além disso, muitos estudos vêm demonstrando que os benefícios promovidos por 

BR e BV vão além da capacidade antioxidante. Observou‐se a redução da rejeição crônica 

a transplantes de órgãos inteiros e de menor porte com a administração de BV (Ollinger 

e  cols.,  2007).  O  tratamento  de  intestinos  médios  transplantados  com  esta  mesma 

molécula  levou  à  redução  significativa  de  mediadores  inflamatórios,  infiltração  de 

leucócitos e  injúria  tecidual (Nakao e cols., 2004). Mais recentemente, a BV vem sendo 

reconhecida  como  um  importante  regulador  da  expressão  gênica,  por  ser  um  fator 

determinante para o desenvolvimento do eixo dorsal de larvas de Xenopus, por suprimir 

isoen

42 

Regulação da expressão gênica de HO­  

HO‐1  pertence  a  uma  grande  família  de  proteínas  responsivas  a  estresse,  cuja 

regulação  transcricional  responde  a  condições  ambientais  adversas.  Citocinas 

inflamatórias,  endotoxina  e  hipoxia  (Terry  e  cols.,  1998;  Carraway  e  cols.,  1998; 

Carraway e cols., 2000), bem como radiação ultravioleta A e metais pesados (Ossola & 

Tomaro, 1998; Eyssen‐Hernandez e cols., 1996) ativam a expressão de HO‐1. A presença 

de H2O2,  assim  como  a  depleção  de  GSH  (glutationa  reduzida),  eventos  associados  ao 

desbalanço  no  equilíbrio  redox  da  célula,  também  acarretam  a  indução  deste  gene 

vasodilatação, por promover  relaxamento dos músculos da vasculatura  lisa através da 

produção de cGMP pela guanilato ciclase (Ramos e cols., 1989). É também descrito que 

tanto a HO‐1 como a NO sintase (NOS) são co‐induzidas em resposta a estresse e a maior 

parte  das  evidências  indicam  que  a  HO  deve  servir  tanto  para  regular,  como  para 

continuar os efeitos da NOS em sequência à resposta inicial. Considerando que NO induz 

HO‐1 e, portanto, a produção de CO,  e que este por  sua vez,  inibe a atividade da NOS, 

acredita‐se que NO e CO parecem servir como mecanismo de “feedback”. Como o NO é 

um  vasorelaxante  e  também  um  radical  livre,  a  coordenação  entre  estas  duas  vias 

garante a contenção dos efeitos deletérios de uma molécula potencialmente tóxica com a 

manutenção das suas propriedades vasodilatadoras (Kirkby & Adin, 2006). Os efeitos do 

CO mediados por cGMP também incluem neurotransmissão (Snyder e cols., 1998; Verma 

e cols., 1993), inibição da agregação plaquetária (Brune & Ullrich, 1987), proliferação da 

musculatura  vascular lisa (Morita & Kourembanas, 1995; Morita e cols., 1997), proteção 

de células pancreáticas β de apoptose (Gunther e cols., 2002), broncodilatação (Cardell e 

cols.,  1998;  Fujita  e  cols.,  2001)  e  citoproteção,  via  inibição  da  citocromo  c  oxidase  – 

complexo IV da cadeia transportadora de elétrons (Zuckerbraun e cols., 2007). 

1.9.4 1

43 

(Lautier e cols., 1992; Oguro e cols., 1996). Da mesma forma, injúria tecidual, hemólise e 

angiogênese são exemplos onde a ativação de HO atua como um importante mecanismo 

citoprotetor a elevadas concentrações de heme (Alam e cols., 2003). Na tabela 1 a seguir 

estão  listadas algumas condições  físicas e químicas que promovem a  indução de HO‐1 

em  mamíferos.  Como  podemos  ver,  todas  elas,  de  alguma  forma,  são  relacionadas  a 

situações de estresse. 

 

TC 

abela 1: Condições que induzem expressão ou atividade de HO­1 (adaptado de Otterbein & hoi, 2000 e Ryter e cols., 2006). 

Radiação UVA Estresse por pressão de fluidos (“shear‐stress” Choque térmico Variações nas tensões de oxigênio ‐ Hipóxia 

a ‐ HiperóxiMetais pesados ‐ Arsênio  

o ‐ CádmiMetaloporfirinas ‐ Heme ‐ CoPP IX ‐ ZnPP IX ‐ SnPP IX Depleção nutricional Prostaglandinas Hormônios Endotoxina Marcadores de estado inflamatório ‐ Interleucinas ‐ TNF‐α Fatores de crescimento ‐ TGF‐β Estresse oxidativo ‐ Depleção de GSH 

s de NO idrogênio 

‐ NO e doadore‐ Peróxido de h‐ Peroxinitrito 

   

44 

os. 

Como  ilustrado na  figura 8,  os  fatores de  transcrição  responsivos  a  estresse Nrf2, 

HSF1, AP‐1 e NF‐κB regulam o gene de HO‐1. Postula‐se que este último fator faça isso, 

indiretamente,  por  meio  de  uma  proteína  ligadora  de  DNA  ainda  desconhecida  (X). 

Enzimas MAPK provavelmente controlam alguns fatores de transcrição, por fosforilação 

direta  (setas  contínua)  ou  indireta  (múltiplas  setas),  através  de  outras  proteínas  na 

cascata de sinalização. A complexidade da regulação deste gene permite a sua ativação 

sob  diferentes  estímulos  e  condições  (esfera  branca).  Consequentemente  HO‐1  é 

expressa em altos níveis, presumivelmente como parte de uma resposta adaptativa, em 

uma variedade de estados patológicos (esfera amarela). Há uma considerável regulação 

cruzada  e  recorrente  em  praticamente  todos  os  estágios  da  via  de  resposta.  Um  bom 

exemplo é o desbalanço no equilíbrio redox da célula, associado ao estresse oxidativo, 

disparado  por  mediadores  inflamatórios,  que  pode  também  levar  ao  acúmulo  de 

O vasto número de estímulos que ativam a HO‐1 refletem a presença de múltiplos 

elementos  responsivos  na  região  promotora  deste  gene,  capazes  de  ligar  fatores  de 

transcrição,  que  por  sua  vez,  são  capazes  de  interagir  com  muitos  componentes  das 

cascatas de sinalização celular. A via de sinalização MAPK foi a primeira que se observou 

ligando estímulos extracelulares com a indução por estresse da HO‐1 (Maines & Gibbs, 

2005).  A  indução  de  HO‐1,  em  mamíferos,  é  regulada  principalmente  por  dois 

“enhancers”  na  região  5’  do  gene,  conhecidos  por  E1  e  E2  (Alam  e  cols.,  1989,  1995; 

Alam,  1994)  (figura  9).  Ambas  as  regiões  contém  múltiplas  sequências  consenso  de 

reconhecimento  por  diversos  fatores  de  transcrição.  Como  exemplos,  vale  destacar  os 

elementos  responsivos  a  estresse  (StRE;  Inamdar  e  cols.,  1996)  que  correspondem 

estrutural  e  funcionalmente,  à  sequência  de  reconhecimento  pelas  proteínas  Maf 

(MARE; Kataoka e cols., 2001) e elementos de resposta antioxidante (ARE), entre muitos 

outr

45 

proteínas não corretamente enoveladas, o que também afeta a homeostase proteica da 

célula (Alam & Cook, 2006). 

 

 

 Figura 8: Regulação do gene de HO­1 por diversos fatores de trasncrição e a sua relação com diferentes estados patológicos. Abreviações: ALI,  “acute  lung  injury” –  injúria aguda do ulmão;  ARDS,  “acute  respiratory  distress  syndrome"  –  síndrome  respiratória  aguda;  MI, myocardial infarction” – infarto do miocárdio (Alam & Cook, 2006). p“   

Um dos mecanismos de regulação do gene de HO mais bem conhecidos envolve os 

ativadores transcricionais Nrf2/Maf, que formam heterodímeros. Nrf2, ou fator nuclear 

eritróide  2,  é  um  fator  de  transcrição do  tipo bZip,  que  é  sensível  ao  estado  redox da 

célula. Em condições redox normais, Nrf2 fica ligado ao seu par Keap1 que o mantém no 

citoplasma,  onde  é  degradado  via  proteassomo  (Itoh  e  cols.,  1999).  Entretanto,  a 

alteração  do  estado  redox,  gera modificações  químicas  no  Keap1,  que  se  refletem  em 

46 

mudanças conformacionais que liberam o Nrf2 para translocação nuclear e ativação de 

genes  responsivos  a  estresse,  incluindo  HO‐1.  Além  desse  refinado  mecanismo  de 

regulação, um repressor transcricional do gene de HO‐1, Bach1,  fica  ligado a múltiplos 

elementos de reconhecimento por proteínas Maf (MAREs) nos “enhancers” deste gene. 

Estudos recentes mostraram que a ligação do heme a estes repressores libera os MAREs 

para que a ativação transcricional aconteça (Sun e cols., 2002) (figura 9). 

 

 

   Figura 9:  Ligação de Maf  aos  “enhancers” de HO­1.  Membros  da  família  de  proteínas Maf podem ser parceiros de  ligação  a Bach1. Estes  repressores  impedem a  ativação  transcricional deste gene por Nrf2 e outros ativadores que possam se ligar a estas regiões. Altos níveis de heme iberam  Bach1  promovendo  a  expressão  de  HO‐1,  resultando  na  degradação  do  heme  (Sun  e ols., 2002). lc 

 

Assim,  considerando a  importância  epidemiológica do mosquito Aedes aegypti  e  o 

papel  citoprotetor  e  regulatório  da  enzima  HO,  já  elucidado  em  diversos  modelos, 

buscamos  investigar esta enzima deste  inseto. Considerando ainda que esta é uma via 

amplamente  induzida  em  situações  de  estresse  e  a  digestão  do  sangue  promove  uma 

situação  desafiadora  para  este  mosquito,  hipotetizamos  que  esta  via  poderia,  neste 

contexto, representar um importante papel protetor. 

47 

2 OBJETIVOS 

 

O objetivo principal desta  tese  foi  identificar  e  caracterizar a via a degradação do 

hem uto final e a enzima chave desta via. e no Aedes aegypti, incluindo seu prod

este derivam objetivos específicos: D

 

‐  Identificar,  purificar  e  caracterizar  estruturalmente o produto de degradação do 

heme em Aedes aegypti; 

 

 Elucidar a via de formação e excreção desta molécula; ‐

 

‐  Verificar  a  expressão  da  enzima  heme  oxigenase,  especialmente  no  epitélio 

intestinal; 

 

 Silenciar este gene no intestino médio deste inseto; ‐

 

‐ Caracterizar heme oxigenases de outros mosquitos. 

48 

3 MATERIAIS E MÉTODOS COMPLEMENTARES 

 

3.1 Os mosquitos 

A maior parte deste trabalho foi realizada com mosquitos adultos, da espécie Aedes 

aegypti,  cepa  Red,  mantidos  no  Laboratório  de  Biologia  e  Bioquímica  de  Insetos  do 

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS, UFRJ.  

Para  alguns  experimentos,  realizados  no  laboratório  do  Dr.  Anthony  A.  James, 

Universidade da Califórnia, Irvine, EUA, mosquitos das cepas Higgs e Rockfeller também 

foram utilizados.  

Ovos, larvas, pupas e adultos foram submetidos a um fotoperíodo de 12 h de claro e 

12h  de  escuro,  com  umidade  relativa  do  ar  em  torno  de  75  e  80%,  e  temperatura 

ambiente de 28 ± 1 °C. 

Para eclosão dos ovos, estes foram submetidos a vácuo por 20 minutos na presença 

de  água  filtrada  e  descansada  por  pelo  menos  12  h.  As  larvas  resultantes  eram 

transferidas para bandejas com água, tratada da mesma forma já descrita, e alimentadas 

com  ração  de  cachorro  triturada.  As  larvas  eram  re‐divididas  pelo menos  duas  vezes 

para garantir condições de crescimento ótimas e as mais homogêneas possível para toda 

a população. As pupas recém‐eclodidas eram transferidas para gaiolas, onde os adultos 

eram  mantidos  e  alimentados  com  sacarose  10%  “ad  libitum”.  Os  mosquitos  no 

laboratório do Dr. Anthony A.  James eram mantidos com uvas passas e água oferecida 

em um algodão. 

Todos os experimentos foram realizados com fêmeas de Aedes aegypti, entre 3 e 7 

dias  após  a  eclosão  dos  adultos,  que  jamais  haviam  sido  alimentadas  com  sangue 

ante iormente. r

 

49 

3.2 Ensaio de captação de um análogo do heme (ZnPP) pelo epitélio intestinal 

 

3.2.1 Alimentação artificial com ZnPP 

A solução estoque de ZnPP foi preparada em DMSO, numa concentração de 20 mM. 

Esta foi então diluída em NaOH 0,1 N para uma concentração de 10 mM e, a partir daí, 

rediluída mais uma vez, na solução contendo as proteínas em água. 

A globina foi preparada de acordo com Lara e cols., 2005 e titulada contra heme, a 

410  nm,  para  que  não  houvesse  o  risco  de  oferecermos  porfirina não  ligada. A  ZnPP‐

albumina  foi  dialisada  contra  água,  para  que  o  excesso  de  ZnPP  não  ligada  fosse 

removido. ZnPP‐globina ou ZnPP‐albumina, contendo entre 50 e 100 µM da porfirina, foi 

acrescentada  ao  plasma  ou  soro  que  recebeu  ainda  ATP  1  mM  (molécula  fago 

estimulante), para garantir a eficiência da alimentação. 

Para  obtenção  do  plasma,  o  sangue  de  coelhos  adultos  era  coletado  com  seringa 

heparinizada, centrifugado a 1.000Χg por 5 minutos para coleta do plasma, e a este foi 

acrescentado  ATP  1  mM  (molécula  fago  estimulante),  para  garantir  a  eficiência  da 

alimentação.  O  plasma  ou  soro  fetal  bovino  foram  suplementados  com  ZnPP  IX, 

Zn(I orfirI)protop ina (Porhyrin Products) associada à globina ou albumina. 

Quando  as  fêmeas  foram alimentadas  artificialmente,  a  sacarose  foi  retirada 24  h 

antes,  para  tornar  a  alimentação mais  eficiente.  As  refeições  eram  oferecidas  em  um 

alimentador artificial, com um plástico do tipo “Parafilm” bem esticado, mantido a 37 °C 

por um banho circulante. 

Vale ainda acrescentar, que o plasma que alimentava os grupos controle, era sempre 

diluído da mesma forma que aquele dos grupos teste. 

 

 

50 

3.2.2 Dissecção dos mosquitos 

Os mosquitos foram imobilizados à ‐20 oC por 2 minutos, no máximo, e transferidos 

para uma placa de petri no gelo. A dissecção foi feita sobre lâminas, em etanol 50%, com 

o au d  xílio  e pinças n° 5. 

Nos  experimentos  de  microscopia  os  tecido  foram  dissecados  em  PBS  pH  7,4 

(tampão fosfato 10 mM e NaCl 0,15 M) ou etanol 50% e estocados em formaldeído 4% 

em PBS a 4 °C. 

 

3.2.3 Microscopia de fluorescência 

Os intestinos médios, mantidos em formaldeído 4% em PBS a 4°C, foram colocadas 

em uma lâmina e levemente cobertos com uma lamínula e observadas por contraste de 

interferência diferencial utilizando um microscópio Axioplan 2 (Zeiss). As imagens de 

fluorescência foram obtidas usando uma lâmpada de mercúrio de 100 W como a fonte 

de excitação e um filtro Zeiss‐15 (BP 546nm‐12/FT 580·nm/LP 590·nm). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

51 

3.3  Caracterização  preliminar  do  gene  de  HO  nos  mosquitos  Culex 

quinquefasciatus e Anopheles gambiae** 

 

3.3.1 Extração de RNA total 

Larvas e fêmeas adultas alimentadas apenas com açúcar ou 24 h após alimentação 

com sangue de Culex quinquefasciatus e Anopheles gambiae foram utilizadas. O RNA total 

foi purificado com o reagente TRIzol  (Invitrogen), utilizando o protocolo descrito pelo 

fabricante. O RNA total purificado foi dosado por medida da absorção de luz a 260 nm. 

Aproximadamente  1  μg  de  RNA,  foi  então  tratado  com  DNase  I  (Invitrogen)  por  15 

minutos  em  temperatura  ambiente,  da  seguinte  forma:  1  μg  do RNA;  1  μl  da DNase  I 

(1U/μl); 1 μl do tampão DNase I (10X); 7 μl H2O DEPC (volume final de 9 μl). Após 30 

minutos foi acrescentado 1 μl EDTA 25 mM e as amostras foram incubadas a 65 °C por 

0 minutos para inativação da enzima. 1

  3.3.2 rtPCR (“Retro Transcribed Polymerase Chain Reaction” ou Reação em Cadeia 

da Polimerase por Transcrição Reversa) 

O rtPCR foi feito com “OneStep RT‐PCR Kit” (Qiagen). As seguintes condições foram 

utilizadas: 0,6 μM de ambos dos oligonucleotídeos iniciadores, 0,4 mM dos dNTPs, além 

do  tampão  adequado  às  condições  ótimas  das  enzimas  Trasncriptase  Reversa  e 

“HotStarTaq” DNA polimerase do Kit (com cloreto de magnésio em uma concentração de 

2,5 mM).  

 

 

** Estas etapas do trabalho foi realizada no laboratório do Dr. Anthony A.  James, Universidade da Califórnia em Irvine, EUA, sob supervisão do Dr. Osvaldo Marinotti. 

 

52 

O volume de reação foi ajustado com água MilliQ até 25μl e a reação foi efetuada no 

termociclador  “MJ  Research  PTC  100  Termal  Cycler  with  Hot  Lead”.  A  reação  foi 

realizada nas seguintes condições: 30 minutos a 50 °C, para síntese do cDNA; 15 minutos 

a  95  °C,  para  ativação  da  Taq;  2 minutos  a  94  °C;  35  ciclos  de  1 minuto  94  °C,  para 

desnaturação,  1 minuto  a 60  °C,  para  anelamento dos  iniciadores  e  1 minuto  a 72  °C, 

para extensão das fitas. Ao final do último ciclo uma etapa de extensão de 10 minutos a 

72 °C foi realizada. As sequências dos inicadores utilizados estão indicadas na tabela 2 

abaixo.  

O produto  final  da  amplificação  foi  analisado por  eletroforeses  em gel  de  agarose 

2% conforme descrito por Sambrook e cols., 1989. 

 

Tabela 2: Iniciadores para PCR de HO e RP de Culex quinquefasciatus e Anopheles gambiae.  

Espécie  Gene/orientação  Sequência (5’ – 3’) 

Culex quinquefasciatus  HO senso   GCTACGCGTGAGATTCACAA HO anti­senso    TGGGCTGGTATTTGGACTTC  RP 49 sens   o CTTCAAGGGCCAGTACCTGA 

RP 49 anti­senso   GCGATCTCGGCACAGTAGAC   Anopheles gambiae  HO senso   TGAGCAGGACCTTCGCTACT   

HO anti­senso    CGTCCGGATAATGGTGTTGT    RP 49 senso   GCCGAAGATTGTGAAGAAGC  

RP 49 anti­senso   CTTCGAACCGTAACCGATGT    

 

 

 

 

 

 

53 

3.4 5’ e 3’RACE da HO de Culex quinquefasciatus** 

Utilizamos o “BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit” (Clontech) para fazer 5’ e 

3’RACE do gene de HO de Culex quinquefasciatus. O RNA  total  foi extraído  com TRIzol 

(Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante.  

Segundo  este  protocolo,  foram  sintetizadas  duas  populações  separadas  de  cDNA 

para 5’ e 3’RACE. O cDNA para 5'RACE foi sintetizado utilizando um oligo dT modificado 

e o “SMART II A Oligonucleotide”. A modificação neste oligo dT corresponde à presença 

de  dois  nucleotídeos  degenerados  na  porção  3’,  permitindo  que  o  iniciador  anele  no 

início  da  cauda  poli‐A,  eliminando  a  heterogeneidade  gerada  por  um  oligo  dT 

convencional.  Quando  a  transcriptase  reversa  deste  kit  alcança  a  porção  5’  do mRNA 

alvo,  ela  adiciona  alguns  resíduos  dC.  O  “SMART  II  A  Oligonucleotide”  (5'–

AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3')  anela  nesta  cauda  servindo  de  molde 

para  a  transcriptase  reversa.  Já  o  cDNA  para  3'RACE  foi  sintetizado  utilizando  o 

procedimento  tradicional  de  retro  transcrição.  Neste  caso,  entretanto,  é  utilizado  um 

oligo dT especial contendo uma porção do “SMART II A Oligonucleotide” na sua região 5’ 

(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN–3').  Desta  forma,  as  reações  de  PCR 

subsequentes  para  ambas  as  populações  de  cDNA  podem  ser  realizadas  com  um 

iniciador  universal  (idêntico  à  uma  região  do  “SMART  II  A  Oligonucleotide”)  em 

conjunto com iniciadores gene específicos. 

Os cDNAs foram diluídos três vezes em um tampão Tris 10 mM pH 8,5 e EDTA 1 mM 

para  um  volume  final  de  30  μl,  e  foram  estocados  a  ‐20  °C  até  a  realização  dos  PCRs 

subsequentes.   

 

** Estas etapas do trabalho foi realizada no laboratório do Dr. Anthony A.  James, Universidade da Califórnia em Irvine, EUA, sob supervisão do Dr. Osvaldo Marinotti. 

 

54 

O termociclador utilizado foi “MJ Research PTC 100 Termal Cycler with Hot Lead”. O 

primeiro PCR foi feito com um iniciador gene específico externo e o iniciador universal 

(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'),  fornecido  pelo  Kit.  Para  o  segundo  PCR 

utilizamos  um  iniciador  mais  interno  ao  primeiro  na  sequência  do  gene  de  HO  e  o 

mesmo  iniciador  universal  (tabela  3).  Os  PCRs  foram  feitos  com  30  ciclos  de  30 

segundos a 94 °C, para desnaturação, 30 segundos a 60 °C, para anelamento e 2 minutos 

a 72 °C, para extensão das  fitas. Os produtos de PCR  foram clonados no vetor pCR®4‐

TOPO  fornecido  pelo  “TOPO  TA  Cloning®  Kit”  (Invitrogen)  e  sequenciados  numa 

“Facility” da UCI (Laguan Scientific). 

 

Tabela 3: Iniciadores para RACE de HO de Culex quinquefasciatus.  

RACE  Posição/orientação  Sequência (5’ – 3’) 

3’  senso externo  GCTACGCGTGAGATTCACAA 5’  anti­senso externo  GAT CC GTTTGAGGTAATCGCAGACTT3’  senso interno  CGGAAGGACTGCTGGTATTC 5’  anti­senso interno  TGGGCTGGTATTTGGACTTC 

55 

3.5 5 o’RACE da heme  xigenase das diferentes cepas de Aedes aegypti ** 

Utilizamos o  “BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit”  (Clontech) para  fazer 5’ 

RACE  das  diferentes  cepas  de Aedes aegypti  (Red, Higgs  e  Rockefeller).  A  extração  de 

RNA dos ovos foi feita da mesma forma descrita no íntem 3.3.1 e a síntese da primeira 

fita de cDNA como descrito no íntem 3.4. O primeiro PCR foi feito com um iniciador gene 

específico  externo  (tabela  4)  e  o  iniciador  universal,  fornecido  pelo  Kit  (sequência  no 

item anterior). Inicialmente, 10 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 65 °C e 1 

minuto a 72 °C, com o decréscimo de 1 °C na temperatura de anelamento por ciclo foram 

feitos.  A  seguir,  30  ciclos  com  as  mesmas  condições,  exceto  pela  temperatura  de 

anelamento, que  foi mantida a 55  °C,  foram  feitos. Para o  segundo PCR utilizamos um 

iniciador mais  interno  (tabela 4)  e o mesmo  iniciador universal. Os PCRs  foram  feitos 

com  o mesmo  esquema  acima,  exceto  pelas  temperaturas  de  anelamento  que,  nos  10 

primeiros  ciclos  variaram  de  70  a  60  °C.  Na  segunda  rodada,  foi mantida  a  60  °C.  Os 

produtos  de  PCR  foram  clonados  no  vetor  pCR®4‐TOPO  fornecido  pelo  “TOPO  TA 

Cloning® Kit” (Invitrogen) e sequenciados numa “Facility” da UCI (Laguan Scientific). 

 

Tabela 4: Iniciadores para RACE de AaHO das diferentes cepas.  

Posição  Sequência (5’ – 3’) 

externo  TG T TTTTAATATTTGCACGGTinterno  CAAAACTTGCTTTCGCCC 

 

 

 

 

** Estas etapas do trabalho foi realizada no laboratório do Dr. Anthony A.  James, Universidade da Califórnia em Irvine, EUA, sob supervisão do Dr. Osvaldo Marinotti. 

56 

O 

Considerando  que  24  h  após  a  alimentação  no  galináceo  infectado  o  epitélio 

intestinal já é invadido pelos oocinetos, as fêmeas foram dissecadas neste momento da 

digestão,  conforme  descrito  no  ítem  3.2.2,  e  o  RNA  total  dos  epitélios  intestinais  foi 

extraído  conforme  o  item  3.3.1.  A  medida  de  expressão  relativa  de  AaHO  (heme 

3.6 Efeito da infecção por Plasmodium galinaceum na expressão relativa da AaHO 

 

3.6.1  Alimentação  dos mosquitos  nos  hospedeiros  infectados  e manutenção  do 

ciclo 

O ciclo de infecção foi mantido de mosquitos infectados para galináceos. Mosquitos 

das cepas Red, Higgs e Rockfeler foram utilizados nestes experimentos. Uma alíquota de 

sangue congelado de uma ave  infectada por Plasmodium gallinaceum  foi  inoculada em 

galináceos "White Leghorn (Spafas)” jovens (4 a 6 semanas) para estabelecer a infecção. 

A  partir  daí  o  ciclo  foi  mantido  pela  alimentação  dos  mosquitos  com  estas  aves 

infectadas. A parasitemia foi monitorada a partir do sexto dia e quando alcançava entre 

2 e 10% os mosquitos se alimentavam nestas aves para garantir 100% de infecção. Após 

cerca  de  10  dias  estes  mosquitos  picavam  novos  galináceos  e  assim  por  diante.  As 

fêmeas  de  Aedes  aegypti  foram  mantidas  em  jejum  por  algumas  horas  antes  da 

alimentação com sangue. Um grupo de pelo menos 20 mosquitos foram mantidos até o 

15 dia após infecção. Os intestinos médios foram dissecados e o número de oocistos foi 

contado  para  verificar  o  percentual  de  infecção.  Os  mosquitos  controle  foram 

alimentados com hospedeiros vertebrados não  infectados da mesma  idade e mantidos 

sob as mesmas condições que os doentes. 

 

3.6.2 Dissecção dos mosquitos, extração do RNA e medida de expressão relativa de 

AaH

57 

oxigenase  de  A.  aegypti)  foi  realizada  de  acordo  com  os  procedimentos  descritos  no 

apêndice 2. Os experimentos foram realizados com dois ou três grupos de 10 mosquitos 

por condição, e uma vez para cada cepa. 

 

58 

3.7 Efeito de CoPP sobre a expressão relativa da AaHO 

 

3.7.1 Alimentação dos mosquitos 

As  fêmeas  foram  mantidas  em  jejum  por  24  h,  para  tornar  a  alimentação  mais 

eficiente. As refeições foram oferecidas em um alimentador artificial, com um plástico do 

tipo “Parafilm” bem esticado, mantido a 37 °C por um banho circulante. 

A Co(III)protoporfirina IX (Porphyrin Products) (CoPP) foi solubilizada em 1/5 do 

volume final de NaOH 0,1 N e 4/5 do volume de tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 e NaCl 0,15 

M para  concentração  de  5 mM. O  sangue  de  coelhos  adultos  foi  coletado  com  seringa 

heparinizada.  Este  foi misturado  com CoPP para  uma  concentração  final  de  2,5 mM e 

ainda  recebeu  a  adição  de  1 mM de ATP  (molécula  fago  estimulante),  para  garantir  a 

eficiência da alimentação. Vale ainda acrescentar que o sangue que alimentou os grupos 

controle, foi diluído da mesma forma que aquele dos grupos teste. 

 

3.7.2 Dissecção dos mosquitos, extração do RNA e medida de expressão relativa de 

AaHO 

As  fêmeas  foram  dissecadas  24  h  após  a  alimentação,  conforme  descrito  no  ítem 

3.2.2, e o RNA total dos epitélios intestinais foi extraído conforme o item 3.3.1. A medida 

de expressão relativa de AaHO (heme oxigenase de A. aegypti)  foi  realizada de acordo 

com os procedimentos descritos no apêndice 2. Os experimentos foram realizados três 

vezes independentes com dois grupos de 10 mosquitos por condição. 

59 

3.8 Silenciamento da expressão da AaHO por RNA de interferência** 

 

3.8.1 Preparação da dupla fita de RNA 

Inicialmente  um  rtPCR  como  descrito  no  item 3.4.2  foi  realizado  a  partir  de RNA 

total de Aedes aegypti  e Anopheles gambiae,  extraído de acordo com o  item 3.4.1, para 

heme  oxigenase  (HO)  e  OBP‐7  (“odorant  binding  protein”  ou  proteína  ligadora  de 

odorante),  respectivamente.  Este  produto  de  PCR  foi  utilizado  como  molde  para  a 

síntese  de  RNA  de  dupla  fita.  Para  amplificação  de  GFP  um  plasmídeo  pGLOW 

(Invitrogen)  foi  utilizado  como  molde.  As  condições  de  amplificação  e  os  iniciadores 

estão listados na tabela 5 a seguir. O termociclador utilizado foi “MJ Research PTC 100 

Termal  Cycler  with  Hot  Lead”.  Para  OBP‐7,  os  PCRs  foram  feitos  com  40  ciclos  de  5 

minutos iniciais a 94 °C; 30 segundos a 94 °C; 30 segundos a 55 °C e 1 minuto a 72 °C. 

Para HO, foram feitos 5 ciclos iniciais de 30 segundos a 94 °C; 30 segundos a 65 °C e 30 

segundos a 72 °C. A seguir mais 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C; 30 segundos a 77 °C e 

30 segundos a 72 °C, seguidos por um ciclo final de 10 minutos a 72 °C. Para GFP, foram 

feitos 5 ciclos iniciais de 30 segundos a 94 °C; 30 segundos a 75 °C e 30 segundos a 72 

°C. A seguir mais 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C; 30 segundos a 82 °C e 30 segundos a 

72 °C, seguidos por um ciclo final de 10 minutos a 72 °C. Os produtos gerados possuíam 

aproximadamente 500 bp. Os produtos de PCR foram concentrados e purificados com o 

“PCR Cleaning Kit” (QIAGEN) seguindo o protocolo recomendado e, após serem eluídos 

em água MilliQ autoclavada, estes produtos foram quantificados em espectrofotômetro 

pela absorção à 260 nm. 

 

** Estas etapas do trabalho foi realizada no laboratório do Dr. Anthony A.  James, Universidade da Califórnia em Irvine, EUA, sob supervisão do Dr. Osvaldo Marinotti. 

60 

Os  RNAs  de  dupla  fita  foram  sintetizados  com  o  Kit  “MEGAscript®”  (Ambion) 

seguindo as recomendações do fabricante utilizando 1 µg de molde por 20 µl de reação. 

Para a síntese foi feita uma incubação por 16 h a 37 °C. A seguir, os RNAs foram limpos 

com uma coluna e reagentes fornecidos pelo kit, seguindo os protocolos recomendados. 

Ao  final  deste  processo  foram  eluídos  em  água  DEPC  aquecida  e  quantificados  em 

espectrofotômetro  pela  absorção  à  260  nm.  As  concentrações  eram  ajustadas  para  1 

µg/µl  e os RNAs de dupla eram mantidos a  ‐20  °C até a  injeção, mas não por mais de 

duas semanas. 

 Tabela 5: Iniciadores para PCR mole da síntese de dupla fita de RNA.  

Gene ção/ Orienta   Sequência (5’ – 3’) 

TM (°C) 

HO senso  TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCTTTCGCCCTTTATGACAG  65 7‐7HO anti‐ senso  TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCGCTTTCGTGTGTCCTC OBP‐7 senso  TA GATACGACTCACTATAGGGTACT ATGTGTGAATATTCGAATAC 55

OBP‐7 anti‐senso T  A GATACGACTCACTATAGGGTACT CTCCAGCACTAGTAGGTGGFP senso  T  AATACGACTCACTATAGGGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGG 75‐82

GFP anti‐senso  TAATACGACTCACTATAGGGTGCCGTCCTCGATGTTGTGG  

3.8.2 s mosqu Injeção no itos 

Fêmeas de A. aegypti, entre 24 e 48 h após a emergência sofreram injeção torácica 

com seringas de vidro feitas no “Sutter Instrument Co.”, Modelo P‐2000 (feito nos EUA), 

com os seguintes parâmetros: Heat‐ 275; Fil‐ 3; Vel‐ 37; Del‐250; Pull‐125  

 

3.8.3  

 Medida dos níveis de expressão da AaHO  

Para  medida  dos  níveis  de  expressão  da  heme  oxigenase  de  A.  aegypti  (AaHO), 

rtPCRs  semi‐quantitativos  e  PCR  em  tempo  real  foram  realizados.  Este  último  foi 

realizado de acordo com a metodologia descrita no apêndice 2. O RNA total dos tecidos 

foi extraído de acordo com o  item 3.3.1. Os  tecidos dissecados  foram:  intestino médio, 

61 

ovários e resto do corpo da fêmea, antes e em diferentes tempos após a alimentação com 

sangue. Cerca de 10 indivíduos foram utilizados para cada ponto.  

O  rtPCR  semi‐quantitativo  foi  feito  com  “OneStep  RT‐PCR  Kit”  (Qiagen)  com  as 

seguintes  condições  foram  utilizadas:  0,6  μM  de  ambos  dos  oligonucleotídeos 

iniciadores,  0,4  mM  dos  dNTPs,  além  do  tampão  adequado  às  condições  ótimas  das 

enzimas Trasncriptase Reversa e “HotStarTaq” DNA polimerase do Kit (com cloreto de 

magnésio em uma concentração de 2,5 mM). O volume de reação foi ajustado com água 

milliQ até 25 μl e a reação foi efetuada no termociclador “MJ Research PTC 100 Termal 

Cycler with Hot Lead”. A reação foi realizada nas seguintes condições: 30 minutos a 50 

°C, para síntese do cDNA; 15 minutos a 95 °C, para ativação da Taq; 2 minutos a 94 °C; 

ciclos de 30 segundos a 94 °C, para desnaturação, 30 segundos a 60 °C, para anelamento 

dos  oligonucleotídeos  e  30  segundos  a  72  °C,  para  extensão  das  fitas.  Os  inicadores 

utilizados foram os mesmos desenhados para PCR em tempo real, que constam no item 

materiais  e métodos  do  apêndice  2.  Os  ciclos  correspondentes  à  amplificação  na  fase 

logarítmica  (antes  da  fase  estacionária)  foram  determinados  para  os  genes  de  HO  e 

RP49 e  correspondiam,  respectivamente,  a 33 e 27 ciclos. Um volume de 5 µl de  cada 

reação com 1 µl de tampão de amostra foi analisado por eletroforeses em gel de agarose 

% conforme descrito por Sambrook e cols., 1989. 2

 

3.8.4   Medida da oviposição

Cerca de 15 fêmeas foram  injetadas com 1 µg de dupla fita de RNA por mosquito e 3 dias 

após  a  injeção  foram  alimentadas  com  sangue  e  separadas  em  gaiolas  individuais.  Três  dias 

depois, um recipiente com água foi colocado em cada gaiola e 3 dias depois o número de ovos foi 

contado. 

62 

 Preparação do padrão de biliverdina alfa e quantificação da AaBV 

A solução estoque de biliverdina  IXα  (Porhyrin Products) 1 mM  foi preparada em 

DMSO.  Uma  curva  padrão  foi  construída  a  partir  da  leitura  a  680  nm  de  soluções  de 

concentração conhecida. A absorção de luz da amostra foi medida em espectrofotômetro 

GBC  UV/VIS  920.  A  partir  desta  curva  a  concentração  das  soluções  de  AaBV  foram 

determinadas. 

3.9 Ensaios para testar a capacidade antioxidante da AaBV  

 

3.9.1   HPL A purificação do pigmento de A. aegypti por  C 

Intestinos  médios  de  fêmeas  dissecados  após  a  alimentação  com  sangue  foram 

homogeneizados em PBS pH 7,4 (tampão fosfato 10 mM e NaCl 0,15 M) e centrifugados 

por  15  minutos  a  12.000Χg.  Os  sobrenadantes  foram  secos  em  “speed‐vac”  e 

armazenados a ‐20 °C até a análise. 

Imediatamente antes das análises, as amostras foram ressuspensas em acetonitrila 

25%  e  ácido  trifluoracético  0,05%.  A  purificação  do  pigmento  foi  realizada  por 

cromatografia  em  fase  reversa  de  alta  performance  (HPLC),  utilizando  a  coluna 

Shimadzu ODS C18. As amostras foram eluídas com um gradiente de acetonitrila de 5 a 

80% em ácido trifluoracético 0,05% (10 minutos apenas em 5% de acetonitrila, de 10 a 

50 minutos foi feito o gradiente de 5 a 80% de acetonitrila e, finalmente, 20 minutos em 

80% de  acetonitrila),  em um  fluxo  de  0,4ml  por minuto.  A  eluição  foi monitorada  em 

diversos comprimentos de onda por um detector tipo “diodearray” (modelo SPD M10A). 

Os  picos  com  espectro  de  absorção  de  luz  e  tempo  de  eluição  correspondentes  à 

bilivedina de A. aegypti  (AaBV)  foram coletados manualmente,  secos em “speed vac” e 

armazenados a ‐20 °C ao abrigo da luz. 

 

3.9.2

63 

3.9.3 Medida da atividade antioxidante por proteção da oxidação da B­ficoeritrina 

O estoque de B‐ficoeritrina (Sigma) (B‐PE) foi preparado em acetato de amônio 0,01 

M pH 5,0 para uma concentração de 2,08 x 10‐6 M e mantida sob proteção da luz a 4 °C. O 

tampão utilizado neste ensaio foi o tampão fosfato de sódio e potássio 0,075 M, pH 7,0, 

com ou sem a adição de DMSO para uma concentração final de 0,5%.  

Os ensaios com a biliverdina alfa foram feitos no tampão contendo DMSO, para que 

esta  molécula  fosse  mantida  em  solução.  Tanto  o  controle  como  a  AaBV  foram 

subm te idos à mesma condição. 

A  solução  de  ABAP  (2,2'‐azobis  (2‐amidinopropano)  dihidroclorado)  40mM  foi 

preparada fresca em tampão fosfato de sódio e potássio 0,075 M, pH 7,0. Os estoques de 

Trolox e Ácido ascórbico (Sigma) também foram preparados no momento da realização 

do ensaio, em água numa concentração de 1 mM. A AaBV foi diluída em água e teve a sua 

concentração medida de acordo com o item 3.7.2 desta seção. 

A fluorescência foi monitorada num fluorímetro “VARIAN Cary Eclipse Fluorescence 

Spectrophotometer”, com excitação a 540 nm (slit 10 nm) e emissão 565 nm (slit 5 nm). 

O  volume  do  ensaio  foi  de  1  mL.  A  concentração  final  de  B‐PE  foi  1,65  x  10‐8  M.  As 

medidas  em  cada  condição  foram  feitas  por  60  minutos  e  os  valores  de  emissão  de 

fluorescência  foram  transformados  em  percentual  de  fluorescência  da  B‐PE.  As 

concentrações  finais  das moléculas  de  antioxidantes  estão  indicadas  nas  legendas  das 

figuras com os resultados. Os experimentos foram realizados duas vezes independentes. 

 

 

 

 

64 

o descritos na legenda da figura. 

As  amostras  foram  separadas  por  eletroforese  desnaturante  (SDS‐PAGE 15%).  As 

proteínas  foram  então  transferidas  para  uma membrana  de  PVDF  em  “Trans  Blot  SD 

Semi  Dry  Transfer  Cell  (Bio‐Rad)”  por  90 minutos  a  190 mA.  Após  a  transferência,  a 

membrana foi rinsada rapidamente em água MilliQ e incubada por 30 minutos em DNPH 

(2,4‐dinitrofenilhidrazina) 0,1 mg/ml preparado em HCl 2 N, com agitação orbital leve e 

proteção da luz. A seguir a membrana foi submetida a três lavagens de 5 minutos em HCl 

2 N e cinco lavagens de 5 minutos em Metanol 100%. Ao final deste ciclo de lavagens, a 

membrana foi rinsada em PBS pH 7,4 e submetida à “western blot”. 

3.9.4  Medida  da  capacidade  antioxidante  por  imunodetecção  de  proteínas 

carboniladas 

Cerca  de  60  intestinos  médios  de  fêmeas  alimentadas  apenas  com  solução  de 

sacarose foram dissecados em PBS pH 7,4, coletados no gelo em coquetel de inibidores 

de p tro eases (Sigma) e homogenizados em “potter” de vidro.  

A  solução  estoque  de  hemina  (Sigma)  foi  preparada  em  1/5  do  volume  final  de 

NaOH  0,1  N  e  4/5  do  volume  de  tampão  fosfato  0,1  M  pH  7,4  e  NaCl  0,15  M  para 

concentração de 1 mM. tert‐butilhidroperóxido (Sigma) (t‐BOOH) 10 mM foi preparado 

em água. Os estoques de Trolox e Biliverdina alfa foram preparados como no ítem 3.7.3 

desta seção. Todas as soluções foram preparadas no momento do ensaio.  

Um volume correspondente a 2 epitélios foi incubado com 500 µM de t‐BOOH e 100 

µM  de  heme,  como  sistema  gerador  de  radicais  livres.  Os  antioxidantes  foram 

adicionados ao meio  reacional para concentração  final de 25 e 100 µM. As  incubações 

foram feitas em tampão PBS pH 7,4, por 60 minutos a 37 °C. Estas eram interrompidas 

pela adição de 1 µl de BHT 50 mg/ml e tampão de amostra com SDS. As amostras foram 

fervidas e estocadas a ‐20 °C até a realização do “western blot”. Os controles utilizados 

estã

65 

O bloqueio da membrana foi feito com uma solução de leite desnatado em pó Molico 

5%  preparada  em  TBS  com  0,1%  de  Tween  20  a  4  °C  durante  a  noite.  Na  manhã 

seguinte,  três  lavagens  de  cinco  minutos  com  TBS  com  0,1%  de  Tween  20  foram 

realizadas. A membrana  foi  incubada  com um anticorpo  primário  policlonal  (anti‐2,4‐

dinitrofenilhidrazona, um derivado da conjugação do DNPH às carbonilas das proteínas 

oxidadas), diluído em TBS com 0,1% de Tween 20, na proporção de 1:5.000, por 2 horas. 

Três  lavagens  de  dez  minutos  com  TBS  com  0,1%  de  Tween  20  foram  realizadas.  A 

seguir,  a  membrana  foi  incubada  com  um  anticorpo  secundário  (anti‐IgG  de  coelho), 

diluído  em  TBS  com  0,1%  de  Tween  20,  na  porporção  de  1:10.000,  por  1  hora.  Três 

lavagens de dez minutos com TBS com 0,1% de Tween 20 foram realizadas, seguida por 

uma  com apenas TBS. A  seguir  a membrana  foi  submetida  à  revelação  com o Kit  ECL 

(Amershan), conforme protocolo sugerido pelo fabricante. 

66 

4 RESULTADOS 

 

Se por um lado, o heme desempenha importantes papéis fisiológicos, assim como o 

transporte de oxigênio e a transdução de sinal (Ponka, 1999), em contrapartida, quando 

livre em solução, é um potente gerador de radicais livres. Liberado da estrutura protéica 

da hemoglobina, o heme passa a forma livre em solução no lúmen intestinal dos insetos 

hematófagos, como resultado da digestão. A liberação de grandes e tóxicas quantidades 

de  heme  gera,  no  aparelho  digestivo  destes  organismos,  um  grande  desafio  oxidativo. 

Esta  molécula,  pode  participar  de  reações  de  peroxidação  lipídica,  desencadeando  e 

propagando  a  formação  de  radicais  livres.  Estas  espécies  podem  comprometer  a 

estrutura e a função de inúmeras moléculas, gerando diversos danos aos componentes 

celulares.  Assim,  ao  longo  de  sua  evolução,  os  organismos  que  vem  ocupando  com 

sucesso este desafiador nicho, sofreram uma pressão natural que resultou, na seleção de 

inúmeros mecanismos capazes de reduzir a toxicidade do heme ou de conter os efeitos 

das espécies radicalares, produzidas por ele. A sua degradação enzimática é um destes 

meios,  e  já  foi  descrita  em  inúmeros  organismos  de  diversos  reinos.  Catalisada  pela 

enzima heme oxigenase, ela  resulta na produção de um pigmento verde, a biliverdina, 

além  de  CO  e  Fe2+.  Considerando  a  importância  epidemiológica  do  mosquito  Aedes 

aegypti e o pouco conhecimento acerca do metabolismo de heme neste inseto, passamos 

a investigar este processo.  

67 

4.1 Identificação e caracterização da via de degradação do heme em Aedes aegypti 

 

Inicialmente,  e  como  pode  ser  visto  no  primeiro  manuscrito  anexado, 

caracterizamos  a  estrutura  do  produto  de  degradação  do  heme  em  A.  aegypti,  uma 

biliverdina  modificada  que  chamaremos  aqui  de  biliverdina  de  Aedes  aegypti  ou, 

simplesmente, AaBV. Este pigmento foi purificado por cromatografia de fase reversa em 

HPLC.  A  solubilidade  da  AaBV  no  lúmen  intestinal,  assim  como  a  sua  menor 

hidrofobicidade, quando comparada à biliverdina alfa por cromatografia de fase reversa, 

estão associadas a uma modificação química nesta molécula. Utilizamos espectrometria 

de  massa  por  pulverização  de  elétrons  (ESI‐MS,  electrospray  ionization  mass 

spectrometry) para caracterizarmos a sua estrutura, que corresponde a um isômero alfa 

de  biliverdina,  modificado  por  dois  resíduos  de  glutamina,  em  ligações  amídicas, 

resultando em uma biglutamil‐biliverdina (apêndice 1).  

A  quebra  enzimática  do  anel  porfirínico  corresponde  à  atividade  catalítica  da 

enzima heme oxigenase (HO), enzima expressa pelo epitélio intestinal das fêmeas de A. 

aegyti, produzindo um isômero alfa de biliverdina. Identificamos, também por ESI‐MS, o 

intermediário  modificado  pela  adição  de  apenas  uma  glutamina.  Assim,  a  via  de 

formação da biglutaminil‐biliverdina  foi elucidada, passando pela degradação do heme 

o isômero alfa que, posteriormente, recebe a adição de duas glutaminas.  n

 

68 

oléculas tóxicas. 

Nenhuma diferença marcante foi observada quando o análogo do heme foi oferecido 

em associação com globina ou albumina, sugerindo que a proteína a que a porfirina está 

4.2 Captação de um análogo do heme pelo epitélio intestinal 

 

Buscando  avaliar  in  vivo  a  dinâmica  da  captação  do  heme pelo  epitélio  intestinal, 

utilizando um análogo fluorescente, onde o ferro central é substituído por um átomo de 

zinco. Diferente  do  heme,  que  não  é  fluorescente,  alguns  de  seus  análogos  podem  ser 

importantes  traçadores,  por  serem  fluorescentes  (Lara e  cols.,  2005).  Estudos  sobre  a 

captação  de  heme  por  linhagens  celulares  intestinais  e  hepáticas  utilizaram  uma 

porfirina  onde  o  zinco  era  o  substituinte  de  uma  mesoporfirina  (onde  as  vinilas  da 

protoporfirina  são  substituídas  por  etilas)  (Worthington  e  cols.,  2001).  Vale  ainda 

acrescentar  que,  para  nos  aproximarmos  o  máximo  possível  da  condição  fisiológica, 

utilizamos a porfirina associada às proteínas globina (ZnPP‐globina) ou albumina (ZnPP‐

albumina). 

As  fêmeas  de Aedes  foram  alimentadas  com  soro  fetal  bovino  suplementado  com 

estas moléculas e os intestinos médios foram dissecados em diferentes tempos. Já em 12 

h após a alimentação, pode‐se observar intensa fluorescência nas células epiteliais com 

uma  distribuição  provavelmente  citoplasmática  (figuras  10D  e  11B),  indicando  que  o 

análogo do heme é de fato captado pelo tecido. Com o avanço da digestão, não apenas a 

intensidade da fluorescência aumenta no tecido (figuras 10F e H, 11D e F), mas também 

a distribuição citoplasmática assume uma característica pontuada, sugerindo a presença 

de  vesículas  (figura  11G).  Neste mosquito,  propomos  que  a  degradação  do  heme  é  o 

primeiro passo para a sua excreção. Assim, a presença destas vesículas pode sugerir uma 

estratégia de compartimentalização, para posterior degradação e excreção de porfirinas 

ou m

69 

conjugada  não  parece  afetar  a  sua  captação,  indicando  que  a  porfirina  é  liberada  da 

interação com a cadeia protéica antes de ser captada pelo tecido. 

Uma  cinética  com  tempos  mais  curtos  foi  feita  (figura  12),  mostrando  que  uma 

difusa  marcação  na  luz  intestinal,  observada  nas  horas  iniciais  da  digestão  (até  2  h) 

(figuras 12D e F), é substituída por uma intensa fluorescência no epitélio, como pode ser 

visto a partir de 6 h após a alimentação (figura 12H, J, K e M). Ou seja, à medida que a 

digestão se processa, a fluorescência passa do lúmen para o epitélio intestinal. Podemos 

assim concluir que o heme livre pode alcançar este tecido já nos primeiros momentos da 

digestão. 

 

 

A B

C D

E F

G H

71 

Figura  10:  Cinética  de  captação  de  ZnPP­globina  pelo  epitélio  intestinal  de  fêmeas  de Aedes aegypti observada por microscopia de fluorescência. Na coluna da esquerda (A­G) são mostradas as imagens de contraste por interferência diferencial (DIC) e na coluna da direita (B­H)  as  imagens  de  fluorescência.  São  mostradas  regiões  de  intestinos  médios  de  fêmeas alimentadas apenas com soro, dissecadas 24 h após alimentação (A e B).  Intestinos médios de êmeas alimentadas com soro suplementado com ZnPP‐globina, dissecadas 12 h (C e D), 24 h (E  F) e 48 h (G e H) após alimentação. A linha branca corresponde a 100 µm. fe 

A B

C D

E F

G

73 

Figura 11: Cinética de captação de ZnPP­albumina pelo epitélio  intestinal de  fêmeas de Aedes aegypti observada por microscopia de fluorescência. Na coluna da esquerda (A­E) são mostradas as imagens de contraste por interferência diferencial (DIC) e na coluna da direita (B­G)  as  imagens  de  fluorescência.  São  mostradas  regiões  de  intestinos  médios  de  fêmeas alimentadas com soro suplementado com ZnPP‐albumina, dissecadas 12 h (A e B), 24 h (C e D) e 48 h (E­G) após alimentação. A linha branca corresponde a 100 µm.   

A B

C D

E F

G H

I J

L M

K

75 

Figura 12: Cinética de captação de ZnPP­globina pelo epitélio intestinal de fêmeas de  Aedes  aegypti  observada  por  microscopia  de  fluorescência,  com  intervalos menores.  Na  coluna  da  esquerda  (A­L)  são  mostradas  as  imagens  de  contraste  por interferência diferencial (DIC) e na coluna da direita (B­M) as imagens de fluorescência. São mostradas regiões de intestinos médios de fêmeas alimentadas apenas com plasma, dissecadas 24 h após alimentação (A e B). Intestinos médios de fêmeas alimentadas com plasma suplementado com ZnPP‐globina, dissecadas 0 h (C e D), 2 h (E e F), 6 h (G e H), 12 h (I­K) e 24 h (L e M) após alimentação. A linha branca corresponde a 100 µm. 

76 

4.3 Caracterização da heme oxigenase de Aedes aegypti  

A  heme  oxigenase  de  A.  aegypti  foi  previamente  clonada  e  sequenciada  pelo  Dr. 

Boris Dunkov,  antes mesmo da  liberação do genoma de Aedes aegypti. A  sequência de 

ácidos nucleicos para este gene (GenBank, número de acesso AY433250) corresponde a 

uma ORF (“open reading frame” ou sequência aberta de leitura) de 702 bp cuja predição 

de  tradução  gera  um  peptídeo  de  233  aminoácidos.  Analisando  a  sequência  de 

aminoácidos  da  HO  de  Aedes  aegypti  (AaHO)  em  comparação  com  a  HO‐1  humana, 

cristalizada  em  1999  (Schuller  e  cols.,  1999),  vemos  que  muitos  resíduos  são 

conservados,  especialmente  aqueles  relacionados  à  interação  com  o  heme  (figura  1, 

apêndice 2). 

Vale ainda acrescentar que através da técnica de RACE da porção 5’ do transcrito de 

HO de diferentes  cepas  de Aedes aegypti mostramos  a  presença de  cinco  aminoácidos 

ausentes  na  sequência  depositada  no  GenBank  (número  de  acesso  AY433250)  que 

corresponde  à  cepa  Liverpool.  Esta  porção  apresenta  uma  metionina  na  primeira 

posição  em  “frame”  com o  restante  do  gene.  Entretanto,  como pode  ser  observado na 

figura 13, apenas as cepas Red e Higgs possuem esta porção adicional. Pela semelhança 

entre esta sequência e o início do gene, podemos especular que ela pode ter se originado 

de um evento de duplicação. 

 

77 

 

 

 

 

 

 

HiggsRedRockfellerLiverpool

 Figura 13: Alinhamento das sequências porção 5’ do transcrito de HO das diferentes cepas de  Aedes  aegypti.  As  setas  em  cinza  indicam  as  metioninas.  Vale  ainda  acrescentar  que  o transcrito  depositado  no  GeneBank,  corresponde  à  sequência  utilizada  neste  alinhamento referente à cepa Liverpool. 

78 

4.4 HO em outros mosquitos 

 

Com o objetivo de investigar a presença de heme oxigenases em outros dípteros de 

importância  médica,  buscamos  identificar  genes  com  homologia  a  HO  em  Culex 

quinquefasciatus,  vetor  da  filariose  e Anopheles  gambie,  um  dos  principais  vetores  da 

malária humana (CDC, 2008). No laboratório do Dr. Anthony A. James, com base em um 

“contig” gerado a partir de sequências do VectorBase de Culex quinquefasciatus, através 

da técnica de RACE, amplificamos um produto, clonamos em pCR®4 TOPO (Invitrogen) e 

sequenciamos,  confirmando, assim, a  sequência de HO para este mosquito  (figura 14). 

Também  com  base  na  HO  anotada  em  Anopheles  gambiae  (número  de  acesso 

ENSANGESTG00000003040) mostramos que ambos os mosquitos expressam este gene 

em larvas, fêmeas adultas alimentadas ou não (figura 15). 

79 

 

 

 

1 AGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCATGG S S G I N A E Y A G - Y D S L -

T G K H G

61 ATCAACGCAGAGCATTCTCACTCAGCTGATCATTGTTTTGATTTCTGCGTGGCAAGAGT I N A E H S H S A D H C F D F C V A R V 121 AACTAACGGGACCGGTTGTACGCTATTGTTTTTGAAGCGTTGCTCACAATGGCCGCCTC N - R D R L Y A I V F E A L L T M A A S 181 ACTACCACCACCGAGAAAACGGTTTCCTTTACAAAGGCGATGCGTGTGGCTACGCGTGA T T T T E K T V S F T K A M R V A T R E 241 ATTCACAACGTGAGCGATGGCTTAGTGAATGCGAAATTGGCCTTTGCTTTGTACGATAG I H N V S D G L V N A K L A F A L Y D S 301 GCGGTTTGGGCGGAAGGACTGCTGGTATTCTACGAAATTTTCAAATTTCTTGAGCAGCA A V W A E G L L V F Y E I F K F L E Q H 361 GTGGCACATGACTTCCTGCCGGAAGAGTTCCACCGAACCGAGCAGTTTGAACAGGATCT V A H D F L P E E F H R T E Q F E Q D L 421 GCCTTCTACCTGGGGGCTGATTGGAAGTCCAAATACCAGCCCAGGAAGGAAGTCTGCGA A F Y L G A D W K S K Y Q P R K E V C D 481 TACCTCAAACATCTGGAACAGATCGAGCGCGAGAATCCAAACCTGCTGGTCGCGTACGT Y L K H L E Q I E R E N P N L L V A Y V 541 TACCACCTGTACATGGGCCTGCTCTCCGGAGGACAAATTCTGCAAAAACGACGAAACAT Y H L Y M G L L S G G Q I L Q K R R N I 601 ACCCGCAAGTTTAACCCGTTTGCCACAGCCGGRGAGCCGAACCGGGGTGCGGCGTTGAC T R K F N P F A T A X E P N R G A A L T 661 ACCTTTGAGGAGCACAGCATCTTTGAGTTGAAACAAAAGATGCGTTCCAACATTGATAA T F E E H S I F E L K Q K M R S N I D K 721 TTTGGGGAGAGCCTGGACGAGGAAACGAGGCAGCAAATGATGGAGGAAAGTAGGAGGGT F G E S L D E E T R Q Q M M E E S R R V

A

T

G

T

T

G

T

T

T

G

A

T

781 TTTGAGCTCAACAATGGGATCATTCGGACGGTGCAAGGAGTTAATCGAGCCAACGTCAAG F E L N N G I I R T V Q G V N R A N V K 841 ACGCTGATTTACGTCGCGCTGTTGGTGATGATTTATTTTGTTGTGAAATATCTGTTTTTC T L I Y V A L L V M I Y F V V K Y L F F 901 TGAGAGAAAAATTCTGATTTGAAACTRAATTAGATTGTGTGATGTAGAATAAATTTTAAT E K N S D L K X N - I V - C R I N F N 961 GAGGATAAATAGACTTATATAACATAAATTAAATAAAAAAACGWCAAACWAAAAAAAAAA E D K - T Y I T - I K - K N X K X K K K 1021 AAAAAAAAAAAAAAAAA  

S

 Figura 5: HO de Culex quinquefasciatus. A sequência de nucleotídeos representa o transcrito. Abaixo estão os aminoácidos correspondentes ao peptídeo predito. S: significa “stop” códon ou códon de parada da tradução. 

80 

      

A B

HORP

1 2 3 1 2 3

  

Figura  6: HO  é  expressa por  outros mosquitos.  rtPCR  para  heme  oxigenase  em  (A)  Culex quinquefasciatus  e  (B)  Anopheles  gambiae.  1,  larvas;  2,  fêmeas  alimentadas  com  açúcar;  3, fêmeas  24  h  após  a  alimentação  com  sangue.  RP  corresponde  à  proteína  ribossomal  utilizada como controle endógeno em ambos os casos. 

81 

4.4 A digestão do sangue, a expressão da AaHO e a produção de AaBV 

 

Se  a  disponibilização  do  heme  depende  diretamente  do  curso  da  digestão,  assim 

como a sua captação pelo epitélio intestinal, é natural que a sua degradação acompanhe 

também este processo. Através de cromatografia de  fase  reversa em HPLC mostramos 

que a quantidade máxima da biglutaminil‐biliverdina (ou biliverdina de Aedes aegypti –  

AaBV)  no  lúmen  intestinal  aparece  em  torno  de  24  h  após  alimentação,  o  que 

corresponde ao período crítico da digestão sanguínea (figura 4A, apêndice 2). É também 

entre 24 e 30 h que a hemoglobina é intensamente proteolisada (figura 4C, apêndice 2). 

Com  o  avançar  da  digestão,  entretanto,  as  quantidades  do  pigmento  reduzem‐se 

seve menra te, devido a sua excreção nas fezes (figura 4B, apêndice 2). 

A  AaHO  é  expressa  nos  diferentes  estágios  de  desenvolvimento  do  mosquito  e 

também em diferentes tecidos da fêmea 24 h após a alimentação com sangue (figura 3A 

e  B,  respectivamente,  apêndice  2).  Através  de  PCR  em  tempo  real,  a  sua  expressão 

relativa  foi medida  no  intestino médio  e  ovários.  A  cinética  de  expressão  nestes  dois 

tecidos, ao longo da digestão do sangue, possui um perfil muito semelhante. Entretanto, 

a máxima indução é mais tardia nos ovários, ocorrendo cerca de 66 h após a alimentação 

(figura 5B, apêndice2), diferente da ativação no intestino médio, que acontece entre 24 e 

42  h  (figura  5A,  apêndice2).  Observamos  também  que  tanto  a  ingestão  de  apenas 

albumina bovina, como o bloqueio da digestão pela suplementação do sangue com um 

inibidor de tripsina (SBTI), ativam parcialmente a expressão deste gene, em comparação 

ao  sangue,  apontando  para  uma  regulação  múltipla  (figura  6,  apêndice2).  Estes 

resultados  sugerem  que  a  distensão  do  intestino médio  e/ou  a  dieta  protéica  podem 

ativar  a  expressão  da  AaHO.  Da mesma  forma,  a  digestão  parece  ser  necessária  para 

liberar um sinal capaz de induzir a AaHO, que talvez seja o próprio heme. Por outro lado, 

82 

a alimentação com sangue acrescido de um gerador de radicais superóxido (paraquat) 

inibe  a  AaHO  (figura  7,  apêndice2),  sugerindo  que  a  presença  de  sangue,  além  do 

superóxido,  representa  um  estímulo  adicional  e  predominante,  resultando  em  um 

padrão  de  expressão  distinto  dos  sistemas  clássicos  de  HO,  onde  a  presença  de  ROS 

induz  este  gene  (Keyse  &  Tyrrell,  1989).  Outro  indício  de  que  os  mecanismos  de 

regulação  deste  sistema  sejam  diferentes  dos  até  então  descritos,  foi  gerado  pela 

suplementação  do  sangue  com  CoPP  IX  (cobalto‐protoporfirina  IX),  um  conhecido 

ativador  transcricional  da  HO  (Smith  e  cols.,  1993).  Não  observamos  uma  mudança 

significativa  na  expressão  relativa  da  AaHO  quando  o  grupo  que  foi  alimentado  com 

sangue  suplementado  com  CoPP  foi  comparado  com  aquele  que  se  alimentou  apenas 

com sangue (figura 16), mostrando que este gene não é induzido por esta profirina. 

 

 

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

sangue sangue + CoPP (2,5 mM)

Expr

essã

o re

lativ

a de

HO

 

 Figura 16: CoPP não  induz a expressão de AaHO. Dois  grupos de 10  intestinos médios por condição  foram  dissecados  18  h  após  a  alimentação.  Este  experimento  foi  realizado  3  vezes independentes. 

83 

Já  é  amplamente  estabelecido  que  HO‐1  é  uma  enzima  de  resposta  a  estresse 

(Otterbein & Choi, 2000). Desta forma, para observar o comportamento da AaHO frente 

à  perturbação  promovida  pela  invasão  do  intestino médio,  medimos  a  sua  expressão 

durante  a  infecção  por  Plasmodium  gallinaceum,  um  modelo  de  malária  aviária. 

Entretanto, a infecção não mudou significativamente o perfil transcricional da AaHO, no 

epitélio intestinal 24 h após alimentação em um hospedeiro infectado (figura 17). 

 

 

 

0

0,5

1

1,5

2

controle infectado

Expr

essã

o re

lativ

a de

HO

 

Figura 17: A infecção com Plasmodium gallinaceum não induz a expressão de AaHO. Um ou três  grupos  de  10  intestinos médios  por  condição  foram dissecados  24  h  após  a  alimentação. Este  gráfico  é  representativo  de  experimentos  feitos  com  as  três  diferentes  cepas  de  Aedes aegypti. 

84 

4.5 Silenciamento parcial da AaHO por RNA de interferência 

 

A injeção de dupla fita de RNA (dsRNA), tem se mostrado uma ferramenta muito útil 

no  silenciamento  de  diversos  genes  em  insetos  (Terenius  e  cols.,  2007;  Schlüns  & 

Crozier, 2007). Para que pudéssemos compreender melhor o papel fisiológico da AaHO, 

estabelecemos,  em  colaboração  com  o  laboratório  do  Dr.  Anthony  A.  James,  a  injeção 

toráxica de dsRNA para AaHO alcançando níveis de silenciamento bastante significativos 

e  especificamente no  intestino médio, medidos por PCR  semi‐quantitativo  (figura 18). 

Nessa ocasião testamos alguns controles (GFP, OBP‐7 e vitelina de Anopheles gambiae) 

para que determinássemos o melhor a ser utilizado como “nonsense” dsRNA. Como pode 

ser observado pelos PCRs em tempo real (figura 19), a expressão da AaHO no intestino 

médio é  reduzida quando o  tecido é ou não é desafiado pela alimentação com sangue, 

estendendo‐se até cerca de 10 dias após a  injeção. É também importante observar que 

apenas a injeção de veículo, como também a presença de dsRNA “non sense”, induziu o 

gene de AaHO, sugerindo que o dano físico provocado pela injeção e também a presença 

de  dsRNA  podem  provocar  a  ativação  deste  gene  (figura  20).  Já  foi  observado 

anteriormente,  não  só  a  indução  de  um  gene  relacionado  à  resposta  imune  inata  em 

lepidópteras, mas também o aumento da atividade de fenoloxidase quando dsRNA para 

GFP foi injetado nestes insetos (Hirai e cols., 2004; Terenius e cols., 2007). Portanto, se 

compararmos  os  níveis  de  redução  na  expressão  de  AaHO  das  fêmeas  injetadas  com 

dsRNA controle, podemos observar que o nível de silenciamento foi ainda maior do que 

se compararmos apenas com as fêmeas não injetadas (figura 19 e 20). 

Acompanhando  a  sobrevivência  das  fêmeas  na  primeira  semana  após  a  injeção, 

observamos  que  não  há  diferença  na  mortalidade  entre  os  grupos  submetidos  às 

injeções  de  dsGFP  ou  dsHO  (dados  não  mostrados).  Da  mesma  forma,  através  dos 

85 

gráficos  de  oviposição,  percebemos  que  não  há  uma  diferença  importante  quando  os 

grupos de  fêmeas  sem  injeção  são  comparados  com as  injetadas  com dsCT  (controle  ‐ 

“non  sense”  dsRNAs)  e  dsHO  (figura  12),  sugerindo  que  o  silenciamento  da AaHO,  no 

intestino médio, não afeta significativamente a sobrevivência ou a oviposição das fêmeas 

de A. aegypti. 

86 

 

não

inje

tada

sds

GFP

dsH

Onã

oin

jeta

das

dsG

FPds

HO

não

inje

tada

sds

GFP

dsH

Onã

oin

jeta

das

dsG

FPds

HO

11 dias PI(24h PAS)

HO

RP

3 dias PI 24h PAS 48h PASnã

oin

jeta

das

dsG

FPds

HO

não

inje

tada

sds

GFP

dsH

Onã

oin

jeta

das

dsG

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HO

não

inje

tada

sds

GFP

dsH

Onã

oin

jeta

das

dsG

FPds

HO

não

inje

tada

sds

GFP

dsH

O

HORP

3 dias PI 24h PAS 48h PAS 24h PAS 48h PAS3 dias PI

A

B C

 Figura  18:  Redução  na  expressão  de  HO  por  injeção  de  dsRNA  é  tecido  específica.  O silenciamento parcial da AaHO pode ser observado apenas no (A) intestino médio, mas não nos ovários (C) e no restante do corpo (B). Foram injetadas 1 µg de dupla fita de RNA por mosquito e grupos de 10 indivíduos foram utilizados por condição (PI, pós injeção; PAS, pós alimentação com sangue).

87 

 

 

 

0

1

2

3

Exp

ress

ão re

lativ

a de

HO

não injetadasdsGFPdsHO

 

Figura  19:  A  redução  na  expressão  de HO  no  intestino médio  se mantém  ao  longo  do tempo.  Foram  injetadas  1  µg  de  dupla  fita  de  RNA  por mosquito  e  grupos  de  10  indivíduos foram utilizados por condição. Estes resultados mostram médias e desvios um de experimento típico entre dois independentes (PI, pós injeção; PAS, pós alimentação com sangue). 

88 

 

 

 

 

0

1

2

Exp

ress

ão re

la

3

4

5

tiva

de H

O non injected

PBS 1XdsOBPdsHO

não injetadas PBS 1X dsOBP dsHO

 

Figura 20: A  injeção de veículo além da  injeção de dsRNA controle ativa a expressão de AaHO no intestino médio. Foram injetadas 1 µg de dupla fita de RNA por mosquito e grupos de 10  indivíduos  foram dissecados por condição, 24 h após alimentação com sangue. Este gráfico mostra médias e desvio entre as réplicas de um experimento. 

89 

      

50

75

100

125 p

osto

s/fê

mea

ovos

25

não i

njetad

as

dseG

FPds

HO0

igura 21: A injeção de dsRNA não afeta a oviposição de fêmeas. Estes resultados mostram édias e desvios de três experimentos independentes.

Fm 

 

90 

4

 

.6 Capacidade antioxidante da AaBV 

As propriedades antioxidantes da bilirrubina (BR), produto de degradação do heme 

em  mamíferos  e  a  forma  mais  reduzida  da  biliverdina  (BV),  foi  identificada  há  pelo 

menos duas décadas por Stocker e colaboradores em 1987. Neste trabalho, demonstrou‐

se que quantidades micromolares de bilirrubina, na tensão de oxigênio fisiológica (2%), 

foram capazes de atuar como “scavengers” de radicais peroxil mais eficientemente que o 

α‐tocoferol,  um  potente  antioxidante  presente  no  soro.  Estudos  posteriores 

demonstraram que a indução da HO promoveu redução do estresse oxidativo, via BR, em 

condições pós isquêmicas (Maines e cols., 1999; Foresti e cols., 2001). 

Nesta  tese,  utilizamos  duas  ferramentas  para  testar  a  capacidade  antioxidante  da 

AaBV. A primeira é um ensaio simples onde monitoramos a  fluorescência emitida pela 

proteína  B‐ficoeritrina  (B‐PE)  (Cao  e  cols.,  1993).  Diferente  da  forma  nativa,  onde  a 

emissão é máxima, ao ser oxidada, esta molécula muda sua conformação, resultando na 

redução  da  fluorescência  emitida.  Ela  é  desafiada  por  um  gerador  de  radicais  peroxil 

(ABAP) (figura 22). Assim, na ausência de um antioxidante e desafiada pelo ABAP, a B‐

PE  apresenta uma  redução da  emissão de  fluorescência. Ao  contrário,  a  adição de um 

antioxidante  ao  sistema  gera  uma  fase  “lag”  a  esta  curva,  significando  a  redução  na 

oxidação da B‐PE. Como pode ser visto na figura 24A, a AaBV foi capaz, de forma dose‐

dependente,  de  proteger  a  B‐PE  da  oxidação.  Quando  a  AaBV  é  comparada  a  dois 

conhecidos antioxidantes hidrossolúveis (trolox, um análogo hidrossolúvel da vitamina 

E – α‐tocoferol e ácido arcórbico –  vitamina C) (figura 24B) e à BV alfa (figura 24C) ela 

demonstra uma capacidade protetora comparável. 

 

 

91 

 

 Figura 22: Reação de geração de radicais peroxil pelo ABAP. ABAP ou AAPH (2,2'‐azobis (2‐midinopropano)  dihidroclorado)  decompõe‐se  por  termólise,  gerando  radicais  peroxil retirado de Krasowska e cols., 2001). 

2 O2

a( 

 

Outro  método  utilizado  para  testar  a  capacidade  antioxidante  da  AaBV  foi  a 

imunodetecção  de  proteínas  oxidadas  (carboniladas)  (Levine  e  cols.,  1990). 

Considerando que o epitélio intestinal das fêmeas de A. aegypti contém as proteínas que 

enfrentam  o  desafio  oxidativo  imposto  pela  digestão  do  sangue,  utilizamos  um 

homogenato deste  tecido  como alvo da oxidação. Estes homogenatos  foram  incubados 

com um  sistema  gerador  de  radicais  alquil  e  peroxil  (heme  e  t‐BOOH),  na  presença  e 

ausência  de  antioxidantes.  Em  seguida,  estes  homogenatos  foram  separados  por 

eletroforese  desnaturante  e  transferidos  para  uma  membrana  de  PVDF,  onde  as 

proteínas  foram  então  derivatizadas,  ou  seja,  conjugadas  à  2,4‐dinitrofenilhidrazina, 

como mostra a figura 23, e submetidos à imunodetecção por “wester blot”. Mais uma vez 

a  AaBV  mostrou,  nas  mesmas  concentrações  molares,  uma  capacidade  protetora 

comparável à do trolox e da BV alfa (figura 16). 

 

+

Figura 23: Derivatização grupamentos carbonil. A 2,4‐dinitrofenilhidrazina representa uma importante  ferramenta para detecção de grupamentos  carbonila  (C=O) em aldeídos e  cetonas. Em meio ácido, ela reage com este grupamento gerando 2,4‐dinitrofenilhidrazonas. Estas podem ser  medidas  colorimetricamente  ou  ainda  imunodetectadas  em  “western  blot”  utilizando 

92 

anticorpos  que  as  reconhecem  especificamente.  R,  R•  pode  ser  um  hidrogênio  ou  um grupamento  alquil.  (reação  retirada  de http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lab_manuals/c10expt25.html). 

93 

0 5 10 15 20 25 30 35 40 4520

40

60

80

100 CT(-)40 nM

100 nM

250 nM

tempo (min)

fluor

escê

ncia

da

B-PE

(%)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5020

40

60

80

100 CT(-)

ácido ascórbico

trolox

AaBV

tempo (min)

fluor

escê

ncia

da

B-PE

(%)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5020

40

60

80

100 CT(-) DMSOalfa BV

AaBV

tempo (min

A

B

C

fluor

escê

ncia

da

B-PE

(%)

)

Figura 24: AaBV é um antioxidante solúvel. A fluorescência da B‐ficoeritrina foi monitorada a 565  nm  quando  esta  foi  desafiada  por  ABAP,  um  gerador  de  radicais  peroxil,  na  presença  e ausência  de  antioxidantes.  (A)  Curva  dose  resposta  da  AaBV.  (B)  Comparação  na  mesma concentração molar (250 nM) de antioxidantes solúveis. (C) Comparação entre AaBV e BV alfa em um meio mais hidrofóbico, para garantir a solubilidade da BV alfa. Este é um experimento representativo de duas repetições independentes, ou seja, de purificações de AaBV diferentes. 

94 

 

 A

 

1 2 3 4 5 6 7 8

 B

5000

4000

3000

6000

Qua

ntific

ação

por

den

sito

met

ria (U

A)

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 25: Medida da capacidade antioxidante da AaBV por imunodetecção de proteínas carboniladas. Homogenatos de intestinos médios foram incubados por 1h a 37°C com heme e tert‐butil  hidroperóxido  (t‐BOOH),  na  presença  e  ausência  de  antioxidantes,  em  duas concentrações  molares.  (A)  Autoradiografia  do  “western  blot”.  (B)  Quantificação  por densitometria  das  linhas  que  correspondem  às  diferentes  condições.  1,  controle  negativo (homogenato  incubado  com BHT); 2,  controle  positivo  (homogenato  incubado  com heme  e  t‐BOOH); 3­8, homogenato incubado com heme e t‐BOOH na presença de duas concentrações dos diversos antioxidantes,  3, AaBV 25 µM; 4, AaBV 100 µM; 5, BV alfa 25 µM; 6, BV alfa 100 µM; 7, trolox 25 µM; 8, trolox 100 µM.  

 

 

95 

5 DISCUSSÃO 

 

Liberado  da  estrutura  protéica  da  hemoglobina,  o  heme  passa  à  forma  livre  no 

lúmen  intestinal das  fêmeas de Aedes aegypti. Demonstramos que ele é  convertido em 

uma  biliverdina  IX  alfa  modificada  pela  conjugação  de  dois  resíduos  de  glutamina, 

através de ligações amídicas,  formando uma biglutaminil‐biliverdina (ou simplesmente 

biliverdina  de  A.  aegypti,  AaBV).  Já  é  amplamente  reconhecido  na  literatura  que  a 

produção  da  biliverdina  depende  da  atividade  de  uma  enzima,  heme  oxigenase  (HO), 

descrita  em  diversos modelos.  Propusemos  que  neste mosquito  a  via  de  formação  da 

biglutaminil‐biliverdina passa pela abertura do anel porfirínico do heme, catalisada pela 

HO, seguida pela ação de uma enzima modificadora, capaz de adicionar duas glutaminas 

à estrutura (figura 9, apêndice 1).  

A sequência de aminoácidos predita para a heme oxigenase de Aedes aegypti (AaHO) 

mostrou grande identidade com HO‐1 e com as sequências de outros insetos (figuras 1 e 

2,  apêndice  2).  A  análise  do  alinhamento  entre  a  heme  oxigenase  de  vários  insetos, 

incluindo a de Aedes aegypti e a HO‐1 humana,  indica que a AaHO conserva o domínio 

catalítico, na região amino‐terminal. Esta semelhança estrutural, entre a HO‐1 e a AaHO,  

na região que inclui o sítio catalítico sugere um mecanismo de catálise similar. Podemos 

também  observar  que  o  domínio  hidrofóbico,  na  porção  carboxi‐terminal,  também  é 

conservado  na AaHO. Na HO‐1  de mamíferos,  uma  enzima microssomal,  esta  região  é 

responsável pela inserção em membrana, visto que a expressão recombinante da forma 

truncada,  sem  esta  porção,  exibe  localização  citossólica.  Este  dado  reforça  a 

possibilidade  da  localização  membranar,  talvez  microssomal  da  AaHO.  Através  dos 

dados gerados pela cristalização da HO‐1 humana (Schuller e cols., 1999), comparamos 

os  resíduos  importantes  não  só  para  catálise,  como  também  para  o  alinhamento  do 

96 

heme no sítio catalítico (figuras 1 e 2, apêndice 2). O ligante proximal do heme, a His25, 

na HO‐1 é conservado nas HOs de insetos. Na HO‐1 um grupo hidroxil é o ligante distal 

do heme e estabelece pontes de hidrogênio com as  Gly139 e 143, que são conservadas 

na maioria dos insetos, com exceção de Drosophila e Glossina. Em Drosophila a Gly139 foi 

substituída por uma alanina. Um estudo com esta HO sugere que ela gera os isômeros α, 

β  e  δ  de  biliverdina,  provavelmente,  porque  carece  deste  resíduo  considerado 

importante  no  alinhamento do heme no  sítio  catalítico  (Zhang e  cols.,  2004).  A  região 

conhecida pela  ligação do heme e  também como  “assinatura da HO”  (Maines & Gibbs, 

2005)  também  é  razoavelmente  conservada  nos  insetos,  principalmente  nos  HOs  dos 

mos f .quitos ( igura 1, apêndice 2)  

Assim,  podemos  concluir  que  a  AaHO  apresenta  não  só  uma  considerável 

semelhança com a HO‐1, como também mantém muitos dos resíduos importantes para a 

catálise  e  o  alinhamento do heme,  o que pode  explicar o  fato de  ambas produzirem o 

mes o bm  isômero de  iliverdina.  

A  solubilidade  do  pigmento  de  A.  aegypti  no  lúmen  intestinal,  assim  como  a  sua 

menor  hidrofobicidade,  quando  comparado  à  biliverdina  alfa  estão  associados  à 

modificação  estrutural  da  molécula,  onde  a  biliverdina  IX  alfa  é  modificada  pela 

conjugação de dois resíduos de glutamina, através de ligações amídicas, formando uma 

biglutaminil‐biliverdina  (figura  1B  e  C,  apêndice  1).  Já  foi  identificada,  em  larvas  de 

Manduca sexta, uma atividade enzimática responsável pela biossíntese de N‐linolenoil‐L‐

glutamina,  associada  à  fração  microsomal  do  epitélio  digestivo.  Esta  molécula  está 

presente  no  regurgito  das  larvas,  e  parece  disparar,  na  planta,  uma  resposta  anti‐

herbivorismo  (Lait  e  cols.,  2003).  A  conjugação  da  glutamina  ao  ácido  linoleico,  uma 

molécula  hidrofóbica  assim  como  a  biliverdina,  é  mediada  por  uma  ligação,  também, 

amídica. É possível especular que uma enzima de atividade semelhante seja responsável 

97 

pela síntese da AaBV no mosquito. A ocorrência desta atividade enzimática associada à 

fração microssomal do epitélio digestivo de outro inseto é muito interessante, uma vez 

que, conforme já mencionamos anteriormente, as HOs são enzimas microssomais. O fato 

de  não  identificarmos  a  biliverdina  não  modificada  como  produto  da  alimentação 

sanguínea, indica que a sua ligação aos resíduos de glutamina deva ser bastante rápida, 

sugerido  uma  co‐localização  subcelular  das  atividades  de  degradação  do  heme  e 

conjugação das glutaminas. Entretanto, a enzima modificadora pode também ser solúvel 

e associar‐se à HO, de forma semelhante à que ocorre com a biliverdina redutase (BVR) 

em  mamíferos.  A  BVR  é  citossólica,  mas  associa‐se  à  HO  para  gerar  bilirrubina, 

mantendo  assim,  os  níveis  intracelulares  de  biliverdina muito  baixos.  Sabe‐se  que  na 

ausência da biliverdina redutase, a saída da biliverdina do sítio catalítico da HO torna‐se 

o  passo  limitante  da  via  de  degradação  de  heme,  uma  vez  que  a  formação  deste 

com o  Hplex  enzimático O‐BVR acelera esta etapa (Liu & Ortiz de Montellano, 2000). 

Em  mamíferos,  a  bilirrubina,  produto  insolúvel  da  degradação  do  heme,  é 

transportada  até  os  hepatócitos,  onde  é  convertida  pela  adição  de  dois  radicais  (por 

exemplo, ácidos glicurônicos) em uma molécula solúvel. Desta forma então, ela pode ser 

facilmente excretada. Apesar do produto final no A. aegypti ser a biliverdina, a tática de 

solubilização de um produto da degradação do heme é muito semelhante. Exibindo uma 

estratégia  similar,  mas  surgida  independentemente  ao  longo  da  evolução,  um  outro 

hematófago,    o  barbeiro  Rhodnius  prolixus  produz  um  isômero  γ  de  biliverdina, 

modificado pela adição de duas cisteínas através dos grupamentos vinis  (Paiva‐Silva e 

cols., 2006). 

A AaBV alcança quantidades máximas 24 h após a alimentação com sangue (figura 

4A, apêndice 2), o que está de acordo com o pico de atividade proteolítica máxima da 

tripsina  tardia  (Noriega  &  Wells,  1999)  e  outras  enzimas  proteolíticas,  como 

98 

exopeptidases  (Noriega  e  cols.,  2002).  Em  seguida,  a  quantidade  de  AaBV  no  lúmen 

intestinal  é  reduzida  significativamente.  Esta  observação  pode  ser  atribuída  ao  seu 

aparecimento nas fezes,  indicando a sua excreção (figura 4B, apêndice 2). As variações 

nas  quantidades  do  pigmento  verde,  ao  longo  da  digestão,  podem  refletir  a  maior 

disponibilização  de  substrato  para  a  reação  catalisada  pela  HO  de A.  aegypti  (AaHO). 

Observamos ainda que este gene é induzido pela alimentação com sangue e que atinge 

níveis  máximos  de  expressão  ente  24  e  42  h  após  a  ingestão  do  sangue  (figura  5A, 

apêndice  2).  Podemos  então  considerar  que  a  elevação  das  quantidades  do  pigmento 

verde,  seja  também  consequência  deste  efeito  regulatório  sobre  a  expressão  da  heme 

oxigenase.  Sabe‐se  que  a  alimentação  com  sangue  é  capaz  de  modificar,  no  intestino 

médio  de  A.  aegypti,  a  expressão  de  diversas  enzimas  associadas  à  captação  de 

nutrientes  e  ao  metabolismo,  resposta  celular  ao  estresse,  formação  da  matriz 

peritrófica (PM), entre diversos outros genes (Sanders e cols., 2003). 

A  matriz  peritrófica  é  uma  estrutura  acelular  que  envolve  o  bolo  alimentar  e  é 

composta  por  quitina,  glicoproteínas  e  glicose,  representrando  um  importante 

mecanismo de proteção (Shao e cols., 2001). Um estudo bastante recente mostrou, em A. 

aegypti, que ao final da digestão, aproximadamente 87% do ferro total ingerido na forma 

de heme é excretado (Zhou e cols., 2007). Entretanto, os 13% restantes, que alcançam o 

epitélio  intestinal,  são  o  suficiente  para  representar  um  desafio  oxidativo  para  este 

tecido. A matriz peritrófica é capaz de ligar grande parte do heme liberado pela digestão 

da hemoglobina sanguínea, amenizando os seus efeitos deletérios (Pascoa e cols., 2002). 

Esta  ligação  é  mediada  por  uma  proteína  do  tipo  mucina  (Devenport  e  cols.,  2006). 

Estudos histoquímicos demonstraram que, nas primeiras horas após a alimentação com 

sangue, a matriz ainda é tenra e a ligação ao heme é reduzida. Ao longo da digestão, esta 

estrutura torna‐se espessa, ligando intensamente o heme (Pascoa e cols., 2002). A partir 

99 

das observações feitas com o análogo fluorescente do heme, a ZnPP (figuras 10, 11 e 12), 

concluímos que esta metaloporfirina alcança o epitélio intestinal, já nas primeiras horas 

da digestão. Assim, apesar da protetora ligação do heme à matriz ser um evento massivo, 

nas primeiras horas da digestão, quando esta estrutura ainda não está completamente 

formada,  uma  parte  do  heme  alcança  o  epitélio  intestinal,  representando  assim  um 

grande  desafio  oxidativo  para  este  tecido.  Considerando  que  12 h  após  a  alimentação 

com sangue os níveis da expressão da HO, bem como da AaBV são significativos, o que 

indica  uma  intensa  degradação  de  heme,  propomos  que  a  HO  apresente  um  papel 

protetor importante principalmente nas primeiras horas da digestão, atuando como um 

mecanismo  redundante  e  complementar ao da matriz peritrófica,  garantindo proteção 

necessária ao epitélio intestinal contra os efeitos deletérios do heme. 

Para assegurar o papel antioxidante da via de quebra do heme para o mosquito, um 

sistema  de  contenção  dos  íons  ferro,  como  a  ferritina,  precisa  estar  presente.  A 

expressão da cadeia pesada da ferritina já foi identificada neste mosquito (Geiser e cols., 

2003) e aumenta em resposta à alimentação com ferro, peróxido de hidrogênio ou heme 

(Dunkov  e  cols.,  2002).  Curiosamente,  a  expressão  da  ferritina  também  acompanha  a 

cinética de indução da AaHO ao longo da digestão.  

Considerando  que  AaBV  é  capaz  de  atuar  como  “scavenger”  de  radicais  peroxil, 

como demonstrados pelos nossos resultados, e que ao longo da digestão este pigmento é 

produzido  e  excretado  pelo  epitélio  intestinal,  podemos  afirmar  que  a  capacidade 

antioxidante  desta  via para  o mosquito  vai  além da  redução dos  níveis  de  heme,  uma 

molécula tóxica e pró‐oxidante. A atividade da AaHO disponibiliza uma molécula capaz 

de  proteger  o  tecido  que  primariamente  enfrenta  o  desafio  oxidativo  disparado  pela 

digestão do sangue. 

100 

Buscando  ainda  entender  o  papel  desta  enzima  no  intestino  médio  procuramos 

reduzir  a  sua  expressão  por  RNA  de  interferência.  Vimos  que  esta  redução  não 

comprometeu  a  sobrevivência  das  fêmeas,  a  curto  prazo  e  após  a  alimentação  com 

sangue,  nem  tampouco  a  oviposição.  Esta  observação  reforça  a  hipótese  de  que  estes 

mecanismos  antioxidantes  e  de  detoxificação  do  heme  agem  conjuntamente  para 

garantir  a  proteção  tecidual  e,  em  última  análise,  a  sobrevivência.  Entretanto  ainda  é 

necessário avaliar o quanto a  redução nos níveis do  transcrito pode afetar a atividade 

enzimática, ou seja, a produção de AaBV ao  longo da digestão. Além disso, parâmetros 

que revelam o estado redox do tecido precisam ser avaliados, visto que a sobrevivência 

não  c i eex lui a possib lidade d  um estado crônico de estresse oxidativo. 

A  observação  de  que  a  AaHO  é  expressa  nos  vários  tecidos  das  fêmeas  após  a 

alimentação  com  sangue  e  também  em  diversos  estágios  do  desenvolvimento  deste 

mosquito, sugere que os papéis fisiológicos desta via vão além da detoxificação do heme 

gerado  pela  digestão  do  sangue  no  intestino  médio.  Estes  podem,  talvez,  envolver  a 

capacidade  citoprotetora  ou  sinalizadora  deste  sistema.  Tem‐se  demonstrado  que  o 

monóxido  de  carbono  (CO)  tem  papel  de  mensageiro  em  importantes  processos 

fisiológicos.  Evidências  diretas  do  CO  como  neurotrasnmissor  vêm  de  estudos  em 

contração  intestinal  não  adrenérgica  e  não  colinérgica,  importante  na  fase  de 

relaxamento da peristalse (Zakhary e cols., 1997). Um dos efeitos benéficos associados à 

HO reside na sua capacidade de disparar respostas celulares ao estresse. Recentemente 

observou‐se que a  inibição da citocromo c oxidase, pelo CO, gera baixos níveis de ROS 

intracelulares  que,  por  sua  vez,  representam  o  sinal  para  disparar  outras  respostas 

adaptativas  (Zuckerbraun  e  cols.,  2007).  Também  é  conhecido  o  papel  do  CO  como 

regulador do  tônus vascular, pela ativação da gluanilato  ciclase  solúvel nestes  tecidos, 

como havia sido demonstrado anteriormente para o óxido nítrico (NO) (Maines, 1997). 

101 

Até hoje não foi possível detectar a presença de NO em A. aegypti ou alguma sequência 

homóloga  à  NO  sintase.  Podemos  então  especular  que,  no  Aedes  aegypti,  o  CO  possa 

desempenhar  alguns  dos  papéis  atribuídos  a  este  dois  gases,  como  por  exemplo,  o 

controle da contração intestinal e a sinalização celular. 

Os estudos de expressão da AaHO diante de diversas dietas nos  forneceu algumas 

informações  sobre  os  possíveis mecanismos  de  controle  transcricional  deste  gene  no 

mosquito.  A  ingestão  apenas  de  albumina  bovina  (BSA)  induziu  parcialmente  a  sua 

expressão (figura 6, apêndice 2),  sugerindo que a distensão do  intestino médio e/ou a 

presença  de  uma  dieta  protéica  possam  sinalizar  positivamente  para  a  expressão  de 

AaHO. A tripsina tardia é um bom exemplo de como o balanço protéico modula a síntese 

de  proteases  no  intestino  médio  (Noriega  e  cols.,  1994).  Considerando  que  o  trato 

digestivo destes insetos enfrenta, com a ingestão do sangue, uma pressão fluídica que, de 

alguma  forma,  se  assemelha  àquela  provocada  pelo  sangue  nas  células  endoteliais, 

podemos  considerar  alguns  dos  dados  gerados  a  partir  deste  modelo.  Células  da 

musculatura  vascular  lisa,  quando  submetidas  à  pressão  hemodinâmica,  apresentam 

indução  da  HO‐1  (Wagner  e  cols.,  1997).  Analisando  a  região  promotora  do  gene  de 

AaHO,  pudemos  encontrar  sequências  responsivas  putativas  à  este  tipo  de  estresse 

(“shear  stress  responsive  sequence”  ou  sequências  responsivas  e  estresse  de  fluídos, 

SSRE)  (figura 26),  entretanto a  funcionalidade deste  elementos na  regulação da AaHO 

aind ea precisa ser t stada. 

Impedindo  a  digestão  do  sangue,  suplementando‐o  com  um  inibidor  de  tripsina 

(SBTI),  pudemos  também  observar  uma  indução  parcial  do  gene  de  AaHO  (figura  6, 

apêndice 2). Este resultado mostra que a proteólise é fundamental para liberar um sinal 

para a ativação transcricional deste gene, que pode por exemplo, ser o próprio heme. Já 

foi  descrito  que  a  administração  de  heme  em  vários  tipos  celulares  em  mamíferos 

102 

resultam no aumento da expressão da HO‐1 (Alam e cols., 2003). Entretanto, no caso do 

A.  aegypti,  a  participação  específica  do  heme  como  uma molécula  reguladora  precisa 

ainda ser testada.  

Em mamíferos, dentre as vias de regulação da expressão da heme oxigenase, a que 

vem  recebendo mais  atenção nos últimos  anos  é  a  que  envolve  o  fator  de  transcrição 

Nrf2. Este fator tem sua atividade sensível à variações no estado redox da célula (Alam e 

cols.,  2003,  Jaiswal,  2004).  Quando  os  níveis  de  drogas  eletrofilicas  ou  moléculas 

oxidantes  aumentam  no  citoplasma  das  células  ocorre  a  oxidação  da  proteína  Keap1 

(uma âncora citoplasmática do Nrf2), o que permite a migração do Nrf2 para o núcleo e 

sua  ligação  e  ativação  dos  promotores  dos  genes  alvos,  especialmente  enzimas 

antioxidantes e de detoxificacão de fase 2.   

Recentemente foi demonstrado que a via de sinalização Keap1/Nrf2 em Drosophila 

é ativada por oxidantes, induzindo respostas de detoxificação e conferindo tolerância ao 

estresse  oxidativo.  Mutações  que  geram  perda  de  função  em  Keap1  aumentaram  o 

tempo de  vida  de machos  de Drosophila,  sugerindo  o  papel  desta  via  na  regulação  da 

longevidade (Sykiotis & Bohmann, 2008). 

Embora tenhamos encontrado na região promotora da AaHO, sequências consenso 

(denominadas ARE, do inglês antioxidant responsive elements) que, em mamíferos, são 

responsivas a Nrf2, a alimentação de  fêmeas com sangue suplementado com paraquat, 

um  gerador  intracelular  de  radicais  superóxido,  causou  uma  inibição  da  expressão  da 

AaHO  (figura  7,  apêndice  2),  sugerindo  um mecanismo  de  regulação    distinto  ou  co‐

regulado por outros fatores de transcrição neste mosquito. 

Um  evento  no  qual  observa‐se  tipicamente  uma  intensa  expressão  de  HO  é  em 

infecções de células ou tecidos causadas por microorganismos (Camhi e cols., 1995). De 

forma  inesperada,  o  estresse  desencadeado  pela  infecção  do  Aedes  com  Plasmodium 

103 

gallinaceum  não  induziu  a  expressão  de  AaHO,  24  h  após  a  alimentação  de  um 

hospedeiro  infectado.   Além disso,  a  alimentação  com a CoPP  IX,  um  clássico  ativador 

transcricional de HO‐1 em mamíferos, não ativou a expressão deste gene, demonstrando 

que apesar das semelhanças estruturais e catalíticas, a AaHO apresenta mecansimos de 

regulação transcricional distintos dos descritos até agora. 

O conjunto dos nossos dados sugerem que o contexto da digestão do sangue, com 

intensa  liberação  de  heme,  bastante  distinto  das  condições  fisiológicas  e  mesmo 

patológicas  enfrentadas  pelas  células  de  mamíferos,  parece  ter  representado  uma 

pressão  evolutiva  adicional  e  peculiar  nestes  insetos;  o  que  resultou  na  seleção  de 

mecanismos de controle da expressão da  HO diferentes dos descritos até agora.  

 Assim,  no  Aedes  aegypti,  a  enzima  heme  oxigenase  representa  um  importante 

mecanismo de resposta ao estresse causado pela digestão do sangue. A sua expressão é 

induzida, no intestino médio, em resposta à alimentação e à digestão. Entretanto, ela não 

se  restringe  a  este  tecido,  nem  tampouco  à  fase  adulta  do  desenvolvimento  deste 

mosquito,  reforçando  a  hipótese  de  que  seus  papéis  fisiológicos  vão  além  da 

detoxificação  do  heme.  Se  por  um  lado,  esta  via  compartilha  semelhanças  com outros 

sistemas  de  quebra  do  heme  descritos  em  outros  organismos,  ele  apresenta 

peculiaridades  e  características  que  são  únicas  a  este  modelo,  como  a  estrutura  do 

produto final e os possíveis mecanismos de regulação transcricional. 

 

104 

>supercontig:AaegL1:supercont1.302:291826:298435:-1 TGTTCGATGATTGCATTGGCTGTGCTCAGTTTGGTAATGTCGCCTTGCAGCTGGGTAACTCCTGGCAAAGGTGCCATGGCTTGTAGATCGACGGCAATGATTTTGACATCGTCGGCTTCCTTGTCACGGTTTTCGTACAGCTTTTTCGAAAGAACCTGGCTCCAGCTTCCCGGGGCGGCGCACAGGTCCACTGCCCGGGTGACACCTAGTATGGGAGAGTAGAATTGCATTTATTAGATGGAATCTAAAAACATCGAGCATCGAGGAAAACCAGGAATACAAACCTTCGAAAATGTTGAACACTTCGTCGATGTGGATCAACTTAAAAGCGCTTCTGGCACGCCATCCTTCCTCCTTAGCCAATCGATAATAAATGTCCCGTTTATCTTTACTAGTTTTTCCCATTATTGCACAAAATACTTATTTATGATAGTGGAAAAATCTAAAAACTATTGATTTTTACGCAGCTTCCACGCTAGAAGACTGCACTGAACATAAAGCGAAAGAATTGTTTACAGCGAAACGTCATAATTTCCTCAGAGCTGTGCCCGCTTGGCGGCGCCTTGATTGGTTAATTTCATTTCGACTAGCCCAGATAGGGTAAAGCGGGGAAAGGCGAGCTAAACTCACAGGTAGCTCAATCTGTCAGATTCCTCATTCAGCCATTTTAAAATAAGAAGTTACAGCTGGCGAGTTTGTTTTTGTTTTAAACTTATACCATCGTTCATAGTTTCTAGGAATAAAGTCCAAAAAATCATTAGTTTTGACGAGGTTTGCTTACTAGGCACATACAGTGACTCAATCTCATTTTCGTATGGGGCACTGTTTTCATATCAATTTGGTATAAATCTATTAAATGGTGCATGGACTTCGATATATTGCGGTTATTTTGAAAATTTTCCGTTCTGCGGTAGCCGCCAAGTTCTACCGCAGCTGTCACAGTTCTACCGTAGGCTTGAGAATCATTGCATCATTGAACGAAACCATCTAATCAAAGTATGCTTGTAGAGTTCGCAGCTTTGAAAAAATATCCGCAAACAACAGTCATCAGCGTGGTTTACAAGGTAACATCGCAGCCGATCGATGATGCTTTGGGAAAACCAGTAATGTGACAGCTGCGGTAGTTTTCTGTTCAACCGTAGAACGAAAAAATATCTCTAAAATTGCAATACTTTATCAATAATGAAGGTTATAGGTGTCATCTATTGTTTGGCAATGACAAACTGTTTATATTGGTTTAGCAAACTGTATTCATTTGCTTAAATCTTTGGAATAATGGAAAAGTATTGAGATTGTGTCTATAATTGACTCAATTCCATATCCGTACACCTAACAAAAAAGAAATATACAGCATTCAAAACTAATTTTTAATGGACTAGATGATTACTTAAGCTCTTCGTTGTGTTGTTCAGATGCAGTAGAATACATTGGGAAAATTTAAAAGCGGACATATTTGAAACTTAAGTAAATTTAAGGAAAATACCAGTTTTCCCATGTTTTTTGCTAAAATATTCGGTAAGTCGAACAATAAATTGCATTTTTTTCCATATCACTTCCTTAAGTATGATAACTGCGAATATTGCACAAGTTTCAAAAATATATAATCAGTTTTAGAGTAGCTAGGAGTGGATATCGACAGCTTATACTTTTGAATCTTAGGTATTGACTTCGCAGCACCAAACCGTAATCGCGCCTGCTCATGAGGTGCGAACTTTTCTAGATGCGAAGCTAATGTCAAAGTCGAAACAATGGCTCGGCGCGCCGCGGCGGCTGTGAACACTCCGGGCGGCTTTCACGAATGTAAATAAACGGCTTAACAGATCTCTTACACACTATGTCAATAATGACGAAAATGAAATAAATGTTGTGCAACTTGAGATAATTACGTTTCATATGTACATATAAATTTCACTTTAAAAGGGTTGCATTTTCATCAATTATTATTCGTAGGTCTCTAGTCTGCCTGAAAATATGAATCAGTGATGTGAATTCCCAACTATTCAGCTGTTTATGGTGTAAGAAATTAGCAACGTTTTTATACTATGTAGTGAGTAATTTTCTTTCAACGTGCAATTAAGTTCGCAGCTTCCAAACTGAGCTGAGATCGCACTTTGGATTAAGGCAAAAAATACAATAGTATAACATTTATAACAAATCCAAAACCAAAAATTTTAGTCAATTTCTTTATGTTTGGCTCCTAAATGTATATACATAATCCATAGTTAATGTTCCTATCAAAACATTGCGTAATTATCATTTATAATTTACATTTTACTACCAAACATGATTATAGAGATTTAAAGAATAAATATTATTGCCATAACCGCAACACAAACGTTTTTTAAAATGATGAAAACAACAGGATATATTCTATTAAATAGTATAATGCTATCTGCTCATTCAAGTTATTTTGTATTTTTCTTATTAAATCAATAAATTGCAAAATAGGATGCTATTTTGAATATAATTTGAATATTATTTCAAAGATAATTGAATATTACGATGACATCAATTATGTGGAGGTAAGTACAGCGTAGTTTAGGGTACTTTATAGTAAAACAAAGTTCGTAGTTCAAATTATTTATACAGACAAATTCAAAATTAACATTTACCTGTTGGTTAGAATAAAAATTTGGTTTACATTGATTAAAAATATCATTTTAGAAGAGTTTTGAATTTATGGCACAACAATTTTCTGAACTCAAGAGGGATAAAAACTGTTTATGATTTCTGTAAACTATATATATTTCAACTAAATTTCTATCAGAGCTTACGAGTATAATCTATAGATTGGATCCAATGACAAAAATAAACGTTATTGTTCGAATTATAGGATTAAATAGCAAAAATCATTGGAAAACTGGCATTTCTCATAACTTTACCTAAATTTCATGTATGTCCACTAATAAATTGTCCAAATGTATTTCACTACATCTGAACATCATAATAAAGCATTTCAGTAATCAAATAGAGCTTCTAAATTTAGTTTTGAACGTTGTGCGTATGAATCTTGGTAGGTGTACGAATATGGAATTGGGTGAATTTTAGACATCAATTCAATACTTTTCTATTAATCCAAAGATGAATGTAAATGGAAACATTTTGTGACTGACAAACAATAGATAACACCTGTTACCTTCAATGTGGATAAAGTATTTGTAGCTCAATACTTTATTTAATAGTTTTTTACTAGCTTGATGTGCAAACAGTATCCTGTACGAATATGAAATTGGGCCACTGTAGGTTGAGTATTTATTTTTCATTTCACTATTTTCTCTCTATTCCATTATTCATTCCTGGAGCAGGGCATTATAAAGTATAGAACATTTATTTTCCACTCACACATAGGTACACATTTCCGGCATTCCTTTGCCAACTTTTTTGACTTGTGGTAACACTGAAACGAACACTGAACAGTCCATGCTTCGTCTGCCAGTGTTCTGTATGAAAACATATTTCACTTACATATCTTCAACACCGGAATAAATGTATTTTTTAATTAAAGACACTCTAACACCGACACACAGGCTAATGGACGCAGGAGAAAATTTTCACTTCACCATGTTTGTTGTTGTCAACAATCTCTAACAACCCTATAGAATCGGTAGAGTGAAAACCAGTATAAACAAACTCGCCAGCCAGCTAGCTCGCCAGCTGTCACTTCCACCTTCCCCGCTGCTAACCACACCTCGCACCCACTGACTGCTTAGATTGCTAAACCTGTCAATATAAAAACCTTGCTCACGTCCAATGGACTTATGCACGGGTTCACTATGGACCGATGCACGAGTTCATTAATTTGACGTTTGAGCGGTGCCGTATTCACTTGTTGCCATGGTCACATAAATATCACATAAGTCTATGGTGATACTGCTCCTTTTATATCAATTAGTGGTAGCTTTAGGAGAATATCGATCACCCTGCTTTTACGCGTCATCAGGCATACTGCAAGGCAGTCATCTGGGTCCGTTGATTTTCCTTTTGTATATTAACGACGTGCACTTTGTTGTGGAAGGGCGTCGACTGACGTTCACTGACGACCGAAAAATGTTTCTGCGAATATGCTCAATTGCCGATTGCCGTTATCTCCAGGACCAGATAAACGTCTTCGCTGGATGGTGTGATCTCAACCGACTAGTCGTCAATCCAGCAAAGTGCTCCGTAATCACATTTTCACTCCATCCGAGTTACGAGAGCCGCTGAATTTTTGAACCCATTCAGTCGAGGAGTTTATTTACTTTCTTGAGTGAAACAGCACACTTAGCTTAAAAATTAAAATTAAATGCATACAGAAATGGTACATTTTAAAGGTTTGTCCGGAAGCATGTCTTGATTGTCCCACCCAGGTCATAAGTAGTTGTATCATTTTATTATCAAAGTATTGAGTAAAATGATAGAGAATGTGAATTTTTGAATGCGTTTTTCTTTAAGTTTTGAGCATGCATGCGAAAAATAAATGAAATGTGAGTGTTACTTACATAGATTTGATAGAGTTATCGAGATTTTTTTCTTTTTTTTTTGTATTTACGACTTTGCACTTCAGCTGATTTCCAACACCTTGGGGTTTATTCATAAATTTCATAACGCCAAAAATGGTCATTTTTGACACCCACCCACCCCCTCGTAACGCTTTTTGTACGAATATTCTACAAATTTTGTATGAGCTGTATCGCCTCAAGGACACTCACCCATTCCCTAGAGCGTTATGAAATTTGCGAATGGGCCCTTGACATATCTCTTTTATCGTACAAAATCAAAACAAAACGTTTGTTGGCATAAACGGAAATACAAAACGGTTTTCGATCGGAAAAGCATTCTAACGTAAACAAGAATAGGGGTATGATAGTTTCCTTCAGTGTATGCCAAAATGTTCGTTCCATTTCGATTGGTCACCATTCATTATCGCCCTCCTGACTCTCGGTTTGTTTTCATTCATAAAAAAAAGCCAAAACAACAACAGTTACTCATATCGACCGAAACATCGTCAACCAGCTGATCTT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Figura 26: Análise da região promotora da AaHO. TAAAAA, TATA box; TCATAT,  INR  (A = posição +1); TGATCT, DPE (+28 to +33 relativa ao sítio de trasncrição, sequência consenso para Drosophila;  GGTCTC,  “shear  stress  responsive  sequence”,    SSRE  (sequência  consenso  para células  endoteliais);  TGACTCA,  sequência  parcial  da  sequência  consenso  de  MARE  em mamíferos  (TGCTGAG/CTCAGCA)  e  sequência  de  reconhecimento  por  AP‐1;  TGACTTCGC, sequência  consenso  de  ARE  em  mamíferos  (TGAG/CNNNGC);  Exons  são  representados  me negrito. 

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122 

            

Apêndice 1  

 

 

Biglutaminyl-Biliverdin IX Alpha as a Heme Degradation Product in the DengueFever Insect-VectorAedes aegypti†

Luiza O. R. Pereira,‡ Pedro L. Oliveira,‡ Igor C. Almeida,*,§,| and Gabriela O. Paiva-Silva*,‡

Instituto de Bioquı´mica Medica, Programa de Biologia Molecular e Biotecnologia, UniVersidade Federal do Rio de Janeiro,Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil, Department of Biological Sciences, UniVersity of Texas at El Paso, El Paso, Texas 79968,

and Departamento de Parasitologia, UniVersidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP 05508-900, Brazil

ReceiVed January 3, 2007; ReVised Manuscript ReceiVed April 13, 2007

ABSTRACT: Hemoglobin digestion in the midgut of hematophagous animals results in the release of itsprosthetic group, heme, which is a pro-oxidant molecule. Heme enzymatic degradation is a protectivemechanism that has been described in several organisms, including plants, bacteria, and mammals. Thisreaction is catalyzed by heme oxygenase and results in formation of carbon monoxide, ferrous ion, andbiliverdin IXR. During digestion, a large amount of a green pigment is produced and secreted into theintestinal lumen ofAedes aegyptiadult females. In the case of another blood-sucking insect, the kissing-bugRhodnius prolixus, we have recently shown that heme degradation involves a complex pathway thatgenerates dicysteinyl-biliverdin IX gamma. The light absorption spectrum of theAedespurified pigmentwas similar to that of biliverdin, but its mobility on a reverse-phase chromatography column suggesteda compound less hydrophobic than biliverdin IXR. Structural characterization by ESI-MS revealed thatthe mosquito pigment is theR isomer of biliverdin bound to two glutamine residues by an amide bond.This biglutaminyl-biliverdin is formed by oxidative cleavage of the heme porphyrin ring followed by twosubsequent additions of glutamine residues to the biliverdin IXR. The role of this pathway in the adaptationof this insect vector to a blood-feeding habit is discussed.

Dengue fever, associated with dengue hemorrhagic fever(DHF), is the most prevalent vector-borne viral diseaseaffecting humans, transmitted mainly by the mosquitoAedesaegypti (1). The ability of A. aegyptifemales to transmitthese viruses from one vertebrate host to another is strictlyrelated to their hematophagous habit. Ingestion of a bloodmeal triggers intense protein digestion which takes place inthe lumen, providing nutrients required for oogenesis (2) butalso leading to the release of high amounts of free hemedue to host hemoglobin proteolysis.

Heme is potentially toxic due to its capacity to promotethe generation of reactive oxygen species (ROS1) (3). Beingan amphiphilic molecule, heme can also insert itself intophospholipid bilayers, leading to destabilization of membranestructure and cell lysis (4). Blood-sucking arthropods presenta complex array of heme detoxification and antioxidantmechanisms (5) that allow them to counteract free hemecytotoxicity and adapt to hematophagy. These include heme-binding proteins in the hemolymph of kissing-bugs (6) andticks (7), high levels of antioxidant enzymes in the midgutof Rhodnius prolixus(8), and aggregation of heme in themidgut of this kissing-bug (9) and ticks (10, 11). In A.aegypti, the peritrophic matrix, an extracellular layer that issecreted by the midgut cells and separates the meal fromthe midgut epithelium, acts as a protective mechanism bybinding free heme released during digestion (12). Recently,an A. aegypti peritrophinsa protein component of theperitrophic matrixshas been shown to be a heme-bindingprotein (13).

From mammals and plants to bacteria and yeast, mostorganisms deal with heme toxicity by means of degradationby heme oxygenase (HO) (14). The conversion of heme intobiliverdin IXR, CO, and Fe2+ by HO proceeds by a multistepmechanism that involves rapid hydroxylation at the meso-

† This work was supported by grants from Conselho Nacional deDesenvolvimento Cientı´fico e Tecnolo´gico (CNPq), Fundac¸ ao deCoordenac¸ ao de Aperfeic¸oamento do Pessoal de nı´vel Superior(CAPES), Fundac¸ao de Amparo a` Pesquisa de Estado do Rio de Janeiro(FAPERJ), Fundac¸ ao Universitaria Jose´ Bonifacio (FUJB), Programade Nucleos de Exceleˆncia (PRONEX), Howard Hughes MedicalInstitute (HHMI), and by Fundac¸ ao de Amparo a` Pesquisa de Estadode Sao Paulo (FAPESP, Grant No. 98/10495-5. The project describedwas in part supported by Grant No. 5G12RR008124 (to the BorderBiomedical Research Center/University of Texas at El Paso) from theNational Center for Research Resources (NCRR), a component of theNational Institutes of Health (NIH). Its contents are solely theresponsibility of the authors and do not necessarily represent the officialviews of NCRR or NIH.

* To whom correspondence should be addressed. G.O.P.-S.: Institutode Bioquı´mica Medica, Programa de Biologia Molecular e Biotecno-logia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CCS, sala 5, bloco Dsubsolo, Ilha do Funda˜o, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil; tel, 55-(21)25626751; fax, 55(21)22905436; e-mail, gosilva@bioqmed.ufrj.br.I.C.A.: Department of Biological Sciences, University of Texas at ElPaso, 500 W. University Ave., El Paso, TX 79968; tel, (915)747-6086;fax, (915)747-5808; e-mail, icalmeida@utep.edu.

‡ Universidade Federal do Rio de Janeiro.§ University of Texas at El Paso.| Universidade de Sa˜o Paulo.

1 Abbreviations: BV, biliverdin; AaBV, biliverdin fromAedesaegypti; ROS, reactive oxygen species; HO, heme oxygenase;ABM, after a blood meal; PBS, phosphate buffered saline; HPLC,high performance liquid chromatography; TFA, trifluoroacetic acid;ESI-MS, electron spray ionization mass spectrometry; BV IXR,biliverdin IXR; Gln, glutamine; Lys, lysine; Arg, arginine; Tyr,tyrosine.

6822 Biochemistry2007,46, 6822-6829

10.1021/bi700011d CCC: $37.00 © 2007 American Chemical SocietyPublished on Web 05/18/2007

carbon of the porphyrin ring, oxygen-dependent eliminationof the hydroxylated meso-carbon as CO producingR-ver-doheme, and oxidative cleavage ofR-verdoheme to biliverdinIXR, in a reaction dependent on reducing equivalents andO2, with concomitant release of Fe2+ (15). In mammals,biliverdin is further reduced, by biliverdin reductase, tobilirubin (16), which circulates in plasma bound to albuminand is taken up by the hepatocyte and finally is excretedinto the bile mainly as bilirubin glucuronide conjugates (17).

We have recently shown that in the blood-sucking hemi-pteran insect,R. prolixus, heme oxidative degradation ismechanistically distinct from the well-characterized reactioncatalyzed by canonical HO. It involves an initial step ofmodification of heme by addition of two cysteinylglycineresidues prior to cleavagesat the gamma position insteadof the usual alpha meso-carbonsof the porphyrin ring,followed by proteolytic trimming of these dipeptides, toproduce dicysteinyl-BV IX as the main end-product (18).The present work describes the heme degradation pathwayin the mosquitoA. aegyptiand shows thatsin contrast tothe R. prolixussthis involves oxidative cleavage of hemewithout previous modification, in theR meso-carbon.However, distinct from all other previously described organ-isms, the biliverdin produced by this reaction is furthermodified by conjugation of two glutamine residues, leadingto the formation of an excretable biglutaminyl-biliverdin IXR.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Chemicals.Hemin (Fe(III) protoporphyrin IX chloride),Fe(III)-mesoporphyrin IX, and biliverdin IXR were purchasedfrom Frontier Scientific (Logan, UT). Biliverdin IXγ waskindly provided by Dr. Boris Dunkov (University of Arizona,Tucson, AZ).

Mosquitoes and Pigment Extraction. A. aegypti(REDstrain) were from a colony kept at the Universidade Federaldo Rio de Janeiro, Instituto de Biofı´sica Carlos Chagas Filho.They were maintained at 28°C ( 1 °C and 75% to 80%relative humidity, with a 12 h light/dark photoperiod. Larvaewere fed with dog chow pellets (Purina), and adults wereoffered 10% sucrosead libitum. Three to five days afteremergence females were used in the experiments.

For pigment identification and purification, females werefed with rabbit blood. In artificial feeding, meals were offeredthrough a Parafilm membrane stretched across the bottomof a water-jacketed glass feeder apparatus kept at 37°Cadapted from ref19. Stock 5 mM hemin (Fe(III) protopor-phyrin IX chloride), Fe(III)-mesoporphyrin IX, or biliverdinIXR solutions were freshly prepared in 0.1 N NaOH. Thesesolutions were neutralized by adding four volumes of 0.1 Msodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4. In order to feedinsects, these porphyrin solutions were then mixed with bloodor plasma to achieve the desired concentration. BiliverdinIXγ was a gift from Dr. Boris Dunkov.

Female midguts were dissected under 50% ethanol,transferred to 10 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH7.4 (PBS), homogenized, and centrifuged for 15 min at12000g. Supernatants were dried under vacuum using aspeed-vac system (model SC 110, Savant-NY), kept pro-tected from light, and stored at-20 °C until use.

HPLC Fractionation and Light Absorption Spectra.HPLCwas performed on a Shimadzu CLC-ODS C18 column (15

mm x 22 cm) using a Shimadzu LC-10AT device (Tokyo,Japan), equipped with a diode array detector (SPD-M10A).Chromatography analysis was performed using 5% aceto-nitrile with 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) as solvent, ata flow rate of 0.4 mL/min. Before injection, dried midguthomogenates were diluted in 20% acetonitrile with 0.05%TFA and centrifuged for 15 min at 12000g. Ten minutesafter sample injection a 40 min linear acetonitrile gradient(5-80%) was applied, followed by 20 min of 80% aceto-nitrile. Light absorption spectra were recorded during thechromatography by the HPLC diode array detector.

Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS).Mass spectra were obtained in the positive-ion mode usinga Finnigan LCQ-Duo ion trap mass spectrometer (ThermoElectron Co., San Jose, CA). HPLC fractions were preparedin 50% acetonitrile, 0.1% formic acid. Heme stock solutionswere made in 100% DMSO and diluted in 50% methanolimmediately before use. Samples were introduced into theelectrospray source by injection through a 50µm internaldiameter fused silica capillary at a 5µL/min flow rate. ESIsource and capillary voltages were set at 36-46 V and 4.5kV, respectively; the capillary temperature was 250°C.Spectra were acquired at 3 s/scan. Collision-induced frag-mentation (tandem ESI-MS) of parent ions was carriedout using a relative collision energy of 30-50% (1.5-2.5eV). Source-induced dissociation (SID) (cone fragmentation)was achieved by applying a cone fragmentation voltage of92 V.

N-Acetylation of Free Amino Groups of A. aegyptiBiliVerdin. Authentic biliverdin IXR and purifiedA. aegyptibiliverdin (AaBV) were resuspended in precooled 100µLof 1 M NH4OH. After addition of 2.5µL of acetic anhydride,samples were incubated for 10 min at 4°C. This step wasrepeated 2 times. After incubation at 25°C for 30 min,samples were dried under vacuum and resuspended in 5%acetonitrile, 0.1% formic acid for ESI-MS analysis.

Methylation of Carboxyl Groups of BiliVerdin.BiliverdinIXR and purified AaBV were resuspended in 100µL of NH4-OH. After addition of 100µL of 100% methanol, sampleswere incubated for 1 h at 37°C. Samples were dried undervacuum and washed two times with 100µL of 100%methanol. The precipitates were resuspended in 100µL ofmethanol and incubated for 1 h at 75°C. After addition oftert-butanol (20µL), samples were dried under vacuum andresuspended in 50% acetonitrile, 0.1% formic acid for ESI-MS analysis.

RESULTS

Purification and Identification of Green Pigment.Diges-tion in the mosquito midgut lumen shows maximum pro-teolysis of host blood proteins by 24 h following feeding(20). Interestingly, the water-soluble fraction of the midgutcontents shows an intense modification in color during thecourse of digestion, changing from bright red, typical ofhemoglobin, to a green color, suggesting degradation of hemeto a bilin pigment (Figures 1A,B).

In order to characterize theA. aegyptigreen pigment, weanalyzed the midgut homogenates by reverse-phase HPLC(Figure 1C). One of the major peaks displayed a light-absorption spectrum similar to that of biliverdin IXR, withtwo λmax at 379 and 690 nm (Figure 1D). However, this

Heme Degradation inAedes aegypti Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 20076823

component was eluted with a lower retention time than BVIXR, suggesting a compound more hydrophilic than BV IXR(Figure 1C), the product of heme degradation catalyzed bymost HO enzymes (14).

Feeding mosquitoes with plasma drastically reduced theamount of green pigment in the midgut when compared toinsect fed on blood (Figure 2B and Figure 2A, respectively).Addition of heme to plasma, in a concentration 20-fold lowerthan that found in host blood, partially reversed this effect(Figure 2C). This result strongly suggests that the greencomponent present in the insect midgut is a degradationproduct of heme from the blood meal.

Structural Characterization of A. aegypti BiliVerdin.Purified AaBV was analyzed by ESI-MS. This moleculeshowed a molecular mass (M) of 838.3 Da ([AaBV+ H]+

atm/z839.3) (Figure 3B), higher than that of biliverdin IXR([BV IX R + H]+ at m/z 583.2) (Figure 3A). Analysis ofAaBV sequential fragmentation by tandem ESI-MS produced

an ion species atm/z 711, by removal of a 128 Da residue(Figure 3C). The subsequent fragmentation of this speciesproduced a daughter-ion species with the same molecularmass as BV IXR (m/z 583.2), again by the loss of a 128 Da

FIGURE 1: Accumulation of a bilin pigment in the midgut ofA.aegyptiafter a blood meal. (A) Midgut dissected at different timesafter a blood meal (ABM) was homogenized in PBS and centri-fuged. Tubes containing the supernatants are shown. (B)A. aegyptimidgut 38 h ABM. Midgut epithelium (ME); lumenal content (LC);blood meal (BM); scale bar) 0.2 mm. (C)A. aegyptipigmentwas purified by reverse-phase HPLC using a C18 column. Chro-matograms ofA. aegyptimidgut PBS extract (solid lines) andstandard biliverdin IXR (dashed lines) are shown. (D) Light-absorption spectra of peaks containing AaBV (solid line) and BVIXR (dashed lines).

FIGURE 2: A. aegypti bilin pigment is derived from ingestedheme. (A) HPLC profile of midgut homogenate dissected 24 h aftermeal from 5 females fed on blood, (B) plasma, and (C) plasmasupplemented with 0.5 mM hemin. Arrow indicates AaBV peak.

FIGURE 3: ESI-MS analysis ofA. aegyptibiliverdin. (A) Massspectrum of BV IXR [M + H]+ at m/z 583.2 and (B) AaBV [M+H]+ atm/z839.3, revealed a molecular mass forA. aegyptipurifiedpigment of 838 Da, higher than BV IXR. (C) Fragmentation ofAaBV (tandem ESI-MS spectrum) produced a daughter-ion speciesatm/z711, by the loss of a 128 Da fragment. (D) MS3 of the speciesat m/z 711 revealed a 582 Da fragment by the loss again of a 128Da fragment. amu, atomic mass unit.

6824 Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 2007 Pereira et al.

fragment (Figure 3D). These results demonstrated that AaBVconsists of a BV IX coupled to two residues of 128 Da.

In order to definitively prove that the green pigmentproduced by the mosquito during blood digestion was a BVIXR, we compare the tandem ESI-MS profile of BV IXRwith that of the ion species atm/z 583 produced by AaBVsequential fragmentation (Figure 4). A daughter-ion speciesat m/z 297 was produced by AaBV fragmentation (Figure4A). This ion species is typically produced by the fragmenta-tion of the R isomer of BV IX (21, 18) (Figure 4B). Incontrast, theγ isomer of BV IX, produced by some insects(22), generates a different spectrum, with a characteristicdaughter-ion species atm/z 402 (18) (Figure 4C). Thestructure of both BV isomers and the assumed fragmentationpattern are shown as insets (Figure 4B,C).

Analysis and Identification of the Two 128 Da Fragments.Based on these results, we concluded that the AaBV is theR isomer of BV modified by two fragments of 128 Da.According to the solubility of the pigment and to molecularmass of the residues, it was plausible that these fragments

were amino acids, since they have charged groups andcompatible molecular mass. Among them, two amino acidspresented molecular mass of 128 Da (or 146 Da for thehydrated molecule,m/z 147): glutamine and lysine. Theglutamic acid, with molecular mass of 129 Da (or 147 Dafor the hydrated molecule,m/z148), would be a less feasiblecandidate since the addition of two glutamic acids to BVIXR would result in a compound with molecular mass of840 Da, higher than that of AaBV.

Cone fragmentation of AaBV produced ion species withm/zat 147 (data not shown). When fragmented and analyzedby tandem ESI-MS, this ion species produced, among otherfragments, a daughter-ion atm/z101 (Figure 5A). The samespecies was produced by glutamine fragmentation but notfrom lysine (Figure 5B and Figure 5C, respectively). In fact,the fragment atm/z 101 is considered a signature ofglutamine when analyzed by ESI-MS fragmentation (23).Lysine fragmentation did not share any common major ionwith the species atm/z 147 produced from AaBV (Figure5C). None of the ion species produced by fragmentation ofglutamic acid were found in AaBV fragmentation profile

FIGURE 4: AaBV isomer identification. (A) Fragmentation profilesof AaBV ion species atm/z 583 and (B) BV IXR showed identicaldaughter-ion species atm/z 297, in contrast to (C) BV IXγfragmentation profile that presented its typical daughter-ion speciesat m/z 402. Structure of BV IXR and BV IXγ and respectiveassignments of their daughter-ions are shown.

FIGURE 5: AaBV hydrophilic residues are glutamines. (A) ESI-MS spectrum of the ion species atm/z 147 (hydrated 128 Da)produced by cone fragmentation from AaBV. Fragmentation of (B)authentic glutamine and (C) lysine.

FIGURE 6: Degradation of mesoheme and production of mesoAaBVby A. aegyptimidgut. (A) HPLC profile of midgut homogenatesdissected 24 h after meal from females fed on plasma supplementedwith 1.0 mM hemin or with (B) 1.0 mM Fe(III) mesoporphyrinIX. Light-absorbance spectra of the bilin peak are shown as insetsin panels (A) and (B). ESI-MS spectra of modified bilin producedby glutamine addition after feeding on plasma supplemented with(C) hemin or (D) Fe(III) mesoporphyrin IX.

Heme Degradation inAedes aegypti Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 20076825

(data not shown). This result indicated that AaBV was likelyto be produced by the attachment of two glutamine residues,resulting in a biglutaminyl-biliverdin.

Identification of the Chemical Groups InVolVed in theCoValent Attachment of Glutamine to BiliVerdin.To confirmthis unusual biliverdin modification and to better investigatethe nature of AaBV, females were fed with plasma supple-mented with a heme analogue, Fe(III)mesoporphyrin IX,whose vinyls are substituted by ethyl groups. The resultingproduct showed an elution time in the reverse-phase HPLCand light absorption spectrum (Figure 6B) close, but notidentical, to AaBV, the molecule produced by feeding insectswith blood or plasma plus heme (Figure 6A). ESI-MSanalysis of mesoheme derived molecule showed ions speciesatm/z843.3 (M ) 842.3 Da) that corresponds to mesoAaBV(Figure 6D). The differences observed in the molecular massbetween mesoAaBV and AaBV were due to the four extrahydrogens from the ethane residues present in the formermolecule (Figure 6D and Figure 6C, respectively). Theseresults demonstrated that this insect is able to catalyze theoxidative cleavage of the mesoheme porphyrin ring generat-ing mesoBV, and further modify this molecule by additionof the two glutamines. Furthermore, they showed thatglutamine linkages in AaBV do not involve the vinyl groupsof BV IX tetrapyrrole. Based on the previous results, wehypothesized that BV IX carboxyl propionates were involvedin glutamine linkage.

In order to definitely characterize residues of BV IXRinvolved in the binding of glutamine residues, methylationand acetylation reactions were carried out to identify freecarboxyl and amine groups, respectively (Figure 7). Methy-lation of glutamine increased its molecular mass by additionof two methyl groups, resulting inm/z at 175.9 (Figure 7A).This was expected, since under the methylation assayconditionsshigh temperature in acid mediumsthe amidegroups can be converted into carboxyl groups (24). Whensubmitted to methylation, only two methyl groups were

added to BV IXR, corresponding to the modification of thetwo propionate carboxyl free groups (data not shown). Incontrast, methylation of AaBV produced four methyl addi-tions (m/z at 897.3): two bound to the glutamine carboxylgroups and two bound to the amide-derived carboxyls of bothglutamines (Figure 7B). If propionate carboxyl groups werealso free in AaBV, as they are in BV IXR, this reaction wouldresult in addition of six methyl groups. These data supportedthe involvement of biliverdin propionate groups in glutamineattachment. No modification of AaBV molecular mass afteracetylation reaction was observed, indicating absence of freeamine groups (Figure 7C). This result confirmed that aminegroups of glutamine were involved in the binding of BV tothese amino acid residues through an amide bond, anddiscards definitively the participation of lysine in AaBVstructure. A positive control of the reaction was performedby acetylation of the amino acid lysine (Figure 7D). Theproposed structure for AaBV is shown in Figure 9.

AaBV Formation Pathway.In order to observe the additionof the two glutamine residues to the BV in the mosquitomidgut, adult females were fed on plasma supplemented withBV IX R. Reverse-phase HPLC fractionation of insect midguthomogenates revealed the presence of a molecule with thesame elution time as AaBV (Figure 8A). Both moleculeshave the same light absorption (data not shown) and ESI-MS spectra (Figures 3B and 8B). Moreover, ESI-MS analysisof a minor peak that was eluted between AaBV and BV IXRrevealed a compound withm/zat 711 (M ) 710 Da) (Figure8C), which corresponds to the precise molecular mass of abiliverdin IX linked to one residue of glutamine (mono-glutaminyl-BV). Its tandem ESI-MS profile revealed adaughter-ion species atm/z 583 (identical to the singlycharged BV IXR species; Figure 3A), generated by the lossof a 128 Da fragment that corresponds to a glutamine residue(Figure 8D). The ion species atm/z 583 was identified asthe R isomer of BVIX by subsequent fragmentation (MS3)(Figure 8E). These data demonstrated that BV IXR is

FIGURE 7: Identification of the chemical groups involved in the covalent attachment of glutamine to BV IXR in AaBV. AaBV, glutamine,and lysine were submitted to methylation or acetylation reactions to identify free COOH and amino groups, respectively. ESI-MS analysisof (A) glutamine and (B) AaBV after methylation or (C) AaBV and (D) lysine after acetylation.

6826 Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 2007 Pereira et al.

modified by two sequential additions of glutamine residues.The proposed AaBV biosynthesis pathway is representedschematically in Figure 9. The possibility that the twoglutamine residues are tandemly linked to one of thepropionate of the biliverdin IX cannot be excluded. However,this structure seems to be less plausible due to the fact thatwe could not find any of the specific fragments that wouldbe generated by fragmentation of this molecule by ESI-MS(data not shown).

DISCUSSION

Here, we have characterized a unique heme degradationpathway found in the mosquitoA. aegypti, one of the majorvectors of dengue virus. We show that, in this mosquito,heme detoxification initiates by the HO reaction, followedby sequential addition of two glutamines to the biliverdinIX R produced by HO. This pathway is clearly distinct from

the one identified by our group in another hematophagousinsect, the hemipteranR. prolixus(18), and it is different aswell from the mammalian mechanism of disposal of excessbilin. The end product of heme degradation inR. prolixusisaγ-biliverdin with two cysteine residues attached to the vinylgroups, and the heme molecule is initially modified prior tooxidative cleavage of the porphyrin. In mammals, biliverdinis eventually converted to the hydrophobic bilirubin that,when found in high concentrations, can be extremely toxic.The insoluble bilirubin is modified by mono- and biglucu-ronidation in the liver, to make a soluble compound that canbe excreted along with the feces and the bile. Deleteriousconsequences of accumulation of these pigments are il-lustrated by diseases such as the Crigler-Najar syndrome,where failure in bilirubin conjugation to glucuronic acidcauses jaundice and severe neurological disorders (3, 25).The common trend between biliverdin modifications pro-duced byA. aegyptiandR. prolixussand mammals as wellsis the necessity to turn these molecules more soluble andeasier to be excreted. Considering that the habit of bloodfeeding evolved independently several times in differentgroups of hematophagous arthropods (26), these modifica-tions could represent an evolutive convergence to avoidmembrane disturbance and cytotoxicity caused by hydro-phobic bile pigments. Taken all together, these results pointout that the toxicity of high amounts of bilin pigments maybe seen as a selective pressure that ultimately led to thedevelopment of mechanisms to allow efficient disposal ofthese compounds as part of the adaptation of these animalsto a blood feeding way of life.

Although we were not able to find BV IXR in the midgutof Aedes, the fact that feedingA. aegyptifemale with plasmaand BV IXR led to a monoglutaminyl-BV accumulationsbesides biglutaminyl-BVssuggests that BV IXR is anintermediate in the mosquito pathway. This result supportedthe conclusion that this pathway has a regular heme oxyge-

FIGURE 8: Identification of monoglutaminyl-BV as an intermediateof the pathway. (A) HPLC profile of midgut homogenates dissected24 h after meal from females fed on plasma supplemented with0.5 mM BV IXR. (B) ESI/MS analysis of AaBV produced uponfeeding with BV IXR (indicated by an asterisk in the chromato-gram). (C) ESI/MS analysis of a minor peak (arrow in panel A)eluted between AaBV and BV IXR. (D) Fragmentation (tandemESI-MS) spectrum of monoglutaminyl-BV IXR (m/z711) produceda daughter-ion species atm/z 583, which, by further fragmentation(MS3), (E) gave origin to similar daughter-ion species as BV IXR(Figure 4B).

FIGURE 9: Biglutaminyl-biliverdin generation pathway inA. aegypti.Heme degradation into BV IXR is followed by two sequentialadditions of glutamine residues.

Heme Degradation inAedes aegypti Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 20076827

nase activity as its initial step, implying an enzyme similarto that found in most organisms. This is consistent with thefinding of a gene with high degree of similarity with a hemeoxygenase in the recently releasedAedesgenome (GenBankaccession number: AY433250). Feeding with plasma andFe(III)mesoporphyrin IX demonstrated that the enzymeresponsible for the heme degradation inA. aegyptiwas ableto catalyze this reaction in the absence of vinyl groups.Crystal structure of mammalian heme oxygenase-1 showsthat charge interactions of propionate groups are veryimportant in the correct orientation of the heme, placing theR-meso carbon in the position for hydroxylation. In contrast,vinyl and methyl heme substituents appeared not to beimportant in the alignment of heme in the enzyme catalyticsite (27). These data reinforce the conclusion that a typicalHO activity is responsible for the enzymatic degradation ofheme in the mosquito midgut. In fact, most of the humanHO residues (Lys 18, Lys 22, Tyr 134, Lys 179, Arg 183)known to surround the propionates of heme seem to beconserved in the insect enzyme (Arg 8, Arg 12, Lys 114,Lys 163, Arg 167, respectively) (data not shown).

We observed thatA. aegyptiis able to modify aR-biliver-din isomer by two glutamine covalent additions. This aminoacid can be supplied by proteolysis of blood meal proteins,or, alternatively, by synthesis from glutamate and ammonia.Increased glutamine synthetase mRNA expression byA.aegyptimidgut post blood feeding has been reported (28).It was proposed that this reaction provides the glutamineneeded for the initial steps of biosynthesis of chitin, the maincomponent of peritrophic matrix, which is synthesized inresponse to a blood meal (29). Likewise, glutamine hemolym-phatic levels increase after protein feeding and remain highduring ovary development (30).

A situation that resembles the production of AaBVconcerning the type of chemical linkages that are formed isthe synthesis of plant volatile formation elicitors in themidgut of plant-feeding lepidopteran. Plant volatiles arecompounds synthesized by plants in response to herbivorism.Formation of plant volatiles can be triggered byN-linolenoyl-L-glutamine, formed by a microsomal fraction of digestiveapparatus from the mothManduca sexta(31). The type oflinkage between glutamine and linolenate, a hydrophobicmolecule such as biliverdin, is an amide bond between theR-amino group of the glutamine and the carboxyl group ofthe fatty acid, the same linkage observed in AaBV. In themidgut of Spodoptera exiguathe linolenic acid portion isderived from larval food while the glutamine is provided bythe caterpillar (32). A similar situation may be occurring inthe production of AaBV.

Free heme has been shown to have harmful effects on cellphysiology in two ways. Acute effects can lead to immediatelysis of certain cell types upon exposure to this molecule.Alternatively, heme toxicity can be exerted by inducingalterations of cell metabolism that eventually led to cell death(3). Heme oxygenase has been attributed an important rolein cellular protection as a consequence of its capacity toameliorate toxic effects of heme (33). We have proposedthat blood-feeding organisms face a special situation regard-ing heme toxicity, as a consequence of digestion of theirblood meal (5). Therefore, heme degradation inA. aegyptiby the pathway described here is certainly an adaptation toa blood-feeding way of life. In addition to lowering heme

concentration in midgut cells, HO can be protective also dueto the fact that BV, one of the products of the enzyme, is apowerful antioxidant (34, 35). Moreover, recent reports haveshown that both heme and its degradation products (biliverdinand CO) are capable of interfering in gene expression andcell signaling, especially in the modulation of immunity (36-40). A question for future research is whether or not theseregulatory roles of CO and biliverdinsdescribed for mam-malian immune cellssare also valid for heme degradationin insects, especially in the case of the AaBV.

Besides its role in heme detoxification, this heme degrada-tion pathway may be crucial in the acquisition of free ironsan essential micronutrient required as a cofactor of a varietyof proteins and in hemeproteins biosynthesissas it has beenshown for some pathogenic bacterias (41-43). In fact, it hasalready been shown that, inA. aegypti, the blood mealinduces the expression of ferritin (44-45), the main proteininvolved in storage and transport of iron in insects (reviewedin ref 46).

Finally, microarray mRNA expression analysis of anAnophelesstrain refractory toPlasmodiumindicated thatthese mosquitoes exhibited a chronic state of oxidative stress,which was exacerbated by blood feeding, resulting inincreased steady-state levels of ROS, which favored mela-nization of parasites (47). Considering the scenario of themidgut of a hematophagous insect, the presence of a hemedegradation pathway such as the one described here repre-sents a new important factor that may interfere both withsignaling cascades that govern innate immunity and with thecontrol of redox balance, two aspects of vector biology thatare starting to be recognized as crucial determinants ofvectorial competence.

ACKNOWLEDGMENT

We thank Maria Conceic¸ao Costa for colony maintenance,S. J. Tadeu, S. R. de Cassia, and M. Okada for expertassistance, and Boris Dunkov for providing biliverdin IXgamma.

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BI700011D

Heme Degradation inAedes aegypti Biochemistry, Vol. 46, No. 23, 20076829

131 

           

   

Apêndice 2  

  

  

132 

The physiological role of heme oxygenase in Aedes aegypti

Luiza O.R. Pereira*, Boris Dunkov†, Osvaldo Marinotti&, Anthony A. James&, Hanna

Schneider Rodrigues*, Pedro L. Oliveira* and Gabriela O. Paiva-Silva*

* Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Molecular e Biotecnologia,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil

† University of Arizona, Tucson, USA.

‡ FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil.

& Biochemistry and Molecular Biology department, Univertity of California, Irvine, USA.

133 

Summary

Heme oxygenase (HO) is a ubiquitous enzyme responsible for heme breakdown, leading to the formation of CO, ferrous ion and biliverdin. In the mosquito Aedes aegypti biliverdin is further modified by addition of two glutamine residues, thus generating a hydrosoluble bilin pigment, biglutaminyl-biliverdin. Here we described the gene sequence of Aedes HO, showing that it is expressed in different developmental stages and tissues. HO expression increases after a blood meal both in the midgut and in the ovary. Maximum HO expression in the gut coincides with maximal rate of both hemoglobin degradation and production of biglutaminyl-biliverdin. When compared with a blood fed insects, HO expression in the gut was only partially increased by feeding with albumin. Partial stimulation of HO expression was also observed when hemoglobin digestion was inhibited by feeding the animals with blood together with a protease inhibitor, suggesting that transcription of HO gene is regulated both by ingestion of the meal and by formation of digestion products. HO is a classical component of stress response in eukaryotic cells, being activated under oxidative stress. Aedes HO, however, is down regulated when insects are fed with blood enriched with paraquat, a superoxide generator. All together, our data suggest that expression of HO gene in Aedes midgut is under the control of a unique regulatory mechanism.

134 

INTRODUCTION

In most eukaryotic cells heme oxygenase (HO) catalyzes the degradation of heme, cleaving its

alpha-meso carbon bridge to yield equimolar quantities of biliverdin IX alpha, CO and free

iron. Free iron is promptly sequestered into ferritin and, in mammals, biliverdin is

subsequently converted to bilirrubin via the action of biliverdin reductase (Otterbein & Choi,

2000). Heme oxygenase gene, previously known as HSP32, is a major component of cellular

response against stress Besides its relevance in many physiological processes, free in solution

heme is able to amplify formation of reactive oxygen species (ROS) chain (Ryter & Tyrrell,

2000) and destabilize the membrane structure leading cell lysis (Schmitt et al., 1993).

Aedes aegypti is a vector of important human viral diseases such as yellow fever and dengue

(Gubler, 1998). Both adult male and female feed on nectar, but the nutrients required for

oogenesis are exclusively provided by ingestion of large amounts of vertebrate blood (Lehane,

1991). Like other hematophagous animals, mosquitoes face a special situation regarding to

heme toxicity and heme metabolism, as a consequence of digestion of hemoglobin inside their

digestive apparatus that results in the formation of large amounts of heme (Graça-Souza et al.,

2006). In Rhodnius prolixus, the blood-sucking hemipteran, we have recently shown the

existence of a unique pathway for oxidative heme degradation, which produces dicysteinyl-

biliverdin IX gamma as the main end-product (Paiva-Silva et al., 2006). In another work we

had characterize the heme degradation pathway in A. aegypti and showed that, differently

from all other previously described organisms, the biliverdin produced by this reaction is

further modified by conjugation to two glutamine residues, leading to the formation of an

excretable biglutaminyl-biliverdin IX alpha (or Aedes aegypti biliverdin, AaBV) (Pereira et

al., 2007). Here we described a gene with high degree of similarity with a heme oxygenase in

the recently released Aedes aegypti genome (GenBank accession number: AY433250). Here,

in order to better understand the operation of the heme degradation pathway in Aedes aegypti

135 

we analyzed the time course of production and excretion of AaBV together with the dynamics

of HO expression.

136 

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Chemicals. Soybean Trypsin Inhibitor (SBTI) and Bovine Serum Albumin (BSA)

were provided by Sigma. Acetonitrile and Trifluoroacetic acid were supplied by Merk.

Mosquitoes. Aedes aegypti (Red strain) were from a colony kept at the Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. They were maintained

at 28 ºC and 75 to 80% relative humidity, with a 12 h light/dark photoperiod. Larvae were fed

with dog chow pellets (Purina) and adults were offered 10% sucrose ad libitum. Three to five

days after emergence females were used in the experiments.

Artificial feeding. Meals were offered through a Parafilm membrane stretched across

the bottom of a water-jacketed glass feeder apparatus kept at 37 ºC adapted from (Garcia et

al., 1975). BSA and SBTI were freshly prepared in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.4 to

a concentration of 100 mg/ml and 1 mM, respectively. SBTI was added to the blood leading a

final concentration of 100µM. Blood artificial feeding contained the same volume of 0.1 M

sodium phosphate buffer pH 7.4.

Pigment extraction. For pigment identification and purification, females were fed with

rabbit blood. Female midguts were dissected under 50% ethanol, transferred to 10 mM

sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4 (PBS), homogenized and centrifuged for 15 min at

12,000 X g. Supernatants were dried under vacuum, kept protected from light, and stored at -

20 oC until use.

Alternatively for the pigment extraction from the feces, ten blood fed females were kept on

clean 50 mL glass bottles. They were transferred to new glasses after 24h and 42h after blood

meal (abm). The glasses were washed with 10 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4

(PBS) and centrifuged for 15 min at 12,000 X g. Supernatants were dried under vacuum, kept

protected from light, and stored at -20 oC until use.

HPLC fractionation. HPLC was performed on a Shimadzu CLC-ODS C18 column

137 

(15mm x 22cm) using a Shimadzu LC-10AT device (Tokyo, Japan), equipped with a diode

array detector (SPD-M10A). Chromatography analysis was performed using 5% acetonitrile

with 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) as solvent, at a flow rate of 0.4 ml/min. Before

injection, dried samples were diluted in 20% acetonitrile with 0.05% TFA and centrifuged for

15 min at 12,000 X g. Ten minutes after sample injection a 40 min linear acetonitrile gradient

(5–80%) was applied, followed by 20 min of 80% acetonitrile. AaBV peak area data were

taken for statistical analyses using ANOVA, with Tukey’s multiple comparison as post test.

RNA isolation, PCR and real time PCR analysis. Total RNA was isolated from insects

at different developmental stages, whole bodies of males and females adults and from

epithelium midgut, ovary, head, thorax and abdomen (carcass) of blood fed females using

TRIzol (Invitrogen Corporation, California USA) as described by the manufacturer. RNA was

treated with DNase I (Invitrogen Corporation) also following the suggested proceedings.

Total RNA was reverse-transcribed with SuperScriptII First-Strand Synthesis System

(Invitrogen Corporation) according to the manufacturer's instructions and using oligo-dT.

Primers were designed from the cDNA sequences. For Aedes aegypti HO (AaHO)

amplification following primers were used: foward 5'-CAAAACTTGCTTTCGCCC-3' and

reverse 5'-GCAGGAAGTCATGCGATACA-3'. For RP49 (used as the control) primers were:

forward 5'-ACAAGCTTGCCCCCAACT-3' and reverse 5'-CCGTAACCGATGTTTGGG-3'.

PCR was performed using Taq DNA polymerase (Ambion) for 35 cycles (30 seconds at 94

ºC, 30 seconds at 60 ºC and 30 seconds at 72 ºC) in a thermocycler GeneAmp PCR System

2400 (Applied Biosystems). Both fragment obtained were about 100bp in length. PCR

products were separated in a 2% agarose ethidium bromide stained gel.

Real-time PCR was conducted in a 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) using

SYBER green Master Mix RT-PCR (Applied Biosystems). Reactions were performed for

AaHO and for constitutive RP49, used as the endogenous control. Primers were the same

138 

described above. Reactions were carried out using a hot star of 10 minutes at 94ºC and 45

cycles (15 seconds at 94ºC and 1 minute at 60ºC (for primer annealing, DNA extension and

fluorescence reading). The relative quantification of AaHO was determined using the

comparative CT method, also known as the ΔΔCT method, or the 2T-ΔΔCT

method (Pfaffl,

2001), having the constitutive gene RP49 (accession number AAT45939) as the endogenous

control. Standard curves were constructed for AaHO and RP49 primers to validate the

application of the comparative CT method. Analysis of the data was carried out using Excel.

Statistical analyses were made with ΔCT values using ANOVA, with Tukey’s multiple

comparison as post test.

139 

RESULTS

AaHO gene structure and conserved amino acid sequences. The nucleic acid sequence for

heme oxygenase from A. aegypti (GenBank accession number AY433250) has a 702bp ORF,

which encodes a predicted 233 amino acid peptide (Figure 1). Only one HO-1 ortolog can be

found in A. aegypti genome, suggesting that this mosquito seems to have only one isoform of

HO. Additionally no evidence of different transcript sizes, indicating no alternative splicing,

was seen by northern blot analysis (data not shown). The putative initial methionine

corresponding to the start codon in the Liverpool strain (shown in figure 1) is preceded, in

Red and Higgs strains, by an extended aminoterminal of 5 amino acids with a new initial

methionine (data not shown). Both Aedes aegypti and Anopheles gambiae HO genes are less

than 1kb in length (VectorBase accession numbers AAEL008136 and

ENSANGESTG00000003040, respectively) and are composed by two exons separated by a

single small intron. These data reveal a significant difference in gene structure between the

two mosquitoes HOs and the mammalian genes that have five exons and four introns and are

between 14kb (HO-1) and 12kb in length (HO-2), (Shibahara et al., 1989; Alam et al., 1994;

McCoubrey & Maines, 1994). The deduced amino acid sequence of AaHO shows high

similarity to sequences of heme oxygenases from other insects and also to mammalian HOs

(Figure 1). From the alignment it was possible to find conserved residues relevant for

enzymatic activity and for constitution of the heme pocket of the catalytic site (Schuller et al.,

1999) such as the heme proximal ligand His25. In HO-1, a hydroxyl group is the distal heme

ligand and establishes hydrogen bonding to Gly139 and 143, which are conserved in most of

insect HOs, with the exception of Drosophila and Glossina. The region known as heme

binding pocket/HO signature (Maines & Gibbs, 2005) is middling conserved among insects,

mostly in mosquitoes HOs (Figure 1).

140 

AaHO expression and heme degradation. RT-PCR was used to show that AaHO is

expressed in different developmental stages as well as in numerous tissues of blood fed

female (Figure 3). Real Time PCR was used to quantitatively evaluate expression in the

midgut and in the ovary, showing that AaHO transcript is increased after a blood meal in both

organs (Figure 5). Maximal expression of AaHO in the ovary occurred between 48 h and 72

h. In the midgut, however, AaHO transcripts increase between 24 hs and 42 hs ABM, a period

when the maximum concentration of heme are found in the lumen (Pascoa et al., 2002) and

when most of the hemoglobin polypeptide has already been digested by proteolytic enzymes,

as observed by simple analysis of gut content by SDS-PAGE (Figure 4C). The amount of

AaBV, the end product of the heme degradation pathway in the gut, increases until 24 h

ABM, declining subsequently (Figure 4A) as a consequence of appearance of the pigment in

the insect feces (Figure 4B).

Control of AaHO expression. In order to clarify which events determined the increase in

AaHO gene expression in the midgut after a blood meal, adult females were fed with blood,

albumin or blood supplemented with soybean trypsin inhibitor. Females fed on albumin

showed increased AaHO expression when compared to sugar fed insects, but as much as

blood fed insects (Figure 6). This result suggested that either midgut stretching during

ingestion of blood or protein content of the meal is able to trigger AaHO mRNA synthesis but

is not enough to achieve full stimulation. This conclusion is reinforced by the observation that

when digestion of blood proteins is blocked by addition of trypsin inhibitor (SBTI) also

results in partial induction of AaHO transcript (Figure 6). HO is one of the major components

of response against several types of cellular stress (ref), including oxidative stress.

Surprisingly, addition of paraquat, a compound that results in increased intracellular

formation of superoxide anion (Bus & Gibson, 1984), leads to a decrease in AaHO gene

expression (Figure 7).

141 

DISCUSSION

HO belongs to a large family of stress proteins whose transcriptional regulation also responds

to diverse types of adverse environmental conditions (Ryter et al., 2006). Being the enzyme

substrate, heme itself is the prototypical inducer of HO expression and therefore, it is

expected that HO may be relevant in the adaptation of blood-feeding organisms to their heme-

rich diet. Although three isoforms of HO have been identified in mammals (Otterbein & Choi,

2000), we were able to find only a single gene coding for a HO in Aedes aegypti genome. The

AaHO has the basic residues that are considered essential to allow enzymatic cleavage of the

porphyrin ring (Figure 1) and in silico modeling of its tertiary structure produced a protein

compatible with known HO structures (data not shown). Nevertheless, Thr21, Glu29 and

Phe207, amino acids that in mammalian HOs are localized proximal side to the heme and

therefore should participate of the active site does not seem to be conserved, a feature that is

shared with the other insect HOs that were used in the alignment (Figure 1).

Maximal expression of AaHO in the midgut occurs between 24 h ABM, when about 80% of

the ingested protein has already been degraded (Briegel & Lea, 1975) and 42 h (Figure 3), just

before the end of digestion of the blood meal. Monitoring the production of AaBV showed

that this end product of the heme degradation pathway increased almost linearly until 24 h,

when there is a reduction of the amounts this pigment that can be explained by appearance of

the compound in the feces of the insect (figure 4). Taken together the midgut content and the

amount found in feces, the total amout of AaBv remains relatively constant after 24 h ABM,

suggesting that the period of most intense enzymatic activity of the AaHO is in fact occurring

simultaneous with the release of heme from dietary hemoglobin. The relative low rate of

heme breakdown after 24 h could be explained by post-transcriptional inhibition of enzyme,

at the translational or pos-translational level. Alternatively, the heme in the gut may be not

easily available for enzyme to be cleaved. In favor of this second hypothesis are the reports

142 

that showed that heme released from hemoglobin degradation binds to the peritrophic matrix

(PM), a protective barrier secreted by the midgut epithelium (Páscoa et al., 2002) and that a

protein component of the PM is a heme-binding protein (Devenport et al., 2006). PM is

composed by chitin, acidic polysaccharides and proteins, which are synthesized de novo in

response to blood feeding (Kato et al., 2006). During the initial hours of blood digestion, it is

possible that the growing PM is not able to keep pace with the high rate of hemoglobin

hydrolysis due to trypsin activity. Therefore, if the PM has not yet fully developed its capacity

to sequester heme during initial steps of digestion, a significant amount of heme would reach

the midgut epithelium and AaHO activity would be responsible to counteract heme toxicity.

As mentioned before, heme is a powerful stimulus for HO expression in eukaryotic cells, but

several other type of conditions can lead to increased HO expression, such as as UVA

radiation (Keyse & Tyrrell, 1989 and 1990), hypoxia (Murphy et al., 1991), endotoxin

(Camhi et al., 1995) and shear stress (Wagner et al., 1997). In the mosquito midgut, a

pleiotropic pattern of control seems to be involved in the regulation of AaHO expression. Full

stimulation seems to require the presence of products of digestion of vertebrate blood, as

addition of SBTI results in partial inhibition of transcript levels (Figure 6). However,

ingestion of a meal composed only of albumin results also in partial stimulation of expression,

suggesting that mechanical stress during feeding could be one stimulus (but not the only one)

responsible for induction of HO (figure 6). Interestingly, putative shear stress responsive

sequence (SSRE) could be found in AaHO promoter region, also suggesting the possibility of

fluid stress as HO expression control factor (data not shown). Putative antioxidant responsive

element (ARE) and Maf responsive element (MARE) consensus sequence could be found in

the AaHO promoter region. In mammals, these regulatory elements are involved in the

transcriptional control of many stress responsive genes, including HO, through Nrf2, a bZip

type transcription factor sensitive to cellular redox status (Jaiswal, 2004; Alam et al., 2003). It

143 

has been demonstrated that Nrf2 responds to both heme and ROS and is a major regulator of

cellular response against redox imbalance. A Drosophila Nrf2 ortholog was recently

identified and characterized (Sykiotis & Bohmann, 2008). Here. the most peculiar observed

feature on the regulation of AaHO expression, however, was the inhibition of transcript levels

by feeding insects with paraquat, an herbicide that generates superoxide anion in the

mitochondria that is widely used as a reagent that promotes oxidative stress. The literature on

HO biology has frequently overlooked pro-oxidant consequences of cleavage of the heme

ring. The free iron formed during HO catalysis can take part in deleterious reactions such as

the so-called Fenton reaction (Ryter & Tyrrell, 2000). Occurrence of this type of reaction

would depend on the redox status of the cell, specifically on the availability of the iron and on

the rate of production of oxygen radicals (superoxide/hydrogen peroxide). Although at present

we do not have a molecular mechanism that could explain the regulatory pattern after

exposure to paraquat, this paradoxical observation would be reconciled with the physiology of

the insect, if one take into account that HO may have both antioxidant and pro-oxidant effects,

depending on physiology of the cell. Taken all together, our data suggest that HO enzyme and

the regulation of its expression in the midgut may play an important role in the adaptation of

Aedes to live in a high heme environment.

144 

Figure 1: Heme oxygenase structure. Alignment of HOs from several insects and human HO-1 and HO-2 comparing the most important residues in the heme interaction. Legend: conserved residues that contact to heme (red); heme-binding sites specific to HO-2 (blue boxes); heme binding pocket/HO signature (yellow). Figure 2: Neighbor-Joining Phylogenetic tree for insects and mammals HO. Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 4 (Tamura, Dudley, Nei and Kumar 2007). Bootstrap values are shown. Figure 3: AaHO tissues and developmental stages expression. (A) rtPCR revealing heme oxygenase expression from early developmental stages to adults. Legend: 1, negative control; 2, L1 larval stage; 3, L4 larval stage; 4, pupae; 5, adult female and 6, adult male. (B) rtPCR of female tissues dissected 24h after blood meal also showing HO expression. Legend: 1, negative control; 2, midgut; 3, ovaries; 4, malpighian tubules; 5, head; 6, torax and 7, abdomen (carcass). Figure 4: Production and excretion of Aedes aegytpi biliverdin (AaBV) by the midgut. AaBV time course production (A) and excretion (B). Digestion course was monitored by hemoglobin monomers throught 22.5% SDS-PAGE (C). ANOVA p values are shown. Figure 5: AaHO expression during digestion. Real time PCR revealing HO relative expression in the midgut (A) and ovaries (B) during the blood digestion. RP 49 was used as endogenous control. ANOVA p values are shown. Figure 6: AaHO expression is partially inducted by midgut distention and also by the blood digestion. Real time PCR of HO in the midgut after sugar, artificial blood, 100mg/ml BSA (bovine serum albumin) and blood supplemented by 100µM SBTI (soy bean trypsin inhibitor) 24h after meal. RP 49 was used as endogenous control. ANOVA, p<0.05. Figure 7: Intracelular ROS and blood leads to AaHO downregulation. Real time PCR showing HO relative expression in the midgut 24h after artificial blood feeding and blood supplemented by 100µM and 500µM PQ (paraquat). RP 49 was used as endogenous control. ANOVA, p<0.05.

145 

A.aegypti ------------------------------MSFTKEMRVATRDIHNVSD-ALVNAKLAFA 29 C.quinquefasciatus -------------------MAASTTTTEKTVSFTKAMRVATREIHNVSD-GLVNAKLAFA 40 A.gambiae --------------------------MAQNVPFSKQMRIATREIHNVSD-ALVNAKLAFA 33 G.morsitans ------MATAKE---------NKDDVEP-DMVYTKELRAATKDVHKLSD-VLVNAKFAFA 43 D.melanogaster ------MSASEETIADSQVSENVEDVEFVDMAFTKELRKATKDVHNLTD-VLVNAKIALA 53 B.mori --------------------------MSEQDLFTTRMRKATRKIHSVS--ALVNAKFAIS 32 HO-2 MSAEVETSEGVDESEKKNSGALEKENQMRMADLSELLKEGTKEAHDRAENTQFVKDFLKG 60 HO-1 -------------MERPQPDSMP-------QDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKG 40 : :: .*:. * : . .: . A.aegypti LYDSGVWAEGLLIFYDIFKYLEEN---------VSHDFLPEEYHRTQQFEEDLTFYLGAD 80 C.quinquefasciatus LYDSAVWAEGLLVFYEIFKFLEQH---------VAHDFLPEEFHRTEQFEQDLAFYLGAD 91 A.gambiae LYDSRVWAEGLLIFYDVFKHLEQR---------VPHDFLPPEMHRTAQFEQDLRYYLGEG 84 G.morsitans LSDDTVWADGLLSFYEIYKFLENN---------LTEELLPKELHRVKEFEKDFDYFVGEN 94 D.melanogaster LSDDEVWYDGLLAFYELYKFFETH---------LPERLLPKEFHRTAAFERDFAYFYGSD 104 B.mori LRDHTVWGGGLFVFYHIFAYLEDAKER-LNMPEFNKLFVHEILYRKKAFEQDLQHYLGDN 91 HO-2 NIKKELFKLATTALYFTYSALEEEMERNKDHPAFAPLYFPMELHRKEALTKDMEYFFGEN 120 HO-1 QVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPR 100 : :* : :* . . :* : .*: .: * A.aegypti WKSKHQPRKEVCDYIKHLEQLQGENPNLLVAYVYHLYMGLLSGGQILQKRRNFTKKFNPF 140 C.quinquefasciatus WKSKYQPRKEVCDYLKHLEQIERENPNLLVAYVYHLYMGLLSGGQILQKRRNITRKFNPF 151 A.gambiae WLERHTPKAEVRAYLKHLQELEQENANLLLAYVYHLYMGLLSGGQILQKRRSIGRRINPF 144 G.morsitans WRDTYEIRPAVKKYLEHLEEVNKKSKILLFAYAYQMYMALMSGGQLLQKKRMMARKLIRK 154 D.melanogaster WRKDYEIRPAVQKYLEHLEKIAAQNELLLFAYSYQMYMALMSGGQMLQKKRMIARKMWIF 164 B.mori WRSIPKS-LALENYLQHLQDLERDNPKLLMAYVYHLYLGLLSGGQILAKKRRVFGEKNEQ 150 HO-2 WEEQVQCPKAAQKYVERIHYIGQNEPELLVAHAYTRYMGDLSGGQVLKKVAQRALKLPST 180 HO-1 WQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSS 160 * . *::::. : . **.*: * *:. :****:* * A.aegypti ANG---------------------------------------NGARGAALTTFEEHSIYE 161 C.quinquefasciatus ATAX--------------------------------------EPNRGAALTTFEEHSIFE 173 A.gambiae RRADA-------------------------------------EPVPDAAVTTFEDHSIYE 167 G.morsitans S----------------LAIR---------MILTTRPMPLQVPICPDGCAATYFPEKISD 189 D.melanogaster SKNDDEEQQKQADKEAELATARAADGSVDKDDLEARPMPAQVTICPPGCEATYFPEKISV 224 B.mori P-----------------------------------------NTYYVDKVTDFAAVDINK 169 HO-2 GEGTQFYLFEN------------VDNAQQFKQLYRARMNALDLNMKTKERIVEEANKAFE 228 HO-1 GEGLAFFTFPN------------IASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFL 208 A.aegypti LKQKMRKTIDEFGDGLDEDT---RKRMMDESRKVFEMNNEIIKTVKGVN-------RAN- 210 C.quinquefasciatus LKQKMRSNIDKFGESLDEET---RQQMMEESRRVFELNNGIIRTVQGVN-------RAN- 222 A.gambiae LKQRLRKIVDDFGARLDEET---RQRMLDESRKVFELNNTIIRTVEGVG-------SAN- 216 G.morsitans LKAKLRTILNKHYVNFDEQT---KADFIEESRNVFIYNSDVVRSVKGVN-------RAN- 238 D.melanogaster LKAKLRRVFNNHYGAFDDDL---RAAFIEESRNVFRLNIEVVRTIKGVN-------RAN- 273 B.mori LKNEFREAMNQIATTMSSEE---QATFIEESNQVFIMNNLIVNSVEGQN-------KVLY 219 HO-2 YNMQIFNELDQAGSTLARETLEDGFPVHDGKGDMRKCPFYAAEQDKGALEGSSCPFRTAM 288 HO-1 LNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKP-----PLNTRS 263 : .: .:. : . .* . A.aegypti --IKTIVYVIVLIILYFVLKQFILK---------- 233 C.quinquefasciatus --VKTLIYVALLVMIYFVVKYLFFS---------- 245 A.gambiae --MRIVRYIAMAIAAIILMQYVVRNQFGHEQEQTL 249 G.morsitans --IRKLAIVVLFFVSIYFAIKLARR---------- 261 D.melanogaster --LRKLALALIFVSSIVVAVKFALK---------- 296 B.mori GLLCKASAVVFVVASLLFAYKLHRG---------- 244 HO-2 AVLRKPSLQFILAAGVALAAGLLAWYYM------- 316 HO-1 ---QAPLLRWVLTLSFLVATVAVGLYAM------- 288 . .

Figure 1 (Pereira et al., 2008)

146 

Figure 2 (Pereira et al., 2008)

147 

1 2 3 4 5 6

A B

RP

HO1 2 3 4 5 6 7

Figure 3 (Pereira et al., 2008)

148 

12h

24h

30h

42h

12h

24h

30h

42h

12h

24h

30h

42h

12h

24h

30h

42h

A B

kDa

20

10

C

Figure 4 (Pereira et al., 2008)

149 

0

2

4

6

8

10

-25 0 25 50 75 100 125 150

HO

rela

tive

expr

essi

on

Time af ter blood meal (h)

0

5

10

15

20

-25 0 25 50 75 100 125 150

HO

rela

tive

expr

essi

on

Time after blood meal (h)

A

B

Figure 5 (Pereira et al., 2008)

150 

0

1

2

3

4

sugar 100mg/ml BSA blood blood + 100µM SBTI

HO

rela

tive

expr

essi

on

Figure 6 (Pereira et al., 2008)

151 

0

0,5

1

1,5

blood blood + PQ 100µM

blood + PQ 500µM

HO

rela

tive

expr

essi

on

Figure 7 (Pereira et al., 2008)

152 

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Nome: Luiza de Oliveira Ramos Pereira Nascimento: 23/02/1979 Naturalidade: Rio de Janeiro  Formação acadêmica/Titulação  urso  técnico/profissionalizante  em  Biotecnologia.    Escola  Técnica  Federal  de  Química, CETFQ‐RJ, Brasil. 1994‐1998  raduação em Ciências Biológicas ‐ Licenciatura. Universidade Federal do Rio de Janeiro, GUFRJ, Brasil. 1999‐2002  Mestrado  em  Química  Biológica.  Universidade  Federal  do  Rio  de  Janeiro,  UFRJ,  Brasil. 2003‐2004  Doutorado  em  Química  Biológica.  Universidade  Federal  do  Rio  de  Janeiro,  UFRJ,  Brasil. Com período sanduíche em Universidade da Califórnia – Irvine. 2004‐2008   Orientação de Alunos de Iniciação Científica  1. Lilian Brewer Lisboa. Clonagem e expressão de heme oxigenase recombinante de Aedes aeg 2005. ypti.  Iniciação  Científica.  (Graduando  em  Ciências  Biológicas  ‐  Licenciatura)  ‐ Universidade Federal do Rio de Janeiro. Orientador: Luiza de Oliveira Ramos Pereira.  2.  Paula  Ribeiro  de  Sá  Martins.  Avaliação  da  expressão  relativa  de  heme  oxigenase  em Aedes  aegypti  por  PCR  semi‐quantitativo.  2004.  Iniciação  Científica.  (Graduando  em Ciê neiro. Or

ncias  Biológicas  ‐  Modalidade  Médica)  ‐  Universidade  Federal  do  Rio  de  Jaientador: Luiza de Oliveira Ramos Pereira.  

3. Rodrigo da Silva Pires. Avaliação da capacidade antioxidante das biliverdinas de Aedes egypti  e  Rhodnius  prolixus.  2004.  Iniciação  Científica.  (Graduando  em  Medicina)  ‐ niversidade Federal do Rio de Janeiro. Orientador: Luiza de Oliveira Ramos Pereira.  aU Artigos completos publicados em periódicos 1. PEREIRA, L. O. R.  e PEREIRA, L.O.  ; Oliveira, P. L.  ; ALMEIDA,  I. C.  ; Paiva‐Silva, G. O.  . Big guelutaminyl‐biliverdin IX alpha as a heme degradation product in the den  fever insect‐vector Aedes aegypti.. Biochemistry (Easton), v. 46, p. 6822‐6829, 2007.  2.  CARDOSO,  S.  R.  S.  ;  PROVAN,  J.  ;  LIRA,  C.  F.  ;  PEREIRA,  L.  O.  R.  e  PEREIRA,  L.O.  ; FERREIRA,  P.  C.  G.  ;  CARDOSO,  M.  A.  .  High  levels  of  genetic  structuring  as  a  result  of population  fragmentation  in  the  tropical  tree  species  Caesalpinia  echinata  Lam.. Biodiversity and Conservation, v. 14, p. 1047‐1057, 2005.  3. CUPOLILLO, E. ; Alves, F. A. ; Brahim, L. R. N. ; Naiff, M. F. ; PEREIRA, L. O. R. e PEREIRA, L.O. ; Oliveira‐Neto, M. P. ; Falqueto, A. ; GRIMALDI JR., G. . Recent advances in taxonomy of the New World  leishmanial  parasites. Medical Microbiology  and  Immunology,  v.  190,  p. 57‐60, 2001.  4. CUPOLILLO, E. ; PEREIRA, L. O. R. e PEREIRA, L.O. ; FERNANDES, O. ; CATANHO, M. P. ; PEREIRA, J. C. ; MEDINA‐ACOSTA, E. ; GRIMALDI JR., G. . Genetic data showing evolutionary inks  between  Leishmania  and  Endotrypanum.  Memórias  do  Instituto  Oswaldo  Cruz,  v. 3(5), p. 677‐683, 1998.  l9 omunicações em Congressos articipações em eventos (congressos e encontros) ‐ 17 CP 

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