75501137 apostila microbiologia tamara 1 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA

CCUU RR SS OO DD EE EESS PPEECC IIAA LLIIZZAA ÇÇ ÃÃ OO

EEMM TTEECC NN OOLLOOGGIIAA DD EE AALLIIMMEENN TTOOSS

MMIICC RR OOBBIIOOLLOOGGIIAA DD EE AALLIIMMEENN TTOOSS

PROF. DRA. ADENILDE RIBEIRO NASCIMENTO

SÃ O LU Í S - MA

2005

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU

ESPECIALIZAÇÃO EM TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

Reitor Fernando Antonio Guimarães Ramos

Pró-Reitor de Pesquisa e Pós-Graduação João Elias Mouchrek Filho

Diretor do Depto. de Pós-Graduação Lauro Gomes de Oliveira

Diretora da Divisão de Cursos de Pós-Graduação Édila de Queiroz Soares

Idealizador do Curso Gilson de Sousa Mendonça

Coordenador do Curso Pedro Jafar Berniz

Chefe do Depto. de Tecnologia Química Victor Elias Mouchrek Filho

Consultores Adenilde Ribeiro Nascimento

Victor Elias Mouchrek Filho

Colaboradores André Gustavo L. de A. Martins

Silvio Carvalho Marinho

tualmente uma das grandes preocupações dos estudiosos e

das organizações não governamentais é a questão da

segurança alimentar, não só em relação à disponibilidade e

possibilidade de acesso da população ao alimento, mas também em função da

qualidade sanitária desse alimento.

AOs profissionais da área de alimentos devem, portanto, estar atentos

aos riscos de transmissão de microrganismos patogênicos causadores de

doenças veiculadas por alimentos.

Este trabalho tem como objetivo fornecer a estudantes e

profissionais da área de alimentos e afins, informações básicas de

microbiologia de alimentos (teoria e prática). O material apresenta conteúdo

moderno, incluindo um texto claro e objetivo (Parte I) e técnicas atualizadas

de análise de alimentos (Parte II).

São Luís, fevereiro de 2005.

Adenilde Ribeiro Nascimento Doutora em Ciência dos Al imentos

Microbiologia de Al imentos

PPAA RR TT EE II :: 9 CCAAPPÍÍTTUULLMMIICCRROOBB1 HISTÓRIA D

2 IMPORTÂNC

3 CLASSIFICA

4 FONTES PRI

5 CAUSAS DA

CCAAPPÍÍTTUULLMMIICCRROORRAALLIIMMEENNTT1 BACTÉRIAS

1.1 MORFOLO

1.1.1 CARACT

1.2 CARACTE

1.3 MEIOS DE

1.3.1 CARACT

1.3.2 CLASSIF

1.4 CICLO DE

1.5 GÊNEROS

2 FUNGOS .....

2.1 BOLORES

2.1.1 CARACT

OO II 1 IIOOLLOOOS MICR

IA DOS

ÇÃO DO

MÁRIAS

CONTA

OO II II GGAANNI

OOSS ...........

GIA ....

ERÍSTIC

RÍSTICA

CULTU

ERÍSTIC

ICAÇÃO

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DE BAC

...........

...........

ERÍSTIC

GGIIAA DDEE AALLIIMMEENNTTOOSS ORGANISMOS NOS ALIMENTOS...........

MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS....

S MICRORGANISMOS...........................

DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS

MINAÇÃO DOS ALIMENTOS..................

7 ISSMMOOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS NNAA

77 ............................................................

............................................................

AS MORFOLÓGICAS IMPORTANTES NA

S DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MIC

RA PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS ....

AS DO MEIO DE CULTURA...................

DOS MEIOS DE CULTURA ...................

MENTO MICROBIANO...........................

TÉRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLO

............................................................

............................................................

AS GERAIS..........................................

1
........................................................1
........................................................1

........................................................2

NOS ALIMENTOS .............................2

........................................................6

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE

........................................................7

........................................................7

MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS ...8

ROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ........11

......................................................11

......................................................12

......................................................12

......................................................13

GIA DE ALIMENTOS.......................13

......................................................19

......................................................20

......................................................20

2.1.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS.....................................21

3 LEVEDURAS............................................................................................................................22

3.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS...................................................................................................22

3.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS ...................................24

CCAAPPÍÍTTUULLOO II II II 26 PPAARRÂÂMMEETTRROOSS IINNTTRRÍÍNNSSEECCOOSS EE EEXXTTRRÍÍNNSSEECCOOSS DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS QQUUEE AAFFEETTAAMM OO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO MICROBIANO261 FATORES INTRÍNSECOS ...........................................................................................................26

1.1 EFEITOS DO PH ....................................................................................................................27

1.2 ATIVIDADE DE ÁGUA (AW) ...................................................................................................29

1.3 POTENCIAL DE OXI-REDUÇÃO ..............................................................................................32

1.4 NUTRIENTES ........................................................................................................................33

1.5 CONSTITUINTES ANTIMICROBIANOS ....................................................................................34

1.6 ESTRUTURAS BIOLÓGICAS OU SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS ....................................................35

2 FATORES EXTRÍNSECOS ..........................................................................................................36

2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL.................................................................................................36

2.2 UMIDADE RELATIVA ............................................................................................................38

2.3 PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE GASES DO AMBIENTE........................................................39

3 COMBINAÇÃO DOS PARÂMETROS INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS .............................................40

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIVV 41 AA FFLLOORRAA MMIICCRROOBBIIAANNAA DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS EE MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS DDEETTEERRIIOORRAANNTTEESS 411 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS..........................................................43

2 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NÃO-FORMADORES DE ESPOROS .........44

3 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE ESPOROS .................44

4 BOLORES E LEVEDURAS DETERIORANTES ...............................................................................44

5 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS ................................................................................46

6 DETERIORAÇÃO DE CARNE BOVINA E AVES ............................................................................47

7 DETERIORAÇÃO DE PESCADOS................................................................................................48

8 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL..............................................................49

9 DETERIORAÇÃO DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS............................................................52

10 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO ..................................................................52

11 DETERIORAÇÃO DE ALIMENTOS DOCES.................................................................................53

12 INDICADORES DA VIDA DE PRATELEIRA ................................................................................53

CCAAPPÍÍTTUULLOO VV 55 DDOOEENNÇÇAASS DDEE OORRIIGGEEMM AALLIIMMEENNTTAARR 55 1 BREVE HISTÓRICO...................................................................................................................55

2 TAMANHO DO PROBLEMA DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR ..........................................56

3 INTOXICAÇÕES ALIMENTARES ................................................................................................59

4 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS ...................................................................60

4.1 PROGRAMA DE VIGILÂNCIA .................................................................................................60

5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS..........................................................................61

6 DOSE INFECTANTE ..................................................................................................................62

6.1 VARIÁVEIS DO HOSPEDEIRO.................................................................................................63

7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR .......................64

7.1 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTÉRIAS ...............................................................64

7.2 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS .............................................................74

7.3 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VÍRUS ........................................................................78

7.4 INTOXICAÇÕES CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS.............................................80

CCAAPPÍÍTTUULLOO VVII 84 MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IINNDDIICCAADDOORREESS 84 1 INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO FECAL OU DA QUALIDADE HIGIÊNICO-SANITÁRIA DO

ALIMENTO..................................................................................................................................86

1.1 COLIFORMES TOTAIS ...........................................................................................................87

1.2 ENTEROCOCOS.....................................................................................................................88

2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAÇÃO DO ALIMENTO.......................................................89

3 CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS (CONTAGEM PADRÃO EM

PLACAS).....................................................................................................................................90

4 CONTAGEM DE BACTÉRIA PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS ....................................................91

5 CONTAGEM DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ................................................................................91

6 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS ..................................................................................91

7 OUTROS INDICADORES............................................................................................................92

PPAARRTTEE IIII :: 94 CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIII 95 MMÉÉTTOODDOOSS DDEE AANNÁÁLLIISSEESS 95 1 CUIDADOS NA INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS..................................................................96

2 AMOSTRAGEM ........................................................................................................................97

3 PREPARO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE MICROBIOLOGICA.......................................................98

3.1 COLETA DA AMOSTRA .........................................................................................................98

3.2 RETIRADA DA AMOSTRA ......................................................................................................98

3.3 PREPARO DAS DILUIÇÕES.....................................................................................................99

3.4 SOLUÇÕES DILUENTES .........................................................................................................99

CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIIIII 101 EESSTTIIMMAATTIIVVAA DDAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ,, AA 4455ººCC EE EESSCCHHEERRIICCHHIIAA CCOOLLII AATTRRAAVVÉÉSS DDOO NNÚÚMMEERROO MMAAIISS PPRROOVVÁÁVVEELL ((NNMMPP)) 10111 MMÉÉTTOODDOO CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ..............................................................................................102

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIXX 106 CCOONNTTAAGGEEMM PPAADDRRÃÃOO EEMM PPLLAACCAASS ((CCPPPP)) DDEE MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS AAEERRÓÓBBIIOOSS MMEESSÓÓFFIILLOOSS VVIIÁÁVVEEIISS 1061 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................106

CCAAPPÍÍTTUULLOO XX 109 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE SSTTAAPPHHYY LLOOCCOOCCCCUUSS AAUURREEUUSS 109 1 TÉCNICA DE ANÁLISES..........................................................................................................110

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXII 112 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBAACCIILLLLUUSS CCEERREEUUSS 112 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................112

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIII 115 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE CCLLOOSSTTRRÍÍDDIIOOSS SSUULLFFIITTOO RREEDDUUTTOORREESS 115 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................116

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIIIII 118 PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAALLMMOONNEELLLLAA SSPPPP .. 118 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................118

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIVV 121 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBOOLLOORREESS EE LLEEVVEEDDUURRAASS 121 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................121

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXVV 122 TTEESSTTEE DDEE EESSTTEERRIILLIIDDAADDEE CCOOMMEERRCCIIAALL 122 1 MÉTODOS .............................................................................................................................123

AAPPÊÊNNDDIICCEESS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 125 RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS ....................................................................... 139

PP AA RR TT EE II ::

1

CCAAPPÍÍTTUULLOO II

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE AALLIIMMEENNTTOOSS

1 HISTÓRIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS

tualmente sabemos que os microrganismos são encontrados

praticamente em todos os lugares. Antes da invenção do

microscópio, os microrganismos eram desconhecidos dos

cientistas. Havia epidemias devastadoras, cujas causas não se conhecia. Os

alimentos estragavam freqüentemente e não se podia controlar esse processo;

famílias inteiras morriam.

ANa Idade Média, milhares de pessoas morriam de ergotismo sem que

se soubesse que se tratava de um fungo (Claviceps purpurea). Possivelmente

a primeira pessoa a sugerir a existência da relação entre os microrganismos e

a deterioração dos alimentos foi A. Kircher (1658), que examinou carne, leite

e outras substâncias e verificou a presença de “vermes” invisíveis a olho nu.

Contudo suas observações não foram aceitas. Em 1765, L. Lpallanzanii

derrubou a teoria da geração espontânea com os seus experimentos.

Apesar da importância das contribuições mencionadas, foi o médico

francês L. Pasteur, o primeiro cientista a compreender o papel dos

microrganismos nos alimentos. Em 1857, ele mostrou que o azedamento do

leite cru era devido ao crescimento de microrganismos e em 1860, empregou o

calor para destruí-los, processo hoje chamado de Pasteurização.

2 IMPORTÂNCIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS

As interações entre os microrganismos e alimentos implicam em

modificações enzimáticas e conseqüentemente em sabores e odores

desagradáveis.

Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento

2

O advento de alimentos preparados tem ocasionado problemas

relacionados com doenças transmitidas pelos alimentos. A deterioração é

devido à conservação inadequada dos alimentos.

3 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS

Os microrganismos são classificados em três grupos distintos,

dependendo do tipo de interação existente entre microrganismos e alimentos,

conforme descrito a seguir.

1) Os microrganismos nos alimentos são causadores de alterações

químicas prejudiciais resultando na deterioração microbiana. Essas alterações

são conseqüências da atividade metabólica dos microrganismos.

2) Os microrganismos presentes nos alimentos podem representar

riscos à saúde patogênicos doenças de origem alimentar infecção ou

intoxicação.

3) Os microrganismos presentes nos alimentos causam alterações

benéficas em um alimento, modificando suas características originais de

forma a transformá-lo em um novo alimento microrganismos utilizados na

fabricação de alimentos fermentados.

4 FONTES PRIMÁRIAS DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS NOS ALIMENTOS

Gêneros e espécies mais importantes presentes nos produtos

alimentícios são encontrados em oito fontes, descritas a seguir.

a) Solo: O solo contém a maior variedade de microrganismos

procedentes de todas as fontes de contaminação. Organismos do solo entram

na atmosfera pela ação dos ventos e depois nos corpos d’água que são

arrastados para alcançar o interior ou a superfície dos alimentos.


3

São especialmente importantes alguns bolores, leveduras e algumas

espécies dos gêneros bacterianos Bacillus , Clostridium , Enterobacter ,

Escherichia , Micrococcus , Alcaligenes , Flavobacterium , Chromobacterium ,

Pseudomonas , Proteus , Streptococcus , Leuconostoc , Acetobacter .

b) Água: As águas naturais não só contêm sua própria microbiota,

como também microrganismos procedentes do solo e possivelmente de

microrganismos procedentes de animais e de águas residuais. As espécies

bacterianas existentes nas águas naturais são principalmente espécies dos

gêneros Pseudomonas , Chromobacterium , Proteus , Micrococcus , Bacillus ,

Enterococcus , Enterobacter e Escherichia coli . É provável que as três últimas

bactérias sejam contaminantes.

Para a microbiologia de alimentos dois aspectos são importantes: o

aspecto de saúde pública e o aspecto econômico.

c) Águas residuais: Quando são utilizadas águas residuais

domésticas sem tratamento existe a possibilidade de contaminação por

microrganismos patogênicos para o homem (doenças do trato intestinal).

As águas naturais contaminadas com águas residuais aportam os

microrganismos nos mariscos, pescados e outros alimentos de origem

marinha. Bactérias do grupo coliforme, Enterococos , Vibrio , outras bactérias

intestinais e vírus são as principais contaminantes.

d) Ar: A contaminação dos alimentos pelo ar pode ter importância

tanto por razões higiênicas quanto econômicas. Os microrganismos patógenos,

em especial os que são responsáveis por infecções respiratórias podem ser

transmitidos pelo ar que possivelmente contamina os alimentos.

Os microrganismos que alteram os alimentos podem ter sua origem

do ar (fermentações). Os esporos de fungos do ar podem representar um

inconveniente para alguns tipos de alimentos, como por exemplo, queijo,

carnes, pão, leite condensado etc.

Um dos grupos de bactéria que são particularmente bem adaptadas

são Actinomycetos , especialmente aquelas do gênero Streptomyces , produz


4

esporos que sobrevivem muito bem no ar. Algumas espécies podem ser

responsáveis pelo odor e sabor desagradável em água potável.

e) Animais: Todos os animais saudáveis possuem uma microbiota

complexa, que pode ser transitória (microbiota normal de alguns indivíduos) e

patogênica (capazes de matar seus hospedeiros).

Grande quantidade de microrganismos é freqüentemente encontrada

em:

pele – áreas úmidas especialmente virilha ou entre os dedos;

trato respiratório – nariz e orofaringe;

trato digestivo – boca e intestino grosso;

trato urinário – parte anterior da uretra;

trato genital – vagina;

A superfície da pele dos humanos e outros animais é exposta ao ar,

solo e água que contamina os alimentos e equipamentos.

Os microrganismos são característicos de cada espécie do animal e

nos humanos a microbiota normal da pele predominante são bactérias gram

positiva dos gêneros Staphylococcus , Corynebacterium e Propionibacterium .

Para os animais produtores de carne são predominantes os Micrococos,

Staphylococcus e Enterococos.

O nariz humano e as mãos são habitats primários do Staphylococcus

aureus , eles residem na mucosa do nariz. As secreções nasais contêm um

grande número de bactérias, em algumas pessoas, a maior parte é de

Staphylococcus que contaminam suas mãos.

As fezes e os alimentos de origem animal contaminados podem

conter diversos microrganismos entéricos, inclusive do gênero Salmonella .


5

f) Manipulação e tratamento: Outras contaminações podem ter

origem no equipamento que entra em contato com os alimentos nos materiais

util izados e nas pessoas.

O pessoal que trabalha nas plantas de indústrias que fabricam

alimentos pode contaminá-los durante sua manipulação e tratamento. Alguns

pesquisadores citam que os seres humanos eliminam de 103 a 104

microrganismos vivos por minuto. O número e tipo de microrganismos

eliminados possuem uma relação íntima com o ambiente de trabalho. A

microbiota das mãos e roupas dos manipuladores de alimentos pode ser

oriunda do solo, água, poeira e outros ambientes. Outras fontes importantes

são as fossas nasais, a boca e a pele. Em condições muito precárias de higiene

também os microrganismos do trato gastrintestinal podem contaminar as mãos

dos manipuladores e, conseqüentemente, os alimentos por eles preparados.

As mãos podem veicular vários microrganismos importantes,

dependendo do tipo de alimento manipulado ou do momento da coleta das

amostras para análise.

Os manipuladores de alimentos têm um importante papel na

prevenção das toxinfecções alimentares e das demais doenças de origem

alimentar.

As mãos raramente estão livres de bactérias, que podem ser

transitórias ou semipermanentes no interior ou na superfície da pele. A

microbiota das mãos geralmente consiste de estafilococos. Eles aderem à

superfície da pele e persistem nos folículos capilares, poros, cavidades e

lesões causadas por rachadura na pele, e eles não são facilmente removidos.

g) Ração animal: Animais confinados, bovinos e suínos, assim como

as aves, estão expostos a infecções provenientes de rações. Parte de amostras

de rações à base de peixes, ossos e carnes apresentam salmonelas. O consumo

pode levar a uma excreção temporária e às vezes a doenças. Rações

produzidas a partir de sobras do comércio de carnes, reciclam as salmonelas

de volta aos animais.


6

A ingestão de miúdos crus ou inadequadamente tratados pelo calor,

provenientes de ovinos, aves, bovinos e outros animais levará inevitavelmente

à uma infecção por Salmonella .

h) Utensílios – Contaminação cruzada: Utensílios como recipientes,

bandejas, facas, tábuas, moedores etc. , têm papel importante como fonte de

contaminação.

As contaminações cruzadas causam contaminações pós-

processamento do alimento (ou seja, após a etapa de cozimento). Podem ser

evitadas por meio de:

planejamento cuidadoso do ambiente e distribuição de

equipamentos da fábrica;

controle do movimento de pessoal;

hábitos adequados dos manipuladores quanto à higiene.

5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS

Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um

alimento inseguro, causando toxinfecções àquelas pessoas que o ingerem. As

principais causas podem ser resumidas como:

controle inadequado de temperatura durante o cozimento,

resfriamento e a estocagem;

higiene pessoal insuficiente:

contaminação cruzada entre produtos crus e processados;

monitoramento inadequado dos processos.


7

CCAAPPÍÍTTUULLOO II II

MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS NNAA MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE

AALLIIMMEENNTTOOSS

entre os microrganismos existentes, as bactérias e os

fungos têm interesse para a microbiologia de alimentos

por serem responsáveis por processos de deterioração, por

participarem da elaboração de alimentos ou por serem responsáveis por

toxinfecções alimentares.

D

1 BACTÉRIAS

As características das bactérias em relação à sua origem,

reservatórios e o conhecimento a respeito de sua habilidade em sobreviver e

crescer nos alimentos são fatores importantes no controle tanto das

toxinfecções alimentares como na deterioração dos alimentos. A prevenção

está diretamente relacionada com a destruição da bactéria e com a inibição de

seu crescimento.

1.1 MORFOLOGIA

As bactérias podem ser encontradas sob forma de bacilos (em forma

de bastão), cocos (forma esférica) e espirilos (forma de saca-rolhas ou

curvadas). As bactérias individuais podem formar pares, grupos, cadeias ou

outros agrupamentos; tais formações são usualmente características de um

gênero particular ou de uma espécie de bactéria.

A forma de uma bactéria é determinada por hereditariedade.

Geneticamente, a maioria das bactérias é monomórfica, isto é, elas mantêm

uma única forma. Entretanto, uma série de condições ambientais pode


8

modificar sua forma, a qual, quando alterada, dificulta sua identificação.

Algumas bactérias são pleomórficas, o que significa que elas podem ter várias

formas, e não apenas uma.

Invisíveis ao olho humano, as bactérias são normalmente medidas em

micrômetros (µm), que são equivalentes a 1/1000mm (10- 3mm). As células

bacterianas variam em tamanho dependendo da espécie, mas a maioria tem

aproximadamente de 0,5 a 1µm em diâmetro ou largura.

O tamanho, a forma e o arranjo das bactérias constituem sua

morfologia, sua aparência “externa”.

1.1.1 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA

DOS ALIMENTOS

Para identificação das bactérias de um determinado alimento são

necessários sua observação no microscópio com a finalidade para se

determinar a forma, tamanho, tipo de agrupamento, estruturas e reações de

coloração das bactérias existentes nos alimentos. As estruturas de importância

são as seguintes:

Produção de cápsula: O glicocálise bacteriano é um polímero

viscoso e gelatinoso que está situado externamente à parede celular e é

composto de polissacarídeo, polipeptídeo ou ambos. Sua composição química

varia amplamente com as espécies. Na maioria dos casos, ele é produzido

dentro da célula e excretado para a superfície celular.

As cápsulas servem para aumentar a resistência das bactérias às

condições desfavoráveis do meio, como a sua resistência à temperaturas

elevadas e aos agentes químicos. Em certas espécies, as cápsulas são

importantes na virulência bacteriana (o grau com que um patógeno causa

doença). Para o próprio microrganismo podem ser úteis como fonte de

nutriente e reserva.


9

Produção de endósporos: As bactérias dos gêneros Bacillus e

Clostridium são de importância de grande interesse para a microbiologia de

alimentos, esses gêneros formam células especializadas de repouso

denominadas endósporos, células desidratadas altamente duráveis, com

paredes espessas e camadas adicionais. Eles são formados dentro da

membrana celular bacteriana. Quando liberados no ambiente, podem

sobreviver a temperaturas extremas, falta de água e exposição a muitas

substâncias químicas tóxicas e à radiação.

O processo de formação de endósporos dentro de uma célula-mãe

vegetativa leva várias horas e é conhecido como esporulação.

Os endósporos são importantes do ponto de vista clínico e na

indústria alimentícia, pois são resistentes a processos que normalmente

eliminam as células vegetativas. Estes processos incluem o aquecimento, o

congelamento, a dessecação. Enquanto a maioria das células vegetativas é

eliminada à temperatura acima de 70ºC, os endósporos podem sobrevier em

água fervente por várias horas ou mais. Os endósporos de bactérias

termofílicas podem sobreviver na água fervente por 19 horas. As bactérias

formadoras de endósporos são um problema na indústria de alimentos, pois

podem sobreviver ao subprocessamento e, se ocorrerem condições para o

crescimento, algumas espécies produzirão toxinas e doenças. Alguns métodos

são utilizados para controlar os organismos que produzem endósporos.

Parede celular: A parede celular de uma célula bacteriana é uma

estrutura complexa, semi-rígida, responsável pela forma da célula. A

principal função da parede celular é prevenir a ruptura das células bacterianas

quando a pressão da água dentro da célula é maior que fora dela. A

composição química da parede celular é usada para diferenciar os principais

t ipos de bactérias. A parede celular permite a divisão das bactérias em dois

grupos:

bactérias gram positivas

bactérias gram negativas


10

Coloração de Gram

Christian Gram, microbiologista, queria visualizar as bactérias e

descobriu o que atualmente o mundo conhece como Coloração de Gram.

Christian Gram notou que as bactérias podiam ser coradas tanto de azul

escuro (violeta) quanto de vermelho. Isso acontecia devido à precipitação do

cristal violeta com o lugol no interior do citoplasma da célula; precipitação

essa que não podia ser extraída de certos organismos (gram positivos) com a

utilização de solventes como o etanol ou a acetona, porém poderia ser

extraída de outros (gram negativos). Por essas últimas células descorarem-se

após a util ização de álcool ou acetona, uma coloração de contraste foi

necessária, util izando safranina ou fucsina.

Os organismos gram positivos possuem uma parede celular grossa

envolvendo a membrana citoplasmática. Essa é composta por peptídeo glicano

e ácidos teicóicos. Os organismos gram negativos possuem uma parede celular

mais fina que é envolvida por uma outra membrana externa. Portanto, os

organismos gram negativos possuem duas membranas.

Membrana plasmática: É uma estrutura fina situada no interior da

parede celular, revestindo o citoplasma da célula constituída de lipídeos,

proteínas e alguns carboidratos. A mais importante função da membrana é

servir como uma barreira seletiva através da qual os materiais entram e saem

da célula. Também são importantes para a digestão de nutrientes e a produção

de energia.

A membrana plasmática é vital para a célula bacteriana, ela é o sítio

de ação de vários agentes antimicrobianos. Além das substâncias químicas

que lesam a parede celular e assim expõem indiretamente a membrana à lesão,

muitos compostos lesam especificamente a membrana plasmática. Estes

compostos incluem certos álcoois e compostos de amônio, usados como

desinfetantes.


11

1.2 CARACTERÍSTICAS DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE

ALIMENTOS

O crescimento bacteriano tanto no interior como na superfície dos

alimentos apresentam um aspecto desagradável ou prejudicial. As bactérias

que produzem pigmentos modificam a cor da superfície dos alimentos, a

superfície dos líquidos podem ser cobertos por uma película devido ao

crescimento bactérias, também podem apresentar viscosidade, turbidez ou um

sedimento não desejáveis aos alimentos.

Muitos fatores podem ser util izados como uma série de obstáculos

para prevenir o crescimento microbiano. Cada obstáculo representa uma

barreira que deve ser ultrapassada pela bactéria para que ela possa contaminar

e degradar os alimentos. As embalagens com atmosfera modificada, altas

pressões hidrostáticas, luz ultravioleta e bacteriocinas são exemplos de um

método secundário de conservação.

O conceito dos obstáculos deu origem à tecnologia dos obstáculos,

que se baseia na utilização simultânea de mais de uma forma de controle

microbiano nos alimentos, como salga, acidificação, processamento térmico,

adição de conservantes químicos etc. O objetivo é a obtenção de produtos

alimentícios estáveis, de prolongada vida de prateleira, e seguros à saúde dos

consumidores.

1.3 MEIOS DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS

O meio de cultura é denominado o material nutriente preparado no

laboratório para o crescimento de microrganismos. Algumas bactérias podem

crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios

especiais e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio

de cultura já desenvolvido. Os microrganismos que crescem e se multiplicam

nos meios de cultura são denominados cultura.

Para o crescimento de microrganismos no laboratório há uma grande

variedade de meios de cultura. Muitos desses meios são disponíveis em forma


12

comercial e contêm todos os componentes desejados sendo necessário somente

a adição de água para posterior esterilização.

Os meios de cultura estão constantemente sendo desenvolvidos ou

mesmo atualizados para o isolamento e a identificação de bactérias,

principalmente nas áreas de pesquisa de alimentos, água e microbiologia

clínica.

Para permitir o crescimento, o meio de cultura deverá conter uma

fonte de energia, uma fonte de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e todos

os fatores orgânicos que o organismo não é capaz de sintetizar.

1.3.1 CARACTERÍSTICAS DO MEIO DE CULTURA

O meio de cultura deve ser preparado de acordo com o tipo

nutritivo do microrganismo que se pretende cultivar;

Deverão conter quantidade de água necessária;

pH ajustado;

O meio de cultura deverá inicialmente ser estéril .

1.3.2 CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

I. Quanto à consistência: l íquido caldo; semi-sólido; sólido

agar.

II . Quanto à função: enriquecimento; seletivo; diferencial;

manutenção.

III. Quanto à natureza: sintético quimicamente definido; não-

sintético.


13

1.4 CICLO DE CRESCIMENTO MICROBIANO

O ciclo de crescimento microbiano é formado por seis fases,

descritas a seguir.

1. Fase lag : As células não estão se multiplicando, mas sintetizando as

enzimas apropriadas para o ambiente.

2. Fase de aceleração : Uma proporção crescente de células está se

multiplicando.

3. Fase exponencial (ou log) : A população está duplicando. O número de

células cresce de maneira tal que, para visualização gráfica, melhor seria

util izar valores exponenciais (logarítmicos). O gráfico logarítmico desta fase

de crescimento é uma linha reta devido a este tempo de geração constante.

Esta fase é o período de maior atividade metabólica da célula. No entanto,

nesta fase de crescimento os microrganismos são particularmente sensíveis às

mudanças ambientais, às radiações ou mesmo muitos dos compostos

antimicrobianos.

4. Fase de desaceleração : Uma crescente proporção de células não está mais

se multiplicando.

5. Fase estacionária: A taxa de nascimento é igual à de morte, resultando em

um número igual de células em um dado tempo. A morte é causada pelo

esgotamento de nutrientes, pela acumulação de produtos finais tóxicos e/ou

outras mudanças no ambiente.

6. Fase de morte : O número de células mortas é maior do que o de células

vivas.

1.5 GÊNEROS DE BACTÉRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE

ALIMENTOS

Os gêneros bacterianos importantes para alimentos são agrupados

nestas categorias:


14

1. Bactérias gram negativas, aeróbias e microaeróbias;

2. Bactérias gram negativas aeróbias estritas;

3. Bactérias gram negativas anaeróbias facultativas;

4. Cocos gram positivos;

5. Bacilos gram positivos produtores de esporos;

6. Bacilos gram positivos não esporulados;

7. Outros.

1. Bactérias gram negativas, aeróbias e microaeróbias:

Neste grupo, apenas o gênero Campylobacter tem importância para

os alimentos. São oxidase positivas, crescem em meios de cultura com baixa

tensão de oxigênio. As espécies importantes são C. jejuni , C. coli e C. lari

que são patógenos causadores de gastrenterites humana.

2. Bactérias gram negativas aeróbias estritas:

Neste grupo são incluídos os seguintes gêneros: Pseudomonas ,

Xanthomonas , Halobacterium , Halococcus , Acetobacter , Gluconobacter ,

Acinetobacter , Alcaligenes , Alteromonas , Brucella , Flavobacterium ,

Moraxella , Paychrobacter e Shewanella .

Gênero Pseudomonas : Algumas espécies de Pseudomonas podem

alterar os alimentos, estas bactérias são amplamente distribuídas na natureza,

podem ser encontradas em alimentos de origem animal e vegetal. Algumas

Pseudomonas são patogênicas para plantas. P. aeruginosa produz substâncias

tóxicas e são patógenos humanos oportunistas. Alguns casos de doença de

origem alimentar foram causados por algumas espécies de Pseudomonas . São

encontradas em alimentos refrigerados e congelados. Devido a sua baixa


15

resistência térmica, só são encontradas em alimentos processados que

sofreram contaminação pós-processamento.

Gênero Halobacterium: São bactérias halófitas, encontradas

freqüentemente em alimentos salgados, como pescados e carnes, produzem

odor desagradável e coloração vermelha devido ao pigmento.

Gênero Acetobacter : Estas bactérias oxidam o álcool etíl ico a ácido

acético. São encontradas em frutas e hortaliças e são responsáveis pela

deterioração de sucos de frutas e bebidas alcoólicas (vinhos, cervejas).

Gênero Acinetobacter : São bacilos curtos, importantes agentes de

deterioração de alimentos, tanto crus como processados, incluindo carnes e

carcaças de aves.

Gênero Alcaligenes : São largamente distribuídas na natureza, têm

sido causadores de deterioração de alimentos protéicos (leite cru, carnes, ovos

e laticínios). Produz viscosidade no leite.

Gênero Alteromonas : São bactérias marinhas, causam deterioração

em pescados.

Gênero Flavobacterium: As espécies deste gênero são produtoras de

pigmentos amarelos ou vermelho em superfície de carnes, aves, pescados

(mariscos). Algumas espécies são psicrófilas e são encontradas em hortaliças.

Podem ser isoladas de água, solo, animais, humanos e diversos alimentos.

Gênero Brucella: Algumas espécies são patogênicas: B. abortus ,

para o gado bovino e B. suis , patogênica para os suínos. São espécies que

podem causar brucelose no homem. As fontes de infecção são o leite cru,

laticínios, carnes não cozidas ou derivados de carne.

3. Bactérias gram negativas anaeróbias facultativas:

Neste grupo estão incluídas as famílias Enterobacteriaceae e

Vibrionaceae.


16

Gênero Enterobacter : São bacilos imóveis, fazem parte da

microbiota intestinal do homem e pertencem ao grupo dos coliformes. Estas

bactérias são muito abundantes na natureza, podem causar deterioração dos

alimentos.

Gênero Citrobacter : Pertencem ao grupo dos coliformes, são

bactérias intestinais e podem ser encontradas em muitos alimentos, causam

deterioração nos alimentos.

Gênero Escherichia : A principal espécie é E. coli . Pertence ao

grupo dos coliformes de origem fecal, faz parte da microbiota intestinal do

homem e animais, são indicadoras de contaminação fecal de alimentos e água,

alguns sorotipos são patogênicos para o homem e animais.

Gênero Klebsiella: Fazem parte do grupo dos coliformes. Muitas

bactérias deste gênero são capsuladas, se encontram com freqüência nas vias

respiratórias e no trato intestinal do homem.

Gênero Hafnia : São bacilos móveis, importantes na deterioração de

carnes refrigeradas e vegetais.

Gênero Salmonella: As espécies destes patógenos são entéricos. Seu

principal reservatório é o trato gastrintestinal do homem e de animais,

principalmente aves e suínos. São responsáveis pelas infecções alimentares.

Gênero Proteus : São bacilos móveis. São patógenos de origem

alimentar, importantes na deterioração dos alimentos.

Gênero Shigella: São bacilos não esporulados. São encontrados no

trato gastrintestinal do homem. Sua importância nos alimentos deve-se à sua

patogenicidade. São os agentes causadores da shigelose (desinteria bacilar),

que pode ser de origem alimentar.

Gênero Aeromonas : São bacilos móveis e oxidase e catalase

positivos. São anaeróbios facultativos e podem ser psicrófilos, são bactérias

aquáticas, sendo habitantes naturais do intestino de peixes. A espécie A.

hydrophila é patogênica para o homem e animais aquáticos.


17

Gênero Vibrio : São bactérias pertencentes à família Vibrionaceae.

São bacilos pequenos curvos ou retos. Algumas espécies são incapazes de

multiplicar na ausência de NaCl. As espécies V. cholerae , V. vulnificus e V.

parahaemolyticus são patógenos importantes em alimentos. V. cholerae é

encontrado no trato gastrintestinal de humanos, na água e ocasionalmente em

alimentos.

4. Cocos gram positivos:

Neste grupo estão incluídas as bactérias aeróbias e anaeróbias

facultativas da família Micrococcaceae (Micrococcus e Staphylococcus) e os

cocos pertencentes aos gêneros Aerococcus , Enterococcus , Lactococcus ,

Leuconostoc , Streptococcus , Pediococcus e Vagococcus .

Gênero Micrococcus : São células bacterianas esféricas. São

comumente encontradas no solo, água, pó e pele do homem e dos animais.

Algumas espécies são termodúricas, resistem ao tratamento de pasteurização,

outras com freqüência nos utensílios e nos equipamentos utilizados pelos

manipuladores dos alimentos insuficientemente lavados e sanitizados.

Gênero Enterococcus : O enterococcos são um grupo de

micorganismos que vêm-se destacando nos últimos anos como patógenos

oportunistas. A distribuição de enterococos na natureza é ampla e eles fazem

parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato

intestinal. A maioria é relativamente resistente ao congelamento. As espécies

mais encontradas em alimentos são Enterococcus faecalis e E. faecium .

Gênero Staphylococcus : Uma das causas mais freqüentes dos surtos

de intoxicações está relacionada com a presença de toxinas produzidas por

espécies de Staphylococcus aureus . Os S. aureus são encontrados em lesões

de pele e nas vias nasais do homem, sendo facilmente transferidos para os

alimentos.


18

5. Bacilos gram positivos produtores de esporos:

Neste grupo estão os gêneros Bacillus , Clostridium e

Desulfotomaculum , que apresentam a característica comum de produzir

esporos.

Gênero Bacillus : As diferentes espécies podem ser mesófilas ou

termófilas. Pode ser encontrado no solo, água, material fecal e diversos

alimentos. Este grupo abriga espécies patogênicas como B. cereus , que

causam gastrenterites de origem alimentar, numerosas espécies capazes de

deteriorar os alimentos (B. subtilis , B. coagulaus) e espécies empregadas na

produção de alimentos.

Gênero Clostridium: A principal fonte de clostrídio é o solo. São

encontrados no trato intestinal do homem e de animais e nos alimentos. Este

gênero contém duas espécies patogênicas que podem ser veiculadas pelos

alimentos: C. botulinum e C. perfringens .

6. Bacilos gram positivos não esporulados:

Pertencem a este grupo as bactérias do gênero Brochothrix ,

Carnobacterium , Kurthia , Lactobacillus e Listeria .

Gênero Listeria : A espécie mais importante deste gênero é a

Listeria monocytogenes associada com doença de origem alimentar devido a

sua patogenicidade, esta espécie causa a listeriose, que pode apresentar

diversas manifestações clínicas: septicemia, que pode resultar em aborto,

endocardite, conjuntivite, meningite etc.

Gênero Lactobacillus : São bactérias que fermentam carboidratos

produzindo ácido lático, podendo ser homo ou heterofermentativos. Devido a

essa propriedade, os lactobacilos pode ser bastante úteis na produção de

alimentos, mas podem causar também a sua deterioração.


19

7. Outras bactérias de interesse:

Mycobacterium;

Propionibacterium;

Brevibacterium;

Corynebacterium .

2 FUNGOS

Os organismos do Reino dos Fungos podem se unicelulares ou

multicelulares. Os fungos multicelulares grandes, tais como cogumelos,

podem parecer algumas vezes como plantas, mas não são capazes de realizar a

fotossíntese, como a maioria das plantas. Os fungos verdadeiros possuem

parede das células composta principalmente de uma substância chamada de

quitina.

As formas unicelulares dos fungos, as leveduras, são

microrganismos ovais, maiores que as bactérias. Os fungos mais típicos são

os bolores.

Ao longo dos últimos dez anos, a incidência de infecções

importantes causadas por fungos tem aumentado. Estas infecções estão

ocorrendo como infecções nosocomiais e em indivíduos com sistema

imunológico comprometido.

Os fungos também são benéficos, são utilizados pelos homens como

alimentos (cogumelos), para a produção de comida (pão) e drogas (álcool).

Das mais de 100.000 espécies conhecidas de fungos, apenas cerca de 100 são

patogênicas dos homens e dos animais. O estudo dos fungos é chamado de

micologia.


20

Os fungos têm sido utilizados na biotecnologia há muitos anos.

Também podem ser usados pela engenharia genética, no controle biológico de

pragas.

2.1 BOLORES

2.1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS

Os bolores formam uma massa visível (chamada de micélio,

composta de longos filamentos – as hifas) que se ramificam e se expandem. O

crescimento semelhante a algodão, algumas vezes encontrado sobre o pão e as

frutas, são micélios de fungos. Eles obtêm seus alimentos absorvendo

soluções de matéria orgânica de seu ambiente que pode ser o solo, a água do

mar, a água doce, um animal ou uma planta hospedeira.

O aspecto macroscópico de todo bolor que cresce na superfície de

um alimento pode indicar a classe e a ordem a que pertence.

Em geral a maioria dos bolores necessita de uma menor quantidade

de umidade disponível. Pode ser calculada a quantidade total de umidade de

um determinado alimento que limita o crescimento dos bolores, por exemplo

14 a 15% nas farinhas e alguns frutos secos impedirá ou retardará o

crescimento dos bolores.

Os bolores, a maioria, são considerados mesófilos (25-30ºC), alguns

podem crescer entre 35-37ºC ou a temperaturas superiores. Alguns são

psicrófilos, crescem em temperaturas de refrigeração, -5 a -10ºC.

São aeróbios, necessitam de oxigênio para crescer (crescem na

superfície dos alimentos).

Quase todos os bolores são capazes de crescer dentro de um amplo

intervalo de pH (entre 2 e 8,5), ainda que a maioria cresça melhor em pH

ácido.


21

Eles util izam muitos tipos de alimentos, desde o mais simples até o

mais complexo.

Alguns bolores produzem substâncias que inibem outros

microrganismos. Determinados compostos químicos se comportam como

micostáticos por inibir o crescimento de bolores (como por exemplo, o ácido

sórbico, os propionatos e os acetatos), outros são especificamente fungicidas

por destruir os bolores.

O início do crescimento dos bolores é lento quando comparado com

as bactérias e as leveduras.

2.1.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS

Gênero Aspergillus : São bolores muito abundantes, compreendem

mais de 100 espécies. Algumas espécies como A. glaucus e A. repens , são

importantes agentes de deterioração de alimentos. Muitas espécies como A.

orizae e A. soyae , são utilizados na produção de alimentos. A. niger é

util izado para produção comercial de ácidos cítrico, glucônico etc. Algumas

espécies, como A. flavus e A. parasiticus , são produtoras de micotoxinas

(aflatoxinas, ocratoxina A).

Gênero Mucor : Esse gênero de bolor pode ser encontrado no solo,

esterco, frutas, vegetais, grãos e outros alimentos. Muitas espécies de Mucor

são utilizadas na produção de queijos e alimentos fermentados orientais. As

espécies mais encontradas nos alimentos são M. pusillus , M. racemosus e M.

rouxii .

Gênero Alternaria: Os bolores deste gênero são, com freqüência,

causadores de deteriorações nos alimentos (tomates, pimentões, maçãs e

frutas cítricas), causando o escurecimento dos tecidos. São encontrados

também em carnes vermelhas; algumas espécies são produtoras de

micotoxinas.


22

Gênero Neurospora : A espécie N. crassa produz esporos que

permanecem viáveis no ambiente por muitos anos; a espécie N. sitophila

produz pigmentos de coloração rósea e é comum em pães, crescem também em

bagaço de cana-de-açúcar e diferentes alimentos.

Gênero Penicill ium: Este gênero de bolores é freqüente e possuem

incidência de grande importância para os alimentos. Várias espécies como P.

expansum , P. digitatum e P. italicum são responsáveis pelos processos

degradativos de frutas cítricas, as espécies P. cyclopium e P. viridicatum

causam deterioração de grãos e cereais. Muitas espécies de Penicill ium são

empregadas na produção de alimentos, especialmente queijos. A espécie P.

camembertii , util izado para fabricação de queijos camembert e brie e a

espécie P. roquefortii , empregado na fabricação dos queijos roquefort e

gorgonzola. Algumas espécies são produtoras de antibióticos e outra de

micotoxinas.

Gênero Fusarium: Os bolores pertencentes a este gênero crescem

com freqüência na superfície dos alimentos com aspectos algodonosos nas

frutas cítricas, abacaxis e figos. Algumas espécies são produtoras de

micotoxinas.

Gênero Rhizopus : São agentes deteriorantes comuns em alimentos

de origem vegetal, por serem termorresistentes, estas enzimas não são

eliminadas durante o processamento térmico dos vegetais, o que pode causar a

podridão mole pós-processamento.

3 LEVEDURAS

3.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS

As leveduras são fungos unicelulares, não-filamentosos,

caracteristicamente esféricos ou ovais, são amplamente distribuídos na

natureza: são freqüentemente encontradas como um pó branco cobrindo frutas

e folhas.


23

As leveduras que se encontram nos alimentos podem ser benéficas

ou prejudiciais. As fermentações produzidas pelas leveduras intervêm da

elaboração dos alimentos como pão, cerveja, diferentes tipos de vinhos,

vinagre e os queijos maturados. As leveduras são prejudiciais quando

produzem alterações nos sucos de frutas, xarope, melaço, mel, carnes, vinhos,

cerveja e outros alimentos.

As leveduras se classificam principalmente baseada nas suas

características morfológicas, ainda que para a microbiologia dos alimentos,

suas propriedades fisiológicas têm maior importância.

As características morfológicas das leveduras são determinadas

mediante observação microscópica. A forma pode ser desde esférica a ovóide,

alimonada, cilíndrica e triangular.

O crescimento das leveduras se verifica através de um véu na

superfície do meio líquido e produção de um pigmento carotenóide. O aspecto

do crescimento desse microrganismo tem importância quando este produz

pigmento na superfície dos alimentos.

Nos cultivos em Agar é difícil diferenciar as colônias de leveduras

de colônias de bactérias, a observação microscópica dos microrganismos é a

única forma segura que existe para a diferenciação. A maioria das colônias

jovens das leveduras é úmida e mucosa, são colônias brancas, cremes ou

rosadas.

São oxidativas, fermentativas. Na superfície de um líquido, as

leveduras oxidativas podem crescer em forma de película, de véu, ou de

espuma; são denominadas leveduras formadoras de película. As leveduras

fermentativas crescem em toda massa do líquido e produzem dióxido de

carbono.

A maioria das leveduras cresce em substratos com elevadas

concentrações de açúcar e de sal, necessitam de mais umidade do que os

bolores. O intervalo de temperaturas de crescimento da maioria das leveduras


24

é semelhante dos bolores com a temperatura ótima em torno de 25-30ºC e uma

temperatura máxima de 35-47ºC.

Algumas espécies são capazes de crescer à temperatura de 0ºC ou

inferiores. Uma reação ácida próxima de pH 4 a 4,5 estimula o crescimento da

maioria das leveduras.

As leveduras crescem melhor em aerobiose; algumas espécies do

tipo fermentativo são capazes de crescer, lentamente em anaerobiose.

Em geral, os açúcares são fontes de energia mais apropriada para as

leveduras, mesmo as oxidativas.

3.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS

Gênero Candida : Algumas espécies crescem em película e são

capazes de alterar os alimentos com acidez e concentração de sal elevada, são

mais encontradas em carnes, manteiga, margarinas. Estas leveduras têm sido

envolvidas em processos de deterioração de vários tipos de alimentos: como

frutas frescas, vegetais, bebidas alcoólicas e refrigerantes.

Gênero Torulopsis : Estas leveduras fermentativas causam problemas

nas fábricas de cervejas e alteram vários tipos de alimentos. A espécie T.

sphaerica fermenta a lactose, capaz de alterar os produtos lácteos. Outras

espécies são capazes de alterar leite condensado, frutas e os alimentos ácidos.

Gênero Pichia: Estas leveduras crescem em superfície dos líquidos

(cervejas e vinhos) em forma de película.

Gênero Rhodotorula : Estas leveduras de cor vermelha, rosa ou

amarelo podem produzir manchas na superfície dos alimentos, manchas de

diferentes cores na superfície de carnes.

Gênero Debaromyces : As espécies de Debaromyces têm elevada

tolerância ao sal (18-20%) e pertencem ao grupo das leveduras formadoras de


25

películas na superfície de alimentos salgados ou mantidos em salmoura.

Também crescem nos queijos e embutidos.

Gênero Schizosaccharomyces : Essas leveduras têm intensa atividade

fermentativa, requerendo vitaminas para sua multiplicação. Têm sido

associadas à deterioração de frutas e vinhos. Algumas espécies são

xerotolerantes, crescendo em mel, balas, caldo de cana etc.

Gênero Saccharomyces : A espécie do tipo S. cerevisae é muito

empregada na indústria de alimentos, com várias finalidades: fermentação de

pães, bebidas (cervejas, vinhos), fermentação de álcool, glicerol e outras

aplicações em processos tecnológicos. As leveduras de superfície são

fermentadoras muito ativas e crescem rapidamente a 20ºC.

Essas espécies estão freqüentemente envolvidas em alterações

indesejáveis em muitos alimentos como frutas, laticínios (leite, manteiga etc)

maioneses, mel, vinagres e produtos fermentados. A espécie S. cerevisae é

uma mistura de inúmeras linhagens, muito especialmente selecionadas e

exploradas para fins industriais.

A maioria das leveduras que é util izada na indústria de alimentos

pertence ao gênero Saccharomyces .


26

CCAAPPÍÍTTUULLOO II II II

PPAARRÂÂMMEETTRROOSS IINNTTRRÍÍNNSSEECCOOSS EE EEXXTTRRÍÍNNSSEECCOOSS DDOOSS

AALLIIMMEENNTTOOSS QQUUEE AAFFEETTAAMM OO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO MMIICCRROOBBIIAANNOO

xistem muitos fatores que afetam o crescimento bacteriano

e, portanto, podem aumentar a probabilidade de ocorrência

de enfermidades transmitidas por alimentos. Esses fatores

podem estar relacionados às características do alimento (intrínsecos) ou ao

ambiente em que este alimento se encontra (extrínsecos).

E

1 FATORES INTRÍNSECOS

Esses fatores são aqueles relacionados com as características

próprias do alimento que podem estimular ou retardar o crescimento

microbiano.

Esses fatores são os seguintes:

pH;

Atividade de água;

Potencial de oxi-redução;

Nutrientes;

Constituintes antimicrobianos;

Estruturas biológicas;

Cada microrganismo tem um pH mínimo, ótimo e máximo de

crescimento.


27

Em geral, as leveduras e os bolores toleram melhor a acidez do que

as bactérias. O pH intrínseco dos alimentos é diferente em cada um deles,

mesmo que a maioria tenha um pH neutro ou ácido. Os alimentos cujo pH é

baixíssimo (valores inferiores a 4,5) não são alterados facilmente pelas

bactérias, sendo mais sensíveis às alterações por leveduras e bolores. Todo

alimento que tem um pH intrinsecamente baixo tende a ser mais estável, do

ponto de vista microbiológico do que um alimento neutro.

Os bolores são capazes de crescer dentro de uma escala mais ampla

de valores de pH do que as leveduras e as bactérias. O crescimento das

leveduras fermentativas é estimulado por um pH de aproximadamente 4,0 a

4,5. O crescimento da maioria das bactérias é estimulado por um pH próximo

da neutralidade, embora algumas como os acidificantes cresçam em pH médio,

enquanto que outras, como por exemplo as bactérias com atividade

proteolítica, são capazes de crescerem em pH elevado (básico), as bactérias

da clara dos ovos armazenados.

1.1 EFEITOS DO PH

O efeito adverso do pH tem pelo menos dois aspectos:

afeta principalmente a respiração dos microrganismos por ação

em suas enzimas e no transporte de nutrientes para dentro da

célula microbiana.

o pH desfavorável provoca um aumento na fase lag da

multiplicação microbiana.

A membrana citoplasmática dos microrganismos é relativamente

impermeável aos íons H+ e OH-.

De acordo com o pH, os alimentos são subdivididos em três grupos:

alimentos de baixa acidez, que têm pH superior a 4,5.

alimentos ácidos, têm pH entre 4,0 e 4,5;


28

alimentos muito ácidos, têm pH inferior a 4,0.

Os alimentos de baixa acidez (pH > 4,5) são os mais sujeitos à

multiplicação microbiana espécies patogênicas e deteriorantes.

Para os alimentos ácidos (pH entre 4,0 e 4,5), há predominância de

crescimento de leveduras, bolores e de algumas poucas espécies bacterianas,

como as bactérias lácticas e algumas espécies de Bacillus .

Já para os alimentos muito ácidos (pH < 4,0), o desenvolvimento

microbiano fica restrito quase que exclusivamente a bolores e leveduras

(Figura 1 e Tabela 1).

pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Bolores

Leveduras

Alicyclobaci l lus spp.

Salmonel la spp.

Acetobacter spp.

Lis ter ia monocytogenes

Yersin ia enterocol i t ica

Escherichia col i

Clos tr id ium botul inum

Baci l lus cereus

Campylobacter spp .

Shigel la spp.

Vibrio parahaemolyt icus

Vibrio cholerae

Clostr id ium perfr ingens

Fonte : Jay (2000)

Figura 1 . pH aproximado para o crescimento de alguns microrganismos de

origem alimentar.


29

Tabela 1 . Valores de pH de diversos alimentos.

Faixa de pH Alimento pH

Baixa acidez (pH 7,0-5,5)

Leite

Carne vermelha

Peixe

Pão

Manteiga

6,3-6,5

6,2-5,4

6,6-6,8

5,3-5,8

6,1-6,4

Média acidez (pH 5,3-4,5)

Vegetais fermentados

Queijo Cottage

Bananas

Vagem

5,1-3,9

4,5

4,5-5,2

4,6-5,5

Ácido (pH 4,5-3,7) Maionese

Tomates

4,1-3,0

4,0

Muito ácido (<pH 3,7)

Picles em conserva e

Sucos de fruta

Chucrutes

Frutas cítricas

Maçãs

3,9-3,5

3,3-3,1

3,5-3,0

2,9-3,3

Fonte: Forsythe (2002)

1.2 ATIVIDADE DE ÁGUA (A W)

Um dos métodos mais antigos de preservação dos alimentos é a

secagem. A preservação dos alimentos pela secagem é uma conseqüência

direta da remoção da água sem os quais os microrganismos não crescem.

A quantidade exata de água necessária para o crescimento dos

microrganismos é variável.

Define-se atividade de água de um alimento ou de uma solução

qualquer como sendo a relação existente entre a pressão de vapor da água

contida na solução ou no alimento.


30

Para a água pura a atividade de água é 1,00. Os microrganismos não

se multiplicam em água pura, o limite máximo para o crescimento microbiano

é ligeiramente menor do que 1,00.

A atividade de água da maioria dos alimentos frescos é acima de

0,99. Os valores mínimos para o crescimento de alguns microrganismos nos

alimentos são apresentados na Tabelas 2 e 3.

Tabela 2. Principais grupos de alimentos e seus valores de aw.

Valores de aw Alimentos

≥0,98

Carne e pescado frescos

Frutas e hortaliças frescas

Leite

Hortaliças enlatadas em salmoura

0,93-0,98

Estrato de tomate

Carnes curadas enlatadas

Embutidos fermentados

Queijo submetido a tratamento industrial

0,85-0,93

Embutidos secos ou fermentados

Leite condensado

Queijo

0,60-0,85

Frutas secas

Farinha

Cereais

Compotas e geléias

≤0,60

Chocolate

Mel

Biscoito

Batata inglesa

Ovos e hortaliças desidratados

Leite em pó

Fonte: Frazier e Westhoff (2003)


31

Tabela 3 . Valores de aw para multiplicação de microrganismos importantes

em alimentos.

Microrganismos aw

Pseudomonas spp. 0,97

Escherichia coli 0,96

Enterobacter aerogenes 0,95

Clostridium botulinum t ipos A e B 0,94

Vibrio parahaemolyticus 0,94

Mucor spinosus 0,93

Rhizopus spp. 0,93

Candida spp. 0,90

Staphylococccus aureus 0,86

Aspergillus spp. 0,70

Fonte: Frazier e Westhoff (2003)

Geralmente, as bactérias possuem valores mais altos de aw para o

crescimento do que os fungos.

Nas bactérias, a aw ótima e seu limite inferior para o seu

crescimento, são distintos para cada espécie, variando também em função do

tipo de alimento, da temperatura, do pH e da presença de oxigênio e de

inibidores, seus valores são menores para as bactérias capazes de crescer em

meios com elevadas concentrações de açúcar e de cloreto de sódio.

Os efeitos da baixa aw exercem influência sobre:

diminuição da velocidade de multiplicação;

diminuição da produção máxima de células;


32

quanto mais desfavorável é a aw do substrato, tanto menor é a

demora (fase lag) com que se inicia o crescimento dos

microrganismos ou a germinação dos esporos.

1.3 POTENCIAL DE OXI-REDUÇÃO

O poder oxidante e redutor do próprio alimento influi no tipo de

microrganismo e nas modificações que ocorrem. O potencial de oxi-redução

de um alimento é definido pela capacidade de compensação do alimento, é

afirmar sua resistência a modificar seu potencial pela pressão do oxigênio da

atmosfera existente em torno do alimento.

Os microrganismos são classificados em: aeróbios – quando

necessitam de oxigênio livre, anaeróbios – quando crescem melhor na

ausência de oxigênio livre – e facultativos – quando crescem bem tanto em

aerobiose quanto em anaerobiose. Os bolores são aeróbios; a maioria das

leveduras cresce melhor em anaerobiose, enquanto que as bactérias das

diferentes espécies podem ser aeróbias, anaeróbias ou facultativas.

Do ponto de vista do potencial de oxi-redução, um potencial

elevado (oxidante) favorece o crescimento dos microrganismos aeróbios,

ainda que permita o crescimento dos facultativos, enquanto que um potencial

baixo (redutor) favorece o crescimento tanto dos microrganismos anaeróbios

como os facultativos.

O crescimento de um determinado microrganismo pode modificar o

potencial de oxi-redução de um alimento o suficiente, como para impedir que

cresçam outros. É possível que os anaeróbios, reduzam o potencial de oxi-

redução até um valor que iniba o crescimento aeróbio.

O potencial de oxi-redução (Eh) pode ser medido com instrumentos

sendo expresso em milivolts (mV). Um substrato muito oxidado tende a um Eh

positivo, enquanto que o Eh de um substrato reduzido será negativo.


33

A maioria dos alimentos frescos, tanto os de origem vegetal quanto

os de origem animal, têm em seu interior um potencial de oxi-redução baixo e

bem equilibrado – os de origem vegetal porque contêm substâncias redutoras

(por exemplo, ácido ascórbico e açúcares redutores) e os tecidos animais

porque contêm radicais sulfídrico (–SH) e outros grupos redutores.

1.4 NUTRIENTES

A quantidade de nutrientes existentes no alimento é de grande

importância para o crescimento dos microrganismos e os principais são:

água

fonte de energia

fonte de nitrogênio

vitaminas

minerais

A importância da água para o crescimento dos microrganismos

segue em ordem, os bolores (necessitam de menor quantidade), leveduras e

bactérias.

Como fonte de energia os microrganismos podem utilizar açúcar,

álcool e aminoácidos. Poucos microrganismos são capazes de utilizar

carboidratos complexos, como os amidos e celulose, como fonte de energia,

primeiro eles degradam esses compostos para açúcar simples, as gorduras são

usadas também pelos microrganismos como fonte de energia, esses compostos

são ligados, portanto, apenas pequenos números de microrganismos nos

alimentos.

As fontes de nitrogênio mais importantes para os microrganismos

são os aminoácidos, mas uma grande variedade de outros compostos

nitrogenados também pode ser util izada por vários tipos de microrganismos,


34

por exemplo, são capazes de metabolizar nucleotídeos e aminoácidos, outros

são capazes de utilizar peptídeos e proteínas.

As vitaminas são importantes fatores de crescimento de

microrganismos, uma vez que fazem parte de diversas coenzimas envolvidas

em várias reações metabólicas. Entre as vitaminas, as mais importantes são as

do complexo B, biotina e o ácido patotênico. Entre os microrganismos,

verifica-se que as bactérias gram positivas são mais exigentes em suas

necessidades de vitaminas que as bactérias gram negativas, que juntamente

com os bolores, são capazes de sintetizar todos os seus fatores de

crescimento, conseqüentemente esses dois grupos de microrganismos podem

ser encontrados nos alimentos com baixo teor de vitamina B.

Embora necessários em quantidades muito reduzidas, os minerais

são indispensáveis para o crescimento dos microrganismos, pois estão

envolvidos em muitas reações enzimáticas. Entre esses minerais, destacam-se

o sódio, potássio, cálcio e magnésio. Outros como ferro, cobre, manganês,

zinco, cobalto, fósforo e enxofre podem ser igualmente importantes.

1.5 CONSTITUINTES ANTIMICROBIANOS

A estabilidade de alguns alimentos contra ao ataque dos

microrganismos é devido à presença de algumas substâncias naturalmente

presentes nos alimentos com atividade antimicrobiana, com a capacidade de

retardar ou até mesmo impedir a multiplicação dos microrganismos.

Algumas espécies de plantas são conhecidas por apresentarem

compostos antimicrobianos (óleos essenciais) como, por exemplo, os

condimentos, são um bom exemplo, pois vários óleos essenciais com atividade

antimicrobiana, eugenol no cravo, alicina no alho, t imol no orégano etc.

O ovo, em especial a clara tem diversos agentes antimicrobianos

naturais; é rica em lisozima, enzima capaz de destruir a parede celular

bacteriana, sendo especialmente ativa em bactérias gram positivas.


35

O leite bovino também contém numerosas substâncias

antimicrobianas naturais, que podem agir especificamente ou não. Entre os

compostos de ação específica estão as imunoglobulinas, o fator complemento,

os macrófagos e os linfócitos.

A lactoferrina do leite também possui atividade antimicrobiana.

Trata-se de uma proteína que inibe a multiplicação através da retirada de íons

ferro do leite. Outras substâncias como a lisozima, naturalmente presente no

leite e a nisina, produzida por bactérias lácticas no leite, também são

importantes no controle do desenvolvimento microbiano.

Os derivados do ácido hidroxicinâmico, encontrados em frutas e

vegetais, são importantes agentes antimicrobianos, com ação

predominantemente sobre bactérias e alguns fungos, assim como os taninos

presentes em frutas e sementes. As frutas contêm ácidos orgânicos e óleos

essenciais importantes na inibição da multiplicação microbiana.

1.6 ESTRUTURAS BIOLÓGICAS OU SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS

A cobertura natural de alguns alimentos é responsável pela

excelente proteção contra a entrada e subseqüente perda causada pelos

organismos deteriorantes. Estas estruturas funcionam como barreiras

mecânicas para a penetração de microrganismos, impedindo o crescimento de

determinadas espécies.

Nessa categoria estão a casca de nozes, das frutas e dos ovos, a pele

de animais e película que envolve as sementes.

Todo microrganismo que cresce em um alimento pode produzir uma

ou mais substâncias inibidoras para outros microrganismos, como por

exemplo, ácidos, álcoois, peróxidos, antibióticos.

O ácido propiônico produzido pelas bactérias propiônicas no queijo

suíço, inibe os bolores.


36

A nisina produzida por determinadas cepas de Streptococcus lactis ,

pode inibir os clostrídios.

Cada um dos fatores próprios da composição dos alimentos, aw, pH,

potencial de oxi-redução etc. , podem influenciar de forma importante no tipo

da microbiota resultante. Alguns destes fatores podem interagir entre si .

Com a finalidade de impedir ou retardar o crescimento dos microrganismos,

podemos manipular vários desses fatores em vez de ajustar apenas um.

2 FATORES EXTRÍNSECOS

Os fatores extrínsecos dos alimentos são aquelas propriedades

ambientais de armazenamento que afetam os alimentos e os microrganismos.

São os seguintes:

temperatura ambiental;

umidade relativa;

presença e construção de gases do ambiente.

2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL

O fator ambiental mais importante que afeta a multiplicação dos

microrganismos é a temperatura.

Os microrganismos podem multiplicar-se em uma faixa bastante

ampla de temperatura, sendo -34ºC a menor temperatura e 110ºC a maior.

Os microrganismos são classificados de acordo com as

temperaturas:

psicrófilos;

psicrotróficos;


37

mesófilos;

termófilos (termódicos).

Os microrganismos psicrófilos -0º e 20ºC temperatura ótima de

crescimento 10º e 15ºC.

Os microrganismos psicrotrófilos -0º e 7ºC como nem todos os

psicrotrófilos crescem na mesma temperatura eles foram classificados em:

europsicrotrófilos e estenopsicrotrófilos:

europsicrotrófilos são aqueles que tipicamente não formam

colônias visíveis entre 6 a 10 dias a 0ºC e 7ºC (por exemplo,

Enterobacter cloacae , Hafnia alvei e Yersinia enterocolitica);

estenopsicrotrófilos são aqueles que tipicamente formam colônias

visíveis em 5 dias nessa faixa de temperatura (por exemplo,

Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophila – crescem muito bem

até 7ºC em 3-5 dias, mas não crescem a 40ºC)

As espécies de bactérias e cepas que podem crescer a 7ºC ou abaixo

dessa temperatura são largamente distribuídas entre as gram negativas e bem

distribuídas entre as gram positivas.

A menor temperatura registrada de crescimento dos microrganismos

nos alimentos é -34ºC (leveduras e bolores), devido a atividade de água.

Para as bactérias tem sido registrado o crescimento em torno de -

20ºC.

Os alimentos que provavelmente suportam o crescimento

microbiano a essas temperaturas são: suco de frutas concentrado, bacon,

sorvete e certos tipos de frutos.

Os microrganismos psicrófilos e psicrotrófilos multiplicam-se bem

em alimentos refrigerados, sendo os principais agentes de deterioração de

carnes, pescado, ovos, frangos etc. Nesse grupo podem ser incluídos os


38

seguintes gêneros: Pseudomonas , Alcaligenes , Flavobacterium , Micrococcus e

outros.

Microrganismos mesófilos: temperatura ótima de multiplicação

entre 25º e 40ºC, mínima entre 5º e 25ºC e máxima entre 40º e 50ºC.

Os microrganismos mesófilos correspondem à grande maioria de

importância em alimentos, incluindo a maior parte dos patógenos de interesse.

Microrganismos termófilos: temperatura ótima de multiplicação

entre 45º e 65ºC, mínima entre 35º e 45ºC e máxima entre 60º e 90ºC.

A maioria das bactérias termófilas importantes em alimentos

pertencem aos gêneros Bacillus e Clostridium , incluindo tanto espécies

deteriorantes (Bacillus coagulaus , Clostridium thermosaccharolyticum),

quanto espécies patogênicas (Clostridium botulinum , Clostridium

perfringens).

Alguns membros do grupo Archaea apresentam uma temperatura

ótima de crescimento em torno ou superior a 80ºC. estas bactérias são

denominadas termodúricas, ou, algumas vezes de hipertermófilos. A maioria

destes organismos vive em fontes de águas quentes associadas à atividade

vulcânica. A temperatura mais alta conhecida que suporta o crescimento

bacteriano é de 100ºC.

2.2 UMIDADE RELATIVA

A umidade relativa influencia diretamente a atividade de água do

alimento. Se um alimento com baixa atividade de água está armazenado em

um ambiente com alta umidade relativa, a atividade de água deste alimento

aumenta, permitindo a multiplicação de microrganismo.

A combinação entre umidade relativa e temperatura não pode ser

desprezada. Geralmente, quanto maior a temperatura de armazenagem, menor


39

a umidade relativa, e vice-versa. Alterando o gás da atmosfera é possível

retardar a multiplicação de microrganismos sem diminuir a umidade relativa.

Alimentos que passam por processos de deterioração causados por

bolores, leveduras e certas espécies de bactérias devem ser estocados sob

condições de baixa umidade relativa.

2.3 PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE GASES DO AMBIENTE

A composição gasosa do ambiente que envolve um alimento pode

determinar os tipos de microrganismos que poderão predominar. A presença

de oxigênio favorecerá a multiplicação de microrganismos aeróbios, enquanto

que sua ausência favorecerá aos anaeróbios, embora haja bastante variação na

sensibilidade dos anaeróbios ao oxigênio.

Modificações na composição gasosa são capazes de causar

alterações na microbiota que sobrevive ou que se multiplica em determinado

alimento.

Atmosferas modificadas correspondem a ambientes nos quais o

oxigênio total ou parcialmente substituído por outros gases, são empregadas

como recurso tecnológico para aumentar a vida útil dos alimentos.

Embalagens contendo diferentes combinações entre oxigênio, nitrogênio e gás

carbônico são as mais empregadas industrialmente, embora outros gases

possam também ser utilizados (monóxido de carbono, óxido nitroso e dióxido

de enxofre). A embalagem a vácuo é também bastante empregada em especial

para carnes.

O dióxido de carbono (CO2) é o gás atmosférico mais importante

usado para o controle de microrganismos nos alimentos. O efeito

antimicrobiano depende de inúmeros fatores. O mais importante é a

temperatura, sendo que o efeito é mais intenso quanto mais baixa for a

temperatura. Portanto, o armazenamento do alimento em temperatura

inadequada pode cancelar a ação biostática do CO2. Além disso, a ação do


40

CO2 é dependente do pH e da aw do alimento, dos tipos e das condições

metabólicas dos microrganismos presentes e da concentração do CO2.

Atmosferas contendo 10% de CO2 são utilizadas, há muito tempo,

para prolongar o tempo de armazenamento de frutas, especialmente maçãs e

pêras. Atmosferas contendo CO2 vêm sendo empregadas também para

prolongar o tempo de armazenamento de carnes vermelhas.

Ozônio (O3) É outro gás atmosférico que tem propriedades

antimicrobianas, e tem sido usado para prolongar a vida útil de certos

alimentos e tem sido efetuado contra uma variedade de microrganismo.

3 COMBINAÇÃO DOS PARÂMETROS INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS

O conhecimento dos fatores intrínsecos e extrínsecos que agem

sobre determinado alimento permite prever sua vida de prateleira, sua

estabilidade microbiológica, conhecer a capacidade de crescimento e/ou

produção de toxinas por microrganismos patogênicos.

Vários fatores ou técnicas são empregados para controlar os efeitos

dos microrganismos nos alimentos; barreiras tecnológicas, combinação de

métodos de preservação.


41

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIVV

AA FFLLOORRAA MMIICCRROOBBIIAANNAA DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS EE

MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS DDEETTEERRIIOORRAANNTTEESS

s alimentos deteriorados são aqueles que têm sabor e odor

desagradáveis. A deterioração é resultado do crescimento

indesejável de microrganismos produtores de compostos

voláteis durante seu metabolismo, os quais o olfato e o paladar humano

podem detectar. Esses microrganismos não causam intoxicações.

O Os termos deteriorados e não-deteriorados são subjetivos – a

aceitação do alimento depende do consumidor e não está relacionada com a

segurança alimentar. Por exemplo: o leite azedo utilizado na fabricação de

doces é inaceitável para beber. A produção de ácido acético durante a

estocagem de vinhos é inaceitável.

A deterioração dos alimentos pode ocorrer devido a diversos

fatores:

danos causados por insetos;

danos físicos devido a batidas, pressão, congelamento, secagem e

radiação;

atividades de enzimas dos próprios tecidos animais e vegetais;

alterações químicas que não são induzidas por microrganismos ou

por enzimas de ocorrência natural;

atividade de bactérias, fungos e leveduras.

Os alimentos podem ser contaminados com uma grande variedade de

microrganismos durante a colheita, o processamento e manipulação.


42

Durante a distribuição e estocagem, as condições serão favoráveis

para a multiplicação de microrganismos específicos, ocasionando a

deterioração.

Essas deteriorações dependem dos parâmetros intrínsecos e

extrínsecos dos alimentos.

A deterioração pode ser retardada por meio da diminuição da

temperatura de estocagem. Para alimentos frescos, as principais alterações na

qualidade podem ocorrer devido:

ao crescimento e metabolismo bacteriano, resultando em

possíveis alterações do pH e formação de compostos tóxicos,

odores desagradáveis e formação de gás e camadas limosas;

à oxidação de lipídeos e pigmentos contidos em alimentos

gordurosos, resultando na liberação de sabor indesejável e na

formação de compostos que possuem efeitos biológicos adversos

ou que favoreçam a descoloração.

a vida de prateleira é dependente do crescimento da microbiota

contaminante, que pode ser inibida por meio de estocagem a frio

ou técnicas de embalagem (embalagem à vácuo e embalagens com

atmosfera modificada).

Quanto maior a carga da microbiota inicial, menor a vida de

prateleira devido ao aumento das atividades microbianas.

Uma grande variedade de microrganismos pode estar presente nos

alimentos se as condições forem favoráveis.

De acordo com a facilidade com que se deterioram os alimentos eles

podem ser classificados em:

1) Alimentos estáveis ou não perecíveis – São grupos de alimentos

que não se deterioram a não ser que sejam manipulados sem o devido cuidado,


43

estão incluídos: açúcar e farinhas, que são produtos que possuem baixa

atividade de água;

2) Alimentos semiperecíveis – Quando os alimentos são

manipulados e conservados de forma apropriada, permanecem sem

deterioração durante bastante tempo; as batatas, maçãs etc;

3) Alimentos perecíveis – Este grupo de alimentos são aqueles mais

importantes para o consumo cotidiano, os quais se deterioram com facilidade

a não ser que sejam utilizados métodos de conservação específicos. Exemplos:

as carnes, o pescado, a maioria das frutas e hortaliças, ovos e leites.

A maioria dos alimentos se enquadra em um dos grupos citados,

alguns se encontram bem próximo ao limite que separa uns dos outros,

portanto, chega a ficar difícil a classificação.

1 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS

As Pseudomonas , Alteromonas e Aeromonas spp. deterioram

produtos lácteos, carne vermelha, carne de frango, peixe e ovos durante a

estocagem a frio. Esses alimentos possuem atividade de água alta e pHs

neutros, além de serem estocados sem atmosfera modificada (isto é, com

níveis normais de oxigênio).

Existem diversos mecanismos de deterioração incluindo a produção

de proteases e lipases termoestáveis, as quais produzem aromas e sabores

desagradáveis no leite mesmo após a morte dos microrganismos pela

pasteurização.

Eles produzem pigmentos na deterioração de ovos. A Erwinia spp. e

várias Pseudomonas spp são responsáveis por aproximadamente 35% das

deteriorações vegetais.


44

2 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NÃO-FORMADORES DE

ESPOROS

As bactérias ácido-lácticas são bastonetes gram positivos que

causam deteriorações típicas em carnes estocadas em embalagens com

atmosfera modificada ou embalagens a vácuo. Acetobacter e Pediococcus spp

podem produzir uma camada limosa espessa em cervejas. Esses

microrganismos podem produzir, ainda ácido láctico em vinhos, causando

gosto amargo. Acetobacter produz ácido láctico em cerveja, também

resultando em sabor amargo ao produto.

3 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE

ESPOROS

Os microrganismos formadores de esporos tais como Bacillus spp. e

Clostridium spp. podem ser importantes deteriorantes de alimentos

processados termicamente, uma vez que seus esporos podem sobreviver ao

processamento.

Os B. cereus podem crescer em leite pasteurizado a 5ºC e produzem

coalho doce. O B. stearothermophilus causa a deterioração ácida sem

estofamento ( f lat sour) em alimentos enlatados. Ele cresce no interior da lata,

produzindo ácidos, isto é, sem produção de gás e, portanto, a lata não incha.

O Clostridium thermosacharolyticum deteriora alimentos enlatados,

produzindo gases e, portanto, a lata estufa. O Desulfotomaculum nigrificans

produz sulfito de hidrogênio, o qual causa estufamento de latas e mau cheiro.

Esse fenômeno é conhecido como deterioração com cheiro de enxofre.

4 BOLORES E LEVEDURAS DETERIORANTES

Os bolores e leveduras são mais resistentes a baixas atividades de

água e pHs ácidos do que as bactérias. Deterioram alimentos como vegetais e

produtos de panificação. Produzem enzimas pectínólicas, que amaciam os


45

tecidos vegetais, causando putrefação. Estima-se que 30% da deterioração de

frutas ocorre devido ao fungo Penicill ium . O pão é deteriorado por Rhizopus

nigricans (bolor preto, manchas pretas), Penicill ium (bolor verde).

As leveduras são capazes de crescer em altas concentrações de

açúcar (65-70%) e deterioram geléias, xaropes e mel. Os fungos podem

produzir também diversos tipos de deterioração de carnes devido aos

microrganismos Mucor , Rhizopus (Tabela 4).

Tabela 4 . Fungos deteriorantes de alimentos.

Microrganismos Produtos tipicamente afetados

Aspergillus versicolor Pão e produtos lácteos

A. flavus Cereais e castanhas

A. niger Temperos

Fusarium oxysporum Fruta

Mucor spp Carne

Neurospora sitophila Pão

Penicillium roqueforti Carne, ovos e queijos

P. expansum Fruta e vegetais

P. discolor Queijo

Penicill ium spp Pão

Rhizopus nigricans Pão

Rhizopus spp Carne

Saccharomyces spp Refrigerantes, geléias, xaropes e mel

Trichoderma harzianum Margarina



46

Os métodos de preservação usualmente empregados para controlar o

crescimento de fungos são:

altas temperaturas;

conservantes ácidos fracos (ácido sórbico);

antibióticos.

OBS: Alguns fungos já desenvolveram resistência ao ácido sórbico,

produzindo pentadieno, de odor desagradável.

5 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS

O leite é um meio ideal para o crescimento de bactérias, deve

sempre ser mantido sob refrigeração. A deterioração do leite é conseqüência

de microrganismos psicrófilos, que produzem lípases e proteases que não são

desnaturadas durante a pasteurização. Os microrganismos que produzem essas

enzimas são: Pseudomonas , Aeromonas , Serratia e Bacillus spp.

Essas enzimas hidrolisam as proteínas do leite, produzindo

peptídeos que azedam o produto. Portanto, altas contagens microbianas antes

da pasteurização são indesejáveis. Entre as bactérias indesejáveis podemos

mencionar os Estreptococos lácticos, as bactérias do grupo coliforme, os

bacilos psicrófilos gram negativos e as bactérias termodúricas. Quando o leite

contém quantidade mínima de microrganismo, sobretudo aqueles que crescem

com facilidade, sua qualidade ou conservação é melhor. O tipo de

microrganismo existente no leite é extremamente importante, em geral, quanto

menor é a sua carga microbiana inicial, melhor é a sua qualidade de

conservação. O número de bactérias presentes no leite é indicativo das

condições higiênicas adotadas, assim como os cuidados empregados na

manipulação durante a sua obtenção.


47

6 DETERIORAÇÃO DE CARNE BOVINA E AVES

As carnes são produtos altamente perecíveis com atividade de água

suficiente para o crescimento da maioria dos microrganismos. Por ser um

produto nutritivo, a carne pode ser deteriorada rapidamente por causa do

crescimento de microrganismos e até ser prejudicial à saúde devido à

contaminação de patógenos. A carne por si só, é estéril quando no corpo do

animal. Entretanto, pode ser contaminada facilmente durante o abate, a

evisceração, a manipulação no processamento e estocagem inadequada.

Como conseqüência das distintas procedências dos microrganismos

são muitas as espécies microbianas que provavelmente contaminam as carnes.

Sendo as mais importantes: Pseudomonas , Acinetobacter , Micrococcus ,

Sarcina , Leuconostoc , Lactobacillus , Proteus , Bacillus , Clostridium ,

Alcaligenes , Escherichia , Campylobacter e Salmonella .

Muitas destas bactérias são capazes de crescer a temperaturas de

refrigeração. Também existe a possibilidade da contaminação por

microrganismos patógenos para o homem (bactérias entéricas).

A pele de aves pode carregar diversos organismos deteriorantes:

Pseudomonas spp., Enterobacter spp. etc. O patógeno C. jejuni também pode

estar presente na pele e, conseqüentemente, ser transferido para a superfície

de trabalho. Os patógenos como Salmonella Enteritidis podem infectar os

ovários e os ovodutos de galinha e conseqüentemente, os ovos, principalmente

durante a formação da casca. As cascas dos ovos tornam-se contaminadas com

bactérias intestinais durante a passagem pela cloaca e com o contato com a

superfície das incubadoras.

As bactérias encontradas em carne de frango incluem: S. aureus , L.

monocytogenes e Cl. botulinum do tipo C (não patogênico para adultos

saudáveis). As linhagens de S. aureus encontradas em aves não são

patogênicas ao homem. Os alimentos à base de frango com Staphylococcus

são normalmente contaminados após cocção por manipuladores infectados.


48

As carcaças, em temperaturas maiores que 20ºC, serão prontamente

deterioradas por bactérias provenientes do intestino dos animais, as quais

contaminam a carne durante a evisceração. A microbiota deteriorante é

dominada por microrganismos mesófilos tais como Escherichia coli ,

Aeromonas spp., Proteus spp.

Em temperaturas abaixo de 20ºC, a microbiota deteriorante será

constituída por psicrófilos como Pseudomonas spp. A temperatura de

refrigeração de 5ºC ou menor a microbiota deteriorante será predominante de

Pseudomonas . Essas bactérias são aeróbias e, portanto, somente crescem na

superfície dos alimentos até uma profundidade de 3 a 4mm.

7 DETERIORAÇÃO DE PESCADOS

O termo “pescado” se refere a todas as espécies comestíveis de água

doce e marinha, compreendendo os peixes, crustáceos, moluscos, anfíbios e

quelônios. A variedade de produtos derivados do pescado é muito ampla e

inclui alimentos preparados por vários métodos tecnológicos tradicionais e

modernos.

Como os pescados são de grande importância para a nutrição

humana mundial, muitos países os util izam na sua dieta como parte principal

de proteínas de alto valor biológico, uma vez que estas possuem todos os

aminoácidos essenciais, especialmente lisina.

A carne do pescado é um excelente substrato para o crescimento da

maioria das bactérias heterotróficas. De acordo com Jay (2000), as bactérias

responsáveis pela deterioração do pescado são, principalmente, as gram

negativas, tais como as Pseudomonas , capazes de crescer a menos 3ºC.

A maioria do pescado é tanto mais rica em espécies microbianas

quanto mais poluídas forem as águas das quais advém. Outro ponto importante

a ser considerado é a espécie do pescado, pois sua composição química

também determinará a predominância de diferentes espécies de

microrganismos.


49

A temperatura da água é outro fator significativo no número e

espécie de bactérias na superfície do pescado, a carga microbiana do pescado

após a captura está relacionada às condições ambientais, qualidade

microbiológica da água, temperatura, teor residual de sal, distância entre a

localização da captura e áreas poluídas com dejetos humanos e animais,

origem dos alimentos consumidos pelo pescado e suas condições de

resfriamento.

As bactérias patogênicas associadas a pescados são caracterizadas

em três grupos:

1) as que normalmente estão presentes em ambientes marinhos e

estuarinos (bactérias do gênero Vibrio , Listeria monocytogenes , Clostridium

botulinum e Aeromonas hydrophila);

2) as enterobactérias (devido a contaminação fecal);

3) as bactérias que contaminam o produto durante o processamento.

O consumo de moluscos bivalves está freqüentemente associado a

elevado número de doença de origem alimentar em função de suas

propriedades fil tradoras e, conseqüentemente, bioacumuladores de

microrganismos.

Pertencentes à família Vibrionaceae, o Vibrio alginolyticus , V.

cholerae não O1, V. parahaemolyticus e V. vulnificus estão entre os principais

patógenos associados com ostras, sururus encontrados em ambientes marinhos

poluídos.

8 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL

As alterações das hortaliças e de frutas frescas podem ser

conseqüência de causas físicas, atividade de suas próprias enzimas, atividades

de microrganismos, ou de combinações de todos esses fatores.


50

As condições ambientais inadequadas durante sua colheita,

transporte, armazenamento e comercialização, podem favorecer sua alteração.

As enfermidades ou defeitos das hortaliças e das frutas podem ser

devido a multiplicação de um microrganismo que obtém seus nutrientes.

As alterações microbianas das frutas e das hortaliças podem ser

devidas:

à microrganismos patógenos que atuam sobre os talos, folhas,

flores ou raízes da planta, frutos ou ainda em determinadas partes

da planta, util izadas como alimento. Por exemplo: raízes ou

tubérculos, ou sobre várias destas partes da planta.

microrganismos saprófitas os quais são ditos invasores, penetram

nas frutas e hortaliças sadias, como é o caso dos diferentes tipos

de podridão.

Um dos gêneros mais freqüentemente envolvidos com a deterioração

de vegetais é a Erwinia . A podridão mole bacteriana é causada por Erwinia

carotovora , Pseudomonas spp., Xanthomonas , Clostridium e Bacillus . Os

microrganismos hidrolisam a pectina provocando o amolecimento do vegetal,

produzindo odor desagradável e aparência úmida. Alguns dos vegetais

atacados são aspargo, cebola, alho, cenoura, alface, salsão, batata, espinafre,

repolho, melancia, pepino, brócolis, couve-flor.

O gênero Erwinia pertence à família Enterobacteriaceae. São

capazes de crescer a 10ºC e são microrganismos produtores de protopectinase.

Além disso, muitas espécies de Erwinia são capazes de fermentar açúcares e

álcoois existentes em certos vegetais, como ramanose, celobiose e manitol;

esses são compostos que não são utilizados pelas bactérias mais comuns.

Os agentes fúngicos são mais importantes do que as bactérias na

deterioração de alimentos de origem vegetal. Os principais gêneros são:

Rhizopus , Botrytis , Aspergillus , Cladosporium , Fusarium , Alternaria etc.


51

A composição das frutas e das hortaliças influi no provável tipo de

alteração. Portanto, a podridão ocasionada pelas bactérias acontece com maior

freqüência nas hortaliças cuja acidez não é muito elevada e nas frutas

aparecem somente naquelas que não são muito ácidas.

A deterioração fúngica dos vegetais freqüentemente resulta em áreas

de amolecimento, enquanto que as podridões fúngicas de frutas secas, como

maçãs e pêssegos, mostram áreas marrons ou de cor creme, devido ao

crescimento do micélio do bolor. Alguns tipos de fungo apresentam área

infectada seca, dura e freqüentemente descolorida.

Os bolores são mais comuns em frutas e vegetais ácidos, deficientes

em vitamina B e que apresentam superfície moderadamente seca.

Os sucos das frutas e hortaliças possuem uma variação de pH 2,4

para o suco de limão, até 4,2 para o de tomate, e todos eles apresentam

açúcares com variação entre 2% a 17%. O alto teor de água favorece o

crescimento de leveduras e bactérias; os bolores são capazes de crescer na

superfície quando em contato com o ar.

O desenvolvimento das leveduras e bactérias dependerá mais da

temperatura de armazenamento do que da composição do suco. A temperatura

entre 15 e 35ºC favorece o crescimento das leveduras.

As alterações que ocorrem em sucos de frutas armazenadas à

temperatura ambiente são decorrentes da fermentação alcoólica, por leveduras

formadoras de película ou por bolores que crescem na superfície, ou da

oxidação do álcool a ácido acético quando bactérias acéticas estão presentes.

Os concentrados de sucos de frutas e hortaliças, devido a acidez e

teores de açúcares elevados, favorecem a multiplicação das leveduras e das

espécies acidotolerantes e sacarotolerantes dos gêneros Leuconostoc e

Lactobacillus .


52

9 DETERIORAÇÃO DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS

A microbiota do trigo, centeio, milho, farinha e outros produtos é

formada por espécies de bolores dos gêneros Aspergillus e Penicill ium e

algumas espécies de bactérias do gênero Bacillus , Sarcina , Serratia e do

grupo coliforme. A contaminação pode ser formada do solo, do ambiente no

qual são armazenados e aquelas adquiridas durante o processamento. Alguns

microrganismos aeróbios formadores de esporos, como os Bacillus , são

produtores de amilase, o que permite que utilizem farinhas e derivados como

fonte de energia, desde que a umidade seja suficiente.

Do ponto de vista de saúde pública, a contaminação por bolores nos

grãos de cereais e dos produtos derivados têm merecido muito interesse

devido a produção de micotoxina. O isolamento freqüente das espécies de

bolores como Aspergillus flavus e A. parasitucus produtores de aflatoxinas,

avalia a necessidade da redução da contaminação.

10 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO

Os bolores constituem a causa mais importante de alteração do pão

e da maioria dos seus produtos. As temperaturas elevadas durante a cocção

geralmente são suficientes para eliminar os esporos dos bolores no interior e

na superfície do pão, de forma que os bolores que ocasionalmente contaminam

chegam à superfície ou penetram no interior depois da cocção. Os bolores

procedem do ar durante o esfriamento e posteriormente da manipulação ou das

embalagens.

Os principais bolores responsáveis pelas alterações são Rhizopus

stolonifer (aspecto algodonoso, de cor branca e negra), Penicillium expansum

(de cor verde) e Aspergillus niger (de cor negra, produz pigmento amarelo).

Os produtos de panificação, manuseados de maneira adequada,

raramente são afetados por microrganismos, uma vez que apresentam baixa

umidade.


53

11 DETERIORAÇÃO DE ALIMENTOS DOCES

A maioria dos alimentos doces raramente está exposta às alterações

microbianas devido seu elevado teor de açúcar e sua umidade relativamente

baixa; e assim, quando preparados, processados e armazenados com os

devidos cuidados.

As bactérias contaminantes mais importantes dos açúcares de cana

pertencem aos gêneros Bacillus e Clostridium . A deterioração ocorrerá caso

os açúcares sejam armazenados sob condições de extrema umidade, sendo os

microrganismos mais envolvidos: Torula spp. e cepas de Saccharomyces spp.,

que provoca a inversão do açúcar.

Entre as balas, confeitos, bombons e outros produtos recheados com

creme, podem sofrer deteriorações caracterizadas por explosões causadas por

bactérias pertencentes ao gênero Clostridium , principalmente C. sporogenes .

A contaminação por essa bactéria ocorre através do açúcar, amido e,

provavelmente, outros ingredientes.

12 INDICADORES DA VIDA DE PRATELEIRA

O tempo de vida de prateleira é um atributo importante de todos os

alimentos. Pode ser definido como o tempo que se passa desde a produção e a

embalagem do produto até o ponto em que ele se torna inaceitável para o

consumo. É relacionado, então, com a qualidade total do alimento e

diretamente ligado ao planejamento da produção, às especificações dos

ingredientes, ao processo de manipulação e à estocagem (no varejo e na casa

do consumidor). A vida de prateleira depende do alimento (Tabela 5) e é

essencial que os produtores identifiquem os parâmetros intrínsecos e

extrínsecos que limitam esse período.


54

Tabela 5 . Produtos alimentícios e seus tempos de prateleira.

Produtos alimentícios Vida de prateleira esperada

Pão Até 1 semana à temperatura ambiente

Molhos, temperos 1 a 2 anos à temperatura ambiente

Pepino 2 a 3 anos à temperatura ambiente

Alimentos resfriados Até 4 meses entre 0 e 8ºC

Alimentos congelados 12 a 18 meses no congelador

Alimentos enlatados Latas não-envernizadas, 12 a 18 meses

Latas envernizadas, 2 a 4 anos


A vida de prateleira pode ser determinada pela combinação de

análises microbiológicas e químicas de amostras dos alimentos.


55

CCAAPPÍÍTTUULLOO VV

DDOOEENNÇÇAASS DDEE OORRIIGGEEMM AALLIIMMEENNTTAARR

1 BREVE HISTÓRICO

ntigamente, acreditava-se que as doenças, infecções e até

mesmo indisposições físicas eram causadas por “maus

espíritos”.

Segundo registros encontrados, há cerca de 2000 a.C., Moisés

elaborou leis para proteger seu povo contra doenças infecciosas. As mãos

deveriam ser lavadas após o sacrifício dos animais e antes das refeições. Leis

foram estabelecidas para animais comestíveis de todos os tipos. Animais eram

proibidos os quais incluíram os suínos, hoje conhecidos como freqüentes

excretores de salmonelas, assim como reservatórios de parasitas, como a

Trichinella spiralis e Taenia solium e pequenas criaturas como macacos,

ratos, lagartos, cobras e caracóis, todos conhecidos hospedeiros de

salmonelas.

A

A descrição de intoxicações alimentares registradas na história

antiga está geralmente associada a toxinas químicas.

As bactérias causadoras de intoxicações alimentares foram

primeiramente descritas por Gaertner em 1888. Elas foram isoladas do

organismo de um homem que havia morrido durante um surto de gastrenterites

que atingiu 59 pessoas na Alemanha. Em 1896, E. van Ermengem, na Bélgica,

descreveu o Clostridium botulinum , o organismo responsável pelo botulismo.

Entre os anos 1909 e 1923 muitas das bactérias hoje conhecidas

como responsáveis por um grande número de intoxicação alimentar.

Apesar dos extensivos ensinamentos sobre a higiene dos alimentos

para a prevenção de doenças de origem alimentar a incidência de surtos e

casos esporádicos continua a crescer.


56

2 TAMANHO DO PROBLEMA DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR

Muitos casos de doenças ou enfermidades causadas por alimentos

não são notificados, pois seus sintomas são geralmente parecidos com gripes.

É sabido que apenas um pequeno número de casos de enfermidades

causadas por alimentos é notificado aos órgãos de inspeção de alimentos, de

controle e às agências de saúde. Isso se deve, em parte, ao fato de que muitos

patógenos presentes em alimentos causam sintomas brandos, e a vítima não

busca auxílio médico. Portanto, o número de casos notificados pode ser

definido como a ponta do iceberg , tendo em vista o número real de

toxinfecções causadas por alimentos (Figura 2).

Casos notificados

Casos avaliados por médicos de hospitais, mas não notificados.

Doentes que não procuram aconselhamento médico.

Enfermidade branda ou assintomática.

Fonte : Forsythe (2002)

Figura 2 . Pirâmide que ilustra a notificação dos casos: ponta do iceberg .

A quantidade de produtos disponíveis no mercado oferece ao

consumidor a oportunidade de ampla escolha. Entretanto, apesar do progresso

na medicina, na ciência e tecnologia de produção de alimentos, as

enfermidades causadas por patógenos alimentares continuam apresentando

problemas significativos para a saúde e para a economia.


57

As estatísticas brasileiras não são definidas, portanto, acredita-se

que incidência de doenças ou enfermidades microbianas de origem alimentar

em nosso país seja bastante elevada.

Vários agentes causadores de doenças no homem podem ser

transmitidos pelos alimentos:

produtos químicos (metais pesados, pesticidas);

toxinas naturais de plantas e animais (alcalóides, histamina);

parasitas (amebas, helmintos);

bactérias patogênicas;

fungos toxigênicos.

A ocorrência de toxinfecções de origem bacteriana depende do

conjunto de circunstâncias peculiares e de alguns ou todos os seguintes

fatores:

1) o organismo infectante (agente causador) em gêneros

alimentícios, nos manipuladores de alimentos e nos animais;

2) as mãos dos manipuladores de alimentos transmitindo os

organismos dos alimentos crus para os alimentos cozidos e para os

equipamentos, roupas e outros utensílios de cozinha, ou, provavelmente, do

próprio manipulador de alimento para os alimentos cozidos;

3) superfícies contaminadas por alimentos crus;

4) alimentos favoráveis ao crescimento bacteriano;

5) condições favoráveis para estocagem à temperaturas mornas por

um período de 2 horas ou mais;

6) pessoas susceptíveis.

A Organização Mundial de Saúde define enfermidade transmitida

por alimento como sendo aquela de natureza tóxica ou infecciosa causada por


58

agentes que invadem o organismo por meio da ingestão de alimentos

contaminados.

As enfermidades de origem alimentar ocorrem quando uma pessoa

contrai uma doença devido à ingestão de alimentos contaminados com

microrganismos ou toxinas indesejáveis. Essa condição é, freqüentemente,

denominada como toxinfecção alimentar.

Toxinfecções alimentares ou enfermidades transmitidas por

alimentos compreendem:

infecções alimentares;

intoxicações alimentares.

As infecções alimentares são decorrentes da ingestão de alimentos

contaminados com agentes infecciosos com reações provocadas pela sua

presença e seus metabólitos.

As infecções alimentares são divididas em dois tipos:

1) aquelas em que os microrganismos patógenos não

necessariamente se multiplicam no alimento; o alimento só atua como

veiculador. Exemplo: microrganismos patógenos como os que produzem a

tuberculose, a difteria, as disenterias, a febre tifóide, a cólera, hepatite

infecciosa etc;

2) aquelas em que os alimentos podem servir de meio de cultura

para que os microrganismos patógenos se multipliquem e alcancem níveis

capazes para ocorrer uma infecção nos consumidores de alimentos. Exemplo:

enfermidades produzidas por Salmonella , Vibrio parahaemolyticus ,

Escherichia coli .

É provável que os surtos de infecções alimentares do segundo tipo

sejam mais severos que os surtos originados por outros patógenos intestinais.


59

3 INTOXICAÇÕES ALIMENTARES

As intoxicações alimentares são causadas pela ingestão de toxinas

pré-formadoras nos alimentos devido à multiplicação dos microrganismos.

Estas toxinas são produzidas durante a intensa proliferação dos

microrganismos patogênicos no alimento. Pertencem a este grupo:

Clostridium botulinum , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e fungos

produtores de micotoxinas.

Essas doenças podem ocorrer de forma individual ou em surtos,

quando um grande número de pessoas é acometido por sintomas semelhantes.

As doenças alimentares de origem microbiana são consideradas

como o mais sério problema no mundo contemporâneo e, conseqüentemente,

como uma causa importante na redução econômica da produtividade.

O grupo de indivíduos mais afetado pelas Doenças Veiculadas por

Alimentos (DVAs) são as crianças, mulheres grávidas, idosos e pessoas com

sistema imunológico imunodeprimido, como nos casos de pacientes com Aids,

câncer, diabetes ou os que estão sob tratamentos com quimioterápicos.

Segundo a Organização Panamericana de Saúde (OPS, 2003), a

segunda causa mais comum de óbitos em crianças de 0 a 5 anos, no mundo

todo, é a diarréia, com estimativa de 12% dos óbitos.

Nas últimas décadas, a epidemiologia de doenças de origem

alimentar sofreu mudanças com o aparecimento de novos importantes

microrganismos e patógenos emergentes que em alguns casos não oferecem

riscos para os indivíduos, porém, em outros, ameaça-lhes a vida. Essas

mudanças podem ser atribuídas a vários fatores:

estatística populacional;

estilo de vida dos consumidores;

desenvolvimento do processamento de alimentos;

preparação e práticas de manipulação dos alimentos.


60

Dados do ano de 2003 da OPS confirmam que mais de 70% dos

casos de enfermidades transmitidas pelos alimentos têm origem no seu

manuseio inadequado pelo consumidor final.

A contaminação cruzada pelos patógenos microbianos pode ter um

importante papel nos casos esporádicos de doenças epidêmicas de origem

alimentar. Durante a manipulação e preparação, as bactérias podem ser

transferidas dos alimentos crus para os manipuladores e, subseqüentemente

para outras superfícies pelas mãos contaminadas. As mãos são também um

ponto crítico para contaminação cruzada.

4 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS

Os microrganismos patogênicos estão presentes no solo e,

conseqüentemente, nas colheitas, no gado, nas aves e nos peixes. Portanto, é

inevitável que produtos crus util izados como ingredientes carreguem

contaminação patogênica. Dessa forma, para evitar toxinfecções alimentares,

os patógenos de ingredientes devem ser identificados e controlados. Os

programas de controle devem ser implantados, sendo monitorados quanto à

sua eficácia, além de serem revisados e modificados, sempre que necessário.

4.1 PROGRAMA DE VIGILÂNCIA

Um programa de vigilância para enfermidade de origem alimentar é

parte essencial de um programa de segurança alimentar.

A vigilância se refere à coleta sistemática e util ização de

informações epidemiológicas para o planejamento, a implementação e a

avaliação do controle de enfermidades.

A vigilância global de problemas de doenças de origem alimentar

pode ter um papel importante na detecção precoce e na advertência, assim

como na rápida investigação e controle dos problemas.


61

5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS

Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um

alimento inseguro, causando toxinfecções àquelas pessoas que os ingerem.

As principais causas podem ser resumidas como:

controle inadequado da temperatura durante o cozimento, o

resfriamento e estocagem;

higiene pessoal insuficiente;

contaminação cruzada entre produtos cruz e processados;

monitoramento inadequado dos processos.

Esses fatores podem ser reduzidos consideravelmente por meio de

treinamento adequado da equipe e implementação do sistema APPCC

combinado com a avaliação de riscos (Tabela 6).

Tabela 6 . Fatores que contribuem para a ocorrência de surtos de doenças de

origem alimentar*.

Fatores de contribuição Percentagema

Fatores re lacionados ao crescimento microbiano Estocagem à temperatura ambiente Resfr iamento inadequado Preparação do a l imento muito longe do lugar onde será servido Espera em ambiente e temperatura inadequada Uti l ização de sobras Descongelamento inadequado e es tocagem subseqüente imprópr iaProdução de a l imento em excesso

43 32 41 12 5 4

22 Fatores re lacionados à sobrevivência microbiana

Aquecimento imprópr io Cozimento inadequado

17 13

Fatores re lacionados à contaminação Manipuladores de a l imentos Alimentos processados contaminados não-enlatados Alimentos cruz contaminados Contaminação cruzada Limpeza inadequada dos equipamentos Fontes duvidosas Alimentos enlatados contaminados

12 19 7

11 7 5 2

a A percentagem excede o to ta l de 100, pois os fa tores que normalmente contr ibuem para a ocorrência de enfermidades de or igem al imentar são múlt ip los .

Fonte : Forsythe (2002)


62

A chave para a produção de alimentos seguros é produzir alimentos

microbiologicamente estáveis. Isto quer dizer que nenhum microrganismo do

alimento vai se multiplicar até doses infecciosas. De maneira ideal, é

importante que estejam inativados e que não haja toxinas.

6 DOSE INFECTANTE

A dose infectante refere-se ao número de microrganismos

necessários para causar a enfermidade, mas, para a maioria das bactérias, a

questão sobre a dose infectante mínima não pode ser respondida facilmente.

Em primeiro lugar, deve-se ter em mente que os consumidores existem grupos

especiais de risco – crianças, idosos, mulheres grávidas e pessoas

imunodeprimidas – que podem adoecer quando expostas a um número menor

de microrganismos patogênicos do que o necessário para causar enfermidade

em um adulto sadio (Tabela 7).

Tabela 7 . Resposta clínica de adultos a diferentes doses de desafio com

patógenos entéricos.

Organismo Dose de desafio (células)

Shigella dysenteriae 101-104

Shigella flexneri 102-109

Vibrio cholerae 103-109

Salmonella Typhi 104-109

Salmonella spp. 105-101 0

Escherichia coli patogênica 106-101 0

Clostridium perfringens 108-109

Yersinia enterocolitica 109

Fonte: HACCP (2001)

Além disso, há vários fatores fisiológicos que influenciam a dose

infectante mínima, como grau de acidez gástrica, conteúdo gástrico,


63

microbiota intestinal, e, não menos importante, o estado imunológico da

pessoa. Este estado, por sua vez, é influenciado pela imunidade de infecções

prévias, pelo estado nutricional e pelo estresse.

6.1 VARIÁVEIS DO HOSPEDEIRO

Idade;

Estado geral de saúde;

Gravidez;

Uso de medicamentos – com ou sem prescrição médica;

Distúrbios metabólicos;

Alcoolismo, cirrose, hemocromatose;

Quantidade de alimento ingerido;

Variação de acidez gástrica: uso de antiácidos, variação natural,

acloridria;

Distúrbios genéticos;

Estado nutricional;

Imunocompetência;

História pregressa cirúrgica;

Ocupação.


64

7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR

7.1 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTÉRIAS

1 Campylobacter jejuni, C. coli .

Os Campylobacter são bastonetes gram negativos, reconhecidos

como patógenos animais, sendo considerados como patógenos humanos

somente há 15 ou 20 anos. São encontrados em aves domésticas, gado, suínos,

ovinos, roedores e pássaros. As rotas da infecção passam pela água

contaminada, leite e carne. Os fungos são as maiores fontes potenciais de

Campylobacter infeciosos.

As características de enterites causadas por Campylobacter são:

doença semelhante à gripe, dores abdominais, febre e diarréia.

O período de incubação é de 2 a 10 dias, perdurando por cerca de

uma semana.

O Campylobacter pode facilmente causar contaminação cruzada em

alimentos processados. A dose infecciosa é de apenas mil células. O C. jejuni

é rapidamente destruído por um cozimento a 55 a 60ºC, por vários minutos.

2 Salmonella spp.

O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. São

gram negativos, anaeróbios facultativos, não formam esporos e têm forma de

bastonetes curtos. A temperatura ótima de crescimento é de aproximadamente

38ºC e a temperatura mínima é de 5ºC. Como não formam esporos, são

relativamente termosensíveis, podendo ser destruídos a 60ºC por 15 a 20

minutos.

Existem mais de 2.5001 sorotipos de salmonelas, dentre os quais

1.478 pertencem à subespécie I, incluindo Salmonella sorotipo Typhi.

Mudanças significativas ocorrem na nomenclatura e taxonomia das salmonelas

nos últimos anos, baseadas, principalmente, nas suas características


65

bioquímicas. O gênero Salmonella está dividido em duas espécies Salmonella

enterica e Salmonella bongori , sendo a primeira subdividida em seis

subespécies.

Essas enterobactérias são transmitidas ao homem, principalmente,

por meio de consumo de alimentos contaminados por fezes de animais ou

humanas.

Os sintomas característicos de doenças de origem alimentar

causadas por Salmonella são: diarréia, náuseas, febre branda e calafrios,

algumas vezes, vômitos, dor de cabeça e fraqueza.

O período de incubação antes da doença é de cerca de 16 a 72 horas.

A enfermidade é, normalmente, autolimitante e persiste durante 2 a 7 dias. A

pessoa infectada excretará grandes quantidades de Salmonella pelas fezes

durante o período da doença.

A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a saúde da vítima,

com o alimento e ainda com a linhagem da Salmonella . As doses infecciosas

podem variar de 20 até 106 células.

Uma ampla variedade de alimentos contaminados é associado às

salmoneloses, incluindo carne bovina crua, aves domésticas, ovos, leite e

derivados, peixes, camarões, perna de rã, fermentos, cocos, molhos, temperos

para salada etc.

A contaminação do alimento ocorre devido ao controle inadequado

de temperatura, de práticas de manipulação ou por contaminação cruzada de

alimentos crus com alimentos processados. O microrganismo se multiplica no

alimento até atingir a dose infecciosa.

3. Shigella spp.

A Shigella é uma bactéria altamente contagiosa que coloniza o trato

intestinal. É bastante similar a E. coli , mas pode ser diferenciada por não


66

produzir gás a partir de carboidratos e por ser lactose negativa. A Shigella se

propaga por contato direto e indireto com indivíduos infectados. O alimento

ou a água podem ser contaminados por contato direto ou indireto com

material fecal de pessoas infectadas. A Shigella causa surtos freqüentemente

em creches e asilos.

Os principais sintomas da shigelose são: diarréia branda ou grave,

aquosa ou sanguinolenta, febre, náuseas, podem ocorrer vômitos e dores

abdominais.

Os sintomas aparecem dentro de 12 até 96 horas após exposição à

Shigella; o período de incubação é de, normalmente uma semana. O número

necessário de microrganismos para causar a infecção em adulto é de 10 a 102.

As medidas de controle e prevenção da shigelose de origem

alimentar estão relacionadas com a boa higiene pessoal e educação dos

manipuladores de alimento. A contaminação de alimentos ou água com

Shigella spp indica contaminação recente com fezes humanas, devido a

fragilidade desse microrganismo.

4 Escherichia coli

Escherichia coli é a espécie predominante entre os diversos

microrganismos anaeróbios facultativos que fazem parte da microbiota

intestinal de animais de sangue quente. Pertence à família Enterobacteriaceae

e entre suas principais características destacam-se: bacilos gram negativos

não esporulados, capazes de fermentar glicose com produção de ácido e gás.

A maioria fermenta também a lactose, com produção de ácido e gás.

As linhagens patogênicas de E. coli são divididas de acordo com os

sintomas clínicos nos seguintes grupos.

E. coli enterotoxigênica (ETEC)

E. coli enteropatogênica (EPEC)


67

E. coli enterohemorrágica (EHEC)

E. coli enterogregativa (EAggEC)

E. coli enteroinvasora (EIEC)

E. coli difusamente adesiva (DAEC)

A importância da E. coli como patógeno humano tem sido

reconhecida desde seu descobrimento, 1885, pelo Dr. Theodor Escherich. Está

relacionada com casos de diarréias, principalmente infantil , com colites

hemorrágicas, disenterias, infecções da bexiga, dos rins, infecções de feridas

cirúrgicas, septicemia, síndrome urênico-hemolítica. Algumas destas

enfermidades terminam em óbitos.

Recentemente, a importância da E. coli foi relacionada com a

presença de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O1 5 7:H7

que tem ocasionando surtos de toxinfecções alimentares com morbilidade e

mortalidade.

A E. coli O1 5 7:H7 é uma cepa entero-hemorrágica (EHEC) implicada

em surtos de DVAs, quando se ingerem alimentos mal cozidos e por

transmissão de pessoa a pessoa.

Os principais sintomas da enfermidade são dores abdominais,

diarréia sanguinolenta, edema da mucosa do cólon, após um a dois dias de

incubação. A enfermidade dura aproximadamente oito dias.

O gado é um reservatório natural de EHEC, razão pela qual os

alimentos de origem animal, principalmente a carne bovina, parecem ser o

principal veículo desse patógeno. Diversos surtos de colite hemorrágica

ocorridos nos Estados Unidos, Canadá e Japão foram claramente associados

com consumo de hambúrgueres.


68

5 Listeria monocytogenes

A Listeria é uma bactéria gram positiva, que não forma esporos,

cresce entre 0 e 42ºC. A pasteurização é suficiente para destruir o organismo.

O gênero é dividido em oito espécies, dentre as quais a L. monocytogenes é a

que causa maior preocupação com enfermidades causadas por alimentos. Já

foi encontrada em uma variedade de alimentos, tanto crus como processados,

onde pode sobreviver e se multiplicar rapidamente durante a estocagem. Entre

esses alimentos, incluem-se leite e queijo supostamente pasteurizados, carnes,

vegetais crus, frutos do mar e peixes.

Sua capacidade de crescer em temperaturas tão baixas quanto 3ºC

permite multiplicação em alimentos refrigerados.

A L. monocytogenes é responsável por infecções oportunistas,

infectando, mulheres grávidas, recém-nascidos e idosos.

Os sintomas da listeriose são: meningite, encefalite e septicemia;

pode levar ao aborto, nascimento de feto morto ou prematuro quando a mulher

grávida é infectada no segundo e terceiro trimestres.

A dose infectiva de L. monocytogenes é desconhecida. O período de

incubação é excessivamente longo: de 1 a 90 dias.

6 Staphylococcus aureus

A espécie Staphylococcus aureus é um microrganismo muito

conhecido pela sua patogenicidade ao homem e outros animais. Foi estudada

pela primeira vez por Denys em 1894 e, posteriormente por Barber, em 1914.

Somente em 1930 foi definitivamente reconhecida a importância dos

estafilococos na intoxicação alimentar.

O gênero Staphylococcus possui mais de trinta espécies. A produção

de enterotoxina está associada principalmente à espécie S. aureus , embora


69

outras espécies como S. intermedius e S. hyicus também tenham sido

reconhecidas como produtoras.

O S. aureus é um dos agentes patogênicos mais comuns, e é

responsável por severas infecções em humanos. Está amplamente distribuído

na natureza e os humanos e os animais são seus principais reservatórios.

São cocos gram positivos, pertencentes à família Micrococaceae.

São facultativos anaeróbios, com maior crescimento sob condições aeróbias,

quando então, produzem catalase.

S. aureus causa intoxicação provocada pela ingestão do alimento

que apresenta a toxina pré-formadora. O período de incubação de um surto

varia, geralmente, de 30 minutos a oito horas, sendo a média de duas a quatro

horas, após a ingestão do alimento contaminado.

Os principais sintomas são: náuseas, vômitos, cãibras abdominais

(geralmente bem dolorosas), diarréias e sudorese, dores de cabeça, calafrios e

a queda de pressão arterial.

Os Staphylococcus estão presentes nas vias nasais e na garganta,

além do cabelo e pele. Apesar dos manipuladores de alimentos serem

normalmente as principais fontes de contaminação dos alimentos, quando há

surtos, os equipamentos e as superfícies também podem ser a fonte das

contaminações. Os alimentos normalmente associados às intoxicações são

carnes e produtos de carne, frangos e produtos de ovos, saladas como as de

atum, galinha, batata e macarrão, produtos de panificação como creme, tortas

de creme, leite ou produtos lácteos.

7 Clostridium perfringens

O Clostridium perfringens é um bastonete anaeróbio, gram positivo,

formador de esporos. É amplamente distribuído no ambiente e freqüentemente

encontrado no intestino de humanos e de animais.


70

As características de intoxicações causadas por Cl. perfringens são:

dor abdominal, náusea, diarréia aguda, sintomas que aparecem de 8 a 12 horas

após a ingestão do microrganismo.

A forma mais comum da intoxicação é caracterizada por dores

abdominais intensas e diarréias que iniciam 8 a 12 horas após o consumo do

alimento contendo grande quantidade do microrganismo, o qual produz as

toxinas causadoras da enfermidade.

As carnes, os produtos cárneos e os molhos são alimentos mais

freqüentemente implicados. Os esporos germinam e a bactéria se multiplica

até níveis causadores de enfermidades durante os períodos de refrigeração e

estocagem.

O controle desse microrganismo é atingido principalmente por meio

de cocção e do resfriamento.

8 Clostridium botulinum

O Clostridium botulinum é um bastonete gram positivo, anaeróbio

estrito. Causa uma doença de origem alimentar denominada botulismo.

Trata-se de uma intoxicação alimentar causada pela ingestão de

neurotoxinas pré-formadoras. O microrganismo é encontrado por toda a

natureza. Existem quatro espécies clinicamente importantes: Cl. botulinum ,

Cl. perfringens causam enfermidades relacionadas à ingestão de alimentos.

Existem sete tipos basicamente pela antigenicidade da toxina. Os

tipos A, B, E e F são os principais causadores de botulismo humano (tipos C e

D em animais). Várias neurotoxinas foram identificadas e estão entre as

toxinas mais potentes conhecidos pelo homem. O microrganismo forma

esporos, os quais podem ser transmitidos pelo ar e contaminar jarras abertas

ou latas. Uma vez fechadas, as condições anaeróbias favorecem o crescimento

dos esporos e a produção de toxinas.


71

Os sintomas do botulismo são: visão dupla, náusea, vômito, fadiga,

tonturas, dor de cabeça, garganta e nariz secos, falhas respiratórias.

O botulismo é associado com alimento enlatado de baixa acidez

(principalmente aquele de produção caseira), vegetais, peixe e produtos de

carne. Também é associado com mel. O botulismo infantil é mais brando do

que a versão adulta. Essa bactéria não pode crescer em alimentos ácidos ou

acidificados com pHs menores que 4,6.

9 Bacillus cereus

O B. cereus é um patógeno alimentar formador de esporos que foi

isolado pela primeira vez em 1887. Os esporos podem sobreviver a muitos

processos de cocção. O microrganismo cresce bem em alimentos cozidos

devido à inativação da microbiota competidora. O B.cereus é um bastonete

gram positivo, aeróbio facultativo, é encontrado por toda a natureza, sendo

isolado do solo, da vegetação, água e dos pêlos de animais. É comumente

encontrado em baixos níveis nos alimentos (<102 UFC/g), os quais são

considerados aceitáveis. As intoxicações alimentares iniciam quando o

alimento é sujeito a abusos de tempo-temperatura, propiciando que um nível

baixo de organismos se multiplique até níveis (>105 UFC/g) significativos

(necessários para intoxicação).

Existem dois tipos reconhecidos de intoxicações alimentares

causadas por B. cereus : o diarréico e o emético. Ambos são autolimitantes e a

recuperação ocorre dentro de 24 horas. O B. cereus produz toxinas diarréicas

durante o crescimento no intestino delgado humano, enquanto as toxinas

eméticas são pré-formadoras no alimento.

Os sintomas da intoxicação alimentar causada por B. cereus são:

náuseas, vômitos, dores abdominais e possível diarréia.

Uma grande variedade de alimentos, incluindo carnes, leite,

vegetais e peixes, foi associada ao tipo diarréico de intoxicação. Os surtos do

tipo emético são geralmente associados com produtos de arroz, no entanto,


72

outros alimentos ricos em amido, como batatas, massas e produtos de queijos.

As misturas para alimentos como molhos, pudins, sopas, massas folhadas e

saladas, são freqüentemente relacionadas a surtos alimentares. A presença de

um grande número de B. cereus (>106 organismos/g) em alimentos é um

indicativo do crescimento ativo e proliferação do microrganismo e é um

perigo potencial à saúde.

10 Vibrio parahaemolyticus

Este microrganismo foi isolado pela primeira vez em 1951. É

atualmente reconhecido como o maior causador de gastrenterites de origem

alimentar no Japão. Isso porque o microrganismo é associado com o consumo

de alimentos marinhos.

Os sintomas típicos de doenças alimentares causadas por V.

parahaemolyticus são: diarréias, dores abdominais, náuseas, vômitos, dores

de cabeça, febre e tremores.

O organismo está presente, normalmente, em quantidade inferior a

103 UFC/g em peixes e frutos do mar, exceto em águas mornas, onde a

contagem pode aumentar para 106 UFC/g. As infecções causadas por esse

microrganismo foram associadas ao consumo de peixes e frutos do mar crus,

mal cozidos ou cozidos e recontaminados. A refrigeração inadequada de

frutos do mar contaminados com esse microrganismo permite a sua

proliferação, o que aumenta a possibilidade da infecção. O organismo é

bastante sensível ao calor, e os surtos devem-se, freqüentemente, a processos

de manipulação inadequados e a abusos de temperaturas. O controle desse

microrganismo pode ocorrer por meio da prevenção da sua multiplicação após

a pesca pelo resfriamento (25ºC) e pela cocção com temperatura interna maior

do que 65ºC. O isolamento de qualquer espécie de Vibrio a partir de alimentos

cozidos indica práticas de higiene inadequadas, já que o microrganismo é

destruído rapidamente pelo calor.


73

11 Vibrio vulnificus

O V. vulnificus foi relatado pela primeira vez em 1976 como víbrio

lactose positivo. O V. vulnificus significa causador de feridas, o que reflete a

habilidade do microrganismo em invadir e destruir. O microrganismo é,

portanto, associado com infecções que originam feridas e septicemias fatais.

Os sintomas típicos da doença alimentar são: febre, tremores, náuseas, lesões

da pele.

O início dos sintomas ocorre cerca de 24 horas (a partir de 12 horas

até vários dias) após a ingestão de frutos do mar cruz contaminados

(especialmente ostras) por pessoas vulneráveis. Os indivíduos mais

susceptíveis às infecções incluem idosos, pessoas imunocomprometidos e

aqueles que sofrem de distúrbios crônicos do fígado e de alcoolismo crônico.

A mortalidade ocorre em 40 a 60% dos casos.

O V. vulnificus é isolado a partir de moluscos e águas li torâneas. O

microrganismo é raramente isolado de águas do mar com temperaturas

inferiores a 10 a 15ºC, mas os números aumentam quando a temperatura da

água é superior a 21ºC. A principal rota de infecção é a ingestão seguida de

feridas e septicemia. A principal forma de prevenção é evitar o consumo de

moluscos crus, em particular ostras, por indivíduos imunocomprometidos.

12 Brucella melitensis , Br. Abortus e Br. suis

A Brucella é um cocobacilo gram negativo, estritamente aeróbio, o

qual causa a brucelose. Esse microrganismo encontra-se em animais e causa

infecções acidentais em humanos. As quatro espécies que causam infecções

em humanos são denominadas a partir do animal em que são comumente

isoladas: Br. abortus (gado), Br. suis (suíno), Br. melitensis (bodes) e Br.

canis (cães). O gado e as indústrias de laticínios são a principal fonte de

contaminação. A Brucella pode entrar no corpo pela pele ou pelos tratos

respiratório ou digestivo.


74

No mundo, a brucelose mantém-se como uma das principais fontes

de distúrbios em humanos e animais domésticos.

A prevenção da brucelose depende da sua erradicação ou do

controle em animais hospedeiros, precauções higiênicas para limitar a

exposição a infecções por meio de atividades ocupacionais e tratamento

térmico de produtos lácteos e outros alimentos potencialmente contaminados.

13 Aeromonas hydrophila , A. caviae e A. sobria

Essas espécies estão presentes em ambientes de água doce e em

águas salgadas. Têm sido freqüentemente encontradas em peixes e frutos do

mar e em amostras de carne vermelha (gado, porco e ovelha) e de frango no

mercado. Crescem em temperaturas que variam de 0º a 45ºC, sendo que

espécies eu determinam patogenia humana (mesófilos) crescem entre 10º e

42ºC.

Algumas espécies são capazes de causar doenças em peixes e

anfíbios, bem como em humanos, os quais adquirem infecções através de

feridas abertas ou pela ingestão de organismos presentes em alimentos ou

água, podem causar gastrenterites em indivíduos saudáveis de septicemia em

indivíduos com o sistema imunológico debilitado.

Os sintomas gerais de gastrenterites causadoras são: diarréias, dores

abdominais, náuseas, tremores e dores de cabeça, doenças similares a

disenteria, colite, sintomas adicionais que incluem septicemia, meningite,

endocardite e úlceras córneas.

7.2 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS

1 Cyclospora cayetanensis

Esse parasita ocorre em águas tropicais no mundo todo e causa uma

diarréia aquosa e explosiva em humanos. Os primeiros casos reportados em


75

humanos ocorreram em 1979. Inicialmente, esse agente foi associado à água

contaminada, mas também foi associado ao consumo de alface, framboesa e

manjericão fresco. O período de incubação é de uma semana após o consumo

do alimento infectado. O Cyclospora infecta o intestino delgado.

Os sintomas típicos de intoxicações causadas por Cyclospora são:

diarréia aquosa, perda de apetite, substancial perda de peso, inchaço, aumento

de flatulência, dores abdominais, náuseas, vômitos, dores musculares, febre

baixa e fadiga.

2 Cryptosporidium parvum

O modo de transmissão do patógeno é pela rota fecal-oral, incluindo

alimentos e água. Os hospedeiros incluem humanos e animais domésticos,

inclusive o gado. Podem sobreviver no ambiente por longos períodos, onde

permanecem infecciosos e resistem a químicos usados para purificar água

para uso humano. Podem, contudo, ser removidos do sistema de água tratada

por meio de fil tragem. Os principais sintomas em humanos são febre, diarréia,

dores abdominais e anorexia. A doença, geralmente, ocorre por menos de 30

dias, mas pode se prolongar em indivíduos imunodeficientes e levar à morte.

3 Taenia saginata e T. solium

As infecções por vermes achatados em humanos são causadas devido

à ingestão de vermes na carne de boi (Taenia saginata) e na carne de porco

(T. solium). Ambos os organismos são, obrigatoriamente, parasitas do

intestino humano. Tais vermes têm um ciclo de vida complexo. A forma larval

é ingerida através de carnes de boi ou porco infectado e se desenvolve até a

forma adulta (podendo alcançar vários metros de comprimento).

Interromper o ciclo de vida do organismo é a principal medida de

controle, o que pode ser feito pela inspeção completa da carne e do cozimento

adequado (>60ºC).


76

4 Toxoplasma gondii

O T. gondii é o agente causador da toxoplasmose que pode ser

encontrado em carnes mal cozidas e cruas tais como porco, cordeiro, carne de

boi e de aves. Os hospedeiros primários são os gatos, sendo que a infecção

humana se dá quando há contato com as suas fezes. A infecção também ocorre

pela ingestão de carne mal cozida ou crua de hospedeiros intermediários tais

como roedores, suínos, gado, cabra, galinha e pássaros. O microrganismo

causa hidrocefalia e cegueira em crianças, enquanto, em adultos, os sintomas

são menos graves. Em indivíduos imunodeprimidos, pode causar hepatite,

miocardite ou combinações dessas doenças. O cozimento apropriado das

carnes destrói o microrganismo.

5 Micotoxinas

As micotoxinas são produtos tóxicos de certos fungos microscópicos

os quais, em algumas circunstâncias, desenvolvem-se sobre ou em produtos

alimentícios de origem animal ou vegetal. Centenas de micotoxinas foram

identificadas e são produzidas por cerca de 200 variedades de fungos.

As micotoxinas são metabólitos secundários que foram responsáveis

por grandes epidemias em humanos e animais. As micotoxinas são produzidas

pelos gêneros de fungos Aspergillus , Fusarium e Penicill ium . Esses fungos

são encontrados no ambiente e fazem parte da flora normal das plantas.

Há quatro tipos de toxicidade:

Aguda, resultando em danos aos rins ou fígado;

Crônica, resultando em câncer de fígado;

Mutagênica, causando danos no DNA;

Teratogênica, causando câncer em crianças por nascer.


77

Aflatoxinas: As aflatoxinas são compostos tóxicos que são

produzidos por certas linhagens dos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus

parasiticus sob condições favoráveis de temperatura e umidade. Esses fungos

crescem em certos alimentos e rações, resultando na produção de aflatoxinas.

Têm sido encontradas em nozes, amendoins e outras sementes oleosas, milho

e semente de algodão.

As aflatoxinas de maior interesse são caracterizadas como B1, B2,

G1 e G2. A aflatoxina B1 é a mais comumente encontrada e é a mais tóxica.

As aflatoxinas produzem necrose aguda, cirrose e carcinoma no

fígado em diversas espécies animais. A toxicidade pode ser influenciada por

fatores ambientais, nível de exposição e duração à exposição, idade, saúde e

estado nutricional.

Ocratoxinas: As ocratoxinas são produzidas por Penicillium

verrusocum e Penicillium viridicatum . São encontradas principalmente nos

cereais, porém níveis significativos de contaminação podem ocorrer em suco

de uva, vinho tinto, café, cacau e frutas secas.

As ocratoxinas são potencialmente nefróticas e carcinogênicas,

sendo a sua potência variável de acordo com as espécies e o sexo.

Fumosina: As fumosinas são um grupo de micotoxinas produzidas

pelo Fusarium , as quais têm ocorrência mundial no milho e produtos

derivados. As fumosinas são bastante estáveis durante o processamento de

alimentos.

Zearalenona: A zearalelona é um metabólito fúngico produzido

principalmente por Fusarium graminearium e F. culmorum , os quais

colonizam milho, cevada, trigo, aveia e sorgo. Estes compostos podem causar

graves problemas de reprodução infertil idade em animais, especialmente em

suínos.

O controle de micotoxina é muito difícil , uma vez que se deve

prevenir a invasão através das sementes pelo fungo, do solo ou mesmo do ar

antes da colheita. A secagem e a estocagem adequadas são processamentos


78

muito úteis, mostrando boas práticas de gerenciamento dos locais de

produção. A seleção de grãos com luz ultravioleta (para evidenciar as

aflatoxinas) é utilizada na produção de milho, semente de algodão e figo.

Príons: As encefalopatias espongiformes transmissíveis em animais

e humanos são causadas por príons (partícula de proteína infecciosa). Os

príons são formas modificadas de uma proteína norma. Essas proteínas

acumulam-se no cérebro, causando buracos ou placas e os subseqüentes

sintomas clínicos, levando à morte.

Na encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca) há

evidências de que o agente infeccioso se trata de um príon.

7.3 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VÍRUS

1 Vírus Norwalk e semelhantes ao Norwalk

Os vírus Norwalk e os semelhantes causam diarréia e vômitos. São

patógenos humanos.

As gastrenterites devidas aos vírus Norwalk são autolimitantes e

moderadas.

As características dessas gastrenterites são: náuseas, vômitos,

diarréias, dores abdominais, também podem ocorrer dores de cabeça, febre,

tremores, dores musculares e fraquezas.

A dose infecciosa é desconhecida, mas é presumivelmente

pesqueira. Um moderado e curto mal-estar geralmente se desenvolve dentro

de 24 a 48 horas após a ingestão de alimentos ou água contaminada e dura de

24 a 60 horas.

As gastrenterites devidas aos vírus Norwalk são transmitidas por via

fecal-oral através de água e alimentos contaminados. A água é a fonte mais

comum de surtos, que podem ser provenientes de origem municipal, poços,


79

lagos de recreação e piscinas. Os moluscos e os ingredientes para salada são

os alimentos mais comumente infectados.

O controle é feito evitando que alimentos sejam contaminados com

água contaminada e manipuladores infectados.

2 Hepatite A

O vírus da hepatite A (HAV) tem sido isolado e coletado de várias

partes do mundo. O período de incubação para o HAV varia de 10 a 50 dias

(com média de 30 dias). O período de comunicabilidade se estende do começo

da incubação até por volta de uma semana do início do desenvolvimento de

icterícia. O maior perigo de transmissão da doença ocorre durante a metade

do período de incubação até bem antes dos primeiros sintomas.

Sintomas típicos da hepatite A são: febre, arrepios, mal-estar, perda

de apetite, náuseas, icterícia, urina de cor escura, fezes de cor mais clara,

dores abdominais na área do fígado.

O HAV é excretado nas fezes de pessoas infectados e poder produzir

doença quando indivíduos susceptíveis consomem alimentos ou água

contaminados. As frutas e suco de frutas, leite e produtos lácteos, vegetais,

saladas, moluscos e as saladas são as fontes mais freqüentes.

A contaminação de alimentos por intermédios de manipuladores

infectados é comum. O HAV possui uma distribuição mundial, ocorrendo

tanto de maneira epidêmica quanto esporádica. É transmissível principalmente

por meio de contato pessoa-pessoa por contaminação fecal, porém também

podem ocorrer fontes epidêmicas como alimentos ou águas contaminadas.

As condições higiênico-sanitárias deficientes e a superpopulação

facilitam a transmissão. Os surtos de HAV são comuns em instituições, casas

superlotadas e prisões.


80

3 Rotavírus

Os rotavírus são classificados como pertencentes à família

Reoviridae. Seis grupos sorológicos foram identificados, três dos quais (A, B

e C) infectam humanos. As gastrenterites causadas por rotavírus são

autolimitantes, variam de brandas a graves e são caracterizadas por vômitos,

diarréia aquosa e febre baixa. Resume-se que a dose infecciosa deva ser de 10

a 100 partículas virais infecciosas. Como uma pessoa com diarréia causada

por rotavírus excreta grandes quantidades de vírus (108-101 0 partículas

infecciosas/mL de fezes), doses infecciosas podem ser facilmente adquiridas

pelo contato com mãos, objetos e utensílios contaminados.

Os rotavírus são transmitidos por rota fecal-oral. A contaminação

pessoa-pessoa é disseminada por mãos contaminadas e, provavelmente, é o

meio mais importante pelo qual esse vírus é transmitido em pequenas

comunidades tais como clínicas geriátricas e pediátricas, berçários e

residências. Os manipuladores contaminados podem contaminar alimentos que

não serão posteriormente cozidos como, por exemplo, saladas, frutas e

aperitivos. Os rotavírus são bastante estáveis no ambiente e têm sido

encontrados em amostras estuarinas.

A incidência de infecção de rotavírus é similar em países com níveis

altos e baixos de padrões de saúde.

Os rotavírus do grupo A são endêmicos no mundo inteiro. Ele é o

causador de diarréias graves em crianças e inclui cerca da metade dos casos

que necessitam de hospitalização.

7.4 INTOXICAÇÕES CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS

Existem muitas intoxicações originadas a partir do consumo de

frutos do mar e moluscos. Podem ser causadas por ciguatera, uma toxina

proveniente de microalgas, as quais ficam acumuladas na carne do peixe.

Outro caso é a intoxicação escombróide, que se deve ao consumo de carne de

peixe contendo altos níveis de histamina. Esse composto é proveniente da


81

ação da histidina desidrogenase bacteriana de peixes como a cavala. As

bactérias envolvidas são Morganella morganis , Proteus spp., Hafnia e

Klebsiella pneumoniae .

As enfermidades relacionadas aos moluscos são causadas por um

grupo de toxinas produzidas por algas (dinoflageladas), na maioria dos casos,

da qual os moluscos se alimentam. As toxinas são acumuladas e, algumas

vezes, metabolizadas pelos moluscos.

A ingestão de moluscos contaminados resulta em uma ampla

variedade de sintomas que dependem das toxinas presentes, das suas

concentrações no molusco e da quantidade consumida do molusco

contaminado. As intoxicações paralisantes por molusco são melhor

caracterizadas do que as intoxicações diarréicas. Todos os moluscos

(alimentados por fil tração) são potencialmente tóxicos. As do tipo paralisante

são geralmente associadas a mexilhões, moluscos e vieiras.

1 Intoxicações Causadas por Ciguatera

Esse tipo de intoxicação caracteriza-se por: irritação nos lábios,

l íngua e garganta, dor de cabeça, dor forte nos braços, pernas e olhos, visão

dupla, lesões na pele (bolhas, coceiras e eritema).

A maioria dos casos apresenta recuperação que leva de dias a semanas, sendo

a mortalidade baixa.

2 Intoxicações Escombróide

Os sintomas desse tipo de enfermidade são: gosto metálico, picante

ou agudo na boca, dor de cabeça intensa, tonturas, náuseas e vômitos, suor

facial e vermelhidão, dor epigástrica, pulsação rápida e fraca, coceira na pele,

queimação na garganta e dificuldade para engolir.


82

Normalmente a recuperação ocorre dentro de 12 horas. As

fatalidades são raras e, geralmente, são devidas a outros fatores de

predisposição.

3 Intoxicações Paralisantes Causadas por Moluscos

Os sintomas desse tipo de intoxicação são principalmente

neurológicos e incluem formigamentos, queimação, sonolência, fala

incoerente e paralisia respiratória. A intoxicação paralisante causada por

moluscos se deve a 20 toxinas produzidas por dinoflagelados.

4 Intoxicações Diarréicas Causadas por Moluscos

Essa intoxicação é, normalmente, um distúrbio gastrintestinal

brando, caracterizado por náuseas, vômito, diarréia e dor abdominal seguida

por tremores, dor de cabeça e febre. Seu início pode ocorrer entre 30 minutos

até três horas, dependendo da dose da toxina ingerida. Os sintomas podem

durar de 2 a 3 dias. A recuperação é completa, sem efeitos posteriores, sendo

que a doença, geralmente, não impõe riscos à vida do infectado.

5 Intoxicações Neurotóxicas Causadas por Moluscos

Esse tipo de intoxicação causa sintomas tanto neurológicos quanto

intestinais, incluindo formigamentos e entorpecimento dos lábios, l íngua e

garganta, dores musculares, tonturas, sensações intercaladas de calor e frio,

diarréia e vômitos. O início dos sintomas pode ocorrer desde alguns minutos

até poucas horas. A duração da enfermidade é razoavelmente pequena, de

algumas horas a vários dias. A recuperação é completa com poucos efeitos

posteriores: nenhuma fatalidade foi registrada. A intoxicação ocorre devido à

exposição a poliésteres chamados de brevetoxinas, produzidas por

dinoflagelados.


83

6 Intoxicação Amnésica Causada por Moluscos

Esse tipo de intoxicação é caracterizado por desordens

gastrintestinais (vômitos, diarréia, dores abdominais) e problemas

neurológicos (confusão e perda de memória, desorientação, coma). Os

sintomas gastrintestinais ocorrem dentro de 24 horas, enquanto os de caráter

neurológico ocorrem em 48 horas.

A toxinose é particularmente séria em pacientes idosos, incluindo

sintomas remanescentes à Doença de Alzheimer. Todas as fatalidades, até

agora, envolveram pacientes idosos. A intoxicação é causada pela presença de

um aminoácido incomum, o ácido dimóico, o qual contamina os moluscos por

meio de diatomáceas.


84

CCAAPPÍÍTTUULLOO VVII

MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IINNDDIICCAADDOORREESS

termo microrganismo indicador pode ser aplicado a

qualquer grupo taxonômico, fisiológico ou ecológico de

microrganismos, cuja presença ou ausência proporciona

uma evidência indireta referente a uma característica particular do histórico

da amostra.

O Normalmente, são associados a microrganismos de origem

intestinal. Outros grupos podem ser usados como indicadores em

determinadas situações. Por exemplo, a presença de bactérias gram negativas

em alimentos tratados termicamente é um indicativo de tratamentos térmicos

inadequados.

Microrganismos indicadores vêm sendo utilizados na avaliação da

qualidade microbiológica da água há longo tempo e mais recentemente na de

alimentos devido às dificuldades encontradas na detecção de microrganismos

patogênicos, como, por exemplo, Salmonella .

Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de

microrganismos, que, quando presentes em um alimento, pode fornecer

informações sobre a ocorrência da contaminação de origem fecal, sobre a

provável presença de patógenos ou sobre a deterioração do alimento, além de

poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento,

produção ou armazenamento.

O temo microrganismo indicador foi sugerido por Ingram, em 1977,

para um organismo marcador cuja presença indicasse a possível presença de

um patógeno.

Os microrganismos indicadores são mais comumente utilizados para

avaliar a segurança e a higiene alimentar do que a qualidade.


85

De forma ideal, um indicador de segurança alimentar deve

apresentar certas características importantes:

ser detectável de forma fácil e rápida;

ser facilmente distinguível de outros membros da microbiota do

alimento;

possuir um histórico de associações constantes com o patógeno

cuja presença visa a indicar;

estar sempre presente quando o patógeno de interesse estiver

presente;

não deve estar presente como contaminante natural do alimento,

pois assim sua detecção não indicará, necessariamente, a

presença de matéria fecal ou dos patógenos;

estar ausente dos alimentos que são livres de patógenos, com

exceção, talvez, de números mínimos;

possuir características e taxas de crescimento equivalentes às do

patógeno.

No entanto, nem sempre todas essas características são observadas.

Os microrganismos indicadores usualmente utilizados são:

coliformes, Escherichia coli , enterobactérias, enterococos.

Os coliformes são bactérias gram negativas, anaeróbias facultativas

em forma de bastonetes. Os critérios util izados para identificação são a

produção de gás proveniente da glicose e outros açúcares e a fermentação da

lactose até a produção de ácido e gás em período de 24 a 48 horas a 37ºC. o

grupo dos coliformes inclui espécies do gênero Escherichia , Klebsiella ,

Enterobacter e Citrobacter , além de E. coli .

Os coliformes foram historicamente util izados como

microrganismos indicadores para servir como uma medida de contaminação


86

fecal e, assim medir a presença potencial de patógenos entéricos em água.

Contudo, como a maioria dos coliformes é encontrada no meio ambiente,

essas bactérias possuem limitada relevância higiênica. Devido ao fato de os

coliformes serem destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem

pode ser útil em testes de contaminações pós-processamento.

1 INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO FECAL OU DA QUALIDADE HIGIÊNICO-

SANITÁRIA DO ALIMENTO

O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de

origem fecal presente em água foi proposto em 1892, uma vez que esse

microrganismo tem seu habitat no trato intestinal de humanos e animais.

Muitas cepas da bactéria são inofensivas, contudo algumas são patogênicas e

causam doenças diarréicas.

Atualmente, seis t ipos principais de E. coli são classificados em

grupos específicos baseados nos fatores de virulência, mecanismos de

patogenicidade, síndrome clínica e distintos sorotipos O:H. Essas categorias

são E. coli enteropatogênica (EPEC), enterotoxigênicas (ETEC),

enteroinvasiva (EIEC), difuso aderente (DAEC), enteroagregativa (EAEC) e

entero-hemorrágica (EHEC).

Recentemente, a importância da E. coli foi relacionada com a

presença de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O1 5 7:H7

que tem ocasionado surtos de toxinfecções alimentares com morbilidade e

mortalidade.

O indicador ideal de contaminação fecal deveria preencher, além

dos requisitos anteriormente citados, os seguintes:

ter como habitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros

animais;

deveria ocorrer em números muito altos nas fezes;


87

deveria haver técnicas rápidas, simples e precisas para a sua

detecção e/ou contagem.

1.1 COLIFORMES TOTAIS

Este grupo é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae ,

são capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a

35º-37ºC por 24-48 horas. São bacilos gram negativos não esporulados.

Fazem parte desse grupo as bactérias do gênero Escherichia ,

Enterobacter , Citrobacter e Klebsiella , além de serem encontrados nas fazes,

também podem persistir longos períodos e se multiplicar em ambientes não

fecais, como vegetais, solo. A presença de coliformes totais no alimento não

indica, necessariamente, contaminação fecal recente. O índice de coliformes

totais é util izado para avaliar as condições higiênicas, sendo que as altas

contagens significam contaminação pós-processamento, l impezas e

sanificações deficientes, tratamentos térmicos ineficientes ou multiplicação

durante o processamento ou estocagem.

Coliformes a 45ºC e Escherichia coli as bactérias pertencentes a

este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade

de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à

temperatura de 45ºC. Nessas condições, em torno de 90% das culturas de E.

coli são positivas. O índice de coliformes a 45ºC ou de E. coli nos alimentos

é empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, condições

higiênico-sanitárias, visto que se estima que a população deste grupo é

constituída de uma alta proporção de E. coli , que tem seu habitat exclusivo no

trato intestinal do homem e de outros animais. Assim, sua presença pode

indicar a possibilidade de ocorrerem outros microrganismos entéricos na

amostra.

Em alimentos como vegetais frescos, o único indicador válido de

contaminação fecal é a E. coli , já que os demais indicadores de contaminação

fecal são encontrados naturalmente nesse tipo de alimento. Em alimentos


88

frescos de origem animal, a ocorrência de números elevados de

Enterobactérias pode indicar manipulação sem cuidados de higiene e/ou

armazenamento inadequado.

Em alimentos processados, a presença de um número considerável

de coliformes ou de Enterobactérias pode indicar:

processamento inadequado e/ou recontaminação pós-

processamento, sendo as causas mais freqüentes aquelas

provenientes da matéria-prima, equipamento sujo ou manipulação

sem a devida higiene;

proliferação microbiana que poderia permitir a multiplicação de

microrganismos patogênicos.

Diferenciação dos coliformes

A enumeração dos coliformes pode ser efetuada utilizando métodos

convencionais e métodos rápidos.

O método convencional ainda muito empregado é o método dos

tubos múltiplos que pode ser util izado para estimar o número de coliformes

pela técnica do Número Mais Provável (NMP). Para diferenciação entre os

coliformes fecais dos não-fecais são necessários testes bioquímicos para

identificação das espécies. Esses testes são coletivamente designados como

reações IMVic I indol; M vermelho de metila; Vi reação de

Voges-Proskauer e C citrato. Outros testes também são sugeridos como os

carboidratos e aminoácidos.

1.2 ENTEROCOCOS

A distribuição de Enterococos na natureza é ampla e eles fazem

parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato

intestinal. São freqüentemente util izados como “indicadores complementares”


89

do grupo de coliformes na determinação de contaminação fecal. A relação

existente entre as contagens de coliformes fecais e enterococos fecais pode

indicar se a contaminação recente é de origem humana ou animal.

Apesar das amplas aplicações dos coliformes como indicadores de

poluição fecal, existem controvérsias sobre sua utilização e estudos

epidemiológicos sugerem a contagem de Enterococos como uma alternativa,

principalmente pelo fato destes microrganismos resistirem a várias condições

adversas como salinidade elevada, desidratação, detergentes e desinfetantes,

congelamento, pH ácido e tratamento térmico moderado.

Os enterococos são um grupo de microrganismos que vêm se

destacando nos últimos anos como patógenos oportunistas. Sua biologia e

taxonomia têm passado por alterações significativas ao longo do tempo.

O gênero foi criado em 1984, com a transferência de Streptococcus

faecalis e S. faecium para Enterococcus faecalis e E. faecium .

Os enterococos são cocos gram positivos, anaeróbios facultativos.

As espécies mais encontradas em alimentos são Enterococcus faecalis e E.

faecium .

Apesar das limitações do uso desses microrganismos como

indicadores de contaminação fecal, sua presença em números elevados em

alimentos indica práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a

condições que permitiram a multiplicação dos microrganismos.

Para determinação de Enterococcus é usada a técnica dos tubos

múltiplos e contagem em placa.

2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAÇÃO DO ALIMENTO

São grupos de microrganismos que, quando presentes em números

elevados nos alimentos poderão causar a deterioração e/ou a redução da vida


90

de prateleira. Essas contagens fornecem informações gerais sobre as

condições durante o processamento do alimento.

As contagens de bactérias viáveis baseiam-se no número de

bactérias que se desenvolvem em placa com meios de cultura nos quais foram

inoculadas quantidades previamente conhecidas do alimento diluído e,

posteriormente, inoculadas sob determinadas condições ambientais.

3 CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS (CONTAGEM

PADRÃO EM PLACAS)

Esta contagem detecta, em um alimento, o número de bactérias

aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob forma vegetativa

quanto esporulada.

A contagem padrão em placas (PCA) tem sido usada como indicador

da qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéia sobre seu

tempo útil de conservação. Sua presença em grande número indica:

matérias-primas excessivamente contaminadas;

l impeza e desinfecção de superfícies inadequadas;

higiene inadequada na produção;

condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção

ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas

circunstâncias.

A deterioração de alimentos pode ser causada pelo crescimento de

microrganismos que levariam a alterações organolépticas. Neste caso,

números elevados são esperados e variam com o tipo de alimento e

microrganismo presente. A maioria dos alimentos apresenta, quando essas

alterações são detectáveis, números superiores a 106UFC/g ou mL do

alimento.


91

4 CONTAGEM DE BACTÉRIA PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS

Essas contagens avaliam o grau de deterioração de alimentos

refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento térmico.

5 CONTAGEM DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS

Alguns sistemas para contagem de bactérias anaeróbias,

desenvolvidos recentemente, ajudaram essas contagens. Entre esses sistemas,

pode-se citar as jarras especiais que comportam várias placas de Petri em uma

atmosfera livre de oxigênio (anaerobiose).

A presença de bactérias anaeróbias é indicativa de que houve

condições favoráveis para a multiplicação, como por exemplo, por

Clostridium botulinum e Clostridium perfringens .

6 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

O crescimento de bolores e leveduras é mais demorado do que o de

bactérias em alimentos de baixa acidez e alta atividade de água. Portanto,

dificilmente serão responsáveis pela deterioração desses alimentos. Em

alimentos ácidos e de baixa atividade de água, no entanto, o crescimento de

fungos é maior, provocando deterioração com grande prejuízo econômico em

frutas frescas, vegetais e cereais. São também responsáveis pela deterioração

de sucos de frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva

como picles, quando armazenados em condições inadequadas.

A presença de fungos filamentosos (bolores) e leveduras em índice

elevado nos alimentos pode fornecer várias informações:

condições higiênicas deficientes de equipamentos;

multiplicação no produto em decorrência de falhas no

processamento e/ou estocagem;


92

matéria-prima com contaminação excessiva.

A presença desses microrganismos pode tornar-se um perigo à saúde

pública devido à produção de micotoxinas pelos bolores.

Algumas medidas devem ser tomadas por manipuladores de

alimentos suscetíveis a essa contaminação, na tentativa de reduzir ou elimina-

la:

boas práticas de higiene levam à redução da carga de esporos;

esses alimentos devem chegar o mais rapidamente possível ao

consumidor;

o armazenamento de alimentos congelados deve ser a

temperaturas inferiores a -12ºC;

eliminar ou reduzir o contato com o ar através de embalagens,

por exemplo;

adicionar ácidos ou conservadores químicos como benzoatos ou

sorbatos, para retardar o crescimento fúngico.

Baixas contagens de bolores e leveduras são normais em alimentos

frescos e congelados, não sendo, portanto, significativas. Somente quando o

crescimento de bolor for visível ou o alimento apresentar um número elevado

de leveduras, o consumidor será capaz de reconhecer a deterioração. Esta

deterioração por leveduras não é prejudicial à saúde.

7 OUTROS INDICADORES

Staphylococccus a presença de números elevados de S. aureus é

uma indicação de perigo potencial à saúde pública, esse microrganismo

produz uma enterotoxina nos alimentos, chamada de enterotoxina

estafilocócica.


93

Clostrídios esses microrganismos foram sugeridos como

indicadores de contaminação fecal, mas não são específicos de fezes humanas.

Por serem formadores de esporos, podem persistir nos alimentos quando a

maioria dos microrganismos entéricos foi destruída. Contudo, C. perfringens

e C. botulinum são importantes em toxinfecções de origem alimentar.

Contagem de esporos de termófilos é usada como indicadora da

eficiência de sanificação de certos vegetais.

Contagem de bolores em equipamentos tem sido usada como

indicadora da sanificação de operações de processamento de alimentos. Esses

bolores crescem rapidamente em alimentos que aderiram à superfícies dos

equipamentos e contaminam os alimentos que passam por esse local

contaminado.


94

PP AA RR TT EE II II ::


95

CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIII

MMÉÉTTOODDOOSS DDEE AANNÁÁLLIISSEESS

nalisar amostras de alimentos quanto à presença de

bactérias patogênicas ou deteriorantes, fungos e toxinas é

uma prática padrão para garantir a segurança e a qualidade

do alimento.

AA análise dos alimentos para se verificar quais e quantos

microrganismo estão presentes é fundamental para se conhecer as condições

de higiene em que esse alimento foi preparado, os riscos que esse alimento

pode oferecer à saúde do consumidor e se o alimento terá ou não a vida útil

pretendida. Além disso, a análise laboratorial permitirá determinar o agente

etiológico mais provável no caso de um surto de toxinfecção alimentar. Essa

análise é indispensável também para verificar se os padrões e especificações

microbiológicas, nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos

adequadamente.

A análise microbiológica de um produto alimentício pode ser

conduzida para investigar a presença ou a ausência de microrganismo nesse

produto, para qualificar os microrganismos presentes e para identificar e

caracterizar as diferentes espécies microbianas Inúmeras métodos

laboratoriais de análises podem ser util izados em cada um desses métodos são

comumente divididos em métodos convencionais e métodos rápidos.

Os métodos devem ser confiáveis e certificados e são encontrados

em varias fontes consideradas de referencia, internacionalmente aceitas.

Esses métodos estão descritos:

Association of Official Analytical Chemist, Bacteriological

Analytical Manual (AOAC), 1992);


96

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of

Foods (Vanderzant & Splittstoesser , 1992);

Pratical Food Microbiology (Rorberts et al . , 1995);

Microorganisms in foods → their significance and methods of

enumeration, publicado pela International Commission on

Microbiological Specification for Foods (ICMSF).

1 CUIDADOS NA INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Os microrganismos estão em um ambiente dinâmico no qual a

multiplicação e a morte de diferentes espécies ocorrem em taxas diversas.

Isso significa que os resultados de um teste são válidos apenas para o

momento da amostragem;

2. As contagens das células viáveis por meio de plaqueamento de

diluições de alimentos em um meio agar podem ser mal conduzidos, não

permitindo o crescimento de microrganismos;

3. A homogeneidade de um alimento é rara especialmente com

alimento sólidos, portanto, os resultados para uma amostra podem não ser

representativos para o lote inteiro. Com tudo, não é possível submeter um lote

inteiro de alimentos à análise microbiológica, porque não haveria produto

restante para vender;

4. As contagens de colônias são válidas apenas dentro de certas

faixas e têm limites de confiança;

5. Existem diversas questões relacionadas à recuperação de

microrganismos de alimentos que devem ser mencionadas em qualquer

procedimento de isolamento:

a) No caso de alimentos sólidos, deve ser feita a homogeneização

por meio de liquidificação para fins de diluição;


97

b) O organismo – alvo normalmente esta em minoria na população

microbiana;

c) O organismo - alvo está presente em pequenas quantidades;

d) O organismo - alvo pode estar física e metabolicamente lesado;

e) O organismo – alvo pode não estar uniformemente distribuído no

alimento;

f) O alimento pode não apresentar composição homogênea.

2 AMOSTRAGEM

A obtenção correta das amostras, seu transporte para o laboratório e

sua preparação para análise são etapas fundamentais para o sucesso de uma

análise microbiológica.

Seguir as seguintes etapas:

A amostra deve ser representativa, os produtos prontos para

consumo devem ser coletados em suas embalagens originais

fechadas, com especificações de dados que o identifique como,

número do lote, data de fabricação, etc. Quando embalagens

abertas precisam ser analisados, é importante que sejam

acondicionadas adequadamente para evitar contaminação com

outros alimentos, manipuladores, e com o ambiente.

Os produtos acondicionados em embalagens, de difícil transporte

para o laboratório podem ser amostrados “in loco”, com a

máxima assepsia.

Alimentos perecíveis refrigerados devem ser mantidos entre O e

44ºC até o início da análise. Quando se tratar de alimentos

congelados, as amostras devem ser descongeladas somente para a

realização da análise. Como regra geral, toda amostra deve ser


98

analisada até 36 horas após sua obtenção. Produtos perecíveis que

não puderem ser analisados nesse período podem ser refrigerados

ou ainda congelado, dependendo do tipo de produto, objetivo da

análise e tipo de microrganismo a ser pesquisado.

O número de unidades a serem coletadas para análise e dos

critérios adotados para aprovação ou reprovação de um produto

define um plano de amostragem.

3 PREPARO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE MICROBIOLOGICA

3.1 COLETA DA AMOSTRA

Técnicas assépticas devem ser util izadas em todas as etapas;

Deve-se proceder à limpeza e a desinfecção da embalagem do

alimento a ser analisado com álcool a 70%;

A quantidade analisada do alimento é muitas vezes na faixa de

25g (ou mL) 50g

A mostra precisa ser homogeneizada com diluente apropriado, a

escolha do diluente depende do tipo do produto e dos

microrganismos a serem pesquisados;

A homogeneização das amostras com o diluente pode ser feita em

liquidificadores ou homogeneizadores de laboratório

denominados stomacher .

3.2 RETIRADA DA AMOSTRA

A operação de retirada da amostra deve ser efetuada,

preferencialmente, dentro de uma capela de fluxo laminar, ou próxima de um

bico de Bunsen, com a chama a meia altura.


99

As embalagens devem ser desinfetadas antes de sua abertura que

deverá ocorrer de maneira asséptica. Amostras de alimentos líquidos devem

ser retirados com pipeta estéril , e os alimentos sólidos ou semi-sólidos devem

ser pesados assepticamente.

3.3 PREPARO DAS DILUIÇÕES

No preparo das diluições sucessivas, podem ser util izados diversos

diluentes; solução salina-peptonada, salina a 0,85% ou água estéril e outros.

Para obtenção da diluição inicial (1/10) procede-se do seguinte modo:

a) Retirar assepticamente porções de 25g ou 25 mL da amostra,

colocando–se em homogeneizadores esterilizados ;

b) Adicionar 225 mL do diluente;

c) Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida, para

não danificar as células microbianas.

d) A partir da diluição inicial (1/10), proceder às diluições

seguintes (1/100); (1/1000), etc. (Apêndice A).

3.4 SOLUÇÕES DILUENTES

a) Solução salina peptonada

Cloreto de Sódio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8.5g

Peptona.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,0g

Água destilada.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000mL

Dissolver os componentes em água destilada. Distribuir em tubos de

ensaio (9mL).Esterilizar em autoclave a 121°C/15min.


100

b) Solução salina 0,85%

Cloreto de Sódio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,85g

Água destilada.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100mL

Dissolver o cloreto de sódio em água destilada. Distribuir em tubos

de ensaio e esterilizar em autoclave a 121ºC/15min.


101

CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIIIII

EESSTTIIMMAATTIIVVAA DDAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ,, AA

4455ººCC EE EESSCCHHEERRIICCHHIIAA CCOOLLII AATTRRAAVVÉÉSS DDOO NNÚÚMMEERROO MMAAIISS

PPRROOVVÁÁVVEELL ((NNMMPP))

radicionalmente, as bactérias do grupo coliformes têm sido

consideradas como indicadoras de poluição fecal em

alimentos e águas. São bastonetes gram negativos, não

esporulados, de metabolismo aeróbio ou facultativo anaeróbio, da família das

Entenobacteriaceae. O grupo dos coliformes totais (CT) apresenta a

característica de fermentar a lactose com produção de gás dentro de 48 horas

a 35ºC. Mais de 20 espécies de bactérias podem ser classificadas como

coliformes, originárias tanto do trato gastrintestinal do homem e de animais,

como também de outros ambientes.

T

O grupo de coliformes a 45ºC é formado pelos coliformes que

fermentam lactose, com produção de gás dentro de 24-48 horas, em

temperatura de 45ºC, normalmente em caldo EC. Podem ser Citrobacter

freundi , Enterobacter ssp, (incluindo E. aerogenes e E. cloacae), Kleblsiella

etc. Entretanto, Escherichia coli é a única espécie cujo habitat é o trato

gastrintestinal do homem e de animais. Enterobacter , Klebsiella e Citrobacter

podem desenvolver-se fora do trato intestinal tal como nos vegetais e no solo.

Quando se determina a população dos coliformes a 45ºC, 90% corresponde á

população de Escherichia coli .

A técnica mais usada nos laboratórios para determinação de

coliformes (totais e a 45ºC) é a do número mais provável (NMP) dos tubos

múltiplos, onde se estima quantitativamente este grupo, util izando-se a Tabela

de Hoskins (Apêndice B).

Outras técnicas são utilizadas para determinação de coliformes

como membrana fil trante e simplate .


102

11 MM ÉÉ TT OO DD OO CC OO LL II FF OO RR MM EE SS TT OO TT AA II SS

Prova Presuntiva

Visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de

lactose, especialmente o grupo coliforme. Células estressadas por tratamentos

térmicos, pelo congelamento ou outro motivo, podem ser recuperados nessa

fase.

Procedimento

Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular uma série

de três tubos de ensaio contendo, em cada tubo, 10 mL de caldo lauril sulfato

e tubos de Durhan invertidos com cada uma das diluições decimais

preparadas. Colocar, em cada tubo com o caldo lauril , 1,0 mL de do inoculo.

Incubar em estufa de bacteriologia a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Após as 48

horas, retirar os tubos de ensaio da estufa. São considerados positivos aqueles

que apresentarem turvação do meio e presença de gás (bolhas de ar) no

interior dos tubos de Durhan. Em seguida contar o número de tubos positivos

correspondentes a cada diluição (Apêndice C).

Prova Confirmatória (Coliformes totais)

O meio utilizado, o caldo verde brilhante Lactose Bile 2%, contém

dois inibidores (Bile e Verde Brilhante) do crescimento da microbiota

acompanhante, especialmente bactérias gram-positivas. Assim, a produção de

gás nos tubos, nas condições do teste, indica que houve desenvolvimento ou

bactérias gram-negativas que fermentaram lactose, características do grupo

coliforme.


103

Procedimento

Riscar os tubos de ensaio positivos no caldo lauril sulfato para os

tubos de caldo verde brilhante a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Os tubos

positivos apresentam turvação e formação de bolhas de gás nos tubos de

Durhan. Anotar os resultados de consulte a tabela para NMP (número mais

provável) para coliformes totais por grama ou mL.

Coliformes a 45ºC

Para a qualificação dos coliformes a 450 risque os tubos de ensaio

positivos no caldo lauril sulfato e/ ou dos tubos positivo do caldo verde

brilhante para os tubos de caldo EC e coloque no banho-maria por 24 ou 48

horas. Os tubos positivos apresentam positividade semelhante nos caldo lauril

e verde brilhante.

Anotar os resultados consultando a tabela do NMP para coliformes a

45ºC por grama ou mL.

Identificação de Escherichia coli

A parti de cada tubo de ensaio positivo com caldo EC riscar

(estriar) placas de Petri para agar EMB (Eosina Azul de metileno) com auxilio

de alça de níquel cromo e incubar a 35ºC por 18 a 24 horas. Ter o cuidado

de, durante a inoculação, não colocar muito material da amostra, afim de não

superlotar as placas, proporcionando às colônias crescimento isolado,

transcorrido este tempo, verificar o crescimento de colônias com

características de E. coli , ou seja, 2 a 3 cm de diâmetro, com brilho metálico

esverdeado ou com centro escuro (Apêndice D).

De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colônias

características para tubo com Agar Triptona de Soja (TSA) inclinado e

incubar por 18-24 horas a 35-37ºC.


104

Efetuar em cada cultura em TSA, as provas bioquímicas descritas a

seguir.

1 Produção de indol

A partir das culturas em TSA inclinado inocular tubos contendo o

meio SIM (meio Sulfeto Indol Motilidade) ou água triptonada e incube a 35°C

por 24 horas. Para o teste do indol, acrescentar de 0,2 a 0,3mL de reagente

Kovacs. O aparecimento de um anel vermelho indica positividade do teste.

O meio SIM é usado também para prova de motilidade e, portanto, a

inoculação deve ser feita com agulha, introduzindo-a e retirando-a em linha e

sem tocar o fundo do tubo de ensaio. Interpretar a prova de motilidade antes

da adição do reagente de Kovacs, observando se há crescimento difuso a

partir da linha de inoculação.

2 Teste de Voges-Proskauer

A partir das culturas em TSA inclinado, inocular tubos de ensaio

com MR-VP e incube a 35°C com 48horas. Transferir 1mL do crescimento

para um tubo de ensaio, acrescente 0,6mL de uma solução de α-naftol e 0,2ml

de uma solução de KOH a 40%. Agitar vigorosamente após a adição de cada

reagente. Deixar em repouso por até 2 horas. O teste é positivo com o

surgimento de uma coloração vermelha ou rósea.

3 Teste de Vermelho de Metila

Reincubar os tubos de ensaio com MR-VP por mais 48 horas e

realizar o teste após 96 horas de incubação. Adicionar 4 gotas de uma solução

de Vermelho de Metila. O desenvolvimento de uma cor vermelha indica que o

teste é positivo.


105

4 Teste de Citrato

A partir das culturas em TSA inclinado estriar a superfície inclinada

dos tubos com Agar Citrato de Simmons e proceder a incubação a 35°C por 96

horas. O desenvolvimento de uma cor azul indica a positividade do teste.

Para evitar resultados falso-positivos, o Agar Citrato deve ser

estriado primeiro, para impedir a transferência de proteínas ou carboidratos

dos outros meios. Se um inóculo for muito pesado, após a morte bacteriana,

compostos da parede celular poderão liberar carbono e nitrogênio suficiente

para também produzir resultados falso-positivos.

5 Interpretação dos resultados

Este grupo de testes é denominado IMViC.

Considerar a cultura positiva para E.coli , quando forem obtidos os

seguintes resultados para o IMViC (Tabela 8).

Tabela 8 . IMVic

Indol VM VP Citrato Tipo

+ + - - E. coli t ípica

- + - - E. coli atípica

OBS:

1- Outros testes bioquímicos podem ser adicionados, como os testes

de carboidratos e aminoácidos.

2- Tabela do NMP (Apêndice B).


106

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIXX

CCOONNTTAAGGEEMM PPAADDRRÃÃOO EEMM PPLLAACCAASS ((CCPPPP)) DDEE

MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS AAEERRÓÓBBIIOOSS MMEESSÓÓFFIILLOOSS VVIIÁÁVVEEIISS

método da Contagem Padrão em Placas (CPP), estima o

número de células viáveis contidas em um alimento

qualquer. Entretanto, é um método passível de erros, uma

vez que células estressadas podem não se desenvolver no meio, mesmo

estando presente no alimento. É uma metodologia muito usada para indicar a

qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéias sobre o seu

tempo útil de conservação. Sua presença em grande número indica:

O a) Matérias-primas excessivamente contaminadas;

b) Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas;

c) Higiene inadequada na produção;

d) Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção

ou a conservação dos alimentos ou uma combinação destas

circunstâncias.

As técnicas util izadas para se quantificar as bactérias são: “Pour

Plate”, “Spread Plate”. O método CPP baseia-se na premissa de que cada

célula viável, isolada, homogeneizada em um meio sólido (agar), dará origem

a uma colônia uma vez que é teoria biológica que uma colônia provém de uma

única célula microbiana.

1 TÉCNICA DE ANÁLISE

Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar diluições

sucessivas.


107

Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placa de Petri

esteril izadas;

Adicionar a cada placa 15-20mL de agar padrão para contagem,

previamente fundido e resfriado a temperatura de 45ºC.

Homogeneizar em movimentos suaves em forma de oito (cerca de

dez vezes) e deixar a temperatura ambiente, até a completa solidificação do

Agar;

Após a solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35-

37ºC/48 horas (Apêndice E).

Resultados

Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem,

somente as placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias;

o resultado deve ser expresso seguindo a formula:

Nº de unidades formadoras de colônias/mL ou g = Nº de colônias x

diluição.

Sempre que quiser trabalhar com segurança, o método CPP exige o

uso de placas de Petri em duplicatas. Muitos erros podem ser cometidos na

execução do método: erros de pesagem, erros da amostra, erros na medida dos

volumes dos diluentes e nas alíquotas a serem distribuídas nas diluições, erros

no espalhamento do inoculo, contaminação nas operações e erros na

homogeneização das amostras.

A contagem padrão poderá expressar números de unidades

formadoras de colônias (UFC) de diferentes microrganismos que crescem em

diferentes temperaturas. Por exemplo: psicrófilos, mesófilos, psicrotrófilos e

termófilos. Para isto é necessário que a temperatura de incubação favoreça

estes diferentes grupos de microrganismos. Assim, para bactérias psicrófilas,

é recomendada uma incubação de dez dias a temperaturas de 7ºC para “Pour


108

Plate”, ou sete a oito dias a 7ºC para “Spread Plate”; para psicrófilas,

incubação de cinco dias nas temperaturas de 23-25°C; para mesófilas, o tempo

de incubação é menor, de 24-48 horas em temperaturas entre 35-37ºC e para

termófilas, incubação a 24 horas a 55ºC.

A técnica de semeadura em superfície é mais adequada para

microrganismos psicrótroficos do que a semeadura em profundidade. Esta

ultima poderá causar injurias ou morte das células se a temperatura do agar

vertido nas placas for maior que 45ºC. Prepare previamente as placas e

estoque a 5ºC por vários dias ou semanas, desde que, acondicionadas em

sacos plásticos bem fechados, para prevenir a desidratação do meio.

No resultado, informe o grupo de microrganismos pesquisados e as

condições de incubação. Por exemplo:

Contagem de bactérias = 36; Diluição = 10- 3; Nº UFC = 36 x 103

UFC/g ou mL ou 36000 = 3,6 x 104 UFC/g ou mL.


109

CCAAPPÍÍTTUULLOO XX

CCOONNTTAAGGEEMM DDEE SSTTAAPPHHYY LLOOCCOOCCCCUUSS AAUURREEUUSS

ma das causas mais freqüentes dos surtos de intoxicações

está relacionada com a presença de toxinas produzidas

por cepas de Staphylococcus aureus . Estas exotoxinas

são termoresistentes, isto é, suportam temperaturas de ebulição por até 30

minutos.

U A origem das cepas toxigênicas é o homem manipulador de

alimentos, o qual abriga essa bactéria em suas fossas nasais, garganta, cabelo

e pele. Muitos de nós podemos ser portadores de S. aureus .

A determinação de S. aureus em alimentos pode ser feita pelo

método de contagem direta em placa ou pelo método de Número Mais

Provável (NMP). Geralmente utiliza-se a Contagem Padrão em Placas (CPP).

Para contagem em placas, o meio de cultura util izado é o agar Baird

Parker (BP), no qual as colônias típicas de S. aureus assumem coloração

negra, são brilhantes, apresentando zona de precipitação em torne de sua

borda, a qual é circulada por um halo claro.

Para a identificação de S. aureus são necessários, além da

observação de suas características morfológicas e tintoriais, testes

bioquímicos tais como: coagulase, termonuclease, catalase, util ização

anaeróbica de glicose e manitol. Entretanto, a atual legislação para alimentos

(ANVISA, 2001), estabelece apenas o teste de coagulase positiva.


110

1 TÉCNICA DE ANÁLISES

Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL, e preparar diluições

decimais sucessivas.

Retirar de cada diluição alíquotas de 0,1mL e semear pela técnica

“Spread Plate” em placas de Petri com BP, previamente secas com auxílio da

alça de Drigalsky.

Inverter as placas e incuba-las por 48horas a 35ºC.

Verificar a presença de colônias típicas com as seguintes

características: circular, com 2 a 3mm de diâmetro, de coloração negra,

geralmente com borda brilhante, circundada por dois halos apresentando uma

zona opaca mais próxima à colônia e outra zona, mais externa, transparente.

Selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar as colônias típicas

de S. aureus . Eventualmente, colônias atípicas podem apresentar-se cinzentas,

sem um ou ambos halos típicos.

Isolamento: Transferir cada colônia suspeita para tubos de ensaios

com 0,3mL de BHI e inocular uma alçada desta suspensão em tubo com TSA

inclinado, para manutenção da cultura. Inocular os tubos com BHI e TSA por

24horas a 35ºC.

Prova de coagulase: Adiconar a cada tubo de ensaio com BHI,

0,25mL de plasma de coelho e agitar. Incubar a 35ºC e examinar a formação

de coágulo periodicamente durante 6 horas. Considerar positivo um coágulo

firme e compacto, que não se despende quanto o tubo é inclinado ou invertido

(Apêndice F).

Coloração de Gram

A partir de cultura de 24 horas em TSA inclinado realizar a

coloração de Gram.


111

Devem ser identificadas bactérias gram positivas em forma de

cocos, arranjados caracteristicamente em forma de cacho de uva.

Cálculo do resultado: Calcular o número de UFC/g ou mL em

função do número de colônias típicas contadas, diluição inoculada e

percentagem de colônias confirmadas. Por exemplo: Diluição 10- 2, 30

colônias típica, 5 submetidas à confirmação, 3 confirmadas (60%):

UFC/g ou mL = 30 x 102 x 10 x 0,6 = 1,8 x 104.


112

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXII

CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBAACCIILLLLUUSS CCEERREEUUSS

contagem de Bacillus cereus em alimentos pode ser feita

pelo método de plaqueamento direto. O meio utilizado é o

Agar manitol gema de ovo polimixina (MYP), que combina

a polimixina como agente seletivo, a gema de ovo e o manitol como agentes

diferenciais.

AA colônia é caracterizada por um grande halo de precipitação. A

confirmação das colônias típicas inclui duas séries de provas bioquímicas; a

primeira objetivando verificar se a cultura isolada pertence ao grupo do B.

cereus ( teste de util ização anaeróbia da glicose, teste de decomposição da

tirosina, teste de VP e teste de nitrato, com provas opcionais de hidrólise da

gelatina e resistência à lisozima) e a segunda objetivando diferencias B.

cereus dos demais bacilos do grupo (verificação da produção de cristais de

toxinas intracelulares, que distingue B. Thuringiensis , verificação da

característica de motilidade, que diferencia B. antrhacis).


Retirar assepticamente 25g ou 25mL e preparar as diluições

sucessivas. Pipetar, de cada diluição, alíquotas de 0,1mL e colocar nas placas

contendo o meio Agar seletivo para B. cereus . Semear o inóculo com alça de

Drigalsk. Incubar as placas invertidas a 30ºC por 24horas. Após a incubação,

contar as colônias típicas de B. cereus e transferir algumas destas colônias (3

a 4) para Agar triptona de soja (TSA) e incubar a 30ºC por 24horas (Apêndice

G).


113

Realizar as seguintes provas bioquímicas: caldo nitrato, caldo

carboidrato vermelho de fenol, Agar amido, Agar gelatina e Voges-Proskauer

(Apêndice H).

Teste de redução de nitrato (caldo nitrato)

Inocular uma alçada com inoculo da cultura nos tubos de caldo

nitrato e incubar a 35ºC por 24 horas. Após incubação adicionar aos tubos de

cultura 0,25mL de cada um dos reagentes para teste de nitrato.

Solução A (solução de ácido sulfanílico); solução B (solução de α-

naftol). Observar o desenvolvimento de uma cor avermelhada em no máximo

10 minutos (teste positivo) e, em caso negativo, a cor do meio fica inalterada.

Teste de utilização anaeróbia da glicose (caldo vermelho de fenol 1%

glicose)

Inocular uma alçada da cultura no meio previamente desaerado

(fervura por 15 minutos em banho, e em seguida resfriar imediato em banho

de gelo). Cobrir a superfície do caldo com óleo mineral ou vaselina líquida

estéril e incubar a 35ºC por 24 horas. Observar se há ocorrência de viragem

ácida do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo (teste

positivo) ou se o meio permanecer com a cor inalterada (teste negativo). As

cepas de B. cereus util izam a glicose anaerobicamente.

Teste de hidrólise de amido

Transferir uma alçada da cultura para as placas de Agar amido,

fazendo duas estrias na superfície do meio. Incubar a 30ºC por 24 horas. Após

a incubação adicionar gotas de lugol na superfície das estrias.


114

O resultado é positivo quando aparecem zonas claras ao redor do

inoculado não corado pelo iodo; o resultado é negativo quando há ausência

destas zonas claras.

Teste de Voges-Proskauer

Inocular uma alçada com inoculo da cultura nos tubos de caldo

MRVP e incubar a 35ºC por 48 horas. Adicionar para cada tubo contendo a

cultura 0,6mL de solução de α-naftol 5%, 0,2mL de solução de KOH 40%.

Agitar, deixar em repouso e observar periodicamente por até 1 hora o

aparecimento de uma coloração vermelha no meio de cultura (teste positivo).

A permanência do meio na cor amarela indica teste negativo. As cepas de B.

cereus são VP positivas.


115

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIII

CCOONNTTAAGGEEMM DDEE CCLLOOSSTTRRÍÍDDIIOOSS SSUULLFFIITTOO RREEDDUUTTOORREESS

s bactérias do gênero Clostridium estão amplamente

distribuídas na natureza, podendo ser encontradas no solo,

ar, poeira, água, alimentos e até no trato intestinal do

homem e de animais.

AEstas bactérias têm sido freqüentemente associadas a surtos de

DVAs, quando uma população de, no mínimo 1 milhão de bactérias,

contamina estes alimentos.

A detecção de clostrídios sulfito redutores se faz por contagem em

placas, em meio contendo sulfito de sódio e sais de ferro, além de antibiótico.

A redução de sulfito, produzindo sulfeto, é detectada por sua reação com

ferro, provocando o aparecimento de colônias negras, dentre aquelas

redutoras de sulfito. Podem ser util izados dois meios seletivos, o Agar

seletivo sulfito polimixina sulfadiazina (SPS) e o Agar triptose sulfito

cicloserina (TSC) com emulsão de gema de ovo, usado para plaqueamento em

profundidade.

Uma outra bactéria sulfito redutora de grande importância é. C.

botulinum que, se presente, será igualmente detectada.

Muitos casos de surtos de toxinfecções relacionados a bactérias

produtoras de toxinas de elevada potência em conservas enlatadas têm sido

relatados.

A pesquisa de determinadas espécies, como C. perfringens ou C.

botulinum , se faz a partir da estimativa em meio de cultura, pela amostragem

de colônias suspeitas e pelas respectivas provas bioquímicas.


116


Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL da amostra e preparar

diluições sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de dada diluição em placas

com Agar (SPS) ou TSC, previamente fundido e resfriado a 50ºC. Após a

absorção do inoculo, adicionar uma sobrecamada cerca de 10mL do meio

fundido e resfriado e permitir mais uma vez a sua solidificação. Incubar em

jarra anaeróbica a 46ºC por 24 horas permitir mais uma vez a sua

solidificação.

Contar o número total de colônias negras, observando o limite entre

20 e 200 colônias negras com ou sem halo por placa. Contar todas as colônias

negras e calcular a média das duas placas (Apêndice I).

Confirmação das colônias típicas de clostrídios sulfito redutores

Selecionar várias colônias típicas e transferir para tubos de caldo

infusão cérebro coração (BHI), previamente desaerados. Incubar os tubos

inoculados a 35ºC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para coloração

de gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase.

Teste de catalase

Adicionar ao tubo de BHI 1,0mL de peróxido de hidrogênio 3% e

observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste

negativo). Os clostrídios sulfito redutores são bastonetes gram positivos,

catalase negativos.


117

Cálculo dos resultados

Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes gram

positivos catalase negativos. Calcular o número de UFC/g ou mL em função

do número de colônias típicas, diluição inoculada e percentual de colônias

confirmadas. Por exemplo, para plaqueamento em profundidade, diluição 10- 2,

25 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 8 confirmadas (80%)

UFC/g ou mL = 2,5 x 102 x 0,8 = 2,0 x 103.


118

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIIIII

PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAALLMMOONNEELLLLAA SSPPPP..

almonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, gram

negativo, não esporulado. Várias espécies são patogênicas ao

homem e aos animais. Habitando o trato intestinal de

animais, Salmonella é eliminada pelas fezes. A possibilidade de contato de

fezes contaminadas com águas, superfícies e manipuladores, torna iminente a

sua veiculação por alimentos.

SExistem vários métodos para o isolamento de Salmonella , nenhum é

completamente satisfatório para isolar todos os sorotipos presentes em

qualquer alimento. Eles compreendem as seguintes etapas: pré-

enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento em Agar seletivo e

diferencial e seleção de colônias suspeitas, com as quais realizam-se provas

bioquímicas, sorologia e fagotipagem, que definirão, finalmente, o sorotipo.


A) Pré-enriquecimento: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amostra e

adicionar 225mL de caldo lactosado ou água peptonada tamponada. Incubar a

35-37ºC por 24 horas.

B) Enriquecimento seletivo: Agitar o caldo pré-enriquecimento e

inocular 0,1mL em 10mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do caldo

tetrationato. Incubar os meios a 37ºC e 42ºC/24 horas.

C) Plaquemento em meio seletivo e diferencial: Agitar os tubos de

caldo Rapapport e tetrationato e estriar uma alçada de cada cultura em placas

nos seguintes meios de cultura: Agar Hektoen, Agar Rambac e Agar XLD,

identificando a origem das culturas (Rapapport e tetrationato). Incubar as

placas invertidas a 35ºC por 24 horas.


119

D) Seleção de colônias suspeitas: Transcorrido o período de

incubação do plaqueamento seletivo, observar as colônias suspeitas de

Salmonella com auxílio de manuais especializados (Apêndice J).

E) Provas bioquímicas de triagem: Transferir duas ou mais colônias

suspeitas de cada placa para tubos inclinados, contendo Agar TSI e LIA. Com

auxílio de agulha de inoculação, tocar levemente o centro da colônia, estriar

na superfície inclinada (ápice) do TSI e dar uma picada na base. Sem flambar

a agulha, dar duas picadas na base do meio LIA e estriar na superfície.

Rotular os tubos, identificando a origem das culturas e incubar a 35ºC por 24

horas.

Reações típicas de Salmonella nos tubos de TSI e LIA, são as

seguintes:

TSI ápice alcalino (vermelho) e base ácida (amarela), com ou

sem produção de gás (bolha) e de H2S (escurecimento do meio).

LIA base alcalina (púrpura), a maioria produz H2S. Coloração

vermelho-tijolo no ápice do meio LIA não é tipo de Salmonella .

Submeter todas as culturas com reações típicas no meio LIA (base

alcalina) e/ou no meio TSI (alcalina/ácida) a testes bioquímicos e

sorológicos. Descartar apenas as culturas ápice/base ácidas no meio TSI e

aquelas com base ácida no meio LIA (Apêndice K).

Provas bioquímicas de confirmação

Teste da urease: Inocular com alça, tubos de ensaio com caldo uréia.

Incubar a 35ºC por 24 horas. Reação positiva: alteração da cor do meio para

rosa escuro, pela viragem alcalina do indicador. A maioria das cepas de

Salmonella é urease negativa (não altera a coloração do meio).

Para os testes posteriores, renovar as culturas urease negativas em

meio TSI inclinado e incubar a 35ºC por 24 horas.


120

Teste de fermentação do dulcitol: Inocular uma alçada em tubos de

ensaio com caldo púrpura de bromocresol com 0,5% de dulcitol. Incubar a

35ºC por 48 horas. Reação positiva: acidificação do meio (amarelo). Reação

negativa: coloração púrpura do meio. A maioria das cepas de Salmonella

fermenta dulcitol.

Teste de util ização do malonato: Inocular cultura para tubos de

ensaio com caldo malonato e incubar a 35ºC por 48 horas, mas examinar após

24 horas. Incubar um tubo controle não inoculado. A maioria dos sorotipos de

Salmonella é malonato negativo (coloração verde). malonato positivo

(alteração de cor verde para azul).

Os testes de indol, vermelho de metila, Voges-Proskauer e citrato de

Simmons, já foram descritos para identificação de Escherichia coli .

As culturas de Salmonella spp. apresentam o seguinte quadro:

Teste Resultado

Citrato de Simmons +

Malonato -

Vermelho de metila +

Voges-Proskauer -

Indol _

Urease -

Lisina +

Açúcares; lactose -

Açúcares; glicose +

Açúcares; dulcitol +

Motilidade (meio SIM) +


121

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIVV

CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBOOLLOORREESS EE LLEEVVEEDDUURRAASS

s bolores são fungos com estruturas filamentosas. As

leveduras são fungos unicelulares de forma esférica,

ovóide, cilíndrica. Os fungos são talvez a causa mais

comum de deterioração de alimentos estocados em ambientes domésticos,

além disso, alguns bolores produzem micotoxinas.

O


Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as

diluições sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placas de

Petri , fazendo de cada diluição placas em duplicatas. Adicionar a cada placa

15mL do agar batata dextrose, previamente fundido, resfriado a 45ºC e

acidificado com o ácido tartárico. Homogeneizar com movimentos em forma

de oito. Deixar solidificar a temperatura ambiente. Incubar as placas a 25ºC

por 3 a 5 dias.

Resultados

Após o período de incubação, considerar para contagem somente as

placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias. Em seguida,

multiplicar a média das duas placas pelo fator de diluição correspondente,

expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colônias por grama ou

milili tros (UFC/g ou mL) (Apêndice L).


122

CCAAPPÍÍTTUULLOO XXVV

TTEESSTTEE DDEE EESSTTEERRIILLIIDDAADDEE CCOOMMEERRCCIIAALL

teste de esterilidade comercial tem por objetivo

comprovar a ausência de microrganismos viáveis em

alimentos enlatados em condições normais.

Microrganismos viáveis podem, normalmente, ser recuperadores de alimentos

processados pelo calor e comercialmente esterilizados sob três condições

gerais:

O 1) quando são termófilos obrigatórios, formadores de esporos e a

temperatura de estocagem do produto está abaixo da faixa termofílica;

2) quando são ácido-tolerantes, podendo estar presentes, mas são

incapazes de crescerem pelas condições ácidas impostas ao produto, ou seja,

pH < 4,6;

3) quando são termofílicos e mosofílicos, formadores de esporos,

podendo ser recuperados de alimentos enlatados nos quais foram usados

processos combinados de calor e atividade de água, para prevenir as

conseqüências da deterioração. É normal encontrar microrganismos nessas

três condições e o produto é considerado comercialmente esterilizado.

O ponto de inibição de pH do crescimento de Clostridium botulinum

é de 4,6, razão pela qual os enlatados devem estar abaixo deste pH.

O teste de esterilidade comercial deve ser feito nos enlatados

aparentemente normais, por meio da observação dos recipientes incubados e

por determinação do vácuo, odor e pH do produto.


123

1 MÉTODOS

Pré-incubação

Incubar as amostras seguindo um plano de amostragem

representativa para o lote, por 14 dias a 35ºC, sobre papel de fil tro para

verificar se há vazamentos. Se qualquer das latas apresentar sinal de

anormalidade, anotar este fato. Retirar as embalagens da estufa, quando

apresentarem sinais externos de crescimento microbiano, visualizado pelo

vazamento ou estufamento. Após a incubação abrir a embalagem e observar se

há odor anormal, alteração na consistência e formação de espuma. Determinar

o pH. Não deve ser usado papel de pH.

Comparar com as embalagens controle e observar se há alguma

anormalidade. Em caso positivo, isto significa que o produto não está

normalmente esterilizado.

Pesquisa de anaeróbios

Usar ambiente o mais asséptico possível, quando proceder a

abertura das latas. Lavá-las com água quente e sabão. Secá-las. Limpar a

superfície das latas com a solução de iodo e álcool e depois enxugar com

toalha de papel. Nunca flambar as latas.

Inoculação: Homogeneizar o conteúdo da embalagem e retirar, do

centro da massa de alimento, porções de aproximadamente 2g ou 2mL e

inocular em quatro tubos de ensaio contendo caldo de carne cozida aquecido a

100ºC e resfriado rapidamente. Inocular os tubos em profundidade e fechar

fortemente as tampas. Também inocular quatro tubos com caldo púrpura de

bromocresol. Incubar os dois primeiros tubos de caldo de carne cozida em

35ºC e os outros dois em 55ºC. Nos primeiros, observar o crescimento após

um período de 96 a 120 horas e nos segundos, de 24 a 72 horas. Incubar os

quatro tubos de caldo púrpura de bromocresol nas mesmas temperaturas

anteriores (35 e 55ºC) e incubar por 24 a 48 horas e 96 a 120 horas,

respectivamente.


124

Leitura dos resultados: Após a incubação, observar todos os tubos

inoculados quanto à ocorrência de crescimento (turvação do meio), formação

de película superficial e/ou produção de gás. Os tubos de caldo de púrpura de

bromocresol também devem ser observados quanto à produção de ácido

(alteração da cor do meio para amarelo).

Interpretação dos resultados: 1) Ausência de alteração em todos os

tubos inoculados produto comercialmente estéril; 2) ocorrência de

crescimento e/ou alteração em qualquer dos tubos inoculados pode ser

indicativa da ausência de esterilidade comercial de contaminação da amostra

no laboratório (Apêndice M).


125

AAPPÊÊNNDDIICCEESS


126

Apêndice A . Esquema das diluições sucessivas.

Diluição

Alimento (25g)

Homogeneizar

225mL de H2O peptonada, 0,85%

10-2 10-3

1mL

1mL

10-1


127

Apêndice B . Tabela do Número Mais Provável (NMP), para séries de três

tubos (NMP/g ou mL).

Número de tubos positivas nas diluições Número de tubos positivos nas diluições

10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP

0 0 0 3 2 0 0 9.1 0 1 0 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6.1 2 1 1 20 0 1 2 9.2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6.2 2 2 0 21 0 2 1 9.3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9.4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3.6 3 0 0 23 1 0 1 7.2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7.3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 2400


128

Apêndice C . Enumeração de coliformes totais e a 45ºC.

1ml 1ml 1ml

10-1 10-2 10-3

Caldo Lauryl(CL)

ESTUFA35ºC/24-48h

2 alçadas

Teste Confirmativo coliformes a 45ºC

(Caldo E.C.)

2 alçadas

Teste Confirmativo coliformes totais

(Caldo VB)

BANHO-MARIA 45ºC/24h

ESTUFA 35ºC/24-48h

Gás (+) Presença de

coliformes a 45ºC

Gás (-) Ausência de

coliformes a 45ºC

Gás (+) Presença de

coliformes totais

Gás (-) Ausência de

coliformes totais

TESTE BIOQUÍMICO Teste API-20E


129

Apêndice D . Identificação de Escherichia coli .

Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli .

Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)

Caldo E.C., presença de gás (+) para coliformes a 45ºC.

INDOL

E. coli (+)

Série Bioquímica


130

Apêndice E . Esquema da técnica de análise de Contagem Padrão em Placas de

bactérias mesófilas.

1mL

1mL 1mLAmostra

(25g)

10-2 10-3 10-4 10-1

1mL 9 mL sol. salina 0,85% NaCl

225mL solução salina estéril

Plate Count Agar (PCA)

1mL 1mL1mL

Incubação 37ºC/48h

Contagem das placas contendo 30 a 300 colônias


131

Apêndice F . Contagem de Staphylococcus coagulase positiva.

Agar Baird Parker (Agar BP)

1ml 9 ml solução salina

225ml solução salina estéril

10-2 10-3 10-410-1

1ml 1ml

0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml

ALIMENTOS 25g ou 25 ml

ESTUFA 35ºC/24 horas

Agar Tripticase Soja (Agar TSA)

Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI)

ESTUFA 35ºC/24 horas Agar BP com crescimento de Staphylococcus spp.

(-) (+) (+)

Teste de Coagulase Teste de Catalase

TESTES BIOQUÍMICOS

(-)


132

Apêndice G . Contagem de Bacillus spp.

Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)

Contagem das colônias típicas

TESTES BIOQUÍMICOS

9 ml sol. salina1ml

225ml soluçãosalina estéril

10-2 10-3 10-4 10-1

1ml 1mlALIMENTO 25g ou 25ml

Espalhamento (alça de Drigaslk)

ESTUFA 35ºC/48 horas

0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml


133

Apêndice H . Identificação de Bacillus cereus .

Voges - Proskauer

Hidrolise do Amido

Fermentação da Glicose

Hidrolise da Gelatina

Agar TSA (Cultura)

(+)(-)

(+) (-)


134

Apêndice I . Contagem de Clostridium spp.

Contagem das colônias típicas de Clostridium spp. em Agar SPS

Isolamento em Agar Tripticase Soja (Agar TSA)

1ml 1ml 1ml 1ml

9 ml sol. salina 1ml


10-2 10-3 10-410-1

1ml 1mlALIMENTO 25g ou 25ml

ESTUFA 46ºC/48 horas(Em Anaerobiose)

TESTES BIOQUÍMICOS


135

Apêndice J . Pesquisa de Salmonella spp.

Estrias

225ml de Água Peptonada Tamponada

ESTUFA A 35ºC/24 horas

ENRIQUECIMENTO

0,1mL 1mL

10mL de Caldo Tetrationato

10mL de Caldo Rapapport

ESTUFA A 35ºC/24 horas

Agar Tripcase Soja

Testes Bioquímicos

Agar Hektoen Agar Rambach

INCUBAÇÃO 35ºC/24H

ALIMENTO 25g ou 25ml


136

Apêndice K . Identificação de Salmonella spp.

Citrato de Simmons

Uréia Agar LIA Agar TSI

a

Testes Preliminares ( 1 Etapa )

Vogues-Proskauer Vermelho de Metila

Indol

Testes Finais ( 2a Etapa )

Fermentação de Lactose Fermentação de Sacarose Caldo Malonato


137

Apêndice L . Contagem de Bolores e Leveduras.


Agar Batata Dextroseadicionado Ácido Tartárico

9 ml sol. salina

1ml

10-2 10-3 10-410-1

1ml 1ml

1ml 1ml 1ml 1ml

ALIMENTOS 25g ou 25 ml

ESTUFA B.O.D. 25ºC/ 5 dias

Contagem das placas que contenhamentre 30 e 300 colônias (UFC/g ou ml)


138

Apêndice M . Esterilidade Comercial.

Caldo Púrpura de Bromocresol

Caldo de Carne Cozida

ESTUFA 55ºC/24 a 72h




INOCULAÇÃO

Abertura Asséptica (Lavagem com água quente e sabãoou desinfetar com álcool a 70%)

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

1. Ausência de alterações em todos os tubos inoculados → produto

comercialmente estéril;

2. Ocorrência de crescimento e/ou alteração em qualquer dos tubos inoculados

→ pode ser indicativa da ausência de esterilidade comercial de contaminação

da amostra no laboratório.


139

RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS


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