6 - enzimas e vetores
TRANSCRIPT
1
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
VETORES DE CLONAGEM
Enzima de restrição: •Reconhecem seqüências especificas e cortam em lugares determinados.
•Reconhecem de 4 a 8 pares de bases.
•Reconhecem seqüências palindrômicas.
•Encontrada em ampla variedade de organismos procarióticos.
Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Têm sequências de
reconhecimento específicas, mas cortam de forma inespecífica dentro da
sequência de reconhecimento.
Enzimas de
restrição
Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilação é feita por
proteínas diferentes. Cortam sequências específicas de forma também
específica.
Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Cortam sequências
específicas de forma também específica.
ALGUMAS ENZIMAS DE RESTRICAO UTILIZADAS EM BIOLOGIA
MOLECULAR
Anabaena variabilis Ava I C (C/T)CG(A/G)G
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G GATCC
Bacillus globigii BglII A GATCT
Escherichia coli RY13 EciRI G AATTC
Escherichia coli R245 EcoRII CC(T/A)GG
Haemophilus aegyptius HaeIII GG CC
Haemophilus gallinarum HgaI GACGC
Haemophilus haemolyticus HhaI GCG C
Haemophilus influenzae Rd HindII GT(C/T) (A/G)AC
Hind III A AGCTT
Haemophilus parainfluenzae HpaI GTT AAC
HpaII C CGG
Klebsiella pneumoniae KpnI GGTTAA C
Moraxella bovis MboI GATC
Providencia stuartii PstI CTGCA G
Serratia marcescens SmaI CCC GGG
Streptomyces stanford SstI GAGCT C
Xanthomonas malvacearum XmaI C CCGGG
ISOESQUIZOMEROS – Enzimas de restricao com regioes coesivas complementares. Algumas
reconhecem sequencias de numero diferente de bases.
Exemplo: BamHI 5’- G/GATCC- 3’ e Sau3A ou MboI 5’- N/GATCN- 3’
ATIVIDADE “STAR”
As enzimas em condicoes não ideais podem reconhecer e cortar em sitios não especificos. Os
fatores que levam a atividade “star” são:
1. Alta concentracao de enzima (>100 unid/ug)
2. Alta concentracao de glicerol (>5%)
3. Substituicao de Mg por Mn.
4. Baixa concentracao de sal (<25mM)
5. pH extremos, especialmente acima de 8.0.
6. Presenca de DMSO, etanol ou outro solvente organico.
INATIVACÃO TERMICA
Grande parte das enzimas de restricao podem ser inativadas por calor (65°C –15 min.)
Enzimas inativadas: AatI, AluI, ApaI, AvaII, BalI, BamHI, BglI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HindIII,
HincII, MboI, MboII, MspI, NotI, NurI, PstI, PvuII, SacI, SalI, Sau3A, SmaI, XhoI, XmaI.
Enzimas não inativadas: BanI, BclI, BglII, HaeIII, HinfI, HpaI, HpaII, PvuI, TaqI, XbaI.
2
INIBICÃO POR METILAÇÃO
A metilação afeta a especificidade das enzimas de restrição. Os genes DAM e DCM de Escherichia
coli codificam metilases que acrescentam um radical metila (-CH3) em sitios especificos do DNA.
1- A metilase DAM transfere um grupo metil da S-adenosilmetionina para o N6 do residuo de
adenina das sequencias GATC.
Enzimas inibidas: BclI (T/GATCA), ClaI (GAT/CGAT), MboI (/GATC), XbaI
(T/CGATC), TaqI (GAT/CGA).
Enzimas não inibidas: BamHI (G/GATCC), BglII (A/GATCT), Sau3A (/GATC).
2- A metilase DCM metila a citosina interna nas sequencias 5’>3’ CCAGG e CCTGG.
Enzimas inibidas: ApaI (GGGCC/CAGG), AvaII (G/GACCAGG), etc.
Enzimas não inibidas: BglI, KpnI, etc.
UNIDADE
1 unidade de enzima de restricao corta completamente 1ug de DNA de fago Lambda em uma
hora em um volume de reacao de 50ul na temperatura ideal da enzima e no tampao
apropriado.
TAMPÕES DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (em geral adquirido junto com a enzima)
a) 10mM Bis-Tris-Propano-HCl, pH 7.0; 10mM MgCl2; 1mM DTT
AluI, EaeI, HgaI, HpaI, KpnI, SpeI, XmaI
b) 10mM Tris-HCl pH7.9; 50mM NaCl; 10mM MgCl2; 1mM DTT
BsmI, EcoRV, HindIII, HinfI, MboII, MseI, MspI, PstI, PvuII, SstI, StuI, XhoI, XorII
c) 50mM Tris-HCl pH7.9; 100mM NaCl; 10mM MgCl2; 1mM DTT
AseI, BclI, BglII, BspEI, BstEI, DraIII, MboI, MluI, PstI, PvuI.
d) 20mM Tris-Acetato pH7.9; 50mM KOAc, 10mM Mg(OAc)2; 1mM DTT
AatII, ApaI, AvaI, AvaII, BanI, BanII, ClaI, DraI, EcoRII, HaeIII, HpaI, SacII, SmaI.
FERRAMENTAS MOLECULARES
CORTE COM ENZIMAS DE RESTRICAO E MAPAS DE RESTRICAO
1. CORTE COM ENZIMA DE RESTRICAO
O corte deve ser realizado com a quantidade adequada de enzima. Quantidades exageradas
podem levar a atividade “star” e concentracoes baixas podem resultar em corte parcial (as
vezes desejado).
1 unidade por ug de DNA genomico
3 unidades por ug de DNA circular (plasmidial).
2. PROTOCOLO TIPICO
Tampão de enzima – 1x (normalmente adquirido 10x)
DNA - o seu volume não deve ser superior a 50% do volume total.
Enzima - o seu volume não deve superar 10% do volume total.
Agua - deve ser utilizada agua ultrapura esterilizada por calor.
BglII BamHI PstI BglI PstI
0.3 0.7 2.6 0.9 0.5 1.2
BglII BamHI PstI BglII BglII BamHI
BamHI PstI PstI
6.2
5.2
4.2
1.7
0.3
1.0
3.6
1.4 1.2
3.5
1.7
0.7
0.3
3.3
1.2
0.9
0.5
0.3
2.6
1.4 1.2 1.0
QUE TIPO DE ALTERACOES PODEM SER RECONHECIDAS ATRAVES DE ANALISE
DE FRAGMENTOS DE RESTRICAO?
1. Mutacoes de ponto no local de reconhecimento e corte por parte da enzima de restricao e c
onsequentemente, a ausencia de sitio de corte.
2. Mutacao de ponto que cria um novo sitio de corte com enzima de restricao.
3. Delecao que elimina sitio de corte e ao mesmo tempo muda o comprimento dos fragmentos
gerados por uma enzima ou outras enzimas.
4. Delecao que nao elimina sitio de corte mas altera o comprimento do fragmento gerado por enzimas
que franqueiam o local.
5. Insercao que gera novo sitio de corte e ao mesmo tempo altera o comprimento dos fragmentos
gerados por uma enzima ou outras enzimas.
6. Insercao que nao gera novo sitio mas aumenta o comprimento dos fragmentos gerados por uma
enzima ou outras enzimas.
0.6 1 3.5 1.2 6.7 0.2
0.6 1 3.5 1.2 6.7 0.2
0.6 1 3.5 1.2 0.3 6.4 0.2
2.6
2.2
1.1
Desenhe o gel correspondente a estes fragmentos de seis organismos.
3
VETORES DE CLONAGEM
Caracteristicas de um vetor de clonagem:
-Autoreplicativo
-Com sitios unicos de corte com enzimas de
restricao.
-Com marcada de selecao.
TIPO DE VETORES
-PLASMIDIOS
Moleculas circulares de DNA extracromossomico autoreplicativas; limite para
clonagem 100 a 10.000pb.
-FAGOS
Derivados de bacteriofago Lmbda; molecula de DNA linear com regioes que
podem ser substituidas por DNA externo sem quebrar o ciclo; limite para clonagem de 8 a
20.000pb.
-COSMIDIOS
DNA extracromossomico circular que combina caracteristicas plasmidiais e
fagicas; limite para clonagem 35.000 a 50.000pb.
-BAC (CROMOSSOMO BACTERIANO ARTIFICIAL)
Baseado em plasmidios mini-F; limite para clonagem 75.000 a 300.000pb.
-YAC (CROMOSSOMO ARTIFICIAL DE LEVEDURA)
Cromossomo artificial contendo centromero, telomeros, origem de replicacao e
marcadores de selecao; limite para clonagem 100.000 a 2.000.000pb.
POLILINKER – SEQUENCIA DE DNA COM DIVERSOS SITIOS DE RESTRICAO.
PLASMIDIOS
VETORES DE EXPRESSAO:
- Os vetores de expressao devem conter promotor e
terminador proximos a sitios de corte com enzimas
de restricao visando a expressao de genes clonados
sob o controle de tal sistema.
VETORES BINARIOS PARA LEVEDURAS:
-Os vetores binarios incluem origens de replicacao eficientes em mais de um organismo e sistema de
selecao nos organismos para os quais foram desenhados.
-YEP352- apresenta origem de replicacao de 2um
-YADE4- apresenta origem de replicacao ARS1
4
VETOR BINARIO PARA TRANSFORMACAO DE PLANTAS COM MONITORAMENTO DE
EXPRESSAO.
Eco Hind
ApR TcR
Eco Hind
ApR TcR
Hind
Hind
CmR
Hind
CmR
CmR ApR
TcR
Eco Hind
Hind
CmR
ApR
TcR
Eco Hind
Hind
+
Construcao do plasmidio binario pHV14 e pHV15
funcionais em E. coli e B. subtilis, pela ligacao de
pBR322 e pC194.
pBR322 pC194
Corte com HindIII Corte com Hind III
Ligacao com T4 ligase
METODO DE LISE ALCALINA PARA EXTRACAO DE PLASMIDIOS (Miniprep).
1. Crescer 5ml de cultura bacteriana em meio LB contendo o antibiotico seletivo a 37C com agitacao por 6h a
18h.
2. Centrifugar 5000 a 10000 rpm por 5 min. e descartar sobrenadante.
3. Adicionar 100ul de 50mM glicose, 25mM TrisHCl pH8.0, 10mM EDTA, 2mg/ml lisozima. Ressuspender e
manter em banho de gelo por 10 min.
4. Adicionar 200ul de 0.2N NaOH, 1% SDS. Misturar lentamente por inversao. Incubar em banho de gelo por 10
min.
5. Adicionar 150ul de acetato de sodio 3M pH4.8. Misturar lentamente por inversao. Incubar por 10 min. no
freezer.
6. Centrifugar por 15 min. 15000rpm a 4C.
7. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar 2 a 2.5 volumes de etanol (-20C). Incubar em banho de
gelo por 10 min.
8. Centrifugar por 1-5min a 10000rpm.
9. Lavar com etanol 70% (-20C)
10. Secar a vacuo ou ambiente, e ressuspender em 50ul de TE. Tratar por 90 min. com RNAse.
OBS: pretratamento com cloranfenicol aumenta o numero de plasmidios por celula e o rendimento da extracao.
VETORES VIRAIS
-Os vetores virais aproveitam a grande
capacidade de transfeccao dos fagos
(1000 vezes maior que um plasmidio)
e a possibilidade de transferencia de
fragmentos de DNA de alto peso
molecular.
Capsídio
(cabeça)
Pescoço
Placa basal
Fibras da
cauda
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
AWB DEFZ J att int xis red N cI cro OP Q S R
Regiao nao essencial
Cabeca Cauda
Integracao e
recombinacao
Regulacao e
imunidade
Sintese de
DNA
Lise Regulacao
final
Terminacao
coesiva
esquerda
Terminacao
coesiva
direita
MAPA FISICO DO FAGO LAMBDA
5
As terminacoes do DNA Lambda sao conhecidas como
sitios COS, cada uma corresponde a uma sequencia fita
simples de 12 nucleotidios. Como suas sequencias sao
complementares, uma terminacao liga-se a outra formando
CONCATOMEROS.
As duas terminacoes de um fago Lambda podem tambem se
ligar entre si formando uma molecula circular. Na celula
bacteriana formam-se fagos circulares pois a DNA ligase
sela a uniao entre as extremidades COS.
No processo de EMPACOTAMENTO do virion Lambda,
duas proteinas Nu1 e A podem reconhecer os sitios COS,
direcionando a insercao do virion para uma cabeca vazia. A
cabeca e entrao acoplada a uma cauda formando a particula
viral completa.
Este ;processo ocorre normalmente na celula hospedeira,
entretanto, para processos de clonagem um complexo de
empacotamento e utilizado.
Proteinas Nu1 e A sao codificadas por genes presentes no
fago. Se os dois genes encontram-se mutados nao ocorre
empacotamento. Como o empacotamento ocorre em cabecas
e caudas preformadas, a celula hospedeira deve acumular
estas estruturas vazias, as quais podem ser extraidas.
Quando os DNA recombinantes de Lambda sao misturados
com cabecas vazias, caudas, proteinas Nu1 e proteinas A, o
empacotamento ocorre.
LAMBDA GT11
COSMIDIOS
Os cosmidios sao uma combinacao de plasmidios e sitios COS que permitem que o DNA cosmidial seja inserido em
cabecas de fagos.
Os cosmidios apresentam as seguintes vantagens:
-Alta eficiencia de transferencia
-Permite carregar aproximadamente 45kb, enquanto que plasmidios e fagos carregam no maximo 25kb.
YAC
Os cromossomos artificiais de leveduras
(YAC) sao capazes de carregar fragmentos de
mais de 2Mb, mas a sua taxa de transferencia
e baixa.
Componentes essenciais de vetor YAC
-Centromero (CEN), telomeros (TEL) e
sequencia de replicacao autonoma (ARS).
-Gene AMP para amplificacao seletiva e
marcadores como TRP1 e URA3 para selecao
em leveduras.
-Sitio de reconhecimento por enzimas de
restricao.
Processo
1.O DNA alvo e parcialmente digerido com
EcoRI e o YAC completamente digerido com
EcoRI e BamHI..
2.Ligacao do vetor clivado com o DNA
digerido formando cromossomos artificiais.
3.Transformacao de leveduras.
FERRAMENTAS MOLECULARES
LINHAGENS MICROBIANAS E MODELOS BIOLOGICOS
ALGUNAS LINHAGENS DE Escherichia coli UTILIZADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR
HB101- F- mcrB mar- hsdS20 (rb- ma
-) recA13 leuB6 ara14 proAZ lacY1 galK2 xyl5 mtl1 rpsL20
(smr) supE44 Lambda-
DH5α – F- Φ80d lac ZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U129 endA1 recA1 hsdR17 (rk-mk
+) deoR thi1 supE44
Lambda- gyrA96 relA1
MC1061 – F- araD139 Δ(ara-leu) 7679 galU galK Δ(lac) X74 rpsL (strr) hsdR2 (rk-mk
+) mcrB1
GM2163 – F- dam dcm supE44 rpsL (strr) Lambda- mcrB1
GENES IMPORTANTES EM LINHAGENS PARA BIOLOGIA MOLECULAR
mcr- sistema de restricao metilcitosina especifico.
mar- sistema de restricao metiladenina especifico.
hsd- sistema de restricao de K12 reconhece AmeACNNNNNNGTGC
rec- sistema de recombinacao
dam- adenina metilase
dcm- citosina metilase
ALGUNAS LINHAGENS DE LEVEDURAS UTILIZADAS EM BIOLOGIA MOLECULAR
A maior parte das linhagens sao derivadas da linhagem isogenica S288C.
AH22 – a leu2-3 leu2-112 his4 canr
GRF18 – α leu2-3 leu2-112 his4 canr
leu2-3 e lau2-112- mutacoes de ponto no gene leu2
his3-200 – delecao in vitro
trp1-901 – delecao in vitro
ura3-52 – insercao de Ty1
6
Caenorhabditis elegans
Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster
Mus musculus
Dictyostelium discoideum
(ameba colonial)
Danio rerio (Zebra fish)
Xenopus
FERRAMENTAS MOLECULARES
TRANSFORMACAO
TRANSFORMACAO EM E. COLI – METODO 1
-Crescer a linhagem bacteriana em LB a 37C por 18h.
-Inocular 1/40 em 250ml de LB e incubar a 37C com agitacao ate uma absorbancia de 0.4-0.5 a 550nm.
-Esfriar em banho de gelo, centrifugar a 6000 rpm a 4C por 10 min.
-Decantar o sobrenadante e colocar o pellet em gelo.
-Ressuspender em 125ml de 100mM CaCl2 gelado, e incubar em banho de gelo por 30 min. com agitacao ocasional.
-Centrifugar a 6000 rpm por 10 min a 4C.
-Ressuspender em 10 ml de 100mM CaCl2 e 15% glicerol.
-Separar em aliquotas e 0.2ml, e incubar em gelo por 12 a 24h. (nesta etapa podem ser congelados em N2-liquido e
mantidos a –80C por varios meses).
-Adicionar o DNA (1 a 10ug de plasmidio para 0.2ml de celulas competentes). Incubar em banho de gelo por 30 min.
-Realizar choque termico a 42C por 2 a 5 min.
-Adicionar 0.4ml de LB e incubar 1h a 37C.
-Plaquear no meio seletivo apropriado.
TRANSFORMACAO EM S. cerevisiae – ACETATO DE LITIO
-Crescer a levedura em YEPD ate a metade da fase logaritmica (~2 x 107 cels/ml) – 10 ml.
- Centrifugar a 5000 rpm por 2 min.
- Ressuspender as celulas em 5ml de 0.1M Acetato de Litio em TE.
- Incubar 30 C por 1 h sob agitacao.
- Centrifugar e ressuspender em densidade de 2 x 109 cels/ml.
- Colocar as celulas em aliquotas de 100ul e acrescentar 1ug de DNA plasmidial. Adicionar 50ug de DNA de
esperma de salmao ou timo de boi em TE (previamente passar a solucao de DNA carregador varias vezes por
seringa).
- Incubar 30 min a 30C.
- Adicionar 0.7ml de 40% PEG4000, 0.1M acetado de litio em TE (pH7.5).
- Incubar 1 h. a 30C.
- Colocar em banho a 42C por 5 min.
- Centrifugar, lavar em agua esterilizada e ressuspender em 0.2 a 0.4ml de agua.
- Plaquear em meio seletivo.
TRANSFORMACAO DE BACTERIAS - ELETROPORACAO
-Utilizar uma colonia de E. coli para inocular 50ml de meio SOB (sem Mg), e crescer com agitacao a 37C por 18h.
-Diluir 0.5ml ca cultura em 500ml de meio SOB (sem Mg) e crescer por 2 a 3h a 37C ate D.O.550= 0.8
-Centrifugar e ressuspender em 500ml de WB (10% glicerol, 90% agua) gelado. Centrifugar novamente e repetir.
-Ressuspender em 2ml de WB gelado e aliquotar em fracoes de 200ul. Conservar a –70C.
-Juntar 20ul de suspensao de celulas com 1ul de DNA e colocar na celula do eletroporador.
-Aplicar um pulso de 2400V, 4000 ohms.
Protocolos semelhantes sao utilizados para outros microrganismos.