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UNIVERSIDADE DE CUIAB-UNIC

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Diagnstico Laboratorial em Microbiologia Clnica

BACTERIOLOGIA

Profa. Evelin Rodrigues Martins Profa. Ana Caroline A. Yamamoto Profa. Rosane Christine Hahn

Cuiab 2011

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Apresentao Esta apostila se destina a complementar as atividades de estgio supervisionado em Bacteriologia Clnica ministrado aos alunos do curso de Farmcia da Universidade de Cuiab, UNIC. A prtica da Bacteriologia Clnica parte importante da formao do farmacutico para proporcionar ao aluno concluinte do curso um alicerce de conhecimentos bsicos necessrios para:

Aplicar, na prtica diria do laboratrio, os princpios de biosegurana;

Conhecer e aplicar corretamente tcnicas de coleta, semeadura e processamento de materiais biolgicos diversos;

Isolar e identificar microrganismos presentes em um material biolgico, relacionando-os

com a microbiota (quando houver) e possveis contaminantes, para que seja diagnosticada a real etiologia de uma infeco;

Realizar teste de sensibilidade a antibacterianos, segundo tcnicas adequadas, para que

seja garantido um resultado fidedigno que oriente a teraputica aplicada ao paciente e garantindo a qualidade dos resultados.

Todas as informaes contidas nesta apostila foram adaptadas conforme rotina do setor de

microbiologia do Laboratrio Escola de Anlises Clnicas do Hospital Geral Universitrio (LEAC-HGU) como guia terico-prtico.

Entretanto vale ressaltar que outros laboratrios de anlises clnicas do Mato Grosso e de diferentes Estados brasileiro adotam rotinas microbiolgicas diversificadas. Desse modo, no decorrer dos anos e dcadas, novas informaes terico-prtico do mundo microbiolgico nos enriqueceram durante nossa vida profissional, para que possamos contribuir com a sade e o bem estar da populao.

As autoras.

Considerem a diferena de tamanho entre algumas das menores e das maiores criaturas

existente na terra. Uma pequena bactria pesa 0, 000 000 01 grama. A baleia azul pesa cerca

de 100 000 000 grama. Mas mesmo assim uma bactria capaz de matar uma baleia. So to

grandes a capacidade de adaptao e a versatilidade dos microorganismos, comparados aos

seres humanos e outros organismos tidos como superiores, que eles sem dvida continuaro

a colonizar e alterar a superfcie da Terra logo depois que ns e o resto de nossos co-

habitantes deixarmos a cena para sempre . Os micrbios, e no os macrbios, dominaro o

mundo.

Bernard Dixon, 1994.


ndice 1- Microbiota Corpo Humano 01

2-Biosegurana em Microbiologia 02

3-Meios de Cultura 06

3.1- Controle de qualidade dos meios de cultura. 10

4- Tipos de Semeadura 15

5- Processamento das Amostras Biolgicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia. 17

6- Interpretao Macroscpica das Bactrias em Meios de Cultura. 26

6.1- Interpretao do crescimento microbiolgico nos meios de cultura. 29

7- Preparo e Fixao do Esfregao Bacteriolgico. 32

8- Principais Coloraes em Bacteriologia 35

9- Identificao Bioqumica de Bactrias de Importncia Mdica. 37

9.1- Cocos Gram Positivos (CGP) 37

9.2- Bacilos Gram Negativos (BGN) 46

9.2.1- Fermentadores de Glicose (Enterobactrias) 46

9.2.2- No Fermentadores de Glicose 51

9.3- Bacilos lcool cido Resistente (BAAR) 51

9.4- Diplococos Gram Negativos 53

9.5- Bacilos Gram Negativos Pleomrficos 54

9.6- Chlamydia spp. e Treponema spp. 56

9.7- Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. 57

10- Diagnstico laboratorial das Infeces Genitais. 58

11- Teste de Susceptibilidade Antibacteriana (TSA). 61

11.1- Mtodos Utilizados na Execuo do TSA. 61

11.2- Procedimentos de Execuo do TSA por Disco-Difuso. 62

11.3- Mecanismo de Ao dos Antibiticos. 63

12- Resistncia Bacteriana aos Antibiticos. 65

12.1- Principais Mecanismos de Resistncia Bacteriana. 65

12.2- Resistncia dos CGP e BGN Alguns Antibiticos. 67

12.3- Triagem Fenotpica de Resistncia Bacteriana Rotina Laboratorial. 68

13-Referncias Bibliogrficas 72

14- Anexos 73


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1-Microbiota Corpo Humano

O corpo humano habitado por um grande nmero de microrganismo, que, juntos, so chamados microbiota ou flora normal. A maioria dos membros da flora normal so bactrias, mas fungos e protozorios tambm so encontrados. No corpo humano sadio, os rgos internos como sangue, crebro, msculos e outros, so normalmente livres de microrganismos. De modo contrrio, os tecidos superficiais como a pele e membranas mucosas esto constantemente em contato com os microrganismos do meio ambiente e so normalmente colonizados por certas espcies microbianas, conforme tabela abaixo.

Bactrias comumente encontradas no corpo humano. Bactrias Pele Conjuntiva Nariz Faringe Boca Intestinos Uretra anterior Vagina Staphylococcus aureus S. epidermidis Streptococcus mitis Streptococcus salivarius Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis Neisseria spp. Neisseria meningitidis Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Bacterioides Lactobacilos Clostridium tetani Corynebacterium Micoplasmas Legenda: comum; irregular ou incerto; proeminente. Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratrio Clnico. Revinter: Rio Janeiro. 2006. p70.

Os microrganismos da microbiota ou flora normal no causam doenas. Eles so residentes de um corpo saudvel e so ocupantes permanentes. J aqueles que so transitrios do corpo humano saudvel podem estabelecer-se brevemente, mas tendem a ser excludos por competio com os residentes ou pelos mecanismos de defesa imunolgicos do hospedeiro. Os microrganismos transitrios no so considerados como parte da flora ou microbiota normal. Alguns organismos da microbiota normal podem ser patgenos oportunistas, causam infeces se ocorrer danos teciduais em stios corpreos especficos ou se a resistncia do corpo infeco diminuda. Deste modo, importante conhecer os tipos de microrganismos que habitam o corpo saudvel. Este conhecimento fornece discernimento dos tipos de infeces que podem ocorrer, aps um trauma tecidual, em vrios stios, bem como, a funo desempenhada pela flora normal de prevenir a colonizao do nosso corpo pelos micrbios.


2

2-Biosegurana

A segurana da rotina laboratorial de suma importncia na organizao do ambiente de trabalho, bem como para nossa proteo pessoal. Portanto, devemos usar corretamente os equipamentos proteo individual (EPIs) e equipamentos de proteo coletivos (EPCs). Isso se deve aos diferentes tipos de nveis de segurana classificados conforme a atividade e o microrganismo de maior risco que venham ser manipulados por diferentes profissionais da rea de sade.

Classificao dos laboratrios segundo os nveis de biosegurana

Resumo dos nveis de segurana recomendados para agentes infecciosos Agentes Condutas EPI e EPC Outros Nvel 1 No causam

doenas ao homem

-Boas prticas de laboratrio

-Jaleco, luva*, culos de proteo (qdo necessrio)

-Pia -Lava olhos

Nvel 2 Associados com doena infecciosa

-Condutas do nvel 1 -Acesso limitado -Sinalizao de infectante -Cuidados com perfurocortantes -Normas para descontaminao

-Cabine de segurana (classe II) -Jaleco, luvas e culos de proteo

-Necessidades do nvel 1 -Descontaminao antes do descarte de resduos (ex.: autoclavao)

Nvel 3 Associados com danos potencialmente letais

-Condutas do nvel 2 Acesso controlado com ante-sala Descontaminao de todo o lixo (ex.: autoclavao)

-EPI do nvel 2 -Jaleco adicional (descartvel) -Mscara apropriada (N95)

-Necessidades do nvel 2 -Sistema de exausto controlado e exclusivo de presso negativa -Porta com fechamento automtico

Nvel 4 Associados a agentes de risco de transmisso desconhecida

-Condutas do nvel 3 -Troca de roupa na entrada -Ducha na sada Descontaminao de todo o material antes de sair das instalaes

-EPI do nvel 3 -Cabine de segurana classe II B3 ou B2 -Roupas especiais com sistema individual de presso positiva

-Necessidades do nvel 3 -Laboratrio em edifcio isolado

*O uso de luvas indicado quando existem leses em pele Fonte: OPLUSTIL, C. P.; et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2 Edio. So Paulo. 2004. Pg. 02.

Equipamentos de Proteo

Os equipamentos de proteo incluem cabine de segurana biolgica combinada com o uso de EPIs (luvas, jalecos, gorros, pr-ps, mscaras ou culos de proteo), dependendo do nvel de segurana necessrio.


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Cabine de Segurana Biolgica So trs os tipos de cabine de segurana biolgica:

Classe I O fluxo de ar ocorre de fora para dentro, pela abertura frontal, sem recirculao do ar. O ar

da cabine passa por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratrio.

Classe II Cabine de abertura frontal na qual uma parte do ar recirculado. Este tipo de cabine se

subdivide em: AII

30% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 70% recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA; 30% so exauridos para dentro ou fora do laboratrio atravs de outro filtro HEPA.

B3 70% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 30% recirculado para o interior da cabine

passando por um filtro HEPA; 70% so exauridos para fora do laboratrio atravs de outro filtro HEPA e por um sistema de exausto.

B2 100% de exausto. Sem circulao do ar protegendo o operador, o material manipulado e o

ambiente.

Classe III Cabine hermeticamente fechada, impermevel a gases, e todo o trabalho realizado com

luvas de borracha que esto presas cmara. O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo exaustor passa por outros filtros

HEPA dispostos sequencialmente. Vias de Infeco

Existem diversas vias pelas quais podem ocorrer infeces no laboratrio de microbiologia. Dentre elas podemos citar:

Inalao: provocada pela formao de aerossis. Ingesto: provocada devido pipetagem da amostra com a boca e no lavar as mos

antes da refeio, de beber ou fumar. Inoculao Direta: provocada por um acidente Contato com membrana mucosa: contaminao com certos organismos atravs da

mucosa oral, ocular, etc. Limpeza

Uma das atividades mais importantes para manter a rea fsica e os equipamentos em condies adequadas a limpeza geral do laboratrio. A limpeza inclui o cuidado com as superfcies e com o resduo gerado dentro do laboratrio.

Para descontaminao de artigos e superfcies do laboratrio podem ser utilizados alguns procedimentos e produtos, tais como:

Autoclave: Concentrao Vapor saturado 121C por 15 minutos Tempo total de contato 50-90 minutos Atividade Contra Bactrias, micobactrias, esporos, fungos e vrus. Caractersticas Importantes Risco de queimadura se operado inadequadamente.


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Aplicao resduos infectantes, lquidos e vidrarias. Fenis Concentrao 0,2-2% Tempo de contato 10-30 minutos

Atividade Contra Bactrias, fungos, micobactrias, vrus hidroflico (germicida varivel) e vrus lipoflicos.

Caractersticas Importantes Efeito residual, corrosivo, efeito irritante da pele e olhos e txico se absorvido ou ingerido. Aplicao Descontaminao ambiental, de bancadas, pisos e superfcies contaminados com material infectante. Cloro e compostos clorados Concentrao 0,1-2% (1000 a 20000 ppm) Tempo de contato 10-30 minutos Atividade Contra Bactrias, micobactrias, fungos, esporos (germicida varivel) e vrus. Caractersticas Importantes inativado por matria orgnica; efeito residual; corrosivos; efeito irritante de pele, olhos e trato respiratrio; txico se absorvido ou ingerido. Aplicao Descontaminao ambiental de bancadas, pisos e superfcies contaminados com material infectante. lcool etlico Concentrao 70-85% Tempo de contato 10-30 minutos Atividade Contra Bactrias, micobactrias, fungos, vrus hidroflicos (germicida varivel) e vrus lipoflicos Caractersticas Importantes inativado por matria orgnica, efeito irritante da pele e dos olhos, txico se absorvido ou ingerido. Aplicao Superfcies de equipamentos e anti-sepsia de pele

Consideraes Gerais

Toda amostra biolgica deve ser considerada potencialmente contaminada. Toda manipulao de material biolgico deve ser realizada com o uso de luvas e, ao trmino

desta, desinfet-las com cido fnico 5% antes de descarta-las e quando necessrio utilizar tambm culos de proteo.

Usar mscara para evitar a inalao de esporos fngicos, pois, alm das espcies que podem infectar pulmes, vrias outras so responsveis por fenmenos alrgicos, que se manifestam tambm nas vias respiratrias.

Trabalhar com o bico de Bunsen aceso e interposto entre o tcnico e o material (clnico ou cultura).

Todo procedimento em que houver risco de respingos ou formao de aerossis deve ser manipulado dentro de uma cabine de segurana biolgica.

No pipetar nenhum tipo de soluo ou material com a boca. No reencapar agulhas e descartar material perfurocortantes em recipiente apropriado.

Reduzir ao mximo a utilizao de materiais perfurocortantes. O material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte. Determinar reas limpas e contaminadas. Os equipamentos devem ser descontaminado antes de ser transportados.


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Limpar e desinfetar todas as superfcies de trabalho aps respingos e ao incio e final de cada jornada.

Manter organizadas todas as reas de trabalho. No estocar grandes quantidades de itens contaminados em reas de trabalho (por exemplo,

placas com crescimento bacteriano). Tirar o jaleco quando sair do setor e colocar em local designado. Lavar as mos e/ou superfcie da pele imediatamente aps contato com amostra biolgica,

aps remover as luvas e ao completar qualquer atividade. Segregar todo resduo infectante gerado e descarta-lo em embalagens prprias para

autoclavao (por exemplo, caixa de descarte, ou saco autoclavvel de polietileno de alta densidade)

Cuidados com gases comprimidos Posicionar os cilindros em local apropriado e de maneira segura. Manter distante de fogo e fontes de calor. Usar os reguladores de presso corretamente

Cuidados com agentes qumicos Usar EPI quando da utilizao de produtos qumicos. Rotular todos os reagentes com seu nome qumico ou tcnico e indicao de risco

qumico apropriado, como: inflamvel, corrosivo, txico, nocivo, e irritante. Ter um manual de procedimentos em caso de acidente para todos os reagentes qumicos. Estocar lquidos inflamveis e combustveis em reas apropriadas e ventiladas. Deixar na bancada somente o volume necessrio para uso dirio. Manter no laboratrio disponvel a todos os colaboradores as fichas contendo

informaes de segurana dos produtos qumicos utilizados.

Orientaes para descontaminao em caso de acidentes Usar luvas e jalecos Colocar sobre o sangue, fluido ou material contaminado papel absorvente (como papel

toalha) Saturar o papel-toalha com hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos. Remover os resduos e descarta-los em caixa apropriada ou em saco autoclavvel

(polietileno de alta densidade). Fazer nova descontaminao de rea com hipoclorito de sdio a 1%. Todo material utilizado na limpeza dever ser descartado em local apropriado

(fragmentos de vidro e outros materiais cortantes).


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3-Meios de Cultura

O meio de cultura uma mistura de nutrientes necessrios ao crescimento microbiano. Basicamente deve conter a fonte de energia e de todos os elementos imprescindveis vida dos microrganismos. O meio de cultura deve ainda atender s necessidades especficas do grupo, da famlia, do gnero ou da espcie que se deseja cultivar. Assim, imprescindvel acrescentar ao meio de cultura vitaminas, cofatores, aminocidos etc.; quando estes compostos no so sintetizados por microrganismos que se deseja cultivar.

Principais Componentes dos Meios de Cultura

gar Agente gelificante para preparao de meios de cultura microbiolgicos, substncia obtida de determinadas espcies de algas vermelhas marinhas, um poligalactosdeo em que a maioria dos microrganismos incapaz de degrad-lo. Bile de boi dessecada Trata-se da bile natural purificada que foi submetida a um processo de dessecao. Casena Hidrolisada Esta substncia obtida pela hidrlise com cido clordrico (HCL). Extrato de Carne preparado a partir de carne desprovida de tendes e gordura. Extrato de Levedura obtida por extrao aquosa de levedo de cerveja autolisado. Devido ao seu elevado contedo em nitrognio amnico e vitaminas, oferece excelentes condies de crescimento a uma gama de microrganismos. Peptona de Carne obtida pela degradao proteoltica da carne por enzimas (pepsina, tripsina). um excelente substrato nutritivo. Proteose-Peptona uma peptona, com uma elevada proporo de peptdeos, aminocidos livres e fatores de crescimento. Constitui-se de uma excelente base nutritiva para o cultivo de Neisseria spp, Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Salmonella spp, Pasteurella spp e Corynebacterium spp. Triptona um digerido pancretico de casena. A casena, protena principal do leite, uma rica fonte de nitrognio amnico. Tem um alto teor de triptofano e, consequentemente, pode ser usada em meios para testar a reao de indol.

**Para o aprimoramento dos isolados bacterianos patognicos atualmente inmeros so os meios de cultura produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que sero descritos apenas os utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.


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Meios de Cultura para Transporte

Meio Stuart - Princpio: Meio semi-slido comercial que impede consideravelmente a multiplicao dos

microrganismos pela carncia de fonte de nitrognio e ao mesmo tempo garante a sobrevivncia atravs de sua composio nutritiva.

- Utilidade: Transportar diversas amostras biolgicas, principalmente secrees e conservao de microrganismos patognicos.

gar Nutriente ou Nutritivo - Princpio: Meio slido relativamente simples, composto de extrato de carne, peptona, gar-

gar e outras substncias. Muito utilizado nos procedimentos do laboratrio de bacteriologia. - Utilidade: Conservao e manuteno de culturas bacterianas.

Salina 0,85% estril Substncia que mantm a bactria vivel e utilizada como meio de transporte para exame a

fresco de secrees genitais.

Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento

O crescimento do microrganismo nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao.

importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

gar Chocolate (AC) Meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e

anaerbias facultativas. - Princpio: base do meio, adicionado sangue de carneiro, coelho ou cavalo em

temperatura alta. Ocorre lise das hemcias, a partir do aquecimento da mistura meio cultura+sangue de carneiro.

Utilidade: Crescimento de microrganismos exigentes como por ex.: Neisseria spp e Haemophilus spp.

- Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa - CO2

gar Sangue (AS) Meio rico, no seletivo e diferencial para hemlise. Permite o crescimento da maioria das

bactrias Gram negativos e Gram positivos, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies.

- Princpio: A base do meio composta exclusivamente de sangue de carneiro, coelho, desfibrinado. Oferece timas condies ao crescimento a maioria dos microrganismos.

- Utilidade: Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. Verificao de hemlise dos Streptococcus spp e Staphylococcus spp; bem como empregado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp).

- Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa - CO2 gar MacConkey (MC) Meio seletivo para bactrias Gram negativa, e diferencial para a utilizao da lactose.


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- Princpio: O cristal de violeta que compe o meio de cultura inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente estafilococos e enterococos.

- Utilidade: Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose. As colnias lactose positiva, apresentam colorao rseo intenso e as colnias lactose negativas apresentam colorao inalterada.

- Atmosfera de incubao: Aerobiose O2

gar Salmonella Shigella (SS) Meio seletivo para Salmonella spp e Shigella spp e diferencial para a utilizao de lactose

(colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra). Ateno: Outros bacilos entricos Gram negativos tambm crescem no meio SS.

- Princpio: Possui componentes tais como: sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio que inibem bactrias Gram positivos. A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positivo (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultam na formao de colnias rseas e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias inalteradas). O tiosulfato se sdio presente permitem a deteco de H2S evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.

- Utilidade: Selecionar e isolar espcies de Salmonella spp e Shigella spp, em amostras de fezes, alimentos e gua.

- Atmosfera de incubao: Aerobiose O2 gar CLED (Cystine Lactose Eletrolyte Deficient) - Princpio: Devido a sua composio deficiente em eletrlitos inibe a formao do vu de

Proteus spp. um meio de cultura no seletivo e diferencial para a utilizao de lactose. Cepas lactose positiva apresentam colnias de colorao amarela; j bactrias lactose negativas apresentam-se inalteradas quanto colorao.

- Utilidade: Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.

- Atmosfera de incubao: Aerobiose O2 gar Cromognico Meio de cultura que utilizam substratos cromognicos, sobre uma base nutricional rica. -Princpio: Aps a clivagem dos substratos cromognicos combinados presentes no meio de

cultura por enzimas bacterianas, tais como: beta-glicosidade, beta-galactosidade (grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia) e triptofano-desaminase (grupo Proteus-Providencia-Morganella) ocorrem liberao de radicais coloridos.

- Utilidade: Para facilitar o reconhecimento precoce de vrios grupos e espcies de microrganismos (bactrias e fungos), tais como os uropatgenos.

-Atmosfera de incubao: Aerobiose O2

gar Lowenstein-Jensen (LJ) Meio seletivo para bactrias lcool cido resistente. - Princpio: Possui incorporado ao meio de cultura uma grande quantidade de protena,

favorecendo no crescimento do BAAR. - Utilidade: Isolamento e testes de identificao de micobactrias. - Atmosfera de incubao: Aerobiose O2


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gar Thayer Martin - Princpio: Possui incorporado ao meio de cultura os suplementos V e X, importantes para o

crescimento dos diplococos Gram negativos. - Utilidade: Isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis em amostras

clnicas que podem conter uma microbiota mista. - Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa - CO2 Caldo Tetrationato (TETRA) - Princpio: Os sais de bile contidos no meio tetrationato inibem microrganismos Gram

positivos. Com a adio da soluo de iodo ocorre inibio da microbiota intestinal de espcies fecais.

- Utilidade: Meio de enriquecimento para Salmonella spp. - Atmosfera de incubao: Aerobiose O2 Caldo Todd-Hewitt Meio lquido seletivo para o isolamento de estreptococos beta-hemolticos de amostras

clnicas contendo flora mista. - Princpio: Tem em sua formulao a adio de alguns antibiticos que tornam o caldo

seletivo para o isolamento de estreptococos do grupo B. - Utilidade: Meio de enriquecimento para o isolamento de Streptococcus agalactiae. - Atmosfera de incubao: Aerobiose O2

Caldo BHI (Brain Heart Infusion) - Princpio: Meio derivado do nutriente do crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona

e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas; j a dextrose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao.

- Utilidades: Auxilia no crescimento e motilidade bacteriana. - Atmosfera de incubao: Aerobiose O2

Meios para Provas Bioqumicas Sero discutidos nos itens de identificao para cocos Gram positivos e bacilos Gram

negativos. **Para o aprimoramento da identificao de bactrias patognicas, atualmente inmeros so os meios de cultura e kits produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que sero descritos apenas os utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.

Meios para Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

gar HTM (Haemophilus Test Medium) - Princpio: Apresentam incorporados ao meio de cultura os suplementos V e X,

importantes para o crescimento da bactria em questo. - Utilidades: Realizao do antibiograma ou teste de sensibilidade aos antimicrobianos em

espcies de Haemophilus. - Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa CO2


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gar Mueller Hinton - Princpio: Oferece condies de crescimento s principais bactrias, padronizada por Kirby

e Bauer e CLSI. - Utilidade: Para realizar teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos

de difuso em disco e fitas de ETest para enterobactrias, no fermentadores e Staphylococcus spp. - Atmosfera de incubao: Aerobiose O2

gar Muller Hinton Sangue - Princpio: Idntico ao item acima. - Utilidade: Meio utilizado para realizao do teste de resistncia aos antimicrobianos pelos

mtodos de disco difuso e fitas de E-Test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos dos grupos A, B, C e G de Lancefield. - Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa - CO2

3.1-Controle de Qualidade dos Meios de Cultura Os meios de cultura produzidos em mdia e grande escala pelo setor de microbiologia clnica dos laboratrios de anlises clnicas devem realizar o controle de qualidade para garantir e monitorar a integridade dos mesmos, bem como para manter de forma contnua a qualidade dos resultados microbiolgicos. O programa de controle qualidade para meios de cultura deve garantir:

Esterilidade Todo novo lote de meio de cultura preparado no laboratrio de microbiologia deve ser testado para prova em questo. Procedimento: Incubar em estufa de cultura microbiolgica a 352C, 5% do lote de meio de cultivo por 18 s 24h e mais 24h em temperatura ambiente. Resultado: Adequado: Ausncia de microrganismos contaminantes nos meios de cultura. Inadequado: Aparecimento de contaminantes nos meios de cultura. Causas provveis resultados inadequados: Processo de autoclavao comprometida, contaminao do ambiente, do sangue ou outro complemento adicionado contaminado. Ao corretiva: O lote de meio de cultivo desprezado e novo lote produzido antes da liberao para uso. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

Viabilidade (crescimento) A habilidade do meio de cultura de permitir crescimento de microrganismos definidos deve ser determinada pela inoculao do meio com isolados especfico de microrganismo estoque, de acordo com as caractersticas esperadas da cepa teste frente a cada tipo de meio de cultura. Procedimento: Preparar uma suspenso a 0,5 da escala de McFarland com soluo salina 0,95%; Diluir a suspenso 1:10;


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Homogeneizar e usar uma ala de 0, 001 mL (1L) para semeadura, equivalente a 1,5 X 104 unidades formadoras de colnias (UFC); Semear a suspenso por esgotamento em quatro quadrantes; Incubar em estufa microbiolgica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade. Resultado: Adequado: crescimento bom em todos os quadrantes, colnias bacterianas tpicas. Inadequado: Ausncia de crescimento ou crescimento de bactrias escassas em somente 01 ou 02 quadrantes. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada. Causas provveis resultados inadequados: Preparao do inculo bacteriano na escala 0,5 de McFarland pouco carregado para este propsito. Ao corretiva: Realizar uma nova suspenso a 0,5 McFarland e repetir o procedimento de crescimento bacteriano.

Inibio (meios seletivos) Os meios seletivos so designados no apenas para permitir crescimento de alguns microrganismos, mas tambm para inibir o crescimento de outros. Procedimento: O meio deve ser inoculado com bactrias representativas de ambos os grupos (bactria para o meio de cultura especfico e outra para controle seletivo de inibio). Por ex: no meio MacConkey semear cepa padro de Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Preparar uma suspenso a 0,5 da escala de McFarland com soluo salina 0,95%; Diluir a suspenso 1:10; Homogeneizar, usar ala 0,01 mL (10L) para semeadura, equivalente a 1,5 X 105 UFC; Semear a suspenso por esgotamento em quatro quadrantes; Incubar em estufa microbiolgica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade. Resultado: Adequado: Inibio do crescimento do microrganismo. Inadequado: Crescimento abundante do microrganismo seletivo de inibio. Causas provveis resultados inadequados: Contaminao dos complementos adicionados de meios de cultura vencidos. Processo de autoclavao de meios de cultura que no devem ser autoclavados. Ao corretiva: Verificar data de validade dos meios de culturas. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

Resposta bioqumica Verifica se os meios de cultura produzidos para reaes especficas de identificao microbiolgica produzem mesmo essa reao. Procedimento: Utilizar cepas que produzam reaes especficas para sua identificao em nvel de gnero ou espcie. Por exemplo:


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Inocular na superfcie do meio FENIL (Fenilalanina) uma cepa de Proteus spp ou Morganella spp. ou Providencia spp. Incubar em estufa microbiolgica a 352C por 18 s 24h. Em seguida adicionar 20 gotas do cloreto frrico 10%. Aguardar a reao. Resultado do exemplo acima citado: Adequado: Formao de colorao VERDE na superfcie do meio FENIL. Esta reao ocorre devido produo de uma enzima especfica (fenilalanina desaminase) presente nos gneros bacterianos citados acima para o consumo do aminocido fenilalanina, que revelada pela adio de um reagente qumico. Inadequado: Ausncia de colorao verde na superfcie do meio fenil. Causas provveis resultado inadequado no exemplo acima citado: Reagente qumico e meio de cultura vencidos. Ao corretiva: Verificar data de validade do meio de cultura e cloreto frrico. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada. ## Para os meios de cultura e kits de identificao comerciais, o certificado do controle de qualidade fornecido pelo fabricante.

Todos os meios de cultura devem ser armazenados em geladeira em temperatura entre 2 - 8C e condicionados em embalagens para manter a umidade do meio. Em todas as placas de meio de cultura produzidas deve conter nmero do lote, datas de fabricao e validade e inicial do meio de cultura. Desprezar meios de cultura slidos que apresentem sinais de ressecamento e meios lquidos que apresentem diminuio do volume original e qualquer sinal de contaminao, mesmo que estejam dentro da data de validade.

Cepas bacterianas para teste dos meios de cultura Para realizao dos testes de meio de cultura pode-se utilizar tipos diferentes de cepas:

o Cepas congeladas a partir de cepas padro (ATCC), adquiridas comercialmente. o Cepas isoladas de pacientes no laboratrio para controle de crescimento de meios de cultura,

aps terem suas identificaes confirmadas.

Controle de qualidade do gar Mueller-Hinton (MH) Provas de controle de qualidade devem ser realizadas no gar Mueller-Hinton para viabilizar a utilizao deste meio de cultura, responsvel pela avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos. Devem ser realizada a cada nova produo de MH, os seguintes testes de controle de qualidade:

Dosagem do pH O pH do meio Mueller-Hinton deve estar entre 7,2 e 7,4. Procedimento: Separar uma poro pequena do gar Mueller-Hinton em becker aps esterilizao; Aps gelificao em temperatura ambiente, macerar o gar e colocar o eletrodo de superfcie do pHmetro para medir o pH;

Ateno!


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Resultado: O pH do meio de cultura MH deve estar entre 7,2 e 7,4.

Espessura do meio MH em placas Para ter halos de inibio de forma fidedignos a espessura do gar Mueller-Hinton deve ser mensurada com paqumetro ou rgua. Procedimento: Aps esterilizao do gar Mueller-Hinton deve-se distribuir em placas de petri sobre superfcie absolutamente plana para obter profundidade uniforme de aproximadamente quatro milmetro (04 mm), com auxlio de pipeta graduada estril. 0 Em placas de 150 mm o volume ideal de meio MH cerca de 60 mL. J em placas de 90 mm o volume ideal de meio de 25 mL. Com uma rgua ou paqumetro mensurar 04 mm de espessura de gar MH na placa petri. Resultado: A espessura do gar MH deve ser de 04 mm.

Dosagem dos nveis de Ca2+ e Mg2+ em gua destilada para preparao do meio de cultura Mueller-Hinton A dosagem de Clcio e Magnsio na gua potvel que passa por processos de purificao como destilao e deionizao so de suma importncia na qualidade da produo dos meios de culturas, principalmente do Mueller-Hinton; bem como no resultado final do antibiograma (leitura e interpretao dos halos de inibio). Procedimento: # Dosagem de Ca2+ na gua destilada Colocar 02 ml de gua destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NaOH 03 mol/L e 05 gotas (NH4)2C2O4 1% agitar. Aguardar reao. # Dosagem de Mg2+ na gua destilada Colocar 02 ml de gua destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NH4OH 05 mol/L e 05 gotas Na2HPO4 0,2 mol/L agitar. Aguardar reao. Resultado: Dosagem de Clcio Resultado positivo: Formao Precipitado Branco. Resultado negativo: No h formao de precipitado. Dosagem de Magnsio Resultado positivo: Formao Precipitado Branco. Resultado negativo: No h formao de precipitado. Variveis que podem interferir no resultado do antibiograma pelo gar Mueller-Hinton. *Nveis de Ca2+ e Mg2+ Altas concentraes levam diminuio na atividade de aminoglicosdeos diante de bactrias como Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes diminudas levam a resultados contrrios. *pH Em pH baixo se observa halos de inibio reduzidos para aminoglicosdeos, quinolonas, macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos por ex: penicilina e tetraciclinas. O aumento do pH leva a resultados opostos ao anteriores. *Espessura do meio MH Menor que 03 mm leva falsa sensibilidade geral, e maior que 04 mm falsa resistncia.

Importante!


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Causas de alterao nas caractersticas e qualidade dos meios de cultura Problema

A B C D E F G Outras Causas

Cor anormal do meio

x x

pH incorreto

x x x x x x Armazenamento em alta temperatura. Hidrlise dos componentes. pH determinado temperatura incorreta.

Precipitado atpico x x x x Solubilidade incompleta

x Aquecimento inadequado. Conservao inadequada em frasco muito pequeno.

Escurecimento ou caramelizao

x x x

Perda capacidade de gelificar

x x x Hidrlise do gar por desvio no pH. Meio de cultura que no deve ser fervido.

Perda capacidade nutritiva

x x x x x x Presena de eletrlitos fortes aucares, detergentes, anti-spticos, metais venenosos, materiais proticos ou outras substncias que podem inibir o inculo. Superaquecimento.

Contaminao

x x Esterilizao ineficaz. Tcnica inadequada de adicionar solues de enriquecimento e distribuio nas placas.

Legenda: A: meio deteriorado ou desidratado, B: vidro mal lavado, C: erro de pesagem, D: mistura incompleta, E: reaquecimento repetido, F: diluio excessiva, G: qualidade gua.


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4-Tipos de Semeadura em Bacteriologia Clnica Semeadura Qualitativa

Permite o isolamento de todas as colnias microbiolgicas diferentes, atravs do decrescente gradiente de concentrao do inculo (amostra biolgica).

Utiliza-se ala microbiolgica de 0,01mL (10L), conforme figura abaixo.

Procedimento da semeadura qualitativa: Homogeneizar a amostra biolgica;

Flambar a ala microbiolgica (10L), deixar esfriar; Introduzir ala microbiolgica 10L na amostra biolgica; Observar a integridade da pelcula de amostra formada na ala at descarregar o

inculo em um canto da placa; Estriar partindo da ponta da primeira semeadura; Repetir o procedimento anterior por duas vezes.

No Esquecer Semear seguindo a sequncia dos meios de cultura mais ricos para os mais seletivos.

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratrio Clnico. 2006. p120.

Semeadura por Rolagem (Tcnica de Maki) A tcnica de semeadura por rolagem utilizada para semear cateteres. Procedimento da semeadura:

Retirar o cateter do tubo estril com auxlio de uma pina estril; Colocar na superfcie do AS; Com o auxlio da pina, rolar o cateter por toda a superfcie do meio para frente e para trs,

duas vezes. Conforme ilustrao abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2004. p80.


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Semeadura Quantitativa

A semeadura quantitativa se baseia na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do nmero de UFC (Unidades Formadoras de Colnias) obtidas aps incubao. Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material: # Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100L. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 1ml, relativo ao volume inoculado; 1000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada. #Tcnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto 1:10, 1: 100, 1: 1000. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para 01 ml, relativo diluio utilizada: 10, 100, 1000, respectivamente.

Utiliza-se ala microbiolgica calibrada 0,001mL (1L), conforme figura abaixo.

Procedimento semeadura quantitativa: Homogeneizar a amostra biolgica; Flambar a ala microbiolgica (1L), deixar esfriar; Introduzir ala microbiolgica 1L na amostra biolgica; Observar a integridade da pelcula de amostra formada na ala at descarregar o

inculo em um nico sentido; Estriar o inculo inicial de forma perpendicular e paralelo a este.

Fonte: Apostila ANVISA - Procedimentos Laboratoriais.

Fonte: LEACHGU/UNIC 2010


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5-Processamento das Amostras Biolgicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia

Os procedimentos as serem realizados em diferentes materiais clnicos e a cada situao especfica de fundamental importncia para o sucesso final do exame microbiolgico.

Cateter As infeces relacionadas a cateteres so em geral importantes, pois auxilia no diagnstico para deteco de bacteremia, fungemia e complicaes no local da insero do cateter. Amostras inaceitveis para processamento De cateter encaminhado em meios de cultura em caldo ou em meio de transporte; Ponta de cateter vesical (Foley), uma vez que o crescimento de microrganismos representa a microbiota da uretra distal. De cateteres maiores que cinco (05) cm.

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme j descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meio de cultura utilizado: gar Sangue (AS) Para semeadura de cateteres, deve ser utilizada pina estril para fazer o processo de rolagem. importante observar, no momento da semeadura, que o cateter est rolando na placa e no sendo esfregado. Isso fundamental para obter colnias isoladas. Aps realizao da semeadura por rolagem em AS do cateter colocar a placa de AS invertida imediatamente na jarra de vela (microaerofilia) e incubar em estufa microbiolgica a 352C por at 72h.

Escarro A cultura de escarro importante para deteco de patologias pulmonares, pois cerca de 30 a 50% das infeces so atualmente causadas por outras espcies que no as bactrias lcool cido resistente (micobactrias). Amostras inaceitveis para processamento Quantidade muito pequena e/ou saliva. Amostras em temperatura ambiente por mais de 24 horas, mantidas refrigeradas por mais de sete (07) dias e expostas luz solar. Utilizao da poro no purulenta do escarro.

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;


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Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme j descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC) e quando solicitado em gar Lowenstein-Jensen (LJ). Utilizar a poro mais purulenta do escarro e semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar sangue (AS), Chocolate (AC) e Mac Conkey (MC). As placas de AS e AC devem ser colocadas invertida imediatamente na jarra de microaerofilia com a vela acesa e incubadas em estufa microbiolgica a 352C por at 72h. J a placa de MC em aerobiose em estufa microbiolgica a 352C tambm por at 72h. O gar Lowenstein-Jensen (LJ) deve ser semeado por estriamento na superfcie inclinada do meio, em seguida fechar o frasco. Incubar em estufa microbiolgica a 352C por 30 dias ou mais.

Fezes O cultivo de fezes fundamental para o isolamento de microrganismos causadores de gastroenterites agudas e/ou crnicas de origem bacteriana. Amostras inaceitveis para processamento

Sem conservantes que foram obtidas e armazenadas h mais de 3 horas; Mistura de vrias amostras colhidas no mesmo dia; Fezes lquidas colhidas ou enviadas em fralda; Amostras de fezes contaminadas com urina; Amostras coletadas h mais de trs dias; Fezes de pacientes fazendo uso de antimicrobianos;

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme j descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: Caldo Tetrationato (CT), gar Mac Conkey (MC) e gar Salmonella/Shigella (SS). *Amostra obtida de swab:

Introduzir swab no tubo com o meio de cultura em caldo Tetrationato e esgotar o algodo molhado nas paredes internas do tubo.

Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriolgica 35 2C por 18 a 24 horas.

Decorrido o perodo de incubao primaria do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar MacConkey (MC) e gar Salmonella/Shigella (SS).

Incubar as placas semeadas em aerobiose, estufa bacteriolgica a 35 2C por 18 24h.


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*Amostra obtida in natura:

Primeira etapa

Inocula-se uma poro da amostra biolgica com auxlio ala bacteriolgica de 10L no tubo contendo salina estril 0,95%.

Incubar a salina com fezes estufa bacteriolgica a 35 2C por 15 minutos.

Aps 15 minutos semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar MacConkey (MC) e gar Salmonella/Shigella (SS).


Segunda etapa

Inocular outra poro da amostra biolgica com auxlio ala bacteriolgica de 10L em caldo tetrationato com 02 gotas de soluo de iodo.

Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriolgica 35 2C por 18 a 24 horas.

Decorrido o perodo de incubao do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar MacConkey (MC) e gar Salmonella/Shigella (SS).


Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado.

Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal As infeces do trato respiratrio inferior so em geral importantes, pois auxilia no diagnstico para deteco de um grande nmero de etiologias principalmente: pneumonia adquirida na comunidade e as hospitalares.

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme j descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC). Homogeneizar o material (LBA ou aspirado traqueal) e imergir a ala bacteriolgica calibrada de 1L na amostra de forma vertical. Semear por Tcnica quantitativa utilizando ala calibrada de 1L em placa de gar AS, AC e MC. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com leituras dirias.

Lquidos Cavitrios Estreis (Asctico, Amnitico, Lquido Cefalorraquidiano-LCR ou Lquor, Pleural, Peritoneal, Pericrdico e Sinovial).


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Qualquer fluido estril do corpo pode ser infectado por bactrias ocasionando patologias graves. Apesar de esses materiais clnicos serem de diferentes reas do corpo humano, so processados de forma semelhante. Amostras inaceitveis para processamento Frascos com conservantes, por ex: Formal ou Soro fisiolgico; Amostras colhidas e enviadas em frascos no estreis ou, congelados.

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme j descrito; Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC) e Caldo BHI. *Amostras purulentas No h necessidade de centrifugar. *Amostras pouco ou no purulentas Separar parte do material em tubo estril. Centrifugar por 15 minutos a 3.000- 5.000 rpm. Remover o sobrenadante, suspender o sedimento para semear. Em ambos os casos deve ser semear em meios de culturas slidos padronizados AS, AC, MC pela Tcnica qualitativa por esgotamento, utilizando ala bacteriolgica de 10L. Uma pequena poro do material biolgico a ser processado deve ser coloca em meio de cultivo lquido o caldo BHI. Em seguida colocar as placas de meios AS e AC em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC e caldo BHI em aerobiose na estufa microbiolgica por at 72h, com leituras dirias. Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado.

Sangue A cultura de sangue ou hemocultura de fundamental importncia para deteco de septicemia. Principal causa de morbidade e mortalidade no mbito hospital mundialmente.

Procedimento Em frascos de hemocultura manual Aps coleta do sangue em frascos especficos para hemocultura manual, o(s) frasco(s) deve ser colocado em estufa por 24 horas. Aps 24h de incubao, realizar o primeiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala de 10L. Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Como proceder? Identificar as placas com nmeros de identificao do paciente(s).


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Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool 70%, hipoclorito ou cido fnico). 1 Etapa: Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para seringa e colocar 01 ou 2 gotas nos meios de cultura acima citados. 2 Etapa: Desfazer a gota com auxlio de ala bacteriolgica de 10L, aps flambagem. Conforme figura abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. Sarvier: So Paulo. 2004.

3 Etapa: Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada at que o sangue seja absorvido no meio de cultura. 4 Etapa: Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC em aerobiose na estufa microbiolgica. Verificar crescimento ou no de colnias microbianas no dia seguinte. 5 Etapa: Retornar os frascos de hemocultura em estufa. Aps 48h de incubao, realizar o segundo repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala de 10L. Identificar as placas com nmeros de identificao do paciente(s). Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool 70%, hipoclorito ou cido fnico). Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas. Aps 04 dias da segunda semeadura, realizar o terceiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala microbiolgica de 10L. Identificar as placas com nmeros de identificao do paciente(s). Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool 70%, hipoclorito ou cido fnico). Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas. Em frascos de hemocultura automatizados OBS: Ser descrita apenas a metodologia implantada pelo LEAC-HGU. Vale ressaltar que existem outras metodologias de hemocultura, utilizando equipamentos automatizados. Aps deteco de positividade do(s) frasco(s) de hemocultura cadastrados no equipamento BacTAlert 3D (Biomerieux), realizar o repique da amostra de sangue. com auxlio de seringa e agulha estreis. - Identificar as placas de meio de cultura com nmeros de identificao do paciente(s). - Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool 70%, hipoclorito ou cido fnico).


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- Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura com auxlio de seringa e agulha estreis e colocar 01 ou 2 gotas do sangue em uma das extremidades dos meios de cultura AS, AC e MC. -Em seguida realizar tcnica de semeadura qualitativa por esgotamento utilizando ala microbiolgica de 10L. - Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada at que o sangue seja absorvido no meio de cultura. - Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC em aerobiose na estufa microbiolgica. Verificar crescimento ou no de colnias microbianas no dia seguinte.

Secrees Genitais: Masculina e Feminina No trato genital feminino e masculino podem ocorrer diversas doenas, de etiologia bacteriana, fngica, parasitria e viral. Portanto devido grande variedade de agentes possveis de serem pesquisados, importante que a suspeita clnica seja bem direcionada para que os exames laboratoriais mais indicados sejam realizados atravs de coletas especficas (dependendo microrganismo) em meios de cultura lquidos e slidos padronizados pelo servio de sade que se trabalha.

Procedimento para secreo vaginal Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biolgica em uma pequena rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala bacteriolgica 10L. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com leituras dirias.

Para processar o caldo Todd-Hewitt indicado para pesquisa de estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) em gestantes deve-se:

Aps o caldo Todd ter sido incubado por 18-24h em estufa microbiolgica a temperatura de 24h a 35 1C, semear o mesmo em AS pela tcnica qualitativa por esgotamento utilizando ala 10L. Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Incubar por 24h a 35 2C em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2 jarra vela.

Procedimento para secreo uretral masculina Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%;


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Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC). Rolar o swab uretral masculino contendo a amostra biolgica em uma pequena rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala bacteriolgica 10L. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com leituras dirias. Em caso de: Procedimento para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secrees vaginal e uretral. Realizar procedimento do Kit comercial adotado por padronizao de cada laboratrio.

Secrees em Geral (Feridas cirrgicas, Fstulas, lceras, Abscessos e Exsudatos). importante cultivar secrees oriundas de feridas, lceras, abscessos entre outras, pois inmeros so os microrganismos patognicos causadores de infeces cutneas, subcutneas e profundas da pele que acometem pacientes que realizam procedimentos cirrgicos ou que esto hospitalizados h algum tempo.

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a secreo em uma pequena rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala bacteriolgica 10L. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com leituras dirias.

Secreo Ocular Vrias so as patologias responsveis por infeces nos olhos, dentre elas vale ressaltar por exemplo a conjuntivite e ceratite.

Procedimento


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Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biolgica em uma pequena rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala bacteriolgica 10L. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com leituras dirias.

Urina Atualmente o aumento do nmero de casos de infeces do trato urinrio complicados vem alarmando o mbito hospitalar nacional e mundial, devido ao isolamento de bactrias com alto grau de resistncia as diferentes classes de antibiticos atravs do cultivo em meios de cultura. Amostras inaceitveis para processamento

Jato primrio (exceto se houver pedido especfico do mdico);

Amostra colhida com menos de 4 horas antes da ltima mico (segunda mico da manh);

Amostra colhida sem higiene prvia;

Amostra em frasco no estril;

Amostra colhida com coletor e contaminada com fezes;

Amostra de coletores auto aderente que permaneceram por mais de uma hora aderidos criana;

Amostra colhida da bolsa coletora de pacientes com sonda;

Amostra sem refrigerao e cujo prazo entre a coleta e o transporte ao laboratrio for superior a 2 horas.

Amostra com conservantes como o formol

Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico 2% ou lcool 70%; Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico semeado. Meio de cultura utilizado: gar CLED Homogeneizar a urina. Introduzir a ala calibrada de 0,001ml ou 1l aps flambagem, verticalmente na amostra biolgica e realizar a semeadura quantitativa. Incubar por 18 a 24 horas a 35 2C em estufa microbiolgica. Este procedimento permite que se distribua o material de maneira uniforme na placa de meio de cultura para auxiliar na contagem de colnias microbiolgicas.


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A urocultura tambm pode ser realizada atravs de outros procedimentos, tais como:

Pour plate Realiza a diluio da urina para obteno de um fator a ser utilizado na interpretao. Por exemplo: diluir 9,9 ml de salina estril + 0,1ml de urina (10-2); diluir 9,9 ml de salina estril + 0,1 ml da 1 diluio (10-4). Adicionar 01 ml da ltima diluio em placa de petri estril (150 mm). Acrescentar o gar Mueller-Hinton (fundido), homogeneizando e incubando a 35-37C em estufa, incubado em aerobiose durante 24 horas. A leitura feita multiplicando o nmero de colnias obtido, pelo fator de diluio.

Lamino-Cultivo Consiste de um recipiente plstico cilndrico com uma tampa ligada a um suporte plstico com duas faces contendo meios de cultura como CLED e MacConkey ou outras combinaes. A leitura feita contando o nmero de unidades formadoras de colnias e o resultado interpretado seguindo as orientaes do fabricante, conforme figuras abaixo.

Laninocultivo contendo gar CLED e gar A contagem de colnias estimada e dada MacConkey (direita). em Unidades Formadoras Colnias-UFC/ml.

Interessante!


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6-Interpretao Macroscpica das Colnias Bacterianas e seu crescimento nos Meios de Cultura

Aps 18 a 24 horas de incubao (estufa microbiolgica) em temperatura adequada, ou em prazos maiores para determinados microrganismos, as placas onde o material clnico foi semeado devem ser examinadas para verificar se existe crescimento de algum microrganismo. Deve ser levada em considerao a presena de microbiota quando existente. A primeira etapa para interpretao do crescimento na cultura primria a identificao macroscpica das colnias, como: TAMANHO O tamanho das colnias bacterianas dever ser considerado na placa como um todo; uma mesma cepa pode formar colnias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa de meio de cultura. Colnias Pequenas At 02 mm de dimetro, bem caracterstico de alguns gneros: # Enterococcus spp.; # Alguns estafilococos coagulase negativa (ECN); # Streptococcus spp.; # Stenotrophomonas maltophilia; # Shigella spp. Colnias Mdias At 03 mm de dimetro, como por exemplo: # Escherichia coli; # Bacilos Gram negativos no fermentadores de glicose (alguns). Colnias Grandes Mais de 04 mm de dimetro, bem caracterstico dos gneros: # Proteus spp pela formao do vu. # Pseudomonas spp; # Klebsiella spp.; # Enterobacter spp.,

Colnias Pequenas Colnias Pequenas Colnias Mdias ECN-gar Chocolate ECN-gar Sangue Escherichia coli/gar MacConkey

Colnias Grandes

Pseudomonas spp / gar CLED


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FORMA As colnias bacterianas tambm apresentam formas variadas. Redonda A forma redonda das colnias bacterianas so sugestivas dos gneros Klebsiella, Serratia, Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos e da espcie Escherichia coli. Irregular A forma irregular das colnias bacterianas so sugestivas dos gneros Pseudomonas e Proteus (formao de vu). Elevada A forma elevada sugestiva do gnero Klebsiella. Chata Esta forma observada nas colnias de Enterobacter spp. e Pseudomonas spp.

Colnias redondas e elevadas gar MH- Colnias redondas E. coli e Klebsiella spp./ gar MacConkey Irregulares de Proteus spp.(formao vu)

COR A colorao das colnias bacterianas depender do meio de cultura utilizado. Meios no seletivos, pode-se identificar a colorao caractersticas de alguns microrganismos. Por exemplo: - Staphylococcus aureus e Micrococcus spp. Cor Amarela. - Serratia spp. Cor Vermelha. - Pseudomonas spp. Diferentes tons de verde e castanho. Meios seletivos, a colorao da colnia sofre interferncia das reaes que ocorrem com substratos dos meios de cultura. - Utilizao da lactose no gar MacConkey, colnias bacterianas rseas. - Utilizao da lactose no gar CLED, colnias bacterianas amarelas. - Utilizao do gar Manitol Salgado pelas bactrias, cor amarela. - Produo de H2S (gs sulfdrico) no gar Salmonella/Shigella, colnias negras.

Colnias H2S+ em gar SS Diferentes isolados de Pseudomonas spp. gar MH Variaes de pigmentao dependendo espcies.


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CONSISTNCIA e DENSIDADE As bactrias quando manuseadas podem apresentar uma consistncia mucide como ocorre com os gneros Klebsiella e Pseudomonas; bem como serem secas, casos este evidncia em colnias de Escherichia coli, Staphylococcus aureus ou Citrobacter spp. As colnias bacterianas tambm podem ser opacas ou com brilhantes. PRODUO de ODOR O odor produzido por muitas bactrias em determinados meios de cultura caracterstico e utilizado em bacteriologia para sugerir algumas espcies, por exemplo: Odor adocicado Pseudomonas aeruginosa; Odor de gua sanitria Shigella spp; Odor de queijo Staphylococcus spp; Odor de vinagre Escherichia coli; Odor de fermento de po Klebsiella pneumoniae; PRODUO de HEMLISE Baseada na lise de hemcias contidas no gar sangue (AS), conforme figura abaixo. Lise Total ocorre formao de halo de transparncia ao redor e/ou sob as colnias, denominada Beta-Hemlise (-hemlise). Lise Parcial h formao de halo com colorao esverdeada ao redor das colnias, denominada Alfa-Hemlise (-hemlise). Ausncia de lise meio de cultura AS inalterado, definido como Gama-Hemlise (-hemlise).



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6.1- Interpretao do Crescimento Microbiolgico nos Meios de Cultura. E agora? Infeco ou Contaminao?

importante lembrar que a presena de microrganismos na cultura no significa necessariamente que eles sejam causadores da infeco. Deve ser observado atenciosamente o isolado bacteriano, a amostra clnica em questo e o nmero de colnias presentes na placa de meio de cultura. Amostras geralmente estreis A presena de bactrias nesses materiais clnicos (sangue, lquor, pleural, sinovial, pericrdico, medula ssea e bipsias) geralmente indica presena de infeco. Amostras que apresentam microbiota normal Geralmente amostras do trato respiratrio, de fezes, secrees genitais e swabs de stios anatomicamente infectados apresentam uma colonizao, Portanto devem ser analisadas todas as colnias bacterianas que cresceram. Nmero de colnias As culturas semi-quantitativas e quantitativas so importantes para determinar uma possvel infeco ou contaminao em diferentes amostras biolgicas, atravs de nmeros pr-estabelecidos pela literatura. Interpretao do crescimento bacteriano em diferentes materiais clnicos ASPIRADO TRAQUEAL e LBA A cultura quantitativa do aspirado traqueal e lavado bronco alveolar-LBA em AS, AC e MC com semeadura por ala de 0,001mL (1l) deve ser valorizada, quando a contagem de colnias bacterianas for maior ou igual 20.000 Unidade Formadora de Colnias (UFC). Isso se deve a ala de 0,001 ml; pois 01 colnia = 20.000 ou 2 x 104 UFC/ml

Amostra biolgica

Significativo se contagem for maior ou igual a (UFC)

Lavado bronco alveolar

20.000 UFC/ml

Aspirado traqueal

20.000 UFC/ml

UFC = Unidades Formadoras de Colnias

OBS 01: Qualquer nmero de colnias crescidas no meio especfico para micobactrias deve ser valorizado laboratorialmente. OBS 02: Se o aspirado traqueal estiver muito espesso, deve-se realizar uma diluio de 1:10 com agente mucoltico, ou seja: Diluir 100L do aspirado traqueal ---------------- 900L agente mucoltico. Homogeneizar e semear com ala de 0,001mL (1L) em meios de AS, AC e MC.


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CATETER A cultura semi-quantitativa dos cateteres com pina estril deve ser valorizada, quando a contagem de colnias bacterianas apresentarem um nmero maior ou igual a 15 unidades formadora de colnias de um nico tipo de microrganismo; desse modo sugere-se que a ponta de cateter pode ser fonte de infeco (critrio de Maki). Com uma contagem menor, o cateter tem baixa probabilidade de ser fonte de infeco. Crescimento de um nmero 15 UFC/ placa = CULTURA POSITIVA. ESCARRO A cultura qualitativa do escarro com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colnias bacterianas puras, ou seja, mesmas caractersticas macroscpicas em grande quantidade e em todos os meios de cultura acima citados em 24, 48 at 72h = Cultura Positiva. Crescimento de colnias bacterianas mistas, ou seja, diferentes caractersticas macroscpicas, em pouca ou em grande quantidade das mesmas nos meios de cultura citados acima em 24 at 72h. Cultura Sem Valor Diagnstico. Provvel contaminao de flora de orofaringe. FEZES A cultura qualitativa das fezes com ala de 0,01mL (10L) nos meios de cultura SS e MC devem ser valorizadas se houver: # Colnias lactose negativa no meio SS; # Colnias H2S positivas (negras) no SS; # Colnias lactose positiva e/ou negativa no meio de cultura MacConkey. O crescimento de diferentes colnias bacterianas = Cultura positiva. A ausncia de crescimento de colnias bacterianas = Cultura negativa**. **Caso incomum, pois sabido que a distribuio da microbiota do intestino grosso por ex: de 10.000.000.000.000 (dez trilhes). Deste modo deve-se verificar o quadro patolgico do paciente, ou possveis erros pr-analticos. LQUIDOS CAVITRIOS ESTREIS A cultura qualitativa do lquor e lquidos (asctico, amnitico, pleural, peritoneal, pericrdico e sinovial), com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento no AS, AC e MC de um nico tipo de colnia. Caso haja pouco crescimento microbiolgico insuficiente para prosseguir a identificao deve ser realizado o reisolamento. Reisolamento o procedimento de semear o microrganismo que se deseja isolar em outra placa de meio de cultura, com a finalidade de obter o microrganismo em quantidade de crescimento suficiente para que possam ser realizados, todos os testes de identificao e sensibilidade a antimicrobianos.


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SANGUE A presena de microrganismos viveis no sangue do paciente representa, em algumas situaes, um agravamento do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame crtico e de grande importncia. Portanto deve-se valorizar a presena de crescimento bacteriano nos meios de cultura AS, AC e MC; atravs da semeadura qualitativa pela ala de 10L. Aps deteco de positividade da amostra em questo pelo equipamento automatizado.

SECREES GENITAIS E A microbiota normal da uretra feminina e masculina constituda por vrios microrganismos. Assim, a interpretao dos resultados microbiolgicos deve ser feita com cautela, certeza de ausncia de outros patgenos potenciais e com nfase na sintomatologia descrita pelos dados clnico do paciente. A cultura qualitativa das secrees genitais com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: # Colnias pequenas -Hemolticas no AS sugestivas do microrganismo Streptococcus agalactiae (cocos Gram positivos). # Colnias pequenas translcidas ou amarelas no AC sugestiva dos microrganismos Haemophilus spp. e Neisseria spp. OBS: Para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secrees vaginal e uretral, a interpretao do crescimento bacteriano depender do Kit adotado por padronizao de cada laboratrio. SECREES em GERAL A cultura qualitativa de feridas, lceras, abscessos entre outras com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colnias bacterianas, exceto colnias bacterianas identificadas como microbiota de pele; proveniente de uma coleta superficial das diferentes amostras biolgicas acima citadas. SECREO OCULAR A cultura qualitativa da secreo ocular com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colnias bacterianas, exceto colnias bacterianas identificadas como microbiota de pele; proveniente de uma coleta superficial. URINA A cultura quantitativa da urina em CLED com semeadura por ala de 0,001mL (1l) de ser valoriza se houver: Crescimento de colnias de mesma forma e caracterstica macroscpica. Crescimento de colnias diferentes em quantidades e que reflitam a presena de microbiota uretral na amostra biolgica, deve solicitar nova coleta.


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#Cultura Positiva: nmero de colnias bacterianas significativa, por exemplo: 11 a 100.000 UFC/ml: suspeita de infeco urinria deve ser associado piria e sintomatologia do paciente. Acima de 100.000 UFC/ml: infeco urinria instalada. #Cultura Negativa: ausncia ou nmero insignificante de colnias bacterianas. 0 a 10.000 UFC/ml: no se considera infeco urinria.

7-Preparo do Esfregao Bacteriolgico A confeco do esfregao depender do tipo de material biolgico e a partir de amostras com consistncia diversas. Materiais lquidos estreis Para os lquidos estreis asctico, amnitico, lquor, pleural, peritoneal, pericrdico e sinovial:

Pouco Turvo Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cnico estril; Centrifugar a 2.500 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL) caso o volume dos lquidos estreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas homogeneizada em agitador mecnico por alguns segundos. Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estril, reservando de 0,5 a 1 mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioqumicos (caso for coletado apenas um frasco do lquido estril). Ressuspender o sedimento (no deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas aladas do material, colocar sobre lmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador qumico ou fsico. Realizar colorao conforme solicitao mdica.

Turvo Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a consistncia da turvao.

Purulento No h necessidade de centrifugao da amostra biolgica estril.

Com auxlio de ala bacteriolgica estril de 10L pegar a amostra, colocar sobre lmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador qumico ou fsico. Realizar colorao conforme solicitao mdica. Para amostra de sangue proveniente das hemoculturas positivas, deve-se: *Etapa A: Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para a seringa e colocar 01 ou 2 gotas em uma lmina de vidro limpa. *Etapa B: Colocar uma segunda lmina a um ngulo de 45 tocando a gota. *Etapa C e D: Com um movimento leve, espalhe a gota ao longo da lmina. Deixar secar a temperatura ambiente, fixar e realizar a colorao conforme solicitao mdica.


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Passos para realizao do esfregao em sangue.

Material lquido (URINA)

# Homogeneizar a urina contida no frasco estril. # Colocar 10L de urina no centrifugada, sobre uma lmina limpa e espalhar realizando movimentos ovais de forma concentrada. # Deixar secar a temperatura ambiente e fixar o material biolgico. # Realizar colorao conforme solicitao mdica. OBS: No recomendado pela literatura realizar esfregao do sedimento urinrio. Materiais Serosos e Purulentos Para secrees genitais, oculares, abscessos, fstulas, lceras e feridas cirrgicas. O esfregao deve ser preparado aps coleta da amostra biolgica com swab estril. Com o auxlio do swab estril, realizar movimentos circular e oval sobre a lmina (limpa e desengordurada). A lmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor. Realizar colorao conforme solicitao mdica.

Materiais Mucides Escarro Expectorado

Separar os grumos purulentos ou com sangue da saliva com auxlio de haste de madeira e placa de petri estril (ao arrastar o grumo de pus, o excesso de saliva fica aderido superfcie, e o material purulento deve ser preferencial para o esfregao).

Com o auxlio de haste de madeira (palito de picol), realizar movimento em uma nica direo sobre uma lmina nova, limpa e desengordurada, repetir o movimento.

A lmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor. Realizar colorao conforme solicitao mdica.

Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal

Pouco Turvo Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cnico estril; Centrifugar a 2.500 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL) caso o volume dos lquidos estreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas homogeneizada em agitador mecnico por alguns segundos.


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Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estril, reservando de 0,5 a 1 mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioqumicos (caso for coletado apenas um frasco do lquido estril). Ressuspender o sedimento (no deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas aladas do material, colocar sobre lmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador qumico ou fsico. Realizar colorao conforme solicitao mdica.

Turvo Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a consistncia da turvao.

Fixao do Material Biolgico Fixao pelo calor Aps o esfregao secar ao ar, passar duas a 3 vezes pela chama do bico de bunsen, tomando cuidado para evitar distores pelo superaquecimento; deixar esfriar o esfregao antes de corar.


Fixao por Substncia Qumica O esfregao pode ser fixado por substncias qumicas, tais como: metanol, albumina ou propilenoglicol (fixadores comerciais).

Previne a lise de eritrcitos, bem como a retirada do material biolgico (esfregao) pouco espesso presente na lmina. Procedimento de fixao por Metanol ou Albumina.

Deixar o(s) esfregao(s) secarem a temperatura ambiente;

Cobrir o esfregao com metanol ou albumina, por aproximadamente 1 minuto; Retirar o excesso destas substncias qumicas, sem lavar a lmina e deixar secar ao ar; No usar calor antes de corar.


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8-Principais Coloraes em Bacteriologia

As coloraes em bacteriologia clnica so de suma importncia, pois: Classificam os microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma

e arranjo; Auxilia no diagnstico presuntivo rpido do processo infeccioso; Indica uma terapia antimicrobiana direcionada; Quantificam relativamente os microrganismos visualizados no esfregao podendo avaliar o

equilbrio da microbiota; Auxilia na seleo de meios de cultura mais apropriados para semeadura inicial; A presena de microbiota anaerbia pode ser suspeitada justificando assim a falta de

crescimento microbiano em culturas, com bacterioscopia positiva; Avaliao quantitativa de elementos figurados (clulas epiteliais, eritrcitos, leuccitos...)

que podem auxiliar na interpretao da resposta inflamatria.

COLORAO de GRAM Descoberto por Hans Cristian Joaquim Gram, bacteriologista dinamarqus, a colorao de Gram tem importncia crucial na microbiologia de urgncia.

A tcnica se baseia na composio da parede celular bacteriana para diferenci-las e classific-las. Utilizam-se dois corantes neste mtodo: violeta de genciana e fucsina diluda. Ainda empregado um mordente (ou fixador): lugol e uma soluo diferenciadora (descorante): lcool-acetona. Esta diferena devido composio da parede celular: nos microrganismos Gram positivos, a parede rica em peptideoglicano, formando uma espessa camada que retm o complexo Violeta-Lugol dentro da clula e pouco permevel ao lcool-acetona. Ao contrrio, a parede celular de microrganismos Gram negativos apresenta uma camada mais delgada de peptideoglicano, que so mais permeveis ao lcool e permitem a remoo do corante do interior da bactria. Para evidenciar estas caractersticas, utiliza-se um corante de contraste, a fucsina diluda que vai corar as clulas Gram negativas. ** Tcnica

Confeccionar o esfregao, com auxlio de ala bacteriolgica ou swab; Aguardar a secagem natural do esfregao e fixar o mesmo pelo calor; Colocar a lmina sobre o suporte na cuba de colorao e cobrir com violeta de genciana por

1 minuto; Desprezar o excesso de violeta e cobrir a lmina com lugol por 1 minuto; Lavar com gua corrente; Descorar com lcool-acetona rapidamente; Lavar novamente com gua corrente; Cobrir com fucsina de Gram por 30 segundos; Lavar, aguardar a secagem da lmina e examinar ao microscpio com objetiva de imerso.

COLORAO de ZIEHL-NEELSEN utilizada para deteco das micobactrias de interesse clnico.

A tcnica se baseia na composio da parede celular bacteriana composta com alto teor de lipdeos (cerca de 60%, principalmente de cido miclico), que quando tratadas pelo corante Fucsina fenicada E AQUECIMENTO (chama do bico de bulsen) coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subsequente por uma soluo de lcool-cido forte (diferenciador). As outras


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bactrias, que no possuem a mesma composio da parede bacteriana, tm a sua colorao pela fucsina descorada pela soluo de lcool-cido e coram-se de Azul pela ao do corante Azul de metileno (contra-corante). ** Tcnica - Ziehl-Neelsen (Colorao Quente)

Preparar um esfregao homogneo, delgado em uma lmina nova desengordurada, limpa e seca;

Deixar secar a temperatura ambiente; Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada; Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente com a chama do bico de

Bunsen, passando lentamente por baixo da lmina, at que se produza emisso de vapores e, quando estes so visveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operao at completar trs emisses sucessivas.

Lavar em gua corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato dgua de baixa presso sobre a pelcula corada, de maneira que no se desprenda;

Descorar com lcool-cido e lavar o esfregao com gua, at obter-se total retirada da fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessrio;

Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a temperatura ambiente.

COLORAO de KINYOUN uma tcnica de colorao similar a colorao de Ziehl Neelsen, mas realizada a frio para deteco micobactrias de interesse clnico.

** Tcnica - Colorao de Kinyoun (Colorao Frio)

Preparar um esfregao homogneo, delgado em uma lmina nova desengordurada, limpa e seca;

Deixar secar a temperatura ambiente; Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada, deixando

agir por 05 minutos;

Lavar em gua corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato dgua de baixa presso sobre a pelcula corada, de maneira que no se desprenda;

Descorar com lcool-cido e lavar o esfregao com gua, at obter-se total retirada da fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessrio;

Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a temperatura ambiente.


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9-Identificao Bioqumica de Bactrias de Importncia Mdica

9.1-COCOS GRAM POSITIVOS (CGP)

Dentre os cocos Gram positivos sero enfatizados alguns gneros: estafilococos, estreptococos e enterococos. Aps avali

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