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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

Marcos Paulo Pinheiro Ferreira

EFEITO DA LASERTERAPIA DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE A

VIABILIDADE DE CÉLULAS MUSCULARES

São Paulo, SP

2008

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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

Marcos Paulo Pinheiro Ferreira



Dissertação de Mestrado

apresentada à Universidade Nove

de Julho, para obtenção do título

de Mestre em Ciências da

Reabilitação.

Orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes

Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari

São Paulo, SP

2008

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Ferreira, Marcos Paulo Pinheiro

Efeito da laserterapia de baixa potência sobre a viabilidade de células

musculares. / Marcos Paulo Pinheiro Ferreira. São Paulo : 2008.

25 f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Nove de Julho, 2008.

Orientadora: Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes

Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari

1. Laserterapia. 2. Mioblastos. 3.C2C12. 4.Células musculares.

I. Fernandes, Kristianne Porta Santos. II. Ferrari, Raquel Agnelli

Mesquita CDU 611.018

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Gostaria de agradecer...

A minha orientadora Kristianne Porta Santos Fernandes que nos últimos

anos foi mais que uma orientadora ou colega e sim uma amiga que

esteve ao meu lado para me ajudar em todos os meus problemas,

sempre me lembrarei com muito carinho da Kris, e mais do que tudo

muito obrigado pela paciência.

A Raquel Agnelli Mesquita Ferrari, por estar sempre pronta para me

ajudar em qualquer momento e no que fosse necessário.

Aos meus colegas e amigos Erick, Hanne, Nadhia e Camila por terem

passado tanto tempo no lab comigo, sem essa ajuda nunca poderia estar

finalizando este trabalho.

A todos técnicos do laboratório que sempre me ajudaram muito em todos

os meus problemas dentro do lab..

A minha amiga Vanessa Pavesi por estar ao meu lado me dando forças nos

momentos em que mais precisava.

A Profa. Manoela Domingues que tem toda a minha admiração, agradeço pelas

risadas, sem sua ajuda e suas palavras de incentivo com certeza não teria

chegado até aqui.

A empresa MM Optics pelo empréstimo do aparelho Twin-laser

Ao Prof. Dr. José Ernesto Belizário do Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo pela doação da linhagem celular C2C12.

Muito obrigado!

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Os efeitos benéficos da fototerapia usando lasers de baixa energia

dependem dos parâmetros de irradiação e do tipo de laser usado. Entretanto,

não poucos dados na literatura sobre a proliferação de mioblastos C2C12 após

a fototerapia com lasers GaAIAs e InGaAIP. O objetivo deste estudo in vitro foi

avaliar o efeito de fototerapia na viabilidade de mioblastos C2C12 cultivados

sob diferentes condições nutricionais (modelo de lesão muscular) usando os

lasers GaAIAs e InGaAIP de baixa energia com diferentes comprimentos de

onda e intensidades. As células C2C12 cultivadas em meios de cultura

convencional (10% soro fetal bovino, SFB) e em deficiência de nutrientes (5%

SFB) foram irradiados com lasers GaAlAs (660 nm) e InGaAlP (780 nm) de

baixa energia com densidade de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2, e 3.8, 10 e

17.5 J/cm2, respectivamente. A proliferação celular foi avaliada indiretamente

24h depois da irradiação por meio da mensuração da atividade mitocondrial e

pelo método do cristal violeta. Não houve diferença significativa na viabilidade

celular entre os mioblastos tratados com laser e as controle para todos os

parâmetros testados, após de 24hs incubação. Entretanto, as culturas que

cresceram em meio convencional suplementado com 10% de SFB exibiram

taxas de crescimento mais altas que as que (irradiadas ou não) cresceram no

meio com deficiência nutricional. A laserterapia, usando os parâmetros

anteriormente descritos, não melhorou a viabilidade das células C2C12

cultivadas sob condições habituais ou sob deficiência de nutrientes (modelo de

injúria muscular).

palavras-chave: laserterapia, C2C12, mioblastos

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EFFECT OF LOW-ENERGY LASER IRRADIATION ON THE

VIABILITY MYOBLASTS

The beneficial effects of phototherapy using low energy lasers depend on

irradiation parameters and type of laser used. However, there are few data in

the literature on C2C12 myoblasts proliferation following phototherapy with

GaAlAs and InGaAlP lasers. The aim of this in vitro study was to evaluate the

effect of phototherapy on the viability of cultured C2C12 myoblasts under

different nutritional conditions (muscle injury model) using low energy GaAlAs

and InGaAlP lasers with different wavelengths and powers. C2C12 cell line

cultured in regular (10% fetal bovine serum, FBS) and nutrient-deficient (5%

FBS) media were irradiated with low-energy GaAlAs (660 nm) and InGaAlP

(780 nm) lasers with energy densities of 3.8, 6.3 and 10 J/cm2, and 3.8, 10 and

17.5 J/cm2, respectively. Cell proliferation was assessed indirectly 24 h after

irradiation by measuring the mitochondrial activity and by the crystal violet

assay. There were no significant differences in cell viability between laser-

treated myoblasts and control cultures for all tested parameters after 24 h of cell

culture. However, cell cultures grown in regular nutrient medium supplemented

with 10% FBS exhibited higher growth rates than cultures, irradiated or not,

grown in nutrient-deficient medium. Laser phototherapy did not improve C2C12

viability under regular or nutrient-deficient (muscle injury model) conditions

using the above parameters.

Key-words: laser therapy, C2C12, myoblasts

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SUMÁRIO

Contextualização.....………………………………………….....…………………...01

Estudo................................................................................................................03

Considerações Finais........................................................................................19

Referências bibliográficas..................................................................................22

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DMEM = Dulbecco's modified Eagles's medium

GaAIAs = arseneto de gálio alumínio

He-Ne = hélio neônio

InGaAIP = índio gálio alumínio fósforo

LPB = lasers de baixa potência

MTT = 3-{4,5-dimetiltiazol-2il}-2,5-difenil brometo de tetrazólio

SFB = soro fetal bovino

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LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Tabela 1: Parâmetros do laser

FIG. 1A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células

C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de

diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2.

Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os grupos de

controle e experimental em ambos os ensaios.

FIG. 1B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de

células C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser

de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2.




C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas

com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10

e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os

grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.


células C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e

irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com densidades de energia

de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade

celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.


C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de

diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2.




células C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser

de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2.


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C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas

com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3

e 10 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular entre os

grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.


células C2C12 em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e

irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com densidades de energia

de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Não houve diferenças significantes na viabilidade celular

entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.

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Photomedicine and Laser Surgery

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Contextualização

Existe considerável interesse na regeneração do músculo esquelético

em função de situações como a reparação rápida de lesões em atletas, os

transplantes, as distrofias e as atrofias musculares. Nestas situações de injúria

muscular, o processo de formação do novo tecido requer que células

mononucleadas quiescentes precursoras se tornem ativas, proliferem, se

diferenciem em mioblastos e se fundam para formar os miotubos.

Subsequentemente, os miotubos irão sofrer diferenciação e maturação para

formar fibras musculares funcionais reparando assim as miofibrilas danificadas

(Bischoff et al. 1994, Sakuma et al. 2003, Grounds et al. 2002, Dominov et al.

1998, Kumar et al. 2005, Dogra et al., 2007).

Um dos recursos bioestimulantes mais utilizados com o intuito de

acelerar o processo de reparo do tecido muscular esquelético é a terapia com

lasers de baixa potência (LBP). Em contrapartida ainda são escassas, e por

vezes contraditórias, as evidências científicas e clínicas que determinem os

parâmetros dosimétricos e metodológicos necessários à aquisição de seus

objetivos terapêuticos (Ferrari et al. 2005, Amaral 2004, Weiss & Oron 1992,

Bibikova & Oron 1993, Oliveira et al.1999, Lopes-Martins et al. 2006).

LBP são aqueles que possuem baixa energia e ausência de potencial

foto-térmico. Os mais usados estão na porção óptica do espectro vermelho e

do infra-vermelho (400 a 780 nm e 780 a 1mm). Seus fótons de energia são

inferiores a 2,0 elétron-volt (eV), portanto, inferiores à energia da ligação das

moléculas biológicas e do DNA, não podendo quebrar ligações químicas e não

sendo capazes de induzir mutação e carcinogênese (Fujihara 2002, Moore et

al. 2005).

Os LBP podem ser agrupados em dois grupos: o laser de hélio neônio

(HeNe) que possui luz vermelha, sendo utilizado como raio terapêutico, ou

como raio piloto em lasers cirúrgicos invisíveis, e o laser diodo (infravermelho)

que pode apresentar os modos de operação pulsátil ou contínuo e possui maior

penetração nos tecidos biológicos (Brugnera et. al., 1991).

Conhecer a correta combinação de parâmetros (tipo de laser,

comprimento de onda, potência e intensidade) no emprego dos LPB é crucial

1

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para alcançar efetivamente os efeitos desejados no uso clínico. Vários estudos

demonstram que mesmo parâmetros similares, podem causar efeitos

diferentes, dependendo do tipo tecidual e celular e da função a ser avaliada.

(Marques et al. 2004, Azevedo et a.l 2006, Moore et al. 2005, Amaral 2004,

Fujihara 2002, Fujihara et al. 2006, Almeida-Lopes et al. 2001, Pereira et

al.2002, Kreisler et al. 2003).

Em se tratando de tecido muscular esquelético, a maioria dos estudos

sobre a utilização de LBP refere-se aos efeitos bioestimulantes da radiação de

HeNe de comprimento 632,8nm em modelos animais e em culturas primárias

de células musculares (Bibikova & Oron 1993, Bibikova & Oron 1995, Weiss &

Oron 1992, Amaral et al. 2001, Ben-Dov et al. 1999, Shefer et al. 2001, Shefer

et al. 2002, Shefer et al. 2003, Shefer et al. 2008). Já o comprimento de onda

de 904 nm de um laser de GaAs mostrou-se ineficaz no processo de reparação

de lesões musculares in vivo (Oliveira et al. 1999).

Mais recentemente, um estudo analisou os efeitos do laser de Arseneto

de Gálio Alumínio (GaAlAs) nos parâmetros de 830 nm (0,3J/cm2), 685 nm

(0,6J/cm2) e 670 nm (1,2J/cm2) sobre culturas primárias de células precursoras

miogênicas e concluiu que a taxa de proliferação celular induzida por estas

irradiações foi de 84,3%, 70,6% e 56,8% respectivamente (Amaral 2004).

O efeito dos lasers de GaAlAs na linhagem de células musculares

C2C12 e do laser de InGaAlP em células precursoras miogênicas ou na

linhagem de células musculares C2C12 ainda não foi descrito.

O estudo dos efeitos da irradiação laser in vitro, utilizando cultura de

células, permite padronizar as amostras e estabelecer rígido controle de pH,

temperatura, pressão osmótica, e tensão de gás carbônico e de oxigênio, deste

modo, pode-se compreender melhor como utilizar este recurso terapêutico nas

diferentes condições clínicas (Freshney 2005, Eduardo et al. 2007).

A proposta do presente estudo foi a avaliar o efeito do laser de GaAlAs

(660 nm) e do laser de InGaAlP (780 nm) sobre a viabilidade de células

musculares (linhagem C2C12) num modelo in vitro de mimetização de injúria

muscular já previamente estabelecido (Shefer et al. 2003).

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Estudo

Introdução

As lesões musculares ocorrem freqüentemente durante as atividades

esportivas e mesmo nos locais de trabalho, por uma variedade de mecanismos,

que incluem aqueles que surgem de trauma direto e/ou indireto1-3. Depois da

lesão muscular, as células satélites que servem como predecessores dos

mioblastos tornam-se ativas e passam por múltiplos ciclos de divisão antes de

fundirem-se com novas miofibras, promovendo a regeneração muscular4-6.

As modalidades de tratamento para as lesões musculares incluem

reparação cirúrgica, repouso, crioterapia, termoterapia, eletroterapia,

compressão, elevação, imobilização e uso de antiinflamatórios não esteróides.

O tratamento ideal ainda não foi determinado, pois os métodos tradicionais

normalmente não promovem recuperação rápida e a recorrência de lesão é

comum, indicando que tais tratamentos falham em prover total recuperação

funcional e são provavelmente ineficazes na prevenção da formação de tecido

cicatricial permanente 3,7,8.

Vários autores têm demonstrado o potencial da laserterapia de baixa

potência (LBP) para facilitar a recuperação muscular 9-12, entretanto, pouco é

conhecido sobre os efeitos da fototerapia na proliferação de mioblastos.

Por outro lado, tem sido demonstrado que LBP promove a proliferação de

células mesênquimais tais como fibroblastos13-16 e osteoblastos 17,18. Há

necessidade de novos estudos para estabelecer quais parâmetros,

particularmente doses e períodos de tratamento, são ideais para induzir a

ativação e a proliferação de cada tipo celular 19-21 e também para determinar o

efeito da fototerapia no crescimento celular sob diferentes condições

nutricionais 13,14,20.

É sabido que os efeitos benéficos de fototerapia usando lasers de baixa

energia depende dos parâmetros de irradiação e tipo de laser usado 13,22.

Entretanto, não há nenhum dado na literatura sobre proliferação de mioblastos

C2C12 após fototerapia com lasers GaAlAs e InGaAlP. Nós conduzimos o atual

estudo para melhor entender o efeito da irradiação dos lasers GaAlAs e

InGaAlP na viabilidade de mioblastos C2C12 usando diferentes parâmetros de

irradiação.

3

15

Materiais e Métodos

Cultura Celular

A linhagem celular C2C12 é um subclone da linhagem celular de mioblastos

C2 derivada de células satélites de ratos adultos 23,24. As células C2C12

cresceram em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab,

Campinas, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB,

Cultilab) e 1% de solução antibiótica-antimicótica (Cultilab), sempre a 37°C em

um ambiente úmido e a 5% CO2. As células foram mantidas em estado de

subconfluência e repicadas a cada 2 ou 3 dias.

Experimentos

Antes dos experimentos, todas as culturas foram examinadas e a sua

viabilidade foi confirmada pelo método de exclusão do azul de trypan. Para

induzir o estresse celular, metade das culturas foi cultivada em DMEM

suplementado com apenas 5% de SFB por 24hs antes de cada experimento.

Esta situação in vitro produz estresse similar às condições de estresse in vivo,

reduzindo as taxas de crescimento celular13,14,16,18,20 e, portanto permitindo a

observação dos possíveis efeitos da fototerapia no crescimento das culturas 13,20.

Irradiação laser

As células foram irradiadas com os lasers de GaAlAs (660nm) e de

InGaAlP (780nm), (MMOptics Ltd., São Carlos, SP, Brasil). Os parâmetros

estão listados na tabela 1 e o tempo de exposição foi fixado em 10 segundos. A

potência de saída dos lasers foi checada usando um medidor de potência

LaserCheck (Coherent, Santa Clara, CA, USA). Para padronizar os resultados,

a distância entre o cabeçote do laser e as culturas celulares foi mantida

constante. A irradiação foi aplicada no fundo dos tubos de ensaio que

continham as células em cultura, como anteriormente descrito18. Desta

maneira, o feixe laser não passou pelo meio de cultura, mas foi aplicado

diretamente no agregado celular presente no fundo dos tubos. As culturas

controle foram submetidos às mesmas condições experimentais que as células

4

16

irradiadas, exceto para a irradiação. A irradiação foi realizada no escuro para

evitar a influência de outras fontes de luz.

Comprimento

de onda

Potência

de saída

(mW)

Área

cabeçote

(cm2)

Potência

(mW/cm2)

Densidade

de energia

(J/cm2)

780 15 0.4 37.5 3.8

780 40 0.4 100 10

780 70 0.4 175 17.5

660 15 0.4 37.5 3.8

660 25 0.4 62.5 6.3

660 40 0.4 100 10

Tabela 1. Parâmetros do laser

Os grupos experimentais incluíram o grupo controle (não irradiado), os

grupos tratados com laser de 780 nm operando a 3.8, 10 e 17.5 J/cm2, e os

grupos tratados com o laser de 660 nm operando a 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Todos

os grupos foram cultivados em dois meios de cultura diferentes: um contendo

5% SFB e o outro contendo 10% de SFB.

Efeitos da Irradiação Laser na Viabilidade Celular

Depois da irradiação, os “pellets” celulares do grupo controle (não

irradiado) e os tratados (irradiados) foram suspensos em meio DMEM

(contendo 10% ou 5% de SFB) e as células foram distribuídas (104

células/poço) em placas de 96 poços. Para a análise de viabilidade celular, as

culturas foram incubadas em um ambiente úmido com 5% de CO2 por 24

horas. As análises de atividade mitocondrial e o ensaio de cristal violeta foram,

então, realizados para avaliar a viabilidade celular.

Análise da Atividade Mitocondrial

A função mitocondrial dos mioblastos C2C12 foi avaliada usando o

ensaio MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide)

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Depois da irradiação laser e incubação

por 24 horas, o MMT foi adicionado às culturas celulares numa concentração

de 0.5 mg/mL e as células foram incubadas num ambiente úmido,contendo 5%

5

17

CO2 , a 37° por 3 h. Depois deste período, 100 µL de isopropanol foi adicionado

em cada poço para dissolver os cristais formazan. A absorbância foi medida a

620 nm usando um leitor de microplacas (Anthos2020, Anthos Labtec

Instruments, Wals, Austria). Figuras 1 a 4 mostram os valores de absorbância

mensurados.

Ensaio de Cristal Violeta

O ensaio cristal violeta é útil para obter informação quantitativa sobre a

densidade relativa de células aderidas em placas de cultura. Brevemente, ao final do

período de incubação, e depois da remoção do meio de cultura, as placas de 96 poços foram

lavadas com 100 µl de PBS por poço, coradas por meio da adição de 10 µl de

solução cristal violeta a 0.5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) em

30% de ácido acético, por 15 minutos em temperatura ambiente e finalmente

lavadas com água destilada 25. O cristal violeta foi solubilizado em 200 µl de

etanol por 30 minutos e a absorbância foi medida a 620 nm usando o leitor de

microplacas. Os dados da absorção estão descritos nas figuras 1 a 4.

Análise Estatística

Os dados de absorbância (correspondente à viabilidade celular) foram

obtidos em quadruplicata e estão representados como médias ± valores de

desvio padrão (DV). As comparações entre os grupos foram realizadas usando

análise de variância (ANOVA) e o teste Dunnett foi usado para determinar

diferenças significativas entre os grupos irradiados e o grupo controle. Valores

de p< 0.05 foram considerados estatisticamente significantes. Os dados foram

analisados usando o software estatístico GraphPad Prism 4.0 (GraphPad

Software, San Diego, CA, USA). Todos os experimentos foram realizados em

quadruplicada em 3 experimentos independentes, embora apenas um único

experimento representativo dos três realizados está demonstrado em cada

figura.

Resultados

6

18

Efeito de irradiação de laser InGaAIP na viabilidade celular (780 nm a 3.8, 10 e

17.5 J/cm2)

Não houve diferenças significantes na viabilidade celular (avaliada pelos

métodos MTT e cristal violeta) entre mioblastos tratados com laser e culturas

controle depois de 24 horas de incubação. Contudo, a viabilidade das células

cultivadas em meio suplementado com 5% de SFB (condição de injúria) foi

significantemente mais baixa que a das células cultivadas em meio de cultura

padrão contendo 10% de SFB.

A Figura 1 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade de células

C2C12 irradiadas com o laser de 780nm (com densidades de energia de 3.8,

10 e 17.5 J/cm2) com a viabilidade das culturas controle não irradiadas, ambas

cultivadas em meio de cultura convencional (10% de SFB).

FIG. 1A. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio MTT) de células C2C12 em

meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm) com

densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na

viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.

7

19

FIG. 1B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células C2C12

em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (780 nm)

com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na



C2C12 irradiadas com o mesmo laser de 780 nm (com densidades de 3.8, 10 e

17.5 J/cm2) com a das culturas controle não irradiadas, ambas cultivadas em

deficiência nutricional (5% SFB).

8

20


meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo

InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças

significantes na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os

ensaios.


em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo

InGaAlP (780 nm) com densidades de energia de 3.8, 10 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças


ensaios.

Efeito de irradiação do laser de GaAIAs na viabilidade celular (660 nm a 3.8,

6.3 e 10 J/cm2)

Da mesma forma, nos grupos tratados com o laser de 660nm, não houve

diferenças significantes na viabilidade celular (avaliado pelo método MTT e

pelo ensaio de cristal violeta) entre mioblastos tratados com laser e células

controle, depois de 24 horas de incubação. Contudo, a viabilidade das células

cultivadas em meio de cultura suplementado com 5% SFB (condição de lesão)

foi significantemente mais baixa que a das células cultivadas em meio de

cultura padrão contendo 10% de SFB.

A Figura 3 (A e B) mostra a comparação entre a viabilidade das células

C2C12 irradiadas com o laser de 660 nm (em 3.8, 10 e 17.5 J/cm2 de

9

21

densidade de energia) com a das células controle não irradiadas, ambas

cultivadas em meio de cultura convencional (10% de SFB).


meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660 nm) com

densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes na


FIG. 3B. Viabilidade celular medida como absorbância (ensaio cristal violeta) de células

C2C12 em meio de cultura habitual (10% SFB) e irradiadas com o laser de diodo GaAlAs (660

10

22

nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 17.5 J/cm2. Não houve diferenças significantes

na viabilidade celular entre os grupos de controle e experimental em ambos os ensaios.


C2C12 irradiadas com o mesmo laser de 660 nm (em 3.8, 6.3 e 10 J/cm2) com

a das células não irradiadas, ambas mantidas em meio de cultura com

deficiência de nutrientes (5% SFB).


meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo

GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Não houve diferenças


ensaios.

11

23


em meio de cultura com deficiência de nutrientes (5% SFB) e irradiadas com o laser de diodo

GaAlAs (660 nm) com densidades de energia de 3.8, 6.3 e 10 J/cm2. Não houve diferenças


ensaios.

Discussão

Este estudo demonstrou que a irradiação laser em diferentes

comprimentos de onda e parâmetros de energia foi incapaz de estimular a

proliferação celular e de prover taxas de crescimento mais altas que as

observadas nas culturas de controle (em situações de deficiência nutricional e

em meio de cultura convencional). Estes resultados foram confirmados por dois

tipos diferentes de ensaios de viabilidade celular: o ensaio de cristal violeta,

que indica a densidade relativa das células aderidas a placas e o ensaio MTTT,

que avalia a atividade mitocondrial.

Um estudo prévio também indicou que as taxas de crescimento de

células Vero irradiadas uma ou duas vezes com lasers diodos de 660 nm

(GaAlAs) e de 780 nm (InGaAlP) (40 e 70 mW a 3 e 5 J/cm2) foram similares as

do grupo controle não irradiadas, mantidas em meio de cultura com deficiência

de nutrientes 20.

Por outro lado, o mesmo grupo de pesquisadores demonstrou que as

taxas de crescimento de fibroblastos gengivais humanos irradiados duas vezes

12

24

com um laser diodo de 660 nm GaAlAs (2 J/cm2) foram significantemente mais

altas que as do grupo de controle, e que culturas de osteoblastos, derivados da

calvária de ratos, irradiadas com laser diodo de InGaAlP (780 nm) usando

diferentes parâmetros de irradiação (10 mW, 3 J/cm2) apresentou um número

mais alto de células que as não irradiadas 16,18.

É possível que a energia emitida pelos lasers no estudo atual não foi

suficiente para estimular a proliferação da célula C2C12 devido a diferenças

específicas entre os tipos de celulares.

Estudos anteriores sobre o efeito do LBP em músculos demonstraram

que a irradiação do laser de He-Ne pode estimular a regeneração e induzir o

acúmulo de miofibras jovens em locais lesionados do músculo esquelético,

sugerindo que as células satélites são as principais candidatas responsivas à

irradiação 26,27 .

Estes resultados são sustentados por estudos sobre o efeito do laser

He-Ne em culturas primárias de células satélites de rato, que relatam a indução

de expressão de proteína regulatória no ciclo da celular, aumento da

proliferação de células satélites, sobrevivência e inibição de diferenciação

celular e de apoptose 12,28,29.

Nós escolhemos usar a linhagem C2C12 porque estas células são um

subclone da linhagem de mioblastos C2 isoladas de células satélites de ratos

adultos 23. Esta linhagem celular exibe a maioria das características do

mioblasto normal e é comumente usada como modelo para estudar a

proliferação e a diferenciação de células musculares. Além disso, o uso de

linhagens celulares como modelo para a análise de proliferação celular elimina

a possibilidade da influência da irradiação de laser na produção de fatores de

crescimento por células não miogênicas contidas nas culturas primárias, tais

como fibroblastos e macrófagos 30,31.

O modelo de lesão muscular usado no atual estudo foi baseado no fato

que, imediatamente após a lesão muscular (por exemplo, excisão parcial), a

área traumatizada sofre lesão isquêmica e falta de nutrientes e oxigênio, assim

o cultivo celular em meio de cultura com baixas concentrações de soro ou

ainda na ausência deste mimetiza o início da fase pós-traumática 12. Portanto,

as condições de estresse in vitro podem ser obtidas em diferentes linhagens

celulares variando-se a concentração de SFB no meio de cultura. Alguns tipos

13

25

de células são capazes de crescer com a metade da concentração de SFB do

meio de cultura habitual exigido para sua taxa de crescimento característica 13,15,16,18, já outros tipos de células necessitam de uma redução marcante na

concentração de nutrientes para reduzir as suas taxas de crescimento 14,20. Em

culturas de mioblastos C2C12, a proliferação e a diferenciação também são

controladas pelos mitógenos do soro, como demonstrado pelos efeitos de

condicionamento do meio ou pela adição ou remoção de mitógenos24.

Usando o meio de cultura complementado com 5% de SFB, nós

observamos que a viabilidade das células C2C12 foi mantida, mas as taxas de

crescimento foram significantemente mais baixas que as das células em meio

de cultura convencional, suplementado com 10% de SFB. Portanto, esta

concentração de soro foi apropriada para o experimento proposto, isto é, o

estudo dos efeitos da irradiação laser de baixa potência na proliferação de

células submetidas a uma condição que mimetiza a lesão muscular.

Na verdade, as condições de deficiência de nutrientes não devem

bloquear completamente o crescimento celular, mas apenas reduzir a sua taxa

de crescimento para que o possível observar o efeito da irradiação laser nas

taxas de crescimento celular sob estas condições 20. Contudo, os parâmetros

do laser usado no atual estudo foram incapazes de normalizar o crescimento

dos mioblastos neste modelo de lesão muscular.

De acordo com outros estudos 13-16,18,20,22, é possível concluir que a

resposta celular a bioestimulação com laser de baixa potência depende da

combinação dos seguintes fatores: comprimento de onda, densidade de

energia, densidade de potência, tempo de irradiação e o tipo de célula exposta

à irradiação. Portanto, os estudos usando as células em cultura são

importantes para determinar a melhor combinação de parâmetros, tais como o

comprimento de onda e doses de irradiação, para diferentes tipos de células 14,16,18.

Tais estudos ajudarão os clínicos a escolher os parâmetros de laser mais

apropriados para serem usados de acordo com o tratamento necessário 16,20.

Muitas questões foram levantadas por esta pesquisa, portanto, outros

estudos são necessários para entender os mecanismos de bioestimulação a

laser em células de músculo esquelético. Além disso, tais estudos também

14

26

podem determinar os parâmetros de laser corretos para otimizar a

bioestimulação de mioblastos.

Conclusão

A laserterapia, usando os parâmetros anteriormente descritos, não

melhorou a viabilidade das células C2C12 cultivadas sob condições habituais

ou sob deficiência de nutrientes (modelo de injúria muscular).

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18

30

Considerações Finais

Para administrar a fototerapia com a dosimetria ideal é necessário

conhecer o comprimento de onda apropriado para o tecido a ser irradiado, a

energia (J), a fluência (J/cm2), a forma de irradiação (pontual ou varredura), a

potência (mW) e finalmente a quantidade e freqüência de irradiações que serão

necessárias (Meneguzzo 2007).

Cada tipo celular ou linhagem tem um pico ótimo de irradiação que é

dose-dependente, podendo-se estabelecer inclusive uma curva de fluência

versus resposta biológica, de modo que valores acima deste pico ocasionam

uma fotoinibição, conforme o conceito da lei de Arndt-Schultz (Baxter 1997,

Low & Reed 2001, Tiphlova & Karu 1987, Meneguzzo 2007).

Optou-se aqui pela utilização da linhagem celular C2C12 pelo fato

destas células derivarem de músculo esquelético de camundongos, exibirem a

maioria das características dos mioblastos normais e diferenciarem-se em

cultura, propiciando um bom modelo para estudar a regeneração muscular.

Além disso, o uso linhagens celulares em modelos de análise de proliferação

celular elimina a possibilidade da influência da irradiação laser sobre a

produção de fatores de crescimento por células não miogênicas contidas em

culturas primárias, como fibroblastos e macrófagos (Lee et al. 2005, Amaral

2004, Amack & Mahadevan 2001, Kumar et al. 2005).

Para evitar especulações sobre crescimento e perda de viabilidade, que

é cíclico, estabeleceu-se como ideal avaliar a viabilidade celular após 24 horas

da aplicação da laserterapia (Freshney 2005, Meneguzzo 2007).

Como não existiam registros na literatura sobre a utilização dos lasers

de GaAlAs e de InGaAlP na linhagem de células musculares C2C12, escolheu-

se seis parâmetros em aplicação única e pontual na tentativa de buscar a

dosimetria ideal.

Não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular

entre as culturas irradiadas e as culturas controle nos parâmetros avaliados, ou

seja, diodo GaAlAs com doses de 3.8 J/cm2 (15 mW), 6.3 J/cm2 (25 mW) e 10

J/cm2 (40 mW) e diodo InGaAlP com doses de 3.8 J/cm2 (15 mW), 10 J/cm2

(40 mW) e 17.5 J/cm2 (70 mW) .

19

31

Os relatos científicos sobre a aplicação destes lasers (nestes mesmos

comprimentos de onda) em culturas celulares demonstram resultados

variáveis.

Um estudo também indicou que as taxas de crescimento celular da

linhagem Vero cultivada em meio com déficit nutricional e irradiada uma ou

duas vezes com os diodos de GaAlAs e de InGaAlP (40 e 70 mW, em 3 e 5

J/cm2) foi similar a das culturas controle não irradiadas (Eduardo et al. 2007).

Já outros estudos do mesmo grupo de pesquisadores, demonstraram

que a taxa de crescimento celular de culturas de fibroblastos gengivais

humanos irradiados duas vezes com o diodo de GaAlAs (10 e 29 mW, 2 J/cm2)

foi significativamente maior que a do grupo controle e que culturas de

osteoblastos irradiadas com o diodo InGaAlP (10 mW, 3 J/cm2) apresentaram

um número de células maior que as não irradiadas (Azevedo et al. 2006,

Fujihara et al. 2006).

Por outro lado, outro estudo demonstrou efeitos opostos da irradiação de

780 nm (50 mW, em 1, 5, e 10 J/cm2) utilizada em culturas de osteoblastos

(MC3T3) e em células derivadas de osteosarcoma (MG63). Houve efeito

inibitório de 14% e de 24% no crescimento celular de osteoblastos irradiados

com doses de 5 e 10 J/cm2 respectivamente, e houve um efeito estimulatório

de 27% e de 14% nas mesmas doses quando aplicadas às células tumorais

(Renno et al. 2007).

Diante da variabilidade encontrada na literatura quanto aos efeitos da

aplicação destes lasers, conclui-se que ainda existe um vasto campo de

pesquisa a ser explorado a fim de que seja possível estabelecer parâmetros

ideais de aplicação para cada tipo celular e finalmente, para a obtenção dos

efeitos terapêuticos desejados.

Nosso modelo evidenciou ainda o papel do LBP em um modelo, já

descrito, de mimetização de lesão muscular (privação parcial de soro na cultura

celular). Este modelo baseia-se no princípio de que imediatamente após a

lesão muscular, a área traumatizada sofre uma injúria isquêmica com falta de

oferta de nutrientes e de oxigênio, assim, o cultivo celular em meio sem soro ou

com baixas concentrações deste nutriente, simula a fase pós-traumática

(Shefer et al. 2003).

20

32

Além disso, vários autores já demonstraram que quando há carência

nutricional, a taxa de crescimento celular é diminuída permitindo a observação

de possíveis diferenças na proliferação celular entre culturas tratadas e culturas

do grupo controle (Azevedo et al. 2006, Marques et al. 2004, Amaral 2004,

Fujihara et al. 2006).

Deste modo, este estudo traz mais uma contribuição ao conhecimento

da atuação do laser de baixa potência sobre as células musculares, de modo a

auxiliar na determinação científica de parâmetros para o uso clínico.

21

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