IMUNO ENSAIOS USANDO

CONJUGADOS

REAES USANDO REAGENTES MARCADOS

Conjugado: molcula constituda por duas substncias ligadas covalentemente e que mantm as propriedades funcionais de ambas

Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com

isotiocianato de fluorescena (FITC)

HRP: enzima peroxidase

IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO

CONJUGADOS

Antgenos usados nos imuno ensaios: patgeno inteiro, molculas derivadas de patgenos, hormnios

Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais

Ensaios manuais e automatizados

TCNICAS

1 TCNICAS QUE USAM FLUORESCNCIA

Fluorescncia: emisso de luz de uma cor aps

irradiao com luz de cor diferente:

FITC: absoro mxima (490-495 nm), emisso

mxima (517 nm)

Tcnicas: imunofluorescncia, citometria de fluxo

Alguns fluorocromos

FITC: isotiocianato de fluorescena

PE: ficoeritrina

Rodamina

IMUNOFLUORESCNCIA

Lmina de imunofluorescncia

Antgeno usado: pode-se usar Ag comercial ou

pesquisar Ag (micrbio) num material coletado do

paciente (ex: secreo)

Exemplo: IMUNOCRUZI: Ag de Trypanosoma cruzi

liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT

CONJUGADO E MONTAGEM DA LMINA

Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina

obtida em espcie heterloga (carneiro, cabra)

purificada e conjugada marcada - com substncia fluorescente (fluorocromo)

Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,

lmina coberta com glicerina de alcalina e lamnula

KIT COMPLETO PARA

IMUNOFLUORESCNCIA

REAO DE

IMUNOFLUORESCNCIA

I - Reao de imunofluorescncia direta

(RIFD)

pesquisa do Ag em clulas ou tecidos

elevada sensibilidade e especificidade

Usa um conjugado para cada sistema

Reao de imunofluorescncia

II - Reao de imunofluorescncia

indireta (RIFI)

amplificao do sinal aumento da

sensibilidade em relao RIFD

A - pesquisa de antgeno

mais sensvel, uso de um nico

conjugado para diferentes sistemas

Reao de imunofluorescncia

Reao de imunofluorescncia

indireta (RIFI)

B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso

Ag do agente infeccioso (lmina) + soro do paciente Ag-Ac

LAVAR

Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscpio

RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI

TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE

RIFI PARA ANTICORPO SRICO ANTI

LEISHMANIA

DETERMINAO DA CLASSE DO AC

Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:

Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC

DETERMINAO DO TTULO DE ANTICORPO

Como o resultado liberado:

Toxoplasmose IgG (imunofluorescncia):

Resultado: reagente (ou positivo at) 1:8.192

INTERFERENTES NA PESQUISA

DE IgM POR RIFI

Presena de fator reumatide (FR) falso-

positivo:

o Competio com IgG falso-negativo

Para eliminar falso positivo e falso negativo:

Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro

com anti IgG humano seguido de centrifugao usar sobrenadante para dosagem de IgM

KIT PARA IMUNOFLUORESCNCIA PARA AC

ANTI TRYPANOSOMA CRUZI

Desvantagens da RIFI:

Mais demorada, maior nmero de reagentes

Limitaes da reao de imunofluorescncia

Necessidade de microscpio de fluorescncia,

subjetividade, no automao

AUTOMAO NA IMUNOFLUORESCNCIA (E

ELISA)

REAES DE

ENZIMAIMUNOENSAIO

Reao Ag-Ac monitorada por medida da

atividade enzimtica

Alta sensibilidade, reagentes estveis,

leitura visual ou fotomtrica, substratos

coloridos ou luminescentes

CLASSIFICAO DOS ENZIMA-

IMUNOENSAIOS

Ensaios homogneos: atividade da enzima alterada como parte da atividade imunolgica, no precisa de lavagem entre as etapas

Ensaios heterogneos: atividade da enzima no alterada, precisa de lavagem entre as etapas

ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGNEO

SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)

A atividade da enzima alterada pela ligao do Ac ao substrato fluorognico

ENSAIOS HETEROGNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent

assay)

Uso de peptdeos sintticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais

Fase slida: placas de poliestireno

Material da placa tem afinidade por protena

Interao protena-placa no covalente

PLACAS E TIRAS PARA ELISA

ETAPAS DO ELISA

sensibilizao (ou cobertura) da fase slida: adio de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)

Bloqueio: adio de protena inerte: soro fetal bovino, leite desnatado

lavagens

ETAPAS DO ELISA

adio da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *

adio do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)

lavagens

ETAPAS DO ELISA

o Adio do substrato cromognico:

peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD

(ortofenilenodiamina) ou ABTS (cido 5-amino

saliclico) (cromgenos)

ETAPAS DO ELISA

Interrupo da reao: adio de SDS ou H2SO4

Leitura do resultado

Leitor de ELISA: Fotmetro multicanal para tiras ou placas

Filtros: 405, 450, 490, 630 nm

Leitura monocromtica: uso do comprimento de onda no qual o produto da reao tem maior absorbncia

Leitura bicromtica ou diferencial: uso de 2 filtros: o primrio e o diferencial

Elimina imperfeies do plstico

Leitura feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferena das 2 absorbncias

EXPRESSO DOS RESULTADOS

limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de

um teste sorolgico; pode-se trabalhar com maior

especificidade ou sensibilidade dependendo do

objetivo do teste (ex: seleo de doadores num

banco de sangue)

Cut-off (limiar de reatividade)

Corrigir: b: mxima sensibilidade e especificidade

g: mxima especificidade

Leitor de ELISA

Reao de ELISA

Lavadora de

placas

Pipeta

multicanal

ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS

ELISA: ENSAIOS PARA ANTGENOS

II - Western Blot

Pesquisa de antgenos e anticorpos

Exemplos:

- Caracterizar reatividade srica de paciente suspeito de infeco pelo HIV (teste confirmatrio para infeco pelo HIV)

II - WESTERN BLOT

Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:

Fracionamento das protenas do HIV: separao de acordo

com peso molecular

Transferncia das protenas para membrana de nitrocelulose

Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais protenas do HIV o soro reconhece

Cromgeno usado deve originar produto insolvel

Western blot

Western Blot

ONDE ESTUDAR

Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. VAZ, TAKEI, BUENO, 1 edio, 2007

OU

Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas

Infecciosas e Auto-Imunes FERREIRA & VILA, 2a edio, 2001.

OU

Imunologia Mdica - PARSLOW, 10a edio, 2004.

OU

Imunologia Clnica na Prtica Mdica VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,

1 edio, 2008.