IMUNO ENSAIOS USANDO

CONJUGADOS

REAÇÕES USANDO REAGENTES MARCADOS

Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas

Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com

isotiocianato de fluoresceína (FITC)

HRP: enzima peroxidase

IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO

CONJUGADOS

Antígenos usados nos imuno ensaios: patógeno inteiro, moléculas derivadas de patógenos, hormônios

Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais

Ensaios manuais e automatizados

TÉCNICAS

1 – TÉCNICAS QUE USAM FLUORESCÊNCIA

Fluorescência: emissão de luz de uma cor após

irradiação com luz de cor diferente:

FITC: absorção máxima (490-495 nm), emissão

máxima (517 nm)

Técnicas: imunofluorescência, citometria de fluxo

Alguns fluorocromos

FITC: isotiocianato de fluoresceína

PE: ficoeritrina

Rodamina

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Lâmina de imunofluorescência

Antígeno usado: pode-se usar Ag comercial ou

pesquisar Ag (micróbio) num material coletado do

paciente (ex: secreção)

Exemplo: IMUNOCRUZI®: Ag de Trypanosoma cruzi

liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT

CONJUGADO E MONTAGEM DA LÂMINA

Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina

obtida em espécie heteróloga (carneiro, cabra)

purificada e conjugada – marcada - com

substância fluorescente (fluorocromo)

Intensidade da luz emitida depende do pH (ao final,

lâmina é coberta com glicerina de alcalina e lamínula

KIT COMPLETO PARA

IMUNOFLUORESCÊNCIA

REAÇÃO DE

IMUNOFLUORESCÊNCIA

I - Reação de imunofluorescência direta

(RIFD)

pesquisa do Ag em células ou tecidos

elevada sensibilidade e especificidade

Usa um conjugado para cada sistema

Reação de imunofluorescência

II - Reação de imunofluorescência

indireta (RIFI)

amplificação do sinal aumento da

sensibilidade em relação à RIFD

A - pesquisa de antígeno

mais sensível, uso de um único

conjugado para diferentes sistemas

Reação de imunofluorescência

Reação de imunofluorescência

indireta (RIFI)

B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso

Ag do agente infeccioso (lâmina) + soro do paciente Ag-Ac

LAVAR

Ag-Ac + conjugado anti-IgG ou anti IgM microscópio

RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI

TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE

RIFI PARA ANTICORPO SÉRICO ANTI

LEISHMANIA

DETERMINAÇÃO DA CLASSE DO AC

Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar:

Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC

DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPO

Como o resultado é liberado:

Toxoplasmose IgG (imunofluorescência):

Resultado: reagente (ou positivo até) 1:8.192

INTERFERENTES NA PESQUISA

DE IgM POR RIFI

Presença de fator reumatóide (FR) falso-

positivo:

o Competição com IgG falso-negativo

Para eliminar falso positivo e falso negativo:

Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro

com anti IgG humano seguido de centrifugação ⇨

usar sobrenadante para dosagem de IgM

KIT PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA AC

ANTI TRYPANOSOMA CRUZI

Desvantagens da RIFI:

Mais demorada, maior número de reagentes

Limitações da reação de imunofluorescência

Necessidade de microscópio de fluorescência,

subjetividade, não automação

AUTOMAÇÃO NA IMUNOFLUORESCÊNCIA (E

ELISA)

REAÇÕES DE

ENZIMAIMUNOENSAIO

Reação Ag-Ac monitorada por medida da

atividade enzimática

Alta sensibilidade, reagentes estáveis,

leitura visual ou fotométrica, substratos

coloridos ou luminescentes

CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMA-

IMUNOENSAIOS

Ensaios homogêneos: atividade da enzima é alterada como parte da atividade imunológica, não precisa de lavagem entre as etapas

Ensaios heterogêneos: atividade da enzima não é alterada, precisa de lavagem entre as etapas

ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGÊNEO

SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay)

A atividade da enzima é alterada pela ligação do Ac ao substrato fluorogênico

ENSAIOS HETEROGÊNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent

assay)

Uso de peptídeos sintéticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais

Fase sólida: placas de poliestireno

Material da placa tem afinidade por proteína

Interação proteína-placa é não covalente

PLACAS E TIRAS PARA ELISA

ETAPAS DO ELISA

sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar)

Bloqueio: adição de proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado

lavagens

ETAPAS DO ELISA

adição da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente *

adição do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase)

lavagens

ETAPAS DO ELISA

o Adição do substrato cromogênico:

peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD

(ortofenilenodiamina) ou ABTS (ácido 5-amino

salicílico) (cromógenos)

ETAPAS DO ELISA

Interrupção da reação: adição de SDS ou H2SO4

Leitura do resultado

Leitor de ELISA: Fotômetro multicanal para tiras ou placas

Filtros: 405, 450, 490, 630 nm

Leitura monocromática: uso do comprimento de onda no qual o produto da reação tem maior absorbância

Leitura bicromática ou diferencial: uso de 2 filtros: o primário e o diferencial

Elimina imperfeições do plástico

Leitura é feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferença das 2 absorbâncias

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de

um teste sorológico; pode-se trabalhar com maior

especificidade ou sensibilidade dependendo do

objetivo do teste (ex: seleção de doadores num

banco de sangue)

Cut-off (limiar de reatividade)

Corrigir: b: máxima sensibilidade e especificidade

g: máxima especificidade

Leitor de ELISA

Reação de ELISA

Lavadora de

placas

Pipeta

multicanal

ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS

ELISA: ENSAIOS PARA ANTÍGENOS

II - Western Blot

Pesquisa de antígenos e anticorpos

Exemplos:

- Caracterizar reatividade sérica de paciente suspeito de infecção pelo HIV (teste confirmatório para infecção pelo HIV)

II - WESTERN BLOT

Western blot para pesquisa de Ac anti HIV:

• Fracionamento das proteínas do HIV: separação de acordo

com peso molecular

• Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose

• Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais proteínas do HIV o soro reconhece

• Cromógeno usado deve originar produto insolúvel

Western blot

Western Blot

ONDE ESTUDAR

Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI,

BUENO, 1ª edição, 2007

OU

Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças

Infecciosas e Auto-Imunes – FERREIRA & ÁVILA, 2a

edição, 2001.

OU

Imunologia Médica - PARSLOW, 10a edição, 2004.

OU

Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI,

DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI,

1ª edição, 2008.