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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

VICTÓRIA REGINA DE ALENCAR CARVALHO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA in vitro DO ÓLEO

ESSENCIAL OBTIDO DAS FOLHAS DE Leonotis nepetifolia (L.)

R. Br. (Lamiaceae)

PETROLINA

2018

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VICTÓRIA REGINA DE ALENCAR CARVALHO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA in vitro DO ÓLEO

ESSENCIAL OBTIDO DAS FOLHAS DE Leonotis nepetifolia (L.)

R. Br. (Lamiaceae)

Trabalho apresentado a Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Centro, como requisito para obtenção do título de mestre em Recursos Naturais do Semiárido.

Orientadora: Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes.

Co-orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa.

PETROLINA

2018

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida.

Aos meus pais, Paulo e Eliane, pelo amor incondicional, por todos os bons

valores que me ensinaram ao longo da vida e por sempre estarem me

incentivando a crescer pessoal e profissionalmente.

Ao meu irmão, Paulo, pela amizade, companheirismo e por estar sempre ao meu

lado nos momentos mais importantes da minha vida.

Ao meu noivo, Vinícius, por todas as demonstrações de amor, carinho, cuidado

e admiração para comigo ao longo desses anos. Por sempre me encorajar a

alcançar meus objetivos e nunca me deixar desistir.

A minha filha de quatro patas, Lua, pela fidelidade e amor mais puro que existe.

A minha orientadora, Profa Xirley, pelo voto de confiança depositado, bem como

os ensinamentos aos quais engradeceram este trabalho.

Ao meu co-orientador, Prof. Mateus, por tornar acessível o laboratório de

Microbiologia e Imunologia Animal da UNIVASF, assim como todo o material

necessário para a realização desta pesquisa. Agradeço também, por sempre

estar disponível nos momentos de dúvidas.

Ao Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais da UNIVASF

(NEPLAME), em especial, a pesquisadora Ana Paula, por disponibilizar o óleo

essencial utilizado nessa pesquisa.

A todos os meus colegas do mestrado pelos laços de amizade formados. Em

especial, a minha amiga Naiana, pela irmandade construída ao longo desses

dois anos, bem como, pela colaboração neste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido

(PPGRNSA), bem como a Universidade Federal do Vale do São Francisco

(UNIVASF), por tornar acessível um ambiente ao qual os estudantes possam

estar colocando em prática seus sonhos e metas.

A CAPES, pelo apoio financeiro, fundamental para o desenvolvimento dessa

pesquisa.

4

RESUMO

Leonotis nepetifolia, conhecida popularmente por cordão-de-frade, tem sido considerada uma planta de interesse no âmbito farmacológico, em decorrência do seu uso constante na prática medicinal popular, bem como, por apresentar algumas atividades biológicas já descritas na literatura. O potencial terapêutico atribuído aos produtos extraídos deste vegetal deriva da presença de metabólitos secundários, como é o caso dos terpenos, presentes majoritariamente em óleos essenciais obtidos da referida espécie, aos quais, são detentores de grande capacidade antimicrobiana. Diante do exposto, a presente pesquisa objetivou avaliar a atividade antimicrobiana, sinérgica e antibiofilme in vitro, do óleo essencial obtido das folhas de Leonotis nepetifolia (OELN), frente a cepas padrões e isolados clínicos bacterianos. O OELN foi fornecido pelo Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais da UNIVASF (NEPLAME/UNIVASF). Ao qual, foi submetido a análise antimicrobiana (Laboratório de Microbiologia e Imunologia Animal - UNIVASF) através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). Após, foi realizada a atividade sinérgica do óleo essencial com antibióticos, a fim de potencializar a resposta farmacológica destes produtos. Bem como, efetuada a avaliação antibiofilme. Os resultados obtidos expuseram que o OELN obteve resposta antimicrobiana frente cepas padrões (Escherichia. coli, Serratia. marcescens, Staphylococcus. aureus, Staphylococcus. epidermidis) e isolados clínicos de S. aureus (II, III, 7669). A qual, foi potencializada frente algumas espécies bacterianas, quando combinado o produto natural com fármacos sintéticos (oxacilina com OELN frente S. aureus ATCC 25923, S. aureus II e S. aureus III; ampicilina com OELN frente E. coli ATCC). Resposta frente a redução da formação do biofilme e do consolidado também foram obtidas através da ação do OELN, em especial, frente cepas padrões e isolados clínicos de S. aureus. Diante do exposto, conclui-se que o OELN pode vir a ser uma possível alternativa viável, no combate a infecções derivadas por microrganismos, em especial, bactérias. Sendo este, o primeiro estudo realizado com o referido produto natural (OELN), para atividade sinérgica e antibiofilme.

Palavras-chave: Antibiofilme. Antimicrobiano. Leonotis nepetifolia. Sinergismo.

5

ABSTRACT

Leonotis nepetifolia, popularly known as cordon de monde, has been considered a plant of interest in the pharmacological field, due to its constant use in the popular medical practice, as well as to present some biological activities already described in the literature. The therapeutic potential attributed to the products extracted from this plant derives from the presence of secondary metabolites, as is the case of terpenes, present mainly in essential oils obtained from this species, to which they have great antimicrobial capacity. In view of the above, the present study aimed to evaluate the in vitro antimicrobial, synergistic and antibiofilm activity of the essential oil obtained from Leonotis nepetifolia leaves (OELN), against standard strains and bacterial clinical isolates. The OELN was provided by the Nucleus of Studies and Research of Medicinal Plants of UNIVASF (NEPLAME / UNIVASF). To which, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were determined by the antimicrobial analysis (Laboratory of Microbiology and Animal Immunology - UNIVASF). Afterwards, the synergistic activity of the essential oil with antibiotics was performed, in order to potentiate the pharmacological response of these products. As well as, carried out the evaluation antibiofilme. The results obtained showed that the OELN obtained an antimicrobial response against standard strains (Escherichia coli, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) and clinical isolates of S. aureus (II, III, 7669). (Oxacillin with OELN against S. aureus ATCC 25923, S. aureus II and S. aureus III, ampicillin with OELN against E. coli ATCC) was potentiated against some bacterial species when combined with natural products with synthetic drugs. Response to the reduction of biofilm formation and consolidation were also obtained through the action of OELN, especially against standard strains and clinical isolates of S. aureus. In view of the above, it is concluded that OELN can be a viable alternative in the fight against infections derived from microorganisms, especially bacteria. This being the first study carried out with said natural product (OELN), for synergistic activity and antibiofilm.

Keywords: Antibiofilm. Antimicrobial. Leonotis nepetifolia. Synergism.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Espécie de Leonotis nepetifolia.

Figura 2 – Distribuição fitogeográfica da espécie Leonotis nepetifolia no Brasil.

Figura 3 – Representação esquemática das duas rotas metabólicas referente à

síntese de terpenos/terpenoides: via do mevalonato e via do 1-desoxixilulose-5-

fosfato (DXP).

Figura 4 – Estrutura molecular de 1,3-Octenol.

Figura 5 – Estrutura molecular de (E)-Ocimeno.

Figura 6 – Estrutura molecular de (Z)-Ocimeno.

Figura 7 – Estrutura molecular de β-Cariofileno.

Figura 8 – Estrutura molecular de Germacreno D.

Figura 9 – Estrutura molecular de m-Xileno.

Figura 10 – Etapas de formação do biofilme.

Figura 11 – Relação entre o surgimento de antibióticos e cepas resistentes de S.

aureus nos séculos XX e XXI.

Figura 12 – Exsicata da espécie de Leonotis nepetifolia depositada no Herbário

da Universidade Federal do Vale do São Francisco.

Figura 13 – Aparelho de hidrodestilação Clevenger.

Figura 14 – Placa de microdiluição estéril com 96 poços.

Figura 15 – Relação entre a produção e a capacidade de formar o biofilme nos

isolados clínicos de S. aureus.

Figura 16 – Relação entre a produção e a capacidade de formar o biofilme nas

cepas padrões bacterianas.

Figura 17 – Interferência com a formação do biofilme entre as cepas padrões na

presença de OELN.

Figura 18 – Interferência com a formação do biofilme entre as cepas padrões na

presença de OELN.

7

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Atividades biológicas atribuídas a espécie Leonotis nepetifolia.

Tabela 2 – Composição química do óleo essencial obtido das folhas de Leonotis

nepetifolia.

Tabela 3 – Linhagens padrões e isolados clínicos bacterianos.

Tabela 4 – Meios de cultura utilizados nos ensaios e suas aplicações.

Tabela 5 – Critérios de classificação do IFI para a metodologia de

Checkerboard.

Tabela 6 – Classificação das linhagens bacterianas quanto a produção de

biofilme.

Tabela 7 – Valores da CIM e CBM frente a linhagens padrões bacterianas para

o OELN.

Tabela 8 – Valores da CIM e CBM frente a isolados cínicos de S. aureus para

o OELN.

Tabela 9 – Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de óleos

essenciais.

Tabela 10 – Valores da CIM e CBM de oxacilina para cepas padrões e isolados

clínicos gram positivos.

Tabela 11 – Valores da CIM e CBM de ampicilina para cepas padrões gram

negativas.

Tabela 12 – Determinação da atividade sinérgica do OELN com oxacilina frente

cepas padrões gram positivas.

Tabela 13 – Determinação da atividade sinérgica do OELN com oxacilina frente


Tabela 14 – Determinação da atividade sinérgica do OELN com ampicilina

frente cepas padrões gram negativas.

Tabela 15 – Classificação das cepas padrões bacterianas quanto a análise de

formação do biofilme.

Tabela 16 – Classificação dos isolados clínicos de S. aureus quanto a análise

de formação do biofilme.

Tabela 17 – Classificação das cepas padrões bacterianas quanto a sua

formação de biofilme na presença do OELN.

Tabela 18 – Classificação dos isolados clínicos de S. aureus, quanto a sua

formação de biofilme na presença do OELN.

8

Tabela 19 – Interferência com o biofilme consolidado de cepas padrões

bacterianas na presença do OELN.

Tabela 20 – Interferência com o biofilme consolidado de isolados clínicos de S.

aureus na presença do OELN.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMP Ampicilina

ANOVA Análise de Variância

BHI Brain Heart Infunsion

CBM Concentração Bactericida Mínima

CIM Concentração Inibitória Mínima

CO-MRSA Community-onset methicillin-resistant Staphylococcus aureus

CTT Cloridrato de Trifenil Tetrazólico

DMSO Dimetilsulfóxido

DO Densidade Óptica

GC-MS Gas-cromatography/mass spectrometry

HVASF Herbário do Vale do São Francisco

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IFI Índice Inibitório Fracionado

ITIS Integrade Taxonomic Information System

KPC’s Klebsiella pneumoniae Carbapenamase

LPS Lipopolissacarídeo de Membrana

MH Mueller Hinton

MRSA Meticillin-resistent Staphylococcus aureus

MRSE Meticillin-resistent Staphylococcus epidermidis

NEPLAME Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais

OE Óleo essencial

OELN Óleo Essencial de Leonotis nepetifolia

OMS Organização Mundial da Saúde

OXA Oxacilina

PBS Tampão Fosfato-Salino

TGI Trato Gastrointestinal

TSB Tryptic soy

UFC Unidades Formadoras de Colônias

UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco

VISA Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus

VRSA Vancomycin-resistent Staphylococcus aureus

10

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 12 2 REFERENCIAL TEÓRICO 14 2.1 IMPORTÂNCIA DOS PRODUTOS NATURAIS 14

2.2 ASPECTOS BOTÂNICOS E ETNOFARMACOLÓGICOS DE Leonotis nepetifolia

15

2.3 EFEITOS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE OS MICRORGANISMOS

22

2.3.1 Características dos Óleos Essenciais 22

2.3.2 Constituição Química do Óleo Essencial de L. nepetifolia 23

2.3.3 Modo de ação dos Óleos Essenciais sobre os Microrganismos 29

2.4 BIOFILME 31

2.5 MICRORGANISMOS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA E RESISTÊNCIA AOS FÁRMACOS ANTIBIÓTICOS

33

2.5.1 Staphylococcus epidermidis 33

2.5.2 Staphylococcus aureus 34

2.5.3 Enterococcus faecalis 37

2.5.4 Pseudomonas aeruginosa 38

2.5.5 Escherichia coli 39

2.5.6 Klebsiella pneumoniae 40

2.5.7 Serratia marcescens 41

2.6 ATIVIDADE SINÉRGICA 42

3 OBJETIVOS 44

3.1 OBJETIVO GERAL 44

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 44

4 MATERIAIS E MÉTODOS 45

4.1 ÓLEO ESSENCIAL DE Leonotis nepetifolia 45

4.2 MICRORGANISMOS 47 4.3 MEIOS DE CULTURA 47

4.4 ANTIBIÓTICOS 48

4.5 PREPARO E PADRONIZAÇÃO DOS INÓCULOS BACTERIANOS 48

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO OELN 48

4.6.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) 48

4.6.2 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) 50

4.6.3 Controle da CIM e CBM 50

4.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE SINÉRGICA (CHECKERBOARD)

50

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DO OELN 51

11

4.8.1 Avaliação da Capacidade Formadora do Biofilme 51

4.8.2 Avaliação da Atividade Antibiofilme do OELN 52 4.8.3 Interferência do OELN na Formação do Biofilme Consolidado 53

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 54

5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO OELN 54

5.1.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima (CBM) do OELN

54

5.1.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida Mínima (CBM) dos Antibióticos

56


57

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DO OELN 61

5.3.1 Avaliação da Capacidade Formadora do Biofilme 61

5.3.2 Avaliação da Atividade Antibiofilme do OELN 64

5.3.3 Interferência do OELN na Formação do Biofilme Consolidado 70

6 CONCLUSÕES 72

REFERÊNCIAS 73

12

1 INTRODUÇÃO

Desde as primeiras civilizações é notório o uso de plantas medicinais com

poder curativo, frente a diversas enfermidades. Sendo este, o principal recurso

terapêutico usado por muito tempo pela população (GADELHA et al., 2013).

Entretanto, com o advento das indústrias farmacêuticas, essa prática foi

gradativamente substituída pelos fármacos sintéticos (ALVIM et al., 2004).

Os medicamentos por sua vez, foram perdendo sua eficácia

farmacológica ao serem administrados de forma indiscriminada ou inadequada,

resultante do surgimento de espécies resistentes, as quais, foram

desenvolvendo ao longo dos anos, variados mecanismos de ação frente as

classes de drogas antimicrobianas (HILAL-DANDAN; BRUNTON, 2013). O que

dificultou no tratamento de inúmeras infecções, em especial, aquelas

ocasionadas por bactérias (HAWKEY, 2008).

Como uma possível alternativa de reversão dos quadros de resistência,

além de outras patologias, os produtos naturais retomam mais uma vez um

patamar de relevância, não apenas pela população, mas também por

pesquisadores e empresas farmacêuticas (GARCIA et al., 2012). Onde é

necessário que seja realizada inicialmente, uma boa seleção destes vegetais por

intermédio de estudiosos, aos quais aplicam frequentemente, três metodologias

bem usuais: o estudo randômico (seleção aleatória da espécie),

quimiotaxonômico (avaliação da composição química de um gênero/família) e

etnofarmacológico (uso terapêutico popular) (ALBUQUERQUE; HANAZAKI,

2006).

A ciência que se ocupa em estudar essas plantas terapêuticas é a

etnobotânica, onde juntamente com a etnofarmacologia, investigam quais os

compostos que exibem atividades biológicas, de acordo com as informações

coletadas através do conhecimento empírico (GIRALDI; HANAZAKI, 2010). É

nesse sentido, que Leonotis nepetifolia é tido como um vegetal de interesse para

ambas ciências, justificado pelo fato de abranger eficácia farmacológica já

comprovada na literatura, como atividade antiparasitária (TABUTI, 2008); anti-

inflamatória (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007); sedativa (BAERTS;

LEHMANN, 1989); hipoglicemiante (NETO; MORAIS, 2003), dentre outras.

O potencial terapêutico atribuído a L. nepetifolia frente determinadas

patogenias, decorre da presença de metabólitos secundários na composição

13

química de seus produtos de extração. Como por exemplo, os óleos essenciais,

detentores de altas concentrações de terpenos (octeno; (Z)-β-ocimeno; β-

cariofileno; β-copaeno; α-humuleno; germacreno-D; óxido de cariofileno, entre

outros) (OYEDEJI; EKUNDAYO; KÖNIG, 1999), que na literatura, são tidos como

potenciais agentes da resposta antimicrobiana e antifúngica (EDRIS, 2007). Por

apresentarem uma maior bioafinidade sobre os patógenos, acarretando nestes,

alterações em seus sistemas enzimáticos, além da inativação ou destruição do

material genético microbiano (TURINA et al., 2006).

Uma outra possibilidade no combate a infecções recorrentes por

microrganismos, seria a atividade sinérgica de produtos naturais com fármacos

sintéticos, a qual promove uma potencialização da ação farmacológica dos

medicamentos, com consequente inibição de mecanismos de resistência

derivados dos patógenos (COUTINHO et al., 2009).

Tendo em vista a utilização popular e algumas atividades biológicas já

comprovadas com a espécie L. nepetifolia, resolveu-se analisar a atividade

antimicrobiana, antibiofilme e sinérgica do produto natural, frente a espécies

padrões e isolados clínicos bacterianos.

14

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 IMPORTÂNCIA DOS PRODUTOS NATURAIS

O conhecimento popular tradicional sobre plantas medicinais, constitui-se

de um importante aliado no tratamento de enfermidades. Especialmente, para

povos que residem em localidades distantes dos centros urbanos, aos quais,

dificilmente detêm acesso aos fármacos sintéticos (JESUS et al., 2009).

No intuito de preservar as valiosas informações acerca do uso de produtos

naturais, trabalhos de campo são realizados, de forma que se obtenham

registros sobre a região a qual o vegetal se encontra, parte deste utilizada e sua

finalidade medicinal (MARODIN; BAPTISTA, 2002). A Organização Mundial de

Saúde (OMS), estima que 80% da população mundial, faz o uso de plantas

medicinais com algum propósito terapêutico (SCUDELLER; VEIGA; ARAÚJO-

JORGE, 2009). Esse alto índice, decorre de fatores, como populações que

moram afastadas das cidades; falta de profissionais habilitados a prescrição de

medicamentos; falta de recursos financeiros, dentre outros (FONTANELLA et al.,

2007).

O Brasil, por apresentar uma rica biodiversidade (COSTA; MAYWORM,

2011), é tido como um país que oferece grandes possibilidades nas descobertas

de novas plantas com propriedades terapêuticas, havendo a possibilidade de

serem desenvolvidos a partir destas, novos fármacos (COUTINHO;

TRAVASSOS; DO AMARAL, 2002). É importante ressaltar, que cerca de 40%

dos medicamentos disponíveis para a comercialização mundial, foram

resultantes de fontes naturais, onde 60% dos fármacos aprovados entre 1981-

2002, eram produtos naturais, ou oriundos destes (NEWMAN; CRAGG, 2007).

As propriedades terapêuticas atribuídas as plantas são consequência da

presença de compostos químicos, denominados metabólitos secundários.

Importantes moléculas envolvidas no processo de desenvolvimento, adaptação

e propagação do vegetal (DEWICK, 2002). Com um numeroso leque de

atividades biológicas já descritas na literatura, como: antiparasitária;

antimicrobiana; antitumoral; anti-inflamatória; antiviral; antioxidante; dentre

inúmeras outras (PEREIRA; DAS GRAÇAS CARDOSO, 2012).

O que facilitou bastante a descoberta desses metabólitos nos vegetais

foram as técnicas hifenadas, que permitiram, além da identificação de novos

15

compostos, facilitar a elucidação de novas estruturas moleculares para serem

utilizadas como modelos em novos fármacos (NEWMAN; CRAGG, 2016).

Levando em consideração que, além de pesquisadores e indústrias

farmacêuticas, a sociedade também compõe parcela fundamental para

inovações tecnocientíficas dos produtos naturais (BERLINCK et al., 2017).

2.2 ASPECTOS BOTÂNICOS E ETNOFARMACOLÓGICOS DE Leonotis

nepetifolia

O bioma caatinga, localizado na região do semiárido brasileiro, ocupa em

termos de extensão 11% do território nacional, com abrangência aos estados da

região Nordeste e o Norte de Minas Gerais (IBGE, 2017). Possui características

peculiares no que se refere a sua vegetação (arbórea/arbustiva), clima

(semiárido) e temperatura (média anual elevada), com plantas (xerófitas) bem

adaptadas a sobrevivência por períodos de longa estiagem (BRASIL, 2017).

Leonotis nepetifolia, conhecida popularmente por Cordão-de-frade ou

Cordão-de-São Francisco (Figura 1 – Página 16), é uma espécie nativa da

África que está introduzida na caatinga (Figura 2 – Página 16), cujas estações

de maior desenvolvimento são a primavera e outono (SCHNEIDER, 2007). Uma

vez que não exige grande aporte de nutrientes para o seu crescimento, pode

prosperar-se em solos arenosos, rochosos e argilosos. Bem como nas encostas

de rodovias e em locais que apresentam acúmulo de lixo (IWARSSON;

HARVEY, 2003).

16

Figura 1. Espécie de Leonotis nepetifolia

Fonte: www.marinelifephotography.com

Figura 2. Distribuição fitogeográfica da espécie Leonotis nepetifolia no Brasil.

Os estados marcados em laranja representam aqueles cuja ocorrência da espécie é conhecida, sendo que quanto mais intensa for a coloração, maior a ocorrência da espécie. Fonte: www.floradobrasil.jbrj.gov.br.

17

As informações taxonômicas pertinentes a espécie, encontram-se

registradas no Integrade Taxonomic Information System, sob o número de série

32546. As quais revelam que L. nepetifolia pertence à família Lamiaceae,

também denominada de Labiatae ou Labiada; subfamília Stachyoideae e tribo

Lamiinae (ITIS, 2017). Morfologicamente, trata-se de uma erva com aspecto

robusto, altura variando de 0,32-4,5 metros, raiz frágil, caule quadrangular e

pouco ramificado, folhas simples e pecioladas, flores hermafroditas aromáticas

com coloração alaranjada e frutos que apresentam textura enrugada (LORENZI;

MATOS; FRANCISCO, 2002).

Em decorrência da sua ampla dispersão na natureza de forma acidental

ou pela disseminação de sementes, L. nepetifolia tem sido considerada uma

“erva daninha” quando presente em lavouras de cultivo. Ao competir com os

nutrientes das plantações, exerce uma interferência negativa, ocasionando

assim, prejuízos econômicos na região afetada. Como por exemplo, o

surgimento de deformidades morfológicas dos vegetais, baixo cultivo, além de

servir como reservatório para alguns tipos virais que infestam as plantações

(PIEDRA-IBARRA et al., 2005).

Apesar dos efeitos adversos que podem ser ocasionados nos sistemas de

plantio, é uma erva largamente utilizada na medicina popular sob a forma de

chás, cataplasmas e compressas, frente ao tratamento de ateriosclerose;

menopausa; ansiedade (BEVILAQUA; SHIEDECK; SCHWENGBER, 2007);

hiperglicemia (MACEDO; FERREIRA, 2004), infecção fúngica (FENNER et al.,

2006); diarreia; alergias; febre; reumatismos, entre outros (AGRA et al., 2007).

Onde no Brasil, cerca de 11% da população localizada na região da Mata

Atlântica e litoral de São Paulo, faz o uso medicinal do vegetal (DI STASI, et al.,

2002).

Na Tabela 1 – Página 18, é possível observar estudos que evidenciam

atividades biológicas atribuídas a espécie até o momento.

18

Tabela 1. Atividades Biológicas Atribuídas à Espécie Leonotis nepetifolia.

Parte da

planta

Coletada

Material

Extraído

Atividade Biológica Referências

Caule Extrato

metanólico

Ansiolítico (AYANWUYI et

al., 2016)

Caule, folhas,

glomérulos,

raízes

Extrato

hidroetanólico

Antimicrobiana,

antioxidante,

antiparasitária

(OLIVEIRA,

2013)

Flores Extrato seco Antifúngica (ABUBACKER;

RAMANATHAN,

2003)

Folhas Nepetaefurano,

leonotinina,

leonotina

Anti-inflamatória (UEDA et al.,

2015)

Folhas Extrato etanólico Espermatotóxico (CHANDIRAN;

VASUDEO;

CHAUDHARI,

2016)

Folhas Acetosídeo,

martinosídeo,

levandulifoliosíde

o

Antioxidante (TAKEDA;

NARUKAWA;

HADA, 1999)

Folhas Extrato etanólico Antidiarreica (GAKUNGA et

al., 2013)

Folhas Extrato etanólico,

fase acetato de

etila

Antimicrobiana,

antitumoral, citotóxica

(OLIVEIRA et

al., 2016)

Folhas Extrato

acetônico,

clorofórmico,

etanólico, acetato

de etila

Antibacteriana,

antioxidante,

larvicida, pesticida

(PRAKASH,

2016)

19

Folhas Extrato

hidroetanólico

Antioxidante (DE OLIVEIRA

et al., 2012)

Folhas Extrato etanólico

e metanólico

Antifúngica (MUHIZI et al.,

2009)

Folhas Extrato

hidroalcoólico,

metanólico,

hexânico, acetato

de etila

Antimicrobiana (TORRES;

RIBEIRO;

SOARES, 2008)

Folhas Extrato

metanólico

Antioxidante (PRAKASH et

al., 2014)

Folhas Extrato

metanólico

Antioxidante,

antiproliferativo

(VEERABADRA

N et al., 2013)

Folhas Óleo essencial Antibacteriana e

antifúngica

(GOPAL;

VASANTH;

VASUDEVAN,

1994)

Folhas Extrato

metanólico e

acetônico

Antioxidante e

citotóxica

(SOBOLEWSK

A et al., 2012)

Folhas Óleo essencial Antibacteriana e

antifúngica

(KIPLIMO,

2007)

Folhas Extrato etanólico Antibacteriana,

antifúngica, antiviral

(COS et al.,

2002)

Folhas Extrato

metanólico

Agente acaricida,

repelente, anti-

ovoposição

(OGAYO et al.

2015)

Folhas Extrato

metanólico

Antifúngica (OCHOLA et al.,

2014)

Folhas Extrato

metanólico

Antibacteriana (PRAKASH et

al., 2012)

20

Folhas Extrato etanólico Antitumoral,

antioxidante

(GURUNAGAR

AJAN;

PEMAIAH,

2010)

Folhas Extrato

metanólico

Antibacteriana (NARAYAN,

2012)

Folhas Extrato

metanólico

Anticonvulsivante (AYANWUYI;

YARO; ADAMU,

2009)

Folhas Extrato etanólico Cicatrizante (NITHYA;

BRINDA;

ANAND, 2011)

Folhas Extrato

metanólico

Antimicrobiana (BOILY; VAN

PUYVELDE,

1986)

Folhas, flores Extrato

metanólico,

hexânico,

etanólico

Anti-inflamatória (PARRA-

DELGADO et

al., 2004)

Planta inteira Infusão Hepatotoxicidade (RIGOBELLO et

al., 2010)

Planta inteira Extrato

metanólico e

aquoso

Hepatoproteção (WILLIAMS et

al., 2016)


hidroetanólico

Antibacteriana (OLIVEIRA et

al., 2015)

Planta inteira Extrato bruto Antiparasitária (LEONIDAS et

al., 2013)


metanólico

Anti-plasmodium (CLARKSON et

al., 2004)

Planta inteira Extrato etanólico Antidiabética (GUNGURTHY

et al., 2013)

Planta inteira Extrato aquoso Anti-plasmodium (CARVALHO et

al., 1991)

21


hidroalcoólico

Anti-espasmolítica (CALIXTO;

YUNES; RAE,

1991)

Planta inteira Extrato alcoólico Inseticida (ATAL et al.,

1978)

Fonte: Autoria própria.

As propriedades medicinais originárias da planta, são conferidas à

presença dos metabólitos secundários, tais como: terpenoides, saponinas,

flavonoides, fitoesteróis e alcaloides (TRIVEDI; NEERAJ SETHIYA; MISHRA,

2011). Entretanto, a ação de fatores advindos do meio externo (temperatura,

grau de exposição ao sol, ataque de patógenos, poluição, deficiência de

nutrientes) nos vegetais, é capaz de levar a uma alteração desses componentes

químicos, tendo em vista que as atividades biológicas também podem diferir,

mesmo quando as ervas pertencem a espécies similares (GOBBO-NETO;

LOPES, 2007).

Estudos in vivo já citados na literatura, expõem alguns efeitos benéficos

oriundos de L. nepetofiolia. Como é o caso da ação relaxante, exercida em

células do tecido de miométrio e traqueia de porquinhos da índia, através da

aplicação de extrato hidroalcoólico e chá, obtidos das folhas (CALIXTO, et al.,

1991). Bem como, atividade anti-inflamatória do extrato etanólico obtido de

folhas, caules e flores, através da indução de edema, em orelhas de

camundongos (PARRA-DELGADO, et al., 2004).

Apesar da eficácia que a espécie proporciona frente a patologias, é

necessário levar em consideração a toxicidade que este pode apresentar. Tendo

como exemplo, efeito abortivo relatado por povos indígenas da tribo Kayapó no

Brasil, após mulheres ingerirem decoctos provenientes das folhas e caules

(ELISABETSKY; POSEY, 1989). Assim como também fora relatado, atividade

hepatotóxica reversível em ratos, ao receberem infusão de L. nepetifolia através

dos seus bebedouros (RIGOBELLO et al., 2010).

É importante que haja o conhecimento acerca da toxicidade que pode ser

apresentada através dos vegetais. Uma vez que ampla parcela da população,

desconhece os danos que venham a ocorrer, existindo apenas a percepção de

que as plantas são uma alternativa segura, barata e eficaz no tratamento de

doenças (TOVAR; PETZEL, 2009). Sendo essenciais o desenvolvimento de

22

estudos interdisciplinares, objetivando a ampliação do entendimento das

pessoas sobre as espécies vegetais, pertinentes a biodiversidade brasileira nos

segmentos químico, tóxico e farmacológico (CAMPOS et al., 2016).

2.3 EFEITOS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE OS MICRORGANISMOS

2.3.1 Características dos Óleos Essenciais

Dentre os maiores produtores mundiais de óleos essenciais na indústria,

destacam-se o Brasil, Índia, China e Indonésia. Além desses, diversos

conglomerados internacionais, fazem o uso dos óleos para o desenvolvimento

de matéria-prima, como aromas; fragrâncias; alimentos e bebidas. Bem como,

são empregados no âmbito farmacêutico-medicinal, na sua forma bruta ou

beneficiada (SILVA-SANTOS et al., 2006).

Os principais órgãos coletados das plantas para o isolamento de óleos

essenciais são: folhas, cascas, rizomas e frutos (SIANI et al., 2000). Aos quais,

são submetidos a diversas técnicas de extração: coobação; hidrodestilação;

prensagem a frio; extração por solventes orgânicos; extração por alta pressão;

extração por CO2 supercrítico e arraste a vapor; sendo esta última, a mais usável

na prática laboratorial (OKOH; SADIMENKO; AFOLAYAN, 2010). O princípio

desse método baseia-se na penetração de vapor d’água nos tecidos vegetais,

onde favorece o arraste dos óleos essenciais por difusão e vaporização de todas

as substâncias voláteis (DE PIPERONAL, 2010).

A composição dos OE’s é formada por misturas complexas de metabólitos

secundários (hidrocarbonetos terpênicos, ésteres, ácidos orgânicos, aldeídos,

cetonas e fenóis). Onde monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanoides, são

os que se apresentam quase sempre em elevadas concentrações, além de

caracterizar as propriedades organolépticas do vegetal (BIZZO; HOVELL;

REZENDE, 2009). Tais características variam do sabor ácido ao picante;

coloração incolor ao amarelo; baixa instabilidade quando expostos a luz; elevada

insolubilidade frente a solventes polares; oleosos e altamente voláteis

(BANDONI; CZEPACK, 2008).

Diversos fatores podem influenciar na composição química dos OE’s,

mesmo quando pertencentes a iguais espécies. Podendo citar as interações que

ocorrem entre as plantas, insetos e microrganismos; idade do vegetal; estágio

23

de desenvolvimento e fatores abióticos (pluviosidade, nutrição, época e horário

da colheita, técnicas de colheita e pós colheita). Destacando-se luminosidade e

temperatura, que estão intimamente envolvidos no processo de fotossíntese,

favorecendo um ambiente ideal para o processo fisiológico das plantas (SOUZA

et al., 2008).

Vale ressaltar que as alterações de compostos secundários por fatores

bióticos ou abióticos nos vegetais, podem influenciar nas atividades biológicas

exercidas sobre os patógenos. Sendo necessária a elucidação da caracterização

química do óleo essencial em estudo, uma vez que, são expostos os compostos

com maiores concentrações, e se eles são os responsáveis pelos efeitos

farmacológicos do OE. Essa avaliação mais detalhada, evita a realização de

pesquisas desnecessárias com espécies que não apresentam potencial

medicinal, bem como, impede o descarte das espécies relevantes para o controle

e cura de doenças (DE MORAIS, 2009a).

2.3.2 Constituição Química do Óleo Essencial de L. nepetifolia

Estudo realizado para análise da constituição química do óleo essencial

de L. nepetifolia obtido das folhas, utilizado na presente pesquisa, revelou a

presença de 31 metabólitos secundários (Tabela 2), correspondendo a 99,51%

do total da amostra. Onde os compostos que se apresentaram em maiores

concentrações foram: Octenol (42,58%), (E)-Ocimeno (15,85%), (Z)-Ocimeno

(7,01%), β-Cariofileno (3,22%), m-Xileno (3,05%) e Germacreno D (2,41%), no

qual Octenol foi considerado o composto majoritário (OLIVEIRA et al., 2016).

Tabela 2. Composição química do óleo essencial obtido das folhas de Leonotis nepetifolia.

Pico TR (min) Composto (% )

1 4,099 o-Xileno 2,35

2 4,139 4-Metil-hexanal 1,31

3 4,551 m-Xileno 3,05

4 4,610 Heptanal 0,12

5 4,673 Nonano 0,57

24

6 4,807 Hexa-2,4-dienal 0,65

7 5,151 Etil dissulfeto 0,28

8 5,543 α-Pineno 0,46

9 5,683 4-Metil-hexanol 0,51

10 6,507 2-Metil-3,4-ditiahexano 0,92

11 6,670 1-Octen-3-ol 42,58

12 6,771 3-Octanona 3,75

13 7,006 Fenchona 0,75

14 7,171 Octan-3-ol 1,58

15 7,272 (2-Pentenil) furano 0,51

16 7,373 (Z)-3-Hexenil acetato 1,28

17 7,929 Dissulfeto de isopropil 0,61

18 8,391 1,8-Cineol 0,73

19 8,515 (E)-Ocimeno 15,85

20 8,896 (Z)-Ocimeno 7,01

21 9,289 3,7-Dimetil-undecano 0,59

22 10,835 Linalol 2,05

23 12,022 2,6-Dimetil-2,4,6-octatrieno 0,59

24 18,950 Dihidroedulano I 0,41

25 22,515 β-Damascenona 0,92

26 23,104 β-Elemeno 1,06

27 24,297 β-Cariofileno 3,22

28 25,722 α-Humuleno 1,82

29 26,664 β-Ionona 0,83

30 26,783 Germacreno D 2,41

31 30,672 Óxido de cariofileno 0,72

25

32 40,489 NI 0,39

33 59,494 NI 0,10

TR: tempo de retenção (minutos); (%) porcentagem de composto na amostra; NI: não identificado. Fonte: (OLIVEIRA et al., 2016).

Observa-se que os compostos em maiores concentrações, pertencem a

classe dos terpenos. Estes, por sua vez, são considerados o maior grupo de

metabólitos secundários, com abrangência a mais de 40.000 moléculas que

estão presentes, em especial, nos óleos essenciais e pigmentos. A função

natural dos terpenos atribuída aos vegetais é a proteção frente a patógenos do

meio externo, além disso, a indústria tem desenvolvido matérias-primas a partir

de óleos essenciais que contenham terpenos na sua composição, como:

fragrâncias, aromas, cosméticos, produtos agrícolas, entre outros (GARCÍA;

CARRIL, 2011).

Estima-se que grande parte da composição química dos OE’s é de

terpenos, sendo os monoterpenos detentores de 90% da concentração total.

Estes originam-se a partir de unidades, denominadas isoprenoides/isoprenos, as

quais ativam difosfato de isopentila (IPP), que se formará através de duas vias:

(1) via piruvato-gliceraldeído-3-fosfato (GAP), que está presente em plastídeos

originando monoterpenos, diterpenos e tetraterpenos; e (2) via acetilcoenzima A

(acetil-CoA), presente no citoplasma celular, originando triterpenos e

tetraterpenos (Figura 3 – Página 26) (KITAOKA et al., 2015).

26

Figura 3. Representação esquemática das duas rotas metabólicas referente à síntese de terpenos/terpenoides: via do mevalonato e via do 1-desoxixilulose-5-fosfato (DXP).

*IPP ou DMAPP. IPP: isopentenil pirofosfato; DMAPP: dimetilalil pirofosfato. GPP: geranil pirofosfato;

FPP: farnesil pirofosfato. Fonte: Adaptado de: Baser; Demirci (2007).

O 1,3-Octenol (Figura 4), componente majoritário do OELN utilizado

nesse estudo, é classificado como um hidrocarboneto monoterpeno. Este,

encontra-se presente em diversos óleos essenciais de outras espécies vegetais,

como Eugenia stipitata (FAJARDO OLIVEROS, 2009), Pleurotus sajor-caju

(MODA, 2008) e Hyptis suaveolens (RODRIGUES et al., 2012). Em decorrência

de sua elevada volatilidade e forte odor, é o responsável por conferir o aroma

característico a cogumelos frescos, além de ser considerado o composto volátil

de maior importância presente nestes (PYYSALO; SUIHKO, 1976).

Figura 4. Estrutura molecular de 1,3-Octenol.

OH


27

Octenol também é tido como um importante atrativo inseticida, por elevar

a sensibilidade dos receptores neuronais de insetos, servindo como uma fonte

de armadilhas na captura de mosquitos, em especial, espécies de Aedes

(GRANT; DICKENS, 2011) (BOHBOT et al., 2013). Com relação ao uso

medicinal do composto isolado, ainda não foram relatados estudos pertinentes

ao tema, contudo, pesquisas envolvendo o efeito tóxico da substância e seus

enantiômeros agindo em células-tronco embrionárias humanas, revelaram uma

elevada toxicidade (INAMDAR et al., 2012).

Dois monoterpenos que também revelaram concentrações significantes

no OELN foram (E)-Ocimeno (Figura 5) e (Z)-Ocimeno (Figura 6). Essas duas

oleofinas estão envolvidas no processo de defesa natural das plantas, tendo em

vista a sua emissão por parte do vegetal, quando este é exposto a algum tipo de

ameaça por patógenos (ARIMURA et al., 2004).

Figura 5. Estrutura molecular de (E)-Ocimeno.


Figura 6. Estrutura molecular de (Z)-Ocimeno.


28

A espécie Gerbera jamesonii (feijão de lima), é umas das espécies que

libera ocimeno ou limoleno no momento em que ocorre ataque por aranhas nas

plantas (KRIPS et al., 2001). Ademais, Estudos in vitro para a determinação da

atividade antimicrobiana do composto isolado cis-β-Ocimeno, determinou que

este foi capaz de inibir o crescimento de espécies de S. aureus e E. coli (DAS

CHAGAS, 2015).

Com relação ao β-Cariofileno (Figura 7), trata-se de um sesquiterpeno

encontrado em óleos essenciais de diversas espécies vegetais como Rhus

coriaria (REIDEL et al., 2017); Piper nigrum (POLITEO et al., 2011); Zingiber

nimmonii (SABULAL et al., 2006); Copaifera reticulata (JUNIOR et al., 2007), as

quais são utilizadas para o tratamento de enfermidades na medicina popular.

Figura 7. Estrutura molecular de β-Cariofileno.

HH


Atividades biológicas já evidenciadas na literatura com o composto

isolado (β-Cariofileno), descreveram o efeito anti-inflamatório (MARTIN et al.,

1993) (FERNANDES et al., 2007); citoprotetor gástrico (TAMBE et al., 1996);

anestésico (GHELARDINI et al., 2001); anticancerígeno (ZHENG; KENNEY;

LAM, 1992) e antiparasitário, frente a espécies de Leishmania brasiliensis e

Trypanosoma cruzi (LEITE et al., 2013).

Assim como β-Cariofileno, Germacreno D (Figura 8 – Página 29) também

é classificado como um sesquiterpeno precursor de muitas outras estruturas

terpênicas, as quais, quando relatadas no passado, eram encontradas em

produtos naturais (YOSHIHARA et al., 1969). A presença dessa substância em

elevadas concentrações no óleo essencial de Aloysia virgata, demonstrou ser

responsável pela atividade antifúngica frente Candida albicans (DUARTE et al.,

2005), bem como atividade antibacteriana do óleo essencial de Lantana camara

(COSTA et al., 2009) e Lantana montevidensis (SOUSA et al., 2011).

29

Figura 8. Estrutura molecular de Germacreno D.


m-Xileno (Figura 9), também foi identificado no OELN, sendo encontrado

em óleos essenciais de espécies que apresentaram atividade antibacteriana e

anti-inflamatória, como Varronia curassavica (QUEIROZ et al., 2016) e Jatropha

gossypifolia (ABOABA et al., 2015) respectivamente.

Figura 9. Estrutura molecular de m-Xileno.


2.3.3 Modo de ação dos Óleos Essenciais sobre os Microrganismos

O emprego de óleos essenciais na prática terapêutica, possui lugar de

destaque no que confere as propriedades antimicrobiana (FERRONATTO et al.,

2007); antiparasitária (NAKAMURA et al., 2006); inseticida (VIEGAS JÚNIOR,

2003); antioxidante (SOUZA et al., 2007); larvicida (SIMAS et al., 2004), entre

outras. As quais são atribuídas em decorrência da presença de misturas

complexas, que se formam através do desenvolvimento de mecanismos de

proteção do vegetal, frente a danos advindos do meio externo (KNAAK; FIUZA,

2010).

Dentre os metabólitos secundários produzidos, terpenos e

fenilpropanoides, expõe relevância no que confere atividade antimicrobiana

frente a patógenos. Sendo determinante a análise de tal efeito para o

30

desenvolvimento de novas alternativas farmacológicas através de óleos

essenciais, uma vez que estas substâncias se encontram em elevadas

concentrações nesses produtos naturais (BAKKALI et al., 2008).

O modo de ação dos óleos essenciais sobre células bacterianas ainda

não foi totalmente elucidado na literatura, contudo, alguns pesquisadores

sugerem como o produto natural interfere nos mecanismos de desenvolvimento

e patogenicidade microbianos, decorrentes dos efeitos tóxicos que os

metabólitos secundários causam sobre esses microrganismos (CARSON;

HAMMER; RILEY, 2006).

Como é o caso da membrana celular bacteriana, a qual sofre alterações

em sua estrutura e função. Pôr o óleo possuir um caráter hidrofóbico, tende a

deslocar-se da fase aquosa em direção as estruturas membranosas (lipídeos,

proteínas), favorecendo sua permeabilidade e internalização (SOLÓRZANO-

SANTOS; MIRANDA-NOVALES, 2012). Com isso, sistemas enzimáticos e

estruturais da célula também serão corrompidos, como perturbações nos canais

de cálcio e equilíbrio iônico, onde íons importantes ao metabolismo energético

da célula serão eliminados (cálcio, fosfato, potássio) (KNOWLES et al., 2005).

Em consequência, há um declínio da produção e transporte de ATP

intracelular, levando a célula a não ter energia suficiente para eliminar as toxinas

presentes. Tais toxinas podem promover a inativação ou destruição do material

genético, bem como inibir a produção de toxinas bacterianas determinantes das

diarreias (SOUSA et al., 2013).

Além disso, os danos provocados pelo produto natural, podem levar a

membrana citoplasmática a tornar-se mais permeável, favorecendo a

internalização de antibióticos, aos quais levam a suspensão da atividade vital

celular (BURT, 2004). Podendo tal efeito, ser obtido a partir do sinergismo de

óleos essenciais com fármacos antimicrobianos (COUTINHO et al., 2010a).

Os mecanismos citados, expõem a eficácia que um produto natural pode

exercer sobre um patógeno, a qual muitas vezes é maior do que quando

comparada a um composto isolado (DA CUNHA; ROQUE; DA SILVA, 2006).

Devendo-se levar em consideração que as atividades biológicas, em especial a

antimicrobiana, pode variar de uma espécie para outra, ou até mesmo, em

espécies iguais, decorrente da variância de constituição química que as mesmas

apresentam (TAJKARIMI; IBRAHIM; CLIVER, 2010).

31

2.4 BIOFILME

Biofilme, caracteriza-se por se tratar de uma organização multicelular

microbiana, a qual está aderida a substratos bióticos ou abióticos. Sua

constituição, inclui a presença de uma forte matriz extracelular que o envolve,

fortalecendo e protegendo-o de possíveis danos advindos do meio externo,

decorrentes de polissacarídeos, proteínas e ácidos nucleicos que compõe a

matriz (BRANDA et al., 2005).

Grande parte dos biofilmes, possuem 10% de massa seca, a qual fazem

parte os microrganismos, e 90% de matriz extracelular (FLEMMING;

WINGENDER, 2010). Interiormente a matriz, ocorre o processo de Quorum

Sensing (QS), que é descrito como uma comunicação célula/célula, a qual

abrange diversas interações moleculares (DE KIEVIT, 2009). Uma interessante

característica do biofilme, é que as células podem mover-se e sair da

comunidade, colonizando assim superfícies distintas. Outra característica, seria

a presença de forças que podem promover a integridade do biofilme, como as

interações hidrofóbicas, forças eletrostáticas e de Van der Waals (FLEMMING;

WINGENDER, 2010).

Um efeito sinérgico entre os microrganismos favorece processos

sincronizados, aos quais em células de vida livre não é possível obter.

Garantindo assim, a proteção de bactérias, por exemplo, contra o sistema

imunológico do hospedeiro, dessecação e biocidas (antibióticos e desinfetantes)

(VAN HOUDT; MICHIELS, 2010). Para que haja a formação do biofilme, a

comunicação intercelular é essencial, podendo este ser monoespecífico (apenas

um tipo de microrganismo) ou heteroespecífico (vários tipos de microrganismos).

Sendo o biofilme bacteriano, geralmente classificado como monoespecífico

(BUTANY et al., 2002).

Um exemplo de formação do biofilme que ocorre com frequência, é a

placa dentária (Figura 10 – Página 32). Inicialmente, a uma adesão bacteriana

em superfícies bióticas (mucosa oral), favorecida através das estruturas

morfológicas do microrganismo como pili, flagelos e fímbrias. Após, as células

formam micro colônias, as quais maturam-se e sintetizam exopolissacarídeos e

constituintes da matriz polimérica. O desprendimento das células, representa a

etapa final do biofilme (KAPLAN, 2010), sendo estas capazes de colonizar outras

superfícies, favorecidas por diversos fatores (distúrbios mecânicos, degradação

32

enzimática, indução de motilidade, produção de surfactantes) (KARATAN;

WATNICK, 2009).

Figura 10. Etapas de formação do biofilme.

Fonte: Adaptado de Tremblay et al., 2014.

Além de possuir capacidade de expressão de diferente genes, o biofilme

também favorece a transmissão de reservatórios ambientais e infecções para

um hospedeiro por meio da propagação das células de vida livre (KAPLAN,

2010). Sendo assim, mais resistentes de 10-1000 vezes a agentes

antimicrobianos (CERI; OLSON; TURNER, 2010), tendo por principal fator de

resistência, a matriz extracelular, a qual reduz/impede a propagação de agentes

antibióticos, assim como, a latência das células internas ao biofilme e a

proximidade destas que promovem a transferência de genes resistentes (LEWIS,

2008).

Dentre as infecções resultantes de biofilmes, pode-se destacar otite;

endocardite; pneumonia; fibrose cística e infeções urinárias (ANDERSON et al.,

2003). As quais podem ser tratadas através de produtos naturais eficazes frente

a ação do biofilme formado, como por exemplo os óleos essenciais (MILLEZI et

al., 2013). Vários estudos descritos na literatura, relatam a atividade antibiofilme

desses produtos, por possuírem a capacidade de eliminação das comunidades

formadas por microrganismos, em especial, as bactérias. Constituindo assim,

33

uma nova alternativa de combate a patógenos resistentes (BUDZYNSKA et al.,

2011).

2.5 MICRORGANISMOS DE IMPORTÂNCIA CLÍNICA E RESISTÊNCIA AOS

FÁRMACOS ANTIBIÓTICOS

A microbiota humana é composta por uma ampla diversidade de

microrganismos, em especial as bactérias, as quais colonizam diversos órgãos

do corpo desde o nascimento (laringe, traqueia, brônquios, sinus nasais,

esôfago, estômago, intestinos, trato urinário, órgãos genitais) (DONIA;

FISCHBACH, 2015).

A função destas está associada a proteção do indivíduo frente a

patógenos resistentes (DAVILA et al., 2013), em decorrência da produção de

vitaminas, modulação do sistema imune e síntese de produtos de fermentação.

Contudo, nem sempre essa colonização ocorre de forma simbiótica (CLEMENTE

et al., 2012).

Perturbações fisiológicas como imunossupressão, além de infecções

hospitalares e uso indiscriminado dos fármacos antimicrobianos, levam ao

desenvolvimento de formas bacterianas multirresistentes, que constituem uma

grande ameaça à saúde pública (NASCIMENTO; SILVA; MADUREIRA, 2013).

Por consequência, há um retrocesso na terapêutica microbiana, uma vez que

novas alternativas de tratamento devem ser desenvolvidas, como por exemplo,

agentes antibacterianos naturais (SENTHIL-RAJAN et al., 2013).

A seguir, serão descritas algumas espécies bacterianas de importância

clínica, as quais desenvolveram mecanismos de resistência ao longo do tempo.

2.5.1 Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis caracteriza-se por ser uma célula Gram

positiva em forma de cocos, pertencente à família micrococaceae. Consiste em

ser um habitante natural da pele humana (GRICE et al., 2009), no entanto, a

espécie é tida como oportunista, no que se refere a causar infecções

nasocomiais subagudas ou crônicas, em órgãos específicos (coração, olhos,

ouvidos, garganta), bem como transmitidas através de cateteres e implantes

ortopédicos (ROGERS; FEY; RUPP, 2009).

34

Uma característica marcante de S. epidermidis, é sua capacidade de

aderir a superfícies e formar biofilmes (RUPP, 2014). Esses, constituem-se de

uma mistura de células bacterianas e nutrientes, aos quais formam uma forte

matriz de polissacarídeo, que serve como proteção das células, além de elevar

a sua viabilidade e persistência (STEWART; FRANKLIN, 2008) (MOORMEIER

et al., 2013).

As bactérias que estão inseridas no biofilme, são modificadas quanto a

sua fisiologia e expressão gênica, favorecendo o desenvolvimento de formas

resistentes a antimicrobianos (YANG et al., 2010). A resistência a meticilina

(MRSE) é a mais comum para cepas de S. epidermidis (ERRECALDE et al.,

2013), decorrente da aquisição de genes (mecA) aos quais são transferidos de

uma espécie a outra. Além disso, tem se tornado crescente o número de

relatórios sobre a susceptibilidade reduzida da bactéria à vancomicina

(QUITOCO et al., 2013).

2.5.2 Staphylococcus aureus

S. aureus, também caracterizado como um coco gram positivo,

pertencente à família micrococaceae, onde é encontrado na microbiota natural

humana (pele e fossas nasais). Contudo, tem sido considerado o microrganismo

que mais causa infecções em ambientes hospitalares, como abcessos cutâneos;

bacteremias; endocardites; pneumonia; entre outros (TRABULSI et al., 2005).

Assim como S. epidermidis, S aureus também possui a capacidade

formadora de biofilmes, principalmente em cateteres endovenosos e próteses

(DAVIS, 2005). As patologias decorrentes de S. aureus podem estar associadas

a três eventos: invasão direta dos tecidos, bacteremia primária e produção de

toxinas (ANDRIOLO, 2005). Onde os mecanismos de patogenicidade diferem

entre as cepas gram positivas, fazendo com que várias características presentes

nessa bactéria não estejam presentes em outras (LUTZ et al., 2003).

Inicialmente, há uma aderência do microrganismo ao epitélio do

hospedeiro, o qual desenvolve estratégias de permanência como a opsonização

do sistema complemento, neutralização fagocitária e inibição da resposta

imunológica celular e humoral. Posteriormente, fatores de virulência são

apresentados para que haja uma maior adesão celular, tanto na obtenção

nutricional como na resposta evasiva imunológica do hospedeiro. Três tipos de

35

classificação remetem a virulência de S. aureus: aderência as células do

hospedeiro ou matriz extracelular através da produção de fibrinogênio,

fibronectina, colágeno; produção de enterotoxinas nos mecanismos de evasão

defensiva do hospedeiro (SEs A-E, G-J, K, L, M, O e P); proteínas do sistema

invasivo (toxinas α, β, δ, γ e δ) na célula do hospedeiro e aderência a superfície

de materiais hospitalares (cateteres e sondas) (OLIVEIRA et al., 2001).

O alto grau infectante de S. aureus não está apenas restrito a esses

fatores, mas também a diversas proteínas que medeiam essa resposta de

virulência. Dentre elas pode-se citar o ácido teicóico, glicanopeptídeo, proteína

A, betalactamases, coagulases, hialuronidases, catalases, lipases, proteases,

esterases, DNAses, toxinas (alfa, beta e gama, leucocidina, esfoliatina, toxina do

choque tóxico, enterotoxinas) (LUTZ et al., 2003). De acordo com o tipo de

proteína ou toxina produzida, a resposta imunológica reflete em manifestações

clínicas e graus de patogenicidade diferenciados. Como por exemplo, a toxina

esfoliativa estafilocócica, que leva a síndrome do choque tóxico e da pele

escaldada, bem como a leucocidina, que pode causar infecções severas de pele,

furunculoses, pneumonia necrosante infanto-juvenil (IWATSUKI et al., 2006).

S. aureus tem desenvolvido mecanismos de resistência aos

antimicrobianos com o passar do tempo que merecem atenção (Figura 11 –

Página 36). Iniciando no final da década de 1930, onde surgiram os primeiros

relatos de espécies resistentes, as quais eram capazes de driblar os

mecanismos farmacológicos de penicilinas, através da produção de enzimas

betalactamases que hidrolisavam o anel beta-lactâmico do fármaco, tornando-o

inativo (MAMISUKA, 2005).

36

Figura 11. Relação entre o surgimento de antibióticos e cepas resistentes de S. aureus nos séculos XX e XXI.

Fonte: (DOS SANTOS et al., 2007).

Em 1959, os índices de resistência frente a esse medicamento já atingiam

80%, se estendendo as ampicilinas e amoxilinas. Tendo em mente a

preocupação de desenvolver fármacos que combatessem as patogenias

provindas desses microrganismos, a meticilina foi criada, no entanto, após uma

década, as primeiras cepas resistentes foram surgindo, sendo denominadas de

MRSA (S. aureus resistente a meticilina). Estas se disseminaram em uma escala

alarmante por hospitais. Pesquisadores citam que a resistência dos

microrganismos a meticilina, é provinda de um gene cromossômico denominado

mecA, que codifica alterações nos receptores dos betalactâmicos, fazendo com

que seja produzida uma proteína ligadora de penicilina (PPB2A) com baixa

afinidade pelo antibiótico (VELÁZQUEZ-MEZA, 2005).

Embora MRSA esteja atribuído a infecções hospitalares, o surgimento da

espécie em patologias relacionadas a comunidade tem sido cada vez mais

relatadas (CO-MRSA) (MORAN et al., 2006). As quais são transmitidas através

de genes mecA na população (FEY et al., 2003), levando a doenças cutâneas;

bacteremias; endocardites; osteomelites e pneumonias, tanto em crianças como

em adultos (DUFOUR et al., 2002). Esses microrganismos apresentam

características que diferem das espécies MRSA, estando relacionadas apenas

com resistência aos beta-lactâmicos, enquanto que a primeira, possui resistência

a variadas drogas (GRAHAM; LIN; LARSON, 2006).

37

Glicolipídios, como vancomicina e teicoplanina, foram os fármacos de

escolha após o surgimento das espécies MRSA, contudo, a vancomicina

causava diversos efeitos adversos nos pacientes como toxicidade e

nefrotoxicidade (MACHADO et al., 2005). Além de que, após alguns anos,

novamente as bactérias desenvolveram seus mecanismos de resistência frente

a esse fármaco (VRSA), que incluíam alterações genéticas adquiridas a partir de

genes de resistência de outras bactérias, bem como inativação e destruição da

droga transmitido através de plasmídeos e transposons (DE LIMA et al., 2005).

Relatos de S. aureus com resistência intermediária à vancomicina (VISA)

são descritos na literatura, sendo estes constituídos de populações mistas

celulares com pouca ou nenhuma resistência ao fármaco e aquelas que

apresentam uma subpopulação resistente (HOWDEN et al., 2006). Estando

associado, geralmente, a infecções persistentes, hospitalizações e tratamentos

prolongados com o antibiótico (HOWDEN et al., 2010).

É imprescindível na prática clínica, que os profissionais da saúde tratem

a patogenicidade desse agente com muita cautela. Já que esta cepa desenvolve

mecanismos de resistência com facilidade, decorrentes, em especial, da

administração inadequada dos antibióticos, onde a saúde pública e a pesquisa

científica do país são essenciais na busca de novos agentes eficazes frente aos

microrganismos resistentes (DOS SANTOS et al., 2007).

2.5.3 Enterococcus faecalis

Enterococcus faecalis, classificada como uma bactéria gram positiva,

apresenta-se morfologicamente como cocos em pares ou em pequenas fileiras,

formando cerca de 105-108 unidades formadoras de colônias (UFC) por grama

de fezes. Faz parte da microbiota intestinal humana, trato genital feminino e

cavidade oral (KOCH et al., 2004), a qual possui a capacidade de sobreviver em

ambientes com ou sem a presença de oxigênio (anaeróbios facultativos)

(RÔÇAS; SIQUEIRA; SANTOS, 2004).

E. faecalis também possui a habilidade catalizadora de diversas fontes

energéticas como carboidratos, glicerol, lactato, malato, citrato, arginina,

agmatina, dentre outros. Bem como suporta ambientes com elevada alcalinidade

(9,6) e salinidade; presença de sais biliares; detergentes; metais pesados;

etanol; azida e dessecação (GILMORE, 2002). Com crescimento variando dos

38

10-45°C, podendo sobreviver até 60°C por 30 minutos (TENDOLKAR;

BAGHDAYAN; SHANKAR, 2003).

Desde a década de 1970, existe uma atenção voltada as cepas

enterocóccicas devido a sua patogenicidade em casos de bacteremias,

endocardites, meningites bacterianas e infecções do trato urinário (VAN TYNE;

GILMORE, 2014). Onde nos EUA, cerca de 80% das infecções nasocomiais

decorrem da presença de E. faecalis (FRANZ et al., 2003). Pesquisas

demonstram, que esse microrganismo consegue invadir o canal radicular do

dente, chegando até o sistema linfático de ratos, considerando esta uma via de

infecção envolvida na patogênese de doenças oportunistas (DE MELO MALTOS

et al., 2003).

Outra via de infecção é quando há uma associação da bacteremia com a

formação de biofilmes provindos de materiais médicos, aos quais, possuem um

elevado grau de resistência frente a fármacos antibióticos (PAGANELLI;

WILLEMS; LEAVIS, 2012), em especial, à vancomicina (VAN TYNE; GILMORE,

2014). Essa resistência, decorre da transmissão horizontal de genes de

virulência entre as cepas (PAGANELLI; WILLEMS; LEAVIS, 2012). Um exemplo,

é quando há transferência de genes resistentes à vancomicina nas espécies de

E. faecalis para S. aureus (PALMER; KOS; GILMORE, 2010).

2.5.4 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa, pertencente à família Pseudomonadaceae, é

caracterizado como um bacilo gram negativo, responsável por causar diversos

surtos de infecções oportunistas (SADER et al., 2001). Decorrente da sua ampla

disseminação, alta letalidade (GALES et al., 2004) e resistência a variados

fármacos antimicrobianos (LIVERMORE, 2002).

O que ocorre em geral, no surgimento da resistência, é um intercâmbio de

material genético natural intra ou interespécies, havendo uma diminuição da

sensibilidade aos antibióticos anti-Pseudomonas (LANDMAN et al., 2007). Até

mesmo em classes como carbapenêmicos e cefalosporinas, aos quais eram

usados como último recurso no tratamento de infecções causadas por esse

agente (RUPP; FEY, 2003).

Com relação a estas classes, a produção de enzimas (betalactamases e

metallo-betalactamases) por parte do microrganismo, tem sido relatada como

39

fator primordial para a inativação dos fármacos (LINCOPAN et al., 2005). Como

por exemplo, o imipenem, um antibiótico bastante utilizado na prática clínica

frente P. aeruginosa, que tinha sua forma e função alterados devido à presença

dessas enzimas (ZAVASCKI et al., 2006). Estas, por sua vez, desenvolveram

mecanismos de modificação estrutural no antimicrobiano para que a resistência

ocorresse, como perda de porinas; presença de proteínas de ligação as

penicilinas com baixa afinidade por carbapenêmicos; superexpressão de

bombas de efluxo e hidrólise enzimática (NEVES et al., 2011).

Assim como nas outras espécies já citadas, P. aeruginosa também possui

capacidade formadora de biofilmes (FERRIS, 2014), o que dificulta ainda mais o

tratamento da patogenia decorrente, por haver uma diminuição da resposta

imune do hospedeiro e aumento de resistência aos medicamentos (SHAH et al.,

2006). Variados são os sintomas que o paciente apresenta quando há infecção,

dentre eles, destacam-se bacteremias em pessoas com queimaduras graves;

queratite ulcerativa aguda naqueles que fazem o uso inadequado de lentes de

contato; bem como, infecção pulmonar crônica nos enfermos com fibrose cística

(NEBES et al., 2016).

Esta última enfermidade merece atenção, já que, por se tratar de uma

doença crônica, as bactérias sofrem alterações fenotípicas, sendo

caracterizadas por conter fenótipo mucoide (MUC) proveniente do alginato

polissacarídeo extracelular (RYALL et al., 2014). Isso leva a uma maior

dificuldade de inibição da resposta bacteriana, por consequente, há uma piora

no estado clínico dos pacientes (SILVA FILHO et al., 2013).

2.5.5 Escherichia coli

Uma outra família que merece destaque é Enterobacteriaceae, a qual,

abrange espécies gram negativas de grande importância clínica que serão

citadas a seguir. Iniciando por E. coli, considerada a maior causadora de

doenças entéricas, tanto em humanos como em animais (GODOY, 2001).

O processo de patogenicidade dessa bactéria inclui variados fatores de

virulência (lipopolissacarídeos de membrana-LPS; presença de cito e

exotoxinas; propriedades de resistência ao meio que contenha ferro como os

sideróforos; multirresistência aos antimicrobianos e a colonização celular

facilitada por fímbrias, adesinas e pili) (RUSSO; JOHNSON, 2000). Que

40

juntamente com as proteínas (termolábeis e termossensíveis) excretadas no

trato gastrointestinal (TGI), dificultam a síntese proteica, com consequente

quadro diarreico no paciente acometido (FAIRBROTHER; GYLES, 2006).

E. coli também exibe uma maior habilidade de resistência frente ao

sistema imunológico do hospedeiro, proporcionado pelas proteínas produzidas

através do microrganismo, que conseguem driblar o sistema complemento e

fagocitário (MONROY et al., 2005). Resistência esta que se intensifica quando

a população faz o uso indiscriminado de fármacos antimicrobianos, bem como

quando a infecção se dá por conta de patógenos oriundos de biofilmes

(LAVERTY; GORMAN; GILMORE, 2014).

Perdas de sensibilidade por parte de E. coli já foram relatadas na

literatura, como frente aos aminoglicosídeos (ROGERS; SIDJABAT;

PATERSON, 2010), carbapenêmicos (MORRIS et al., 2012) e beta lactâmicos

(VALENZA et al., 2014). Todavia, é essencial que se haja o reconhecimento da

linhagem e seu perfil de resistência ao medicamento, uma vez que isso leva a

uma redução do amplo espectro de ação e aumento da sensibilidade (BACCARO

et al., 2002).

2.5.6 Klebsiella pneumoniae

Também pertencente à família Enterobacteriaceae, K. pneumoniae é tida

como um importante agente patogênico de infecções hospitalares. Sendo estas,

caracterizadas por elevados níveis de morbi/mortalidade, decorrentes da ampla

resistência que a espécie possui frente a variadas classes de fármacos

antimicrobianos (CODO; SARAIVA; MEDEIROS, 2016).

KPC’s, são assim chamadas as linhagens que possuem a enzima

carbapenamase, a qual agrega resistência a bactéria por hidrolisar o anel β-

lactâmico de alguns antibióticos, como penicilinas; cefalosporinas;

monobactamas; carbapenêmicos e inibidores da β-lactamase (PAPP-WALLACE

et al., 2010). Além de ser encontrada em K. pneumoniae, estudos revelam que

a enzima também pode estar presente em outras espécies, que incluem

Escherichia coli; Enterobacter sp.; Salmonela entérica; Proteus mirabilis;

Citrobacter freundii; Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii

(ROBLEDO et al., 2010).

41

Nos últimos anos, tem-se observado uma elevada disseminação desses

microrganismos resistentes nos ambientes hospitalares. Como por exemplo, um

estudo realizado em um hospital no Rio Grande do Sul, ao qual evidenciou

resistência de até 95% aos carbapenêmicos, das amostras analisadas de K.

pneumoniae coletadas de pacientes (PEREZ; RODRIGUES; DIAS, 2016). Onde

tal resistência, pode ser transmitida de um paciente a outro, elevando ainda mais

os casos de infeções (PATERSON; BONOMO, 2005).

Já que se trata de uma espécie predominante de ambientes hospitalares,

a presença de biofilmes formados está intimamente relacionada aos

equipamentos desses locais (HALL-STOODLEY; COSTERTON; STOODLEY,

2004). Contribuindo ainda mais, na dispersão das bactérias em sistemas

biológicos humanos (respiratório, intestinal, urinário) e elevando-se o nível de

resistência destas (FUX et al., 2005).

2.5.7 Serratia marcescens

Serratia marcescens, outra espécie pertencente à família

Enterobacteriaceae, fora relatada pela primeira vez em 1819, onde até então,

acreditava-se que a bactéria era tida como não patogênica (MAHLEN, 2011).

Após a segunda metade do século XX, infecções decorrentes do microrganismo

provaram seu potencial patogênico, as quais persistem até os dias atuais, como

meningites; septicemia; pneumonia; infecções do trato urinário; dentre outras

(VOELZ et al., 2010).

Em geral, os fatores que facilitam a aquisição de enfermidades

provenientes de Serratia são o histórico de alcoolismo; trauma; doença vascular

periférica; lúpus eritematoso sistêmico; imunossupressão; diabete mellitus;

artrite; queimaduras e insuficiência renal (VANO‐GALVAN et al., 2014). Além do

uso inadequado de fármacos antimicrobianos, que induz ao surgimento de

espécies resistentes.

Dentre esses fármacos, destacam-se os betalactâmicos e a colistina, aos

quais, perderam a sensibilidade frente ao microrganismo, decorrente da

presença de determinantes de resistência cromossômica mediada por

plasmídeos (MAHLEN, 2011). Estes, podem facilmente espalhar-se de uma

espécie a outra, elevando-se ainda mais o grau de resistência microbiana (MATA

et al., 2010).

42

Uma outra característica importante que está associada a patogênese de

S. marcescens, é sua capacidade formadora de biofilmes, através da aderência

bacteriana em dispositivos médicos e superfícies epiteliais do hospedeiro (HALL-

STOODLEY; COSTERTON; STOODLEY, 2004). Através de um sistema de

comunicação célula-célula denominado Quorom sensing (QS), os

microrganismos presentes no biofilme, regulam os fatores de virulência,

proporcionando assim, uma estratégia eficaz na inibição do mecanismo

farmacológico do medicamento (BAKKIYARAJ; SIVASANKAR; PANDIAN,

2012).

2.6 ATIVIDADE SINÉRGICA

A utilização de fármacos no combate a infecções microbianas vem sendo

realizada por muito tempo através da população (SILVEIRA et al., 2006). No

entanto, a prática de administração do medicamento de forma inadequada e

indiscriminada, tem elevado o índice de resistência por parte dos

microrganismos, dificultando o tratamento das enfermidades

(GEORGOPAPADAKOU, 2002); (NOSTRO et al., 2004). Com isso, houve um

aumento considerável nos casos de morbidade e mortalidade, bem como nos

custos do tratamento realizado por instituições de saúde (COUTINHO;

CORDEIRO; BRINGEL, 2000) (DANCER, 2001).

Inúmeros mecanismos de resistência desenvolvem-se na célula

microbiana, a fim de impedir a ação do efeito farmacológico sobre ela. Dentre

tais mecanismos pode-se citar: redução da concentração do antibiótico no

interior celular, devido a diminuição de absorção e aumento da atividade de

bombas de efluxo (PIDDOCK, 2006); modificação covalente da molécula do

fármaco, bem como, aumento da produção de inibidores competitivos (BROWN-

ELLIOTT; NASH; WALLACE, 2012); (PELGRIFT; FRIEDMAN, 2013).

Uma alternativa eficaz para driblar tal resistência, seria a utilização de

produtos naturais, uma vez que estes, são ricos em misturas complexas de

fitocompostos (COUTINHO et al., 2015). Tanto na forma isolada, quanto na

forma combinada ao fármaco de escolha, resultando dessa forma, num efeito

modulador/modificador frente a resposta microbiana (COUTINHO et al., 2010b).

Quando há um aumento da resposta farmacológica após a combinação produto

43

natural-fármaco, diz-se que ocorreu um sinergismo. Contrário a este, seria um

antagonismo (CANTON; ONOFRE, 2010).

O efeito modulador sinérgico que essa interação resulta na célula

bacteriana, é a inversão da resistência, caracterizada pela eliminação de fatores

de virulência como plasmídeos; inibição de bombas de efluxo, e aumento da

permeabilidade da membrana plasmática microbiana, facilitando assim, a

absorção do antimicrobiano no interior do patógeno (KARLA MONIK et al., 2015);

(NOGUEIRA et al., 2014).

44

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a atividade biológica in vitro do óleo essencial obtido das folhas

de Leonotis nepetifolia (OELN).

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar a atividade antimicrobiana do OELN pelo método de

Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida

Mínima (CBM);

• Avaliar a capacidade formadora de biofilmes das espécies

bacterianas testadas in vitro;

• Determinar a atividade antibiofilme do OELN frente a espécies

bacterianas;

• Avaliar a atividade sinérgica do OELN com fármacos

antimicrobianos.

45

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ÓLEO ESSENCIAL DE Leonotis nepetifolia

O óleo essencial de L. nepetifolia foi fornecido pela equipe do Núcleo de

Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais da Universidade Federal do Vale do

São Francisco (NEPLAME/UNIVASF), através da pesquisadora Ana Paula de

Oliveira.

As folhas (Figura 12) foram coletadas no município de Petrolina,

Pernambuco, Brasil, sendo identificadas e preparada uma exsicata, a qual foi

depositada no herbário do Vale do São Francisco (HVASF), obtendo o respectivo

número de identificação 4454.

Figura 12. Exsicata da espécie de Leonotis nepetifolia depositada no Herbário da Universidade Federal do Vale do São Francisco.

Fonte: (OLIVEIRA, 2014).

46

Após a identificação, as folhas de L. nepetifolia foram pesadas, trituradas

e colocadas em aparelho Clevenger com éter de petróleo como facilitador de

arraste, sendo submetidas ao processo de hidrodestilação por 2h. Em seguida,

o óleo essencial obtido foi refrigerado e separado da fase aquosa, onde a

porcentagem de extração foi calculada de acordo com a massa do óleo essencial

obtida sobre a massa das folhas frescas coletadas (Figura 13). A análise

química do OELN foi realizada em um cromatógrafo de gás Shimadzu QP-2010,

acoplado a um espectrômetro de massas (GC-MS) (OLIVEIRA et al., 2016).

Figura 13. Aparelho de Hidrodestilação Clevenger.


47

4.2 MICRORGANISMOS

As cepas padrões e isolados clínicos bacterianos (Tabela 3) utilizados nos

ensaios, foram obtidos na bacterioteca do Laboratório de Imunologia e

Microbiologia da UNIVASF em Petrolina-PE, Brasil. Sendo cultivados no

intervalo de 15/30 dias para a manutenção da viabilidade das colônias.

Tabela 3. Linhagens padrões e isolados clínicos bacterianos.

Linhagens Padrões Isolados Clínicos

Enterococcus faecalis ATCC19433 S. aureus I

Escherichia coli ATCC S. aureus II

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 S. aureus III

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 S. aureus IV

Serratia marcescens ATCC 13880 S. aureus V

Staphylococcus aureus ATCC 25923 S. aureus 7669

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 S. aureus 7788

S. aureus 8107

S. aureus 8521

S. aureus 8536

S. aureus 9606

*ATCC: American Type Culture Collection. Fonte: Autoria própria.

4.3 MEIOS DE CULTURA

Foram utilizados nos ensaios biológicos os seguintes meios de cultura

(Tabela 4). A preparação foi realizada de acordo com as instruções do

fabricante, sendo submetidos a esterilização em autoclave de vapor quente, por

15 minutos a 21°C.

Tabela 4. Meios de cultura utilizados nos ensaios e suas aplicações.

Meio de Cultura Estado Físico Aplicação

Brain heart infusion (BHI) Ágar Cultivo bacteriano

Brain heart infusion (BHI) Caldo Inóculo baceriano

Mueller hinton (MH) Ágar CBM, Checkerboard

Mueller hinton (MH) Caldo Inóculo bacteriano, MIC, Checkerboard

Tryptic soy (TSB) Caldo Inóculo bacteriano, biofilme

CIM: Concentração inibitória mínima; CBM: Concentração bactericida mínima. Fonte: Autoria própria.

48

4.4 ANTIBIÓTICOS

A escolha dos antimicrobianos foi realizada através do antibiograma,

empregando-se a metodologia de disco difusão (NCCLS, 2003). As linhagens

bacterianas utilizadas foram as gram negativas as quais apresentaram inibição

frente a CIM do OELN. Os antibióticos empregados no antibiograma foram:

ampicilina, cefazolina, ciprofloxacina, gentamicina, imipenem, amoxilina e

cefotaxima. Inicialmente, foi preparada uma suspensão bacteriana, a qual foi

inoculada em ágar MH, e acrescentado a este, os discos de antibióticos. As

placas de petri foram incubadas em aerobiose (37°C/24h).

Após esse período, foi analisado o padrão de crescimento ou inibição ao

redor de cada disco, sendo então medido o tamanho de cada halo. Os resultados

foram comparados aos padrões do NCCLS (2003). Não houve a necessidade de

realização do referido teste para S. aureus, tendo em vista a oxacilina como

fármaco de escolha previamente definido.

4.5 PREPARO E PADRONIZAÇÃO DOS INÓCULOS BACTERIANOS

As linhagens microbianas foram cultivadas em ágar BHI, onde

posteriormente, foram incubadas, em aerobiose, a 37°C por 24h, numa estufa

bacteriana. Após, foi preparada uma padronização para a realização do inóculo,

que consistiu em retirar uma alçada da amostra e colocá-la em solução salina, a

fim de que fosse comparada a turvação obtida com a escala de Mcfarland 0,5

(1x108 UFC/mL), que correspondeu a uma densidade óptica (DO) de 0,036,

obtida a partir da leitura em espectrofotômetro, com comprimento de onda de

546nm. 100 µL da solução foi transferida para o caldo correspondente ao teste

realizado.

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO OELN

4.6.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Para a determinação da CIM e CBM, foi utilizada a metodologia descrita

por CLSI (2014), seguindo as orientações do protocolo M07-A9. Foi preparada

uma solução estoque com o OELN, pesando-se 0,25 mg do produto natural,

49

sendo este diluído em 10 mL de etanol, obtendo-se uma concentração inicial de

25000 µg/mL.

Numa microplaca estéril contendo 96 poços (Figura 14), na posição

horizontal, 200 µL dessa solução foi diluída em 200 µL de caldo MH, seguindo

uma diluição de 1:2 (12500; 6250; 3125; 1562,5; 781,3; 390,6; 195,3 e 97,6

µg/mL). Ao término, 200 µL finais foram descartados e 20 µL do inóculo

bacteriano foi adicionado a cada poço. Os testes foram realizados em triplicata,

sendo reservada uma coluna contendo apenas o meio de cultura (controle

negativo), outra coluna contendo o meio de cultura com o inóculo (controle

positivo) e outra contendo o diluente com o inóculo (controle do diluente).

Figura 14. Placa de microdiluição estéril com 96 poços.

Fonte: Autoria Própria.

As placas foram incubadas em estufa bacteriana por 24h a 37°C, após

esse período, foi adicionado 20 µL do reagente Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio

(CTT). A mudança para a coloração avermelhada foi indicativa de oxidação

bacteriana, ou seja, houve o crescimento da bactéria no poço. A CIM foi avaliada

como a menor concentração que o OELN conseguiu inibir o crescimento

microbiano, sendo esta comparada com as colunas dos controles.

50

4.6.2 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

Para a CBM, foi utilizado um replicador, o qual foi inserido no conteúdo da

microplaca, sendo este carimbado em uma placa de petri contendo o ágar MH.

A placa foi incubada em estufa bacteriana por 24h a 37°C, onde posteriormente,

foi realizada a leitura da menor concentração de OELN que conseguiu causar a

morte do inóculo, através do crescimento de colônias na posição do poço

carimbado.

4.6.3 Controle da CIM e CBM

Como controle positivo do processo, foi realizada a CIM e CBM dos

antibióticos de escolha. Para as linhagens gram positivas, aplicou-se oxacilina,

e para gram negativas foi ampicilina, ambas diluídas em DMSO com água

destilada, obtendo-se uma solução estoque com concentração inicial de 2000

µg/mL. Tal concentração foi diluída na microplaca, seguindo uma diluição de 1:2

(1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,81 µg/mL) dos antibióticos.


Para determinação da atividade sinérgica, utilizou-se a metodologia

Checkerboard (“tabuleiro de xadrez”), a fim de potencializar a resposta

antimicrobiana, quando combinados OELN com fármaco sintético.

Inicialmente, a suspensão bacteriana foi padronizada, a partir de uma

cultura com 24 h de incubação em meio MH, com adição de PBS (Tampão

fosfato-salino) pH 7 estéril, até atingir a turvação equivalente a escala 0,5 de

McFarland (1x108 UFC/mL) em 625nm. Foram utilizadas placas estéreis de

microdiluição, onde a estas foram acrescentados, 100 µL de caldo MH em todos

os poços, após, nos poços de A6-F6, foi adicionado 100 µL do antimicrobiano,

na concentração equivalente a 8X o valor da CIM. Sendo esta, diluída em série

na horizontal, transferindo 100 µL até os poços de A1-F1.

Posteriormente, nos poços de A1-A6, foram acrescentados 100 µL de

solução do OELN, com concentração equivalente a 4X o valor da CIM. Também

foi realizada diluição seriada na vertical, com 100 µL transferidos até os poços

F1-F6. Fora adicionado a cada poço, 100 µL de solução, contendo o inóculo

51

bacteriano. As placas foram incubadas em aerobiose (37°C/24 h). Após esse

período, com auxílio de um replicador, os poços foram carimbados em ágar MH

para posterior leitura de crescimento das colônias. Como controle positivo, foi

utilizado os poços H1-H3, contendo meio de cultura com inóculo. Já para o

controle negativo, os poços H4-H5, continham apenas o meio de cultura.

Para interpretação da metodologia do checkerboard, selecionou-se o

modelo do Índice Inibitório Fracionado (IFI), onde:

∑IFI = FICA + FICB = CIMAB/CIMA + CIMBA/CIMB

Considerando CIMA e CIMB as CIM’s dos produtos ativos A (OELN) e B

(Antibiótico), quando agem isoladamente frente aos patógenos. Já CIMAB e

CIMBA, são as CIM’s dos produtos A e B, ao agirem em combinação. Diante

disso, a atividade sinérgica poderá ser considerada, de acordo com os critérios

de classificação do IFI, segundo Lee, Jang e Cha (2011) (Tabela 5).

Tabela 5. Critérios de classificação do IFI para a metodologia de Checkerboard

∑IFI Ação

≤ 0,5 Sinérgica

0,5 < IFI < 1 Aditiva

1 < IFI < 2 Indiferente

IFI > 2 Antagônica

IFI: Índice inibitório fracionado. Fonte: (LEE; JANG; CHA, 2011).

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DO OELN

4.8.1 Avaliação da Capacidade Formadora do Biofilme

Para avaliar se isolados bacterianos formavam biofilme, seguiu-se a

metodologia em microplacas estéreis (96 poços), de Merino e colaboradores

(2009), com modificações. As amostras bacterianas foram incubadas

(aerobiose), em 3 mL de TSB, acrescidos de 0,25% de glicose para S. aureus,

numa estufa, a 37ºC por 24 h. Posteriormente, 195 μL de caldo TSB foram

adicionados nas microplacas de 96 poços juntamente com 5 μL da solução

contendo o inóculo bacteriano. Em seguida, a microplaca foi novamente

52

incubada a 37ºC por 24 h. Após este período, esta foi lavada com 200 μL de

água destilada estéril três vezes.

Os poços foram corados com 100 μL de violeta de genciana, 0,25% por 5

minutos. Todos os poços foram novamente lavados três vezes com 200 μL de

água destilada. Por fim, utilizou-se 200 μL de álcool-acetona (80:20), para fazer

a análise da absorbância em leitor de microplaca modelo EXPERT PLUS-UV,

mensurado em 620 nm. Como controle negativo foi utilizado o meio TSB, sendo

também utilizado como controle do processo a fim de se avaliar uma provável

contaminação. Os ensaios foram feitos em triplicata e os resultados anotados

em uma planilha para posterior análise.

De acordo com os valores de Densidade Ótica (DO) obtidos na leitura, as

linhagens foram classificadas, quanto a sua produção de biofilme, como disposto

na Tabela 6.

Tabela 6. Classificação das linhagens bacterianas quanto a sua produção de biofilme.

Classificação Critério

Negativo DOA ˂ DOCN

Fraco DOCN ˂ DOA ˂ 2x DOCN

Moderado 2x DOCN ˂ DOA ˂ 4x DOCN

Forte DOA > 4x DOCN

DOA- Densidade ótica da amostra teste; DOCN- Densida ótica do controle negativo Fonte: (MERINO et al., 2009).

4.8.2 Avaliação da Atividade Antibiofilme do OELN

O protocolo de interferência com a formação do Biofilme, baseou-se na

metodologia de Nostro e colaboradores (2007) com modificações. Inicialmente,

os inóculos bacterianos foram cultivados em tubos contendo 3 mL de TSB

0,25%, por 24 h a 37 °C. Após este período, 100 μL deste cultivo foram

acrescidos em uma microplaca de 96 poços, juntamente com 100 μL da solução

do OELN contendo o equivalente à metade do valor da CBM observada na

microdiluição em placa. Após 24 h de incubação a 37 °C, as microplacas foram

submetidas a lavagem com 200 μL de água destilada três vezes. Em seguida,

os poços foram corados com 100 μL de violeta de genciana 0,25% por 5 minutos.

Todos os poços foram novamente lavados três vezes com 200 μL de água

destilada. Por fim, utilizou-se 200 μL de álcool-acetona (80:20) para realizar a

53

análise da absorbância em leitor de microplaca modelo EXPERT PLUS-UV,

sendo mensurado a 620 nm. A interferência na formação do biofilme foi feita com

base nos registros de quantificação do biofilme (Tabela 6 – Página 52), antes e

após a adição da substância teste.

4.8.3 Interferência do OELN na Formação do Biofilme Consolidado

Para o biofilme consolidado, 100 μL do inóculo bacteriano foram

incubados em microplacas por 24h a 37ºC, sendo feita uma primeira leitura a 24

h, após a lavagem com 200 μL de água destilada estéril três vezes, a fim de

retirar a população de células não aderidas. Em seguida, 200 μL da solução

contendo a substância isolada, equivalente à metade do valor de CBM

observado na microdiluição em placa, foi acrescida e posteriormente incubada

por 24 h, sendo, então, feita a leitura à 48 h.

Após o registro das DO’s, foi realizada a média das triplicatas e de posse

desse valor, dividiu-se a DO de 24h pela de 48h, sendo o resultado multiplicado

por 100 para verificação da porcentagem de interferência com o biofilme

consolidado. Como controle negativo foi utilizada o meio TSB, sendo também

utilizado como controle do processo a fim de se avaliar uma provável

contaminação. Os ensaios foram realizados em triplicata, tendo os resultados

anotados em uma planilha para posterior análise.

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas pertinentes aos testes do biofilme, foram

realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 6.0. Com relação a

quantificação do biofilme, os dados foram plotados, sendo submetidos ao teste

One-way ANOVA (não paramétrico), seguido por pós-teste Dunn’s. Já para a

análise da interferência do OELN na formação do biofilme e consolidado, foi

aplicado o teste Two-way ANOVA (paramétrico), seguido por pós-teste

Bonferroni. As médias foram ditas com diferenças estatísticas, utilizando o

intervalo de confiança de 95%, com valor de p < 0,05.

54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO OELN

5.1.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida

Mínima (CBM) do OELN

Os resultados obtidos para análise bacteriostática e bactericida mínima

do OELN, expõe que suas propriedades antibacterianas, foram ativas contra

cepas gram positivas e gram negativa, como demonstrado nas Tabelas 7 e 8.

Para as demais cepas e isolados, não houve atividade antimicrobiana.

Tabela 7. Valores da CIM e CBM frente a linhagens padrões bacterianas para o OELN.

Identificação da linhagem CIM (µg/mL) CBM (µg/mL)

Escherichia coli ATCC 1562,5 6250

Serratia marcescens ATCC 13880

3125 6250

Staphylococcus aureus ATCC 25923

3125 6250

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

1562,5 6250


Tabela 8. Valores da CIM e CBM frente a isolados cínicos de S. aureus para o OELN.

Identificação do Isolado CIM (µg/mL) CBM (µg/mL)

II 781,25 6250

III 1562,25 3125

7669 3125 6250


Entretanto, por se tratar de um produto natural, Aligiannis e Colaboradores

(2001), sugerem uma classificação para atividade antimicrobiana de óleos

essenciais (Tabela 9 – Página 55). Onde, a partir dos critérios estabelecidos, o

OELN apresentou moderada atividade antimicrobiana frente o isolado II de S.

aureus, bem como, fraca atividade frente as demais linhagens.

55

Tabela 9. Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais.

Concentração Inibitória Mínima de Óleos Essenciais

Resultado

Até 500 µg/mL Forte atividade antimicrobiana

Entre 500 e 1500 µg/mL Moderada atividade antimicrobiana

Acima de 1500 µg/mL Fraca atividade antimicrobiana Fonte: (ALIGIANNIS et al., 2001).

Demais estudos antibacterianos realizados com OELN, por disco difusão,

também descrevem efeito bacteriostático do mesmo, quando testado frente a

microrganismos como S. aureus e E. coli (GOPAL; VASANTH; VASUDEVAN,

1994). Contudo, ao avaliar a mesma atividade para E. coli, Kiplimo (2007)

observou resistência bacteriana frente a ação do OELN. Vale ressaltar, que a

diferença entre a constituição química de óleos essenciais, pertencentes a

mesma espécie, pode ser um dos fatores que venham a causar discrepância dos

resultados apresentados (DE MORAIS, 2009b). Tendo em vista que o OELN no

presente estudo, teve por composto majoritário Octenol (OLIVEIRA et al., 2014),

já nos testes de Kiplimo (2007), foi Germacreno D.

Além de óleo essencial, extratos de L. nepetifolia, tem demonstrado

atividade antimicrobiana relatada na literatura. É o que Prakash (2016)

apresenta, ao testar o extrato acetato de etila, proveniente do caule e das folhas,

frente espécies de K. pneumoniae, Bacillus subtilis, P. aeruginosa, E. coli e S.

aureus. Oliveira e Colaboradores (2015), também citam haver bom efeito

antibacteriano, ao testar a susceptibilidade de B. subtilis, E. faecalis e S. flexneri,

ao extrato hidroetanólico. Demais extratos, como metanólico (MELÉNDEZ;

CAPRILES, 2006) (SOBOLEWSKA et al., 2012) e etanólico (COS et al., 2002),

são citados por não apresentar tal atividade.

56

5.1.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Bactericida

Mínima (CBM) dos Antibióticos

As Tabelas 10 e 11, demonstram os resultados referentes a CIM e CBM

dos fármacos de escolha.

Tabela 10. Valores da CIM e CBM de oxacilina para cepas padrões e isolados clínicos gram positivos.

Microrganismo CIM (µg/mL) CBM (µg/mL)

S. aureus ATCC 25923 1,95 7,81

S. epidermidis ATCC 12228 1,95 7,81

S. aureus II 15,62 62,5 S. aureus III 7,81 7,81

S. aureus 7669 7,81 7,81 Fonte: Autoria própria.

Tabela 11. Valores da CIM e CBM de ampicilina para cepas padrões gram negativas.

Microrganismo CIM (µg/mL) CBM (µg/mL)

E. coli ATCC 7,81 15,62

S. marcescens ATCC 13880 7,81 15,62


Tanto a CIM como a CBM dos antibióticos oxacilina e ampicilina,

apresentaram redução quando comparados ao OELN. Entretanto, para

caracterizar sensibilidade por parte da cepa ao antimicrobiano, a CIM da

oxacilina deverá ser ≤ 2 µg/mL e da ampicilina ≤ 8 µg/mL (CLSI, 2017). Sendo

assim, os isolados clínicos de S. aureus, foram confirmados quanto a perca de

sensibilidade ao antimicrobiano (oxacilina), ou seja, resistentes.

A resistência de S. aureus frente a oxacilina (ORSA) persiste desde a

década de 60, quando o uso abusivo desses antibióticos era realizado para o

tratamento de patogenias decorrentes da bactéria (DE SOUSA et al., 2011).

Inicialmente, a presença de ORSA era limitada apenas em ambientes

hospitalares, contudo, observou-se um aumento considerável do espectro de

ação dos microrganismos em comunidades (CA-ORSA) (FERREIRA; ÁVILA,

2001).

57

Essa resistência constitui-se de um fator preocupante, tendo em vista o

grande potencial patogênico que a cepa oferece a população para o

desenvolvimento de infecções (CAVALCANTI et al., 2006). É nesse cenário, que

se faz necessária a busca por novos produtos e metodologias antimicrobianas,

que visem, além da eliminação do patógeno, uma toxicidade seletiva voltada

para este, amenizando assim, possíveis efeitos colaterais aos pacientes

(BROOKS et al., 2012).


Os resultados referentes a avaliação da atividade sinérgica do OELN com

os antibióticos oxacilina e ampicilina, frente cepas padrões e isolados clínicos,

estão dispostos nas Tabelas 12, 13 e 14.

Tabela 12. Determinação da atividade sinérgica do OELN com oxacilina frente cepas padrões gram positivas.

Produto S. aureus ATCC 25923 S. epidermidis ATCC 12228

CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO

Sozinho OELN 3125 1562,5

OXA 1,95 1,95

Combinado OELN

+ OXA

97,6 /

0,061

0,0625 Sinergismo 1562,5 /

0,061

1,031 Indiferente

CIM: Concentração inibitória mínima; ∑IFI: Índice inibitório fracionado; OXA: Oxacilina; OELN:

Óleo essencial de Leonotis nepetifolia. Fonte: Autoria própria.

Na Tabela 12, é possível observar que quando avaliada a interação do

OELN com oxacilina frente S. aureus ATCC 25923, houve sinergismo

(∑IFI=0,0625), em decorrência da redução de CIM do óleo essencial (3125 para

97,6 µg/mL) e do antibiótico (1,95 para 0,061 µg/mL).

Tabela 13. Determinação da atividade sinérgica do OELN com oxacilina frente


CIM: Concentração inibitória mínima; ∑IFI: Índice inibitório fracionado; OXA: Oxacilina; OELN:


Produto S. aureus II S. aureus III

CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO

Sozinho OELN 781,25 1562,5

OXA 15,62 7,81

Combinado OELN+OXA 24,4 /

0,488

0,0624 Sinergismo 48,8 /

0,244

0,0624 Sinergismo

58

Sinergismo também foi verificado, na associação de ambos produtos

testados, frente isolados clínicos de S. aureus II (∑IFI=0,0624) e III (∑IFI=0,0624)

(Tabela 13 – Página 57). Onde a CIM do OELN e oxacilina, foram reduzidas no

isolado II (781,25 para 24,4 µg/mL) (15,62 para 0,488 µg/mL) e no isolado III

(1562,5 para 48,8 µg/mL) (7,81 para 0,244 µg/mL), respectivamente.

Lahmar e Colaboradores (2017), ao avaliarem o potencial sinérgico de

óleos essenciais obtidos de diferentes espécies vegetais (Pituranthos

chloranthus, Teucruim ramosissimum e Pistacia lentiscus) com oxacilina frente

isolados clínicos de S. aureus, também obtiveram redução da CIM dos produtos.

Assim como Rondevaldova e Colaboradores (2017), que testaram um terpeno,

isolado do óleo essencial de Nigella sativa (thymoquinone), com oxacilina, onde

de 7 isolados de S. aureus testados, 3 tiveram sua resistência superada pelo

antibiótico, apresentando um IFI que variou de 0.263-0.450.

Tabela 14. Determinação da atividade sinérgica do OELN com ampicilina frente cepas padrões gram negativas.

Produto E. coli ATCC S. marcescens ATCC 13880

CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO CIM

(µg/mL)

∑IFI

INTERAÇÃO

Sozinho OELN 1562,5 3125

AMP 7,81 7,81

Combinado OELN

+ AMP

97,6 /

0,244

0,0937 Sinergismo 3125 /

0,488

1,062 Indiferente

CIM: Concentração inibitória mínima; ∑IFI: Índice inibitório fracionado; AMP: Ampicilina; OELN:


Com relação a E. coli ATCC (Tabela 14), um efeito sinérgico também foi

tido na associação do OELN com ampicilina, havendo redução da CIM do óleo,

de 1562,5 para 97,6 µg/mL, e do antibiótico (7,81 para 0,244 µg/mL), com valor

de ∑IFI=0,0937. Similar a estes resultados, Palaniappan (2010), ao testar a

combinação de 3 compostos terpênicos (timol, carvacrol e cinamaldeído)

isolados de óleos essenciais, com ampicilina, também observou sensibilidade

por parte das cepas de E. coli, ao serem submetidas a ação antimicrobiana

sinérgica do fármaco com os metabólitos.

No presente estudo, é possível observar, que ao combinar OELN com

oxacilina frente S. aureus ATCC 25923, S. aureus II e S aureus III, a CIM do óleo

essencial fica abaixo de 500 µg/mL, valor este, que quando comparado aos

critérios estabelecidos por Aligiannis e Colaboradores (2001) (Tabela 9 – Página

59

55), determinam que o óleo, onde antes era considerado como detentor de fraca

a moderada atividade antimicrobiana, passar a ter forte atividade. O mesmo pode

ser visto, na associação do OELN com ampicilina, frente E. coli ATCC.

Com relação aos fármacos antimicrobianos, isolados clínicos de S. aureus

(II e III), que antes eram classificados como resistentes a ação isolada da

oxacilina, tiveram sua CIM reduzida para < 2 µg/mL, onde em concordância ao

CLSI (2017), esse valor caracteriza sensibilidade por parte do microrganismo.

Redução da CIM de oxacilina, também pôde ser vista para cepas padrões de S.

aureus ATCC 25923, e ampicilina para E. coli ATCC.

Segundo Lobo e Colaboradores (2014), sinergismo é tido como a

potencialização da atividade biológica de dois produtos combinados, os quais,

agem em um determinado patógeno. Razão pela qual, esse tipo de estudo tem

se tornado de grande valia na busca de novas alternativas terapêuticas,

decorrente do fato de que, certas bactérias têm perdido sua sensibilidade frente

a fármacos industriais, sendo assim consideradas resistentes (SERRA VALDÉS,

2017).

Um dos produtos usuais nas metodologias sinérgicas, além de

medicamentos sintéticos, são os óleos essenciais extraídos de plantas

consideradas medicinais. Pois estes, possuem em sua composição, metabólitos

secundários denominados terpenos, que na literatura, são tidos como

importantes agentes antimicrobianos frente variados patógenos (GYAWALI;

IBRAHIM, 2014).

Isoladamente, os terpenos detêm a capacidade de modificação da

membrana celular bacteriana, a qual, tem sua permeabilidade elevada,

favorecendo assim, a perca de componentes intracelulares vitais, déficit no

sistema enzimático, bem como, na respiração celular (CELIKEL; KAVAS, 2008);

(COUTINHO et al., 2010b). Atrelados a um fármaco sintético, a alteração de

membrana facilita a inserção do antibiótico no interior citoplasmático,

potencializando a resposta farmacológica e por fim, causando a morte do

microrganismo (PAULA, 2010).

A ação antimicrobiana conjunta dos produtos (terpenos e antibiótico)

frente aos microrganismos, pode explicar o efeito sinérgico do OELN quando

combinado a oxacilina e ampicilina, frente cepas padrões e isolados clínicos

bacterianos. Uma vez que, a análise de constituição química do presente óleo,

permitiu identificar 31 metabólitos secundários pertencentes a classe dos

60

terpenos (99,51 % do total da amostra). Tendo por majoritários Octenol (42,58

%); (E)-Ocimeno (15,85 %); (Z)-Ocimeno (7,01 %); β-Cariofileno (3,22 %); m-

Xileno (3,05 %); e Germacreno D (2,41 %) (OLIVEIRA, et al., 2016).

Alguns destes compostos químicos, já foram relatados na literatura, por

serem responsáveis pelo efeito antimicrobiano de óleos essenciais pertencentes

a outras espécies vegetais, frente a determinados patógenos (COSTA et al.,

2009) (CARNEIRO et al., 2010) (DE SOUSA et al., 2011) (ABOABA et al., 2015)

(DAS CHAGAS, 2015) (QUEIROZ et al., 2016). Contudo, deve-se considerar,

além dos metabólitos em concentrações elevadas, os que se apresentam em

menores proporções, pois, segundo Hsouna e colaboradores (2011), o potencial

sinérgico de óleos essenciais se faz de forma conjunta entre as substâncias.

Onde os compostos que exibem menores quantidades, exercem efeitos sobre

os compostos com maiores quantidades, aumentando assim, sua atividade

biológica.

Apesar do OELN apresentar sinergismo quando associado aos

antibióticos frente a determinados microrganismos, pode-se também verificar, na

presente pesquisa, indiferença, como quando combinado óleo essencial com

oxacilina, frente a S. epidermidis ATCC 12228 (∑IFI=1,031) (Tabela 12 – Página

57) e óleo com ampicilina frente S. marcescens ATCC 13880 (∑IFI=1,062)

(Tabela 14 – Página 58). Além disso, efeito antagônico foi observado na

combinação do óleo essencial com oxacilina para S. aureus 7669, sendo

visualizado crescimento bacteriano em todos os poços testados.

Possivelmente, essa supressão da atividade antimicrobiana dos produtos

analisados, venha a ser causada pela interação dos compostos químicos

presentes no OELN e oxacilina, através de variados mecanismos químicos;

farmacocinéticos; competitivos; ou até mesmo, bloqueio de um mesmo receptor

(BEHLING et al., 2004) (DOS SANTOS SALES et al., 2017).

No geral, a atividade sinérgica do OELN com os antibióticos oxacilina e

ampicilina demonstrou eficácia, tendo em vista a potencialização do efeito

farmacológico frente cepas gram positivas e negativa (S. aureus ATCC 25923 e

E. coli ATCC), bem como, isolados clínicos gram positivos (S. aureus II e III).

Levando em consideração, a necessidade de evidenciar novas alternativas

terapêuticas usuais, para o tratamento de infecções advindas de microrganismos

resistentes (FERREIRA et al., 2016).

Vale salientar, que esse é o primeiro estudo sinérgico realizado com

61

OELN combinado a antibióticos, frente cepas padrões e isolados clínicos

bacterianos.

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBIOFILME DO OELN

5.3.1 Avaliação da Capacidade Formadora do Biofilme

Nas Tabelas 15 e 16, é possível observar a capacidade formadora de

biofilmes, das cepas padrões e isolados clínicos testados.

Tabela 15. Classificação das cepas padrões bacterianas quanto a análise de formação do biofilme.

Identificação da Cepa Média da DO (620 nm)

Classificação quanto a formação do Biofilme

Enterococcus faecalis ATCC 19433

0,123 ± 0,02 Fraco

Escherichia coli ATCC

0,148 ± 0,006 Moderado

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

0,064 ± 0,002 Fraco

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

0,135 ± 0,03 Fraco


0,325 ± 0,01 Forte


0,367 ± 0,02 Forte

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

0,310 ± 0,01 Forte

DO – Densidade óptica; DO do meio: 0,062. Os dados foram plotados como Média ± e.p.m. (MERINO et al., 2009). Fonte: Autoria própria.

62

Tabela 16. Classificação dos isolados clínicos de S. aureus quanto a análise de formação do biofilme.

Identificação do Isolado

S. aureus

Média da DO (620 nm) Classificação quanto a formação do

Biofilme

I 0,087 ± 0,002 Fraco

II 0,101 ± 0,016 Fraco

III 0,102 ± 0,001 Fraco

IV 0,778 ± 0,025 Forte

V 0,082 ± 0,0006 Fraco

7669 0,248 ± 0,03 Forte

7788 0,105 ± 0,007 Fraco

8107 0,159 ± 0,03 Moderado

8521 0,157 ± 0,02 Moderado

8536 0,133 ± 0,011 Moderado

9606 0,260 ± 0,029 Forte


Dentre as cepas padrões analisadas (Tabela 15 – Página 61), foram

consideradas como fortes produtoras de biofilme, S. marcescens ATCC 13880

(DO 0,325); S. aureus ATCC 25923 (DO 0,367) e S. epidermidis ATCC 12228

(DO 0,310). O mesmo foi tido para 3 isolados clínicos de S. aureus IV (DO

0,778); 7669 (DO 0,248); 9606 (DO 0,260) (Tabela 16).

Apesar de ser considerada uma cepa padrão, S. aureus ATCC 25923,

demonstrou haver forte formação de biofilme, quando comparada a isolados

clínicos que foram considerados como fracos formadores, em especial, S.

aureus II (p < 0,05) e S. aureus III (p < 0,01) (Figura 15 – Página 63). Bem como

frente a cepa padrão de K. pneumoniae (p < 0,05) (Figura 16 – Página 63).

63

Figura 15. Relação entre a produção e a capacidade de formar o biofilme nos isolaos clínicos de S. aureus.

Mé

dia

da

DO

± e

.p.m

.

I I I I II

IV V

7669

7788

8107

8521

8536

9606

AT

CC

25923

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

I s o la d o s C l ín ic o s d e S . a u r e u s

* * *

As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente, *p < 0,05. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fonte: Autoria própria.

Figura 16. Relação entre a produção e a capacidade de formar o biofilme nas cepas padrões bacterianas.

C e p a s P a d r õ e s

Mé

dia

da

DO

± e

.p.m

.

E. fa

e c ali

s A

TC

C 1

9433

E. c o

li A

TC

C

K. pne u

monia

e AT

CC

13883

P. ae ru

gin

osa

AT

CC

27853

S. m

arc

e s ce n

s A

TC

C 1

3880

S. aur e

us

AT

CC

25923

S. e p

ide rm

idis

AT

CC

12228

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

*

As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente, *p < 0,05. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fonte: Autoria própria.

64

Em concordância a este estudo, Fernandes (2017), ao avaliar a

capacidade formadora de biofilmes da mesma cepa padrão (S. aureus ATCC

25923) e alguns isolados em comum (I, 8536, 9606), verificou similar

comportamento das linhagens. Onde a formação de biofilme de S. aureus ATCC

25923, considerada como forte (DO 0,463), sobressaiu-se frente aos isolados

clínicos (p < 0,001). Assim como Stepanovic e Colaboradores (2000), que

também concluíram haver forte formação de biofilme, para cepas de S. aureus

ATCC 25923 e S. epidermidis ATCC 14990. O mesmo pôde ser constatado, no

estudo de Peixoto e Colaboradores (2015).

Os mecanismos de adesão que S. aureus desenvolve na formação de

biofilme, são muito ágeis. Em menos de 3h, já é possível quantificar células

bacterianas aderidas em superfícies (MILLEZI et al., 2012), o que pode ser

intensificado, quando implementado ao meio de cultura, substâncias favoráveis

ao crescimento do microrganismo, como a glicose, empregada na presente

pesquisa. A qual, segundo Lou e Colaboradores (2014), é um importante fator

ambiental associado na formação do biofilme em espécies de Staphylococcus

sp., uma vez que esta permite a regulação de proteínas via expressão gênica.

Vale ressaltar que o biofilme já formado e aderido à superfície, tende a

agregar proteção aos microrganismos que nele compõe. Tornando este, uma

possível fonte de resistência a ação de agentes químicos e físicos, como

sanitizantes e fármacos industriais. Dificultando assim, o processo de prevenção

e tratamento de doenças ocasionadas por patógenos derivados de biofilmes

(PARK et al., 2012).

5.3.2 Avaliação da Atividade Antibiofilme do OELN

Os dados apresentados a seguir, dispõe sobre o grau de interferência do

OELN frente a formação de biofilmes bacterianos. Onde na Figura 17 – Página

65, é possível observar, que quando em contato com o OELN, grande parte das

cepas analisadas, tiveram redução na formação do biofilme, com valores de p

estatisticamente significantes: p < 0,0001 (E. faecalis, S. marcescens, S. aureus

e S. epidermidis); p < 0,001 (E. coli); p < 0,01 (P. aeruginosa). Apenas K.

pneumoniae, não apresentou redução na formação do biofilme.

65

Figura 17. Interferência com a formação do biofilme entre as cepas padrões na presença de OELN.

I n t e r f e r ê n c ia c o m a F o r m a ç ã o d o B io f i lm e

Mé

dia

da

DO

± e

.p.m

.

E. fa

ecalis

AT

CC

19433

E. coli

AT

CC

K. pneum

onia

e A

TC

C 1

3883

P. aeru

gin

osa A

TC

C 2

7853

S. m

arc

escens A

TC

C 1

3880

S. aure

us A

TC

C 2

5923

S. epid

erm

idis

AT

CC

12228

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

C O N T R O L E

O E L N

* * * * * * *

n s

* *

* * * *

* * * *

* * * *

As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente, *p<0,05. ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Fonte: Autoria própria.

Levando em consideração que, cepas as quais eram tidas como fortes

formadoras de biofilme, após o tratamento com OELN, foram classificadas como

fracas (S. aureus e S. epidermidis) e moderadas (S. marcescens). Onde a maior

porcentagem de inibição, se deu frente S. aureus (78,3%) (Tabela 17 – Página

66).

66

Tabela 17. Classificação das cepas padrões bacterianas quanto a sua formação de biofilme na presença do OELN.

Identificação da Linhagem

Média da DO (620

nm)

Porcentagem de Inibição

(%)

Classificação quanto a produção do

Biofilme


0,066 ± 0,001

46,5 Fraco


0,092 ± 0,004

37,3 Fraco

Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853

0,095 ± 0,004

29,7 Fraco


0,128 ± 0,005

60,7 Moderado


0,080 ± 0,002

78,3 Fraco

Staphylococcus epidermidis ATCC

12228

0,093 ± 0,003

70 Fraco


Com relação aos isolados clínicos (Figura 18 – Página 67), o OELN foi

capaz de reduzir a formação do biofilme frente a todas linhagens testadas. Onde

valores de p estatisticamente significantes, são tidos para os isolados: IV, 7669,

8107, 8521, 9606 (p < 0,0001) e 8536 (p < 0,01).

67

Figura 18. Interferência com a formação do biofilme entre as cepas padrões na presença de OELN.

Mé

dia

da

DO

± e

.p.m

.

I I I I II

IV V

7669

7788

8107

8521

8536

9606

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0C O N T R O L E

O E L N

I n t e r f e r ê n c ia c o m a F o r m a ç ã o d o B io f i lm e

n sn s

n s

* * * *

* * * *

n s

* * * ** * * *

* * * *

* *

n s

As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente, *p<0,05. ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Fonte: Autoria própria.

Após a intervenção com OELN, todos os biofilmes foram classificados

como fracos formadores. Sendo o isolado IV, o que apresentou maior

porcentagem de inibição frente a ação do óleo (89,2%) (Tabela 18).

Tabela 18. Classificação dos isolados clínicos de S. aureus, quanto a sua formação de biofilme na presença do OELN.


Média da DO (620 nm)


(%)

Classificação quanto a

produção do Biofilme

I 0,086 ± 0,002 1,1 Fraco

II 0,080 ± 0,001 20 Fraco

III 0,077 ± 0,001 32,4 Fraco

IV 0,084 ± 0,004 89,2 Fraco V 0,073 ± 0,002 10,9 Fraco

7669 0,077 ± 0,003 68,9 Fraco

7788 0,080 ± 0,002 23,8 Fraco

8107 0,081 ± 0,008 49,6 Fraco 8521 0,078 ± 0,001 55,4 Fraco

8536 0,084 ± 0,001 36,8 Fraco

9606 0,082 ± 0,002 68,4 Fraco DO – Densidade óptica; DO do meio: 0,062. Os dados foram plotados como Média ± e.p.m. (MERINO et al., 2009). Fonte: Autoria própria.

A busca por novos agentes antibiofilmes, tem se intensificado ao longo

dos anos, uma vez que microrganismos aderidos a uma matriz polimérica (vida

68

séssil), apresentam maior resistência quando comparados a microrganismos de

vida planctônica (VUOTTO et al., 2014). Os produtos naturais, através de

pesquisas já descritas na literatura, têm sido considerados possíveis alternativas

usuais frente a esses biofilmes microbianos (ALBUQUERQUE et al., 2017).

Baseado nesse fato, o presente estudo avaliou a capacidade de inibição

da formação do biofilme bacteriano, através do OELN. Sendo este, capaz de

reduzir tal formação em determinadas porcentagens, frente espécies de S.

aureus (78,3%), S. epidermidis (70%), S. marcescens (60,7%), E. coli (37,3%),

P. aeruginosa (29,7%) e E. faecalis (46,5%). Além disso, o óleo também fora

eficiente, reduzindo a formação do biofilme de todos os isolados clínicos de S.

aureus.

Apesar de não haver relatos sobre pesquisas desenvolvidas com o óleo

essencial de L. nepetifolia, nem mesmo com óleos de espécies pertencentes ao

mesmo gênero, frente a biofilmes microbianos, alguns estudiosos descrevem o

efeito antibiofilme que óleos essenciais obtidos de outras espécies vegetais,

exercem sobre células bacterianas formadas e aderidas a superfícies.

Côrrea (2017), ao avaliar a capacidade de inibição da formação de

biofilmes bacterianos, através do óleo essencial obtido de folhas secas de

Eucalyptus staigeriana, demonstrou haver inibição frente a todos os

microrganismos testados. Em especial, frente a cepas de E. faecalis (p < 0,001),

S. aureus (p < 0,0001) e S. epidermidis (p < 0,0001), que em comum a presente

pesquisa, apresentaram porcentagens de inibição significativas.

Jardak e colaboradores (2017), também descreveram em seus estudos,

a capacidade inibitória de formação do biofilme, através da ação do óleo

essencial de Rosmarinus officinalis, frente cepas de S. aureus e S. epidermidis.

Onde esta última espécie, foi erradicada em 67%, valor este que se aproxima do

encontrado nesse estudo para S. epidermidis (70%).

Também em concordância as presentes análises, Oh e Colaboradores

(2017), relataram haver redução na formação do biofilme de E. coli, quando

submetido a ação de óleos essenciais obtidos comercialmente, de timol,

carvacrol e orégano. Bem como Negreiros (2014), que obteve resultados

positivos relacionados a inibição da formação do biofilme de E. faecalis, quando

exposto a ação do óleo essencial de Heterothalamus psiadioides.

Isolados clínicos de S. aureus resistentes a oxacilina, também são

descritos na literatura, por sofrerem a ação redutora do biofilme através de óleos

69

essenciais. Como por exemplo, Vasconcelos e Colaboradores (2017), que

relataram haver inibição na formação de tais isolados, quando submetidos aos

efeitos antibiofilmes do óleo essencial de Plectranthus amboinicus e seu

composto marjoritário Carvacrol.

O efeito redutor sobre a formação de biofilmes bacterianos que o OELN

exerceu, bem como os outros óleos essenciais descritos anteriormente, está

intimamente relacionado a presença de terpenos em sua constituição química

(DE OLIVEIRA; BRUGNERA; PICCOLI, 2013). Uma vez que, a ligação de um

produto antimicrobiano em células as quais ainda não se encontram totalmente

aderidas numa superfície, é mais fácil de ocorrer. Levando assim, a uma

interação inicial dos componentes do óleo essencial com proteínas

membranosas bacterianas, o que dificulta a ligação célula-célula na formação do

biofilme, bem como, na expressão do sistema quorum sensing (KIM et al., 2015)

(KIFER; MUŽINIĆ; KLARIĆ, 2016).

Devido ao caráter lipofílico que os óleos essenciais apresentam, estes são

capazes de atravessar a parede celular de bactérias gram negativas,

acumulando-se na membrana citoplasmática. O que altera a permeabilidade da

célula, pelos danos ocasionados em diferentes estruturas membranosas de

polissacarídeos, ácidos graxos e fosfolipídeos. Íons são perdidos, decorrentes

do aumento dessa permeabilidade, levando a morte celular (BAKKALI et al.,

2008).

Entretanto, apesar de haver inibição da formação de biofilmes bacterianos

gram positivos e gram negativos, o OELN não foi capaz de intervir no biofilme de

K. pneumoniae. Onde Derakhshan, Sattari e Bigdeli (2010) demonstraram em

seus estudos, que ao testarem óleo essencial extraído de sementes de Cuminum

cyminum, observaram inibição do biofilme da referida espécie através do óleo

essencial, em mais de 50%.

Vale lembrar, que um dos fatores que levam as discrepâncias de atividade

biológicas dos óleos essenciais, é a diferença de constituição química, além de

condições ambientais; parte da planta a qual é extraído o óleo; metodologias

aplicadas; dentre inúmeros outros (VUONG et al., 2015).

70

5.3.3 Interferência do OELN na Formação do Biofilme Consolidado

Abaixo, estão listados os resultados referentes a ação do OELN frente ao

biofilme consolidado bacteriano.

Na Tabela 19, observa-se que, após a aderência do biofilme no fundo dos

poços, o OELN foi capaz de reduzir sua formação frente as cepas de E. faecalis

(2,9%); E. coli (2,04%); P. aeruginosa (4,3%); S. aureus (16,1) e S. epidermidis

(4,8%). Bem como frente a isolados clínicos de S. aureus II (2,1%); III (4%) e

8521 (17,4%) (Tabela 20 – Página 71).

Tabela 19. Interferência com o biofilme consolidado de cepas padrões bacterianas na presença do OELN.

Identificação da Cepa

Média da DO 24h (620 nm)



(%)


0,044 ± 0,001 0,045 ± 0,0006 -


0,049 ± 0,0003 0,048 ± 0,0003 2,08

Klebsiella pneumoniae ATCC

13883

0,044 ± 0,0 0,044 ± 0,0003 -

Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853

0,046 ± 0,0006 0,044 ± 0,0006 4,5


0,056 ± 0,002 0,065 ± 0,008 -


0,093 ± 0,0003 0,078 ± 0,0005 19,2

Staphylococcus epidermidis ATCC

12228

0,062 ± 0,013 0,065 ± 0,008 -


71

Tabela 20. Interferência com o biofilme consolidado de isolados clínicos de S. aureus na presença do OELN.





(%)

I 0,056 ± 0,0048 0,075 ± 0,006 -

II 0,048 ± 0,0008 0,047 ± 0,0006 2,1

III 0,052 ± 0,0043 0,050 ± 0,003 4

IV 0,081 ± 0,0020 0,111 ± 0,010 -

V 0,059 ± 0,0055 0,108 ± 0,004 -

7669 0,049 ± 0,0003 0,054 ± 0,004 -

7788 0,070 ± 0,006 0,074 ± 0,002 -

8107 0,062 ± 0,002 0,071 ± 0,005 -

8521 0,074 ± 0,011 0,063 ± 0,008 17,4

8536 0,072 ± 0,007 0,155 ± 0,0324 -

9606 0,092 ± 0,003 0,130 ± 0,021 - Fonte: Autoria própria.

Após o biofilme bacteriano estar aderido em uma determinada superfície,

torna-se difícil o processo de intervenção do seu desenvolvimento por um

produto antimicrobiano (KIFER; MUŽINIĆ; KLARIĆ, 2016). É o que pôde ser

constatado nesse estudo, quando observado os biofilmes pertencentes a cepas

padrões e isolados clínicos, os quais tiveram os níveis de intervenção através do

OELN reduzidos ou nulos.

Selim (2014), expõem que a superprodução de exopolissacarídeos,

atribui um elevado grau de resistência ao biofilme consolidado, o que não era

observado antes no biofilme em formação. Ante o exposto, o acesso dos

compostos químicos, presentes no óleo essencial frente as células bacterianas

é barrado. Existindo apenas a eliminação de células mais próximas à interface

do líquido do biofilme.

O OELN mesmo em baixas concentrações de inibição (19,2%), foi

significativo frente o consolidado de S. aureus ATCC 25923 (p < 0,01),

representando uma possível alternativa, não apenas frente biofilmes já

formados, mas também, na prevenção do desenvolvimento destes. Como por

exemplo, a implementação de óleos essenciais em enxaguantes bucais, já citada

na literatura, como uma forma de precaução frente a agregação, formação de

massa e maturação do biofilme bacteriano nos dentes (MOURA, 2015).

72

6 CONCLUSÕES

Em face aos objetivos propostos na presente pesquisa, pôde-se concluir,

a partir dos resultados obtidos, fraca atividade antimicrobiana do OELN frente

cepas padrões bacterianas de E. coli, S. marcescens, S. aureus, S. epidermidis,

e isolados clínicos de S. aureus (III e 7669). Bem como moderada atividade

antimicrobiana frente ao isolado clínico de S. aureus II.

Após combinado o óleo essencial de L. nepetifolia com os antibióticos de

escolha, o efeito biológico antimicrobiano foi potencializado para algumas cepas

padrões e isolados clínicos, ou seja, houve uma interação sinérgica frente S.

aureus ATCC 25923, E. coli ATCC, S. aureus II e S. aureus III. Contudo,

indiferença também foi tida como resultado do combinado entre os dois produtos

(OELN com antibióticos), frente S. epidermidis ATCC 12228, S. marcescens

ATCC 13880, além de antagonismo para S. aureus 7669.

Maior capacidade formadora de biofilmes foi tida para cepas padrões (S.

marcescens, S. aureus e S. epidermidis) e isolados clínicos de S. aureus (IV,

7669, 9606), com redução na formação deste quando susceptível a ação do

OELN, exceto para a biomassa de K. pneumoniae. Havendo também

interferência na redução do biofilme consolidado, através do OELN, frente cepas

padrões (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) e isolados clínicos de S. aureus (II,

8521).

Diante do exposto, verifica-se que o OELN pode vir a ser uma possível

alternativa viável no combate a infecções derivadas por microrganismos, em

especial, bactérias. Sendo este, o primeiro estudo realizado com o referido

produto natural, para atividade sinérgica e antibiofilme.

73

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€¦ · 3 agradecimentos a deus, pelo dom da vida. aos meus pais, paulo e eliane, pelo amor...

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