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Otimizao da Extrao de Compostos Fenlicos em umaBiofarinha de Ma Enriquecida com Agaricus brasiliensis

Optimization of Phenolic Compounds Extraction in anApple Pomace Flour Enriched With Agaricus brasiliensis

Claudia Benetti

Departamento de Farmcia

Universidade Estadual do Centro-Oeste - UNICENTRO, Guarapuava, PR

[email protected]

Tbata Cristina Colussi



[email protected]

Fernanda Bovo

Universidade Federal do Paran - UFPR, Curitiba, PR

[email protected]

Herta Stutz Dalla Santa

Departamento de Engenharia de Alimentos


[email protected]

Elisa Perez



[email protected]

Resumo: Agaricus brasiliensis tem sido muito estudado por suas propriedades nutra-

cuticas. Como essas propriedades podem estar relacionadas a componentes fenli-

cos, o objetivo deste trabalho foi otimizar o preparo de amostra, para a determinao

de compostos fenlicos totais em uma biofarinha de bagao de ma fermentada de

Recebido em 14/08/2013 - Aceito em 11/04/2014.

RECEN 15(2) p. 255-273 jul/dez 2013 DOI: 10.5935/RECEN.2013.02.06

Revista Cincias Exatas e Naturais, Vol.15, n 2, Jul/Dez 2013

forma submersa comA. brasiliensis. Utilizou-se um planejamento fatorial fracionado

241 , com as variveis: composio do lquido extrator, concentrao do lcool nolquido extrator, tempo e mtodo de extrao, utilizando-se o mtodo Folin-Denis.

Outras otimizaes foram realizadas com as variveis signicativas. O melhor m-

todo de extrao utilizou etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min. O teor de

fenlicos totais, em amostras de biofarinhas de bagao de ma fermentadas com A.

brasiliensis, foi menor (0,04852 0,001458) que o teor encontrado na biofarinha semfermentar (0,1098 0,001246) (p=3,331.1016). O sistema de planejamento fatorialfoi ecaz para otimizao dos resultados. A menor concentrao de fenlicos encon-

trados na biofarinha fermentada devido a, provavelmente, o fungo ter metabolizado

esses compostos.

Palavras-chave: Agaricus blazei; cogumelo; miclio; planejamento fatorial.

Abstract: Agaricus brasiliensis have been studied for their nutraceutical properties.

Given that these properties can be related to phenolic components, the aim of this

work was to optimize the sample preparation for determination of total phenolic

content in a our, obtained from apple pomace submerged fermented with A. bra-

siliensis. Fractional fatorial design 241 was used, with the variables: liquid extrac-tor composition, alcohol concentration in liquid extractor, time of extraction and

method of extration, using Folin-Denis method. Other optimizations were perfor-

med with the signicant variables. The best method of extraction used 70% ethanol

in homogenizer for 15 min. The total phenolic content in ours of apple pomace fer-

mented with A. brasiliensiswas lower (0.04852 0.001458) that the content found inunfermented our (0.1098 0.001246) (p=3,331.1016). The factorial design systemwas effective to optimize results. The lowest concentration of phenolics in fermented

our is probably due to fungus has metabolized these compounds.

Key words: Agaricus blazei; factorial design; mycelium; mushroom.

256

BENETTI, C. et al.

1 Introduo

O cultivo e a explorao de cogumelos comestveis de grande interesse comer-

cial. O Agaricus brasiliensis (A. blazeiMurrill [1]), ou cogumelo do sol [2], cultivado

e comercializado no Brasil, tem sido focado por apresentar propriedade imunomo-

duladora [1], anti-inamatria, anticancergena [3], no combate ao estresse fsico e

emocional, por evitar riscos de doenas como a osteoporose e lcera gstrica e pela

ao antioxidante [4].

Os cogumelos so considerados como alimentos nutracuticos, pois apresentam

eccia quando consumidos como suplementos alimentares [4]. O uso de A. brasi-

liensis como nutracutico porque sua ingesto aumenta as defesas imunolgicas do

organismo [3]. Essa espcie comercializada desidratada, em p ou fatiada, e in-

dicada como suplemento alimentar e nutracutico, considerando suas propriedades

nutricionais (alimento funcional) [3]. H interesse, na indstria nacional, em comer-

cializar essa espcie sob outras formas, como em farinhas fermentadas com esse fungo

(biofarinhas) para, por exemplo, enriquecer alimentos com compostos antioxidantes.

Tendo em vista que alguns antioxidantes sintticos, tais comoBHA (butil hidroxi-

anisol) e BHT (butil hidroxitolueno), possuem propriedades txicas e carcinognicas

[5], pesquisadores tm-se dirigido no sentido de encontrar antioxidantes naturais, que

so mais seguros e aceitos pelo consumidor. Alm de que, podem substituir os sin-

tticos ou fazer associaes entre eles, diminuindo sua concentrao nos alimentos,

cosmticos, medicamentos e correlatos [4].

O organismo produz, normalmente, radicais livres que so tomos ou molcu-

las produzidos de forma contnua e que apresentam um eltron desemparelhado. Em

virtude disso, so entidades qumicas extremamente reativas, apesar de, no organismo

humano, desempenharem importantes funes. Entretanto, em demasia podem cau-

sar danos s clulas, sendo, inclusive, esse excesso relacionado como desenvolvimento

de vrias doenas [6]. Nessa situao, os antioxidantes podem controlar ou prevenir

as leses causadas pelos radicais livres. Os antioxidantes so encontrados em vrios

alimentos e podem neutralizar a ao dos radicais ou, ainda diretamente, reagir com

esses, extinguindo-os. Esses mecanismos de ao dos antioxidantes dividem-se em

257


dois grandes grupos: aqueles que inibem a formao de radicais livres que iniciam o

processo oxidativo (etapa de iniciao), ou ainda, aqueles que impedem a propagao

da sequncia oxidativa, por inibirem radicais chave (etapa de propagao) pela doao

de tomos de hidrognio, interrompendo a reao em cadeia [7].

Os cogumelos possuem grande quantidade de antioxidantes, dentre os quais, po-

demos destacar os compostos fenlicos, que agem como sequestradores de radicais

livres e bloqueadores de reaes em cadeia [8]. Esses parecem ser os principais respon-

sveis pela atividade antioxidante do A. brasiliensis por sua alta concentrao [9]. O

A. brasiliensis fresco contm vitaminas B1 (Tiamina), B2 (Riboavina), B3 (Niacina),

D3 (Ergosterol), alm de compostos fenlicos. A alta concentrao de tocoferis no

A. brasiliensis tambm pode estar relacionada sua propriedade antioxidante [10].

Para a determinao de compostos fenlicos, necessrio otimizar o preparo da

amostra, que pode ser feito por mtodo univariado (uma varivel por vez), ou por

mtodo multivariado (relacionando todas as variveis). Este ltimo pode ser efetu-

ado por meio de planejamento fatorial (PF), que permite a otimizao simultnea de

vrios fatores envolvidos no sistema com menor nmero de experimentos, rapidez,

ecincia e diminuio de custos [11], analisando a signicncia de variveis e indi-

cando as condies timas para obteno dos melhores resultados [12]. Portanto, o

presente trabalho objetivou otimizar o preparo de amostra, para a determinao de

fenlicos totais em uma biofarinha de bagao de ma fermentada comA. brasiliensis.

2 Materiais e mtodos

2.1 Obteno da biofarinha do cultivo submerso

Omaterial foi cedido pelo laboratrio de microbiologia do departamento de En-

genharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO.

O inculo foi cultivado em erlenmeyers com meio Padro contendo (g.L1): glicose(20), extrato de levedura (3,95), MgSO4.7H2O (0,3), e K2HPO4.3H2O (0,5); com pH

ajustado a 6,0 (0,2) em potencimetro com NaOH 0,1N, esterilizados a 121oC por15 min. Foram inoculados cinco pedaos (1cm2) de gar com miclio do cogumelo

em 50 mL de meio e incubados a 30oC a 120 rpm por 7 dias. O miclio foi separado

258

BENETTI, C. et al.

do caldo por ltrao em tela (malha de 0,5 mm2), dividido em duas partes. Uma

parte foi passada atravs da tela com auxlio de uma esptula com 50 mL de gua des-

tilada esterilizada. Essa suspenso de miclio foi usada na concentrao de 5% (v/v)

para produo de miclio por cultivo submerso e inocular o substrato slido.

Foram utilizados 4,0 kg de mas da cultivar Gala, selecionadas, lavadas e saniti-

zadas (50 mg/L durante 20 minutos seguido de enxgue com gua potvel). As frutas

foram cominudas em processador de alimentos (METVISA-MPA). A massa tritu-

rada foi prensada a 3,0 kgf/cm2 durante 1 minuto (Prensa Hidrulica Eureka, 15 ton).

Aps a operao de prensagem, o material slido resultante, denominado de bagao

de ma, foi lavado em gua corrente e colocado para desidratao em estufa de circu-

lao de ar (60oC/12h, MA-035 Marconi), em seguida triturado (METVISA-MP200)

e condicionado em embalagens plsticas.

O cultivo submerso foi conduzido emErlenmeyers (volume de 250mL) contendo

10% de bagao de ma em meio aquoso, com pH de 6,0, esterilizado a 121oC por

15 min e inoculado com 5% da suspenso de miclio do inculo, incubado a 30oC

por 7 dias a 120 rpm. Em seguida, o miclio foi ltrado em papel ltro Whatmann,

seco em estufa a 45-50oC e modo a p, armazenado em frascos fechados a -18 oC

para mensurao do contedo fenlico. Esse material foi denido como biofarinha

fermentada. Bagao de ma do mesmo lote foi submetido ao mesmo processo de

fermentao, porm sem o fungo e igualmente tratado, originando a biofarinha no

fermentada.

2.2 Moagem e determinao da granulometria do material vegetal

Omosto seco passou por processo de moagem em moinho do tipo copo. A bio-

farinha fermentada e no fermentada obtida foi peneirada em tamis com abertura de

malha de 0,25 mm, com o rendimento de cada granulometria calculado.

2.3 Determinao de umidade

O mtodo gravimtrico [13] utilizou cerca de 1,0 g da biofarinha fermentada e

no fermentada (n=3).

259


2.4 Curva analtica

Usou-se padronizao externa com o cido 4-hidroxicinmico (cido p-cumrico -

APC) e o mtodo de Folin-Denis para determinao de fenlicos totais [14]. Diferen-

tes volumes de uma soluo de APC 0,214 mg.mL1 foram tratados com 0,5 mL dereagente Folin-Denis e 1 mL de Na2CO3 15% p/v, sendo o volume nal completado

com gua para 10 mL, originando concentraes nais de 0,428 a 5,136 g.mL1.Aps 30 min foram realizadas leituras em 720 nm, em triplicata, de cada concentra-

o. O branco constou dos mesmos reagentes e procedimento sem APC. Os resul-

tados foram plotados no programa Origin R obtendo-se equao de reta, intervalo e

coeciente de correlao linear (R2).

2.5 Otimizao do preparo de amostra e doseamento das biofarinhas

Usou-se planejamento fatorial fracionrio 241 com ponto central (n=5). As va-riveis testadas foram: composio do lquido extrator (metanol ou etanol); concen-

trao do lcool no lquido extrator (50% ou 70%); tempo de extrao (5 ou 15 min);

e mtodo de extrao (vrtex ou ultrassom), conforme a matriz de contrastes, exem-

plicada na tabela 1.

Tabela 1. Matriz de contrastes do planejamento fatorial fracionrio 241 com ponto cen-tral.

EnsaiosComposio Concentrao do Tempo de Mtodo dedo lquido lcool no lquido extrao extraoextrator extrator

1 -1 (metanol) -1 (50%) -1 (5 min) -1 (vrtex)2 1 (etanol) -1 -1 1 (ultrassom)3 -1 1 (70%) -1 14 1 1 -1 -15 -1 -1 1 (15 min) 16 1 -1 1 -17 -1 1 1 -18 1 1 1 1

Ponto central mistura de metanol a 50% (0,75 Extrao com ultrassom(n=5) mL) mais etanol a 70% (0,75 mL) (5 min) mais vrtex (5 min)

260

BENETTI, C. et al.

Exatamente 0,200 g das amostras de biofarinha (granulometria maior que 0,250

mm) tiveram a adio de 1,5 mL de lquido extrator com o mtodo de extrao e

tempo denidos pela matriz de contrastes. Amistura foi centrifugada a 4000 rpm /15

min e o sobrenadante recolhido. Alquotas (250 L) desse sobrenadante foram secas

em banho-maria (60 C) por 40 min e o material foi ressuspenso com trs lavagenscom gua destilada (1,0mL cada). As lavagens foram recolhidas em balo volumtrico

(10 mL), tratadas pelo mtodo Folin-Denis, o volume completado com gua destilada

e o resultado expresso conforme a curva analtica. O branco constou de todos os

componentes da amostra original, exceto o extrato da biofarinha.

Denidas as variveis signicativas e o melhor mtodo obtido no PF, realizou-

se nova otimizao univariada somente para o mtodo de extrao, utilizando-se dois

mtodos: com vrtex ou homogeneizador por inverso (n=9 para cada grupo), sendo

que, em ambos, a extrao foi por 15 min, com etanol 70%. Com a metodologia

otimizada, realizou-se a determinao de fenlicos da biofarinha fermentada com A.

brasiliensis e no fermentada (n=10), usando-se, para a extrao da farinha fermentada,

3 mL de lquido extrator e para a no fermentada 3,5 mL, em funo de resultados

em relao curva analtica.

2.6 Tratamento dos dados

Os resultados da anlise de umidade e do PF foram tratados com o teste de rejei-

o Q a 95 % [15], alm de serem analisados pelas planilhas de quimiometria [16].

Avaliou-se o PF por meio do desvio do efeito (DE) Equao (1), onde

DE = t .d p (1)

sendo t o valor da distribuio t de Student com =0,05, com quatro graus de li-

berdade, bem como dp o desvio padro dos valores do ponto central. O DE foi

contrastado com o efeito calculado (e f ) - Equao (2) - para cada varivel, onde

n/2i=1 yi(+)

n/2i=1 yi()

n/2(2)

261


sendo e f o efeito calculado para as variveis e interaes usando a diferena entre

as mdias das observaes no nvel mais (yi(+)) e as mdias das observaes no nvel

menos (yi()), para n ensaios e yi observaes individuais [16]. Para a avaliao dosresultados da otimizao univariada e comparaes, utilizaram-se os testes estatsticos

ANOVA, Bonferroni e Tukey com =0,05.

3 Resultados e discusses

3.1 Determinao da granulometria do material vegetal

O rendimento da biofarinha dema fermentada comA. brasiliensis foi de 17,73%

para partculas com dimetro superior a 0,25 mm, e de 23,08% para biofarinha no

fermentada, em partculas com dimetro superior a 0,25 mm. A denio de uma

granulometria tem por objetivo uniformizar o teste, para que as repeties no apre-

sentem variaes em funo de diferentes tamanhos de partculas.

3.2 Curva analtica

OAPC foi empregado em sete concentraes diferentes, de 0,428 a 5,136g.mL1.A equao obtida pode ser expressa como y = 108,0568. x + 0,07543, com R2 =

0,99128. A legislao brasileira recomenda que, para mtodos analticos, seja cons-

truda uma curva com, no mnimo, cinco concentraes diferentes e que a mesma

apresente um R2 superior a 0,99 no mnimo [17]. No presente estudo, a curva foi

elaborada com sete concentraes e o R2 superior a 0,99, de acordo com o exigido.

3.3 Otimizao do preparo de amostra e doseamento das biofarinhas

No PF 241, o DE obtido foi de 0,052245, com efeito de 1a ordem para o mtodode extrao. Quando o mtodo de extrao alterado de vrtex para ultrassom, h

uma diminuio no teor extrado de compostos fenlicos. Entretanto, foram perce-

bidos efeitos de 2a ordem entre composio do lquido extrator + concentrao do

lcool no lquido extrator, composio do lquido extrator+mtodo de extrao,

concentrao do lcool no lquido extrator+ tempo de extrao e tempo de extra-

o +mtodo de extrao (Tabela 2). Os melhores resultados foram obtidos com o

262

BENETTI, C. et al.

uso de etanol a 70%, em extrao por 15 min em vrtex no caso dessa ltima vari-

vel, como o e f de 1a ordem do mtodo de extrao foi maior que o e f de 2a ordem

(0,08245> 0,06861, pois os valores so analisados emmdulo), optou-se pelo vrtex.

Tabela 2. Resultado da signicncia das variveis do planejamento fatorial fracionrio241 para determinao de compostos fenlicos (DE = 0,052245).

Varivel E f ResultadoComposio do lquido extrator -0,04816 VNSConcentrao do lcool no

-0,01818 VNSlquido extratorTempo de extrao -0,03159 VNSMtodo de extrao -0,08245 VS, melhores valores com vrtexComposio do lquido extrator

0,06861VS, melhores resultados com

+ concentrao do lcool no etanol a 70%lquido extratorComposio do lquido extrator

0,01595 VNS+ tempo de extraoComposio do lquido extrator

0,06991VS, melhores resultados para

+mtodo de extrao etanol em ultrassomConcentrao do lcool no

0,06991VS, melhores resultados com

lquido extrator + tempo de lcool em 70% e 15 min deextrao extraoConcentrao do lcool no

0,01595 VNSlquido extrator +mtodo deextraoTempo de extrao +mtodo de

0,06861VS, melhores resultados para 15

extrao min de extrao em ultrassom

Legenda: DE: desvio do efeito; ef: efeito calculado para cada varivel, VS: varivel signicativa; VNS:varivel no signicativa.

Mediante esses resultados, deniu-se a extrao por 15min, com etanol 70% como

a mais ecaz. Como a extrao com vrtex apresentou melhores resultados do que

comoultrassom, a prxima etapa de otimizao foi univariada, emdois grupos (n=9),

sendo eles vrtex e homogeneizador por inverso. O mtodo de extrao mais e-

ciente foi o que usou o homogeneizador, apresentando diferena signicativa por

ANOVA (p= 9,41.104) com a extrao por vrtex. O mtodo de extrao otimi-zado ento foi denido com etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min.

O PF uma importante e simples ferramenta estatstica, que permite a anlise dos

263


resultados considerando todos os parmetros experimentais envolvidos, bem como

fornece o efeito das possveis interaes entre as variveis analisadas [18]. Essa fer-

ramenta ajuda a denir as melhores condies operacionais de um sistema, ou seja,

faixas quemaximizemos resultados, realizando-se umnmero reduzido de ensaios ex-

perimentais e, tambm, avalia quando as associaes de variveis possuem um efeito

sinrgico ou antagnico. Sem o uso de PFs, importantes interaes entre as vari-

veis no so detectadas, levando-se mais tempo para se determinarem as condies

timas, alm de gerar mais gastos por aumentar o nmero de ensaios [19]. Para a

realizao do planejamento, so selecionadas variveis que, provavelmente inuenci-

aram no sistema, e so executados experimentos variando-se os nveis, que podem ser

quantitativos (por exemplo: concentraes de uma substncia, valores de pH etc.) ou

qualitativos (tipos de cidos, tipos de agitao, etc.). Estes so nomeados pelos sinais

(menos) ou + (mais), no sendo um critrio denido a nomeao dos sinais, sendo

importante apenas a relao inicial entre o sinal dado e o efeito obtido [16].

Considerando que os efeitos de altas ordens so quase sempre no signicativos,

a utilizao de PFs fracionrios apresenta a vantagem de um nmero reduzido de ex-

perimentos, de forma mais rpida (nv-x , onde x a reduo, sendo o valor 1 para

metade dos experimentos, por exemplo), fornecendo as informaes com os efeitos

mais importantes (primeira e segunda ordem). Retira, na maioria das vezes, as mes-

mas concluses caso fosse realizado um planejamento completo [16].

A extrao de compostos fenlicos em produtos naturais sofre inuncia da natu-

reza qumica da matriz, solventes extratores, condies de extrao, bem como m-

todo, tempo e temperatura de extrao [5] o que justica a grande variedade de resul-

tados obtidos por diferentes pesquisadores. Para quanticao de compostos antioxi-

dantes de fontes naturais, essencial a realizao da extrao com solventes de pola-

ridades diferentes [4]. Os compostos fenlicos so substncias de elevada polaridade,

que podem ser extrados por meio de solventes como metanol, etanol, acetona, gua,

acetato de etila, propanol, dimetilformaldedo e suas combinaes [20]. Quando se

trata de solventes orgnicos, o metanol, por conseguir extrair maiores quantidades

de metablitos, tem sido indicado como o mais efetivo [21]. Por isso, a escolha foi

entre dois lcoois de fcil acesso, o metanol e etanol, em propores diferentes, com

264

BENETTI, C. et al.

gua. A gua considerada o solvente universal que, quando combinada com outros

solventes orgnicos, ajuda a tornar o meio um pouco mais polar, o que favorece a

extrao de compostos fenlicos [22].

Estudos anteriores apontam que extratos metanlicos de Lentinus edodes e A.

brasiliensis, independente do tipo de extrao, apresentaram maior atividade antioxi-

dante do que os extratos etanlicos [4]. Como os compostos fenlicos so substncias

antioxidantes, esperava-se a mesma resposta; entretanto, em nossa anlise, percebeu-

se que, ao diminuir a polaridade - ao acrescentar etanol e diminuir o percentual de

gua -, a quantidade extrada de substncias fenlicas aumenta.

Em outro trabalho, o corpo de fruticao de A. blazei Murill foi extrado sob

a forma de decoco e de macerao, com gua. Vericou-se, in vitro, a resistncia

oxidao por meio de trs mecanismos: inibio do processo oxidativo enzimtico

(por inibio de 100% das enzimas horseradish peroxidase e mieloperoxidase); inibi-

o do estresse oxidativo celular (por meio da inibio de 80% da ruptura oxidativa

de neutrlos polimorfonucleares); e ao direta em espcies reativas (pela supresso

de 62% de HOCl e 87% do radical nion superxido O2 ) [23].Porm, ainda no foi desenvolvido um sistema satisfatrio de extrao com sol-

ventes para a quanticao de todos os antioxidantes ou uma classe especca desses

compostos por vrios fatores. Os resultados obtidos podem ser justicados devido

grande variedade e quantidade de compostos presentes nos cogumelos (compostos

fenlicos como cidos fenlicos, avonoides e tocoferis), possibilidade de interao

com carboidratos, protenas e outros componentes dos alimentos, alm do fato de

esses compostos variarem do simples ao altamente polarizado [24].

O efeito da varivel tempo no rendimento da extrao no um fator amplamente

analisado [4]. Quando se trata de tempo de extrao, vrias metodologias utilizadas

consideram um fator importante o perodo de macerao melhorando a ecincia

da extrao [22]. Outros estudos armam que o tempo de extrao tem pouca in-

uncia quando comparado ao tipo de solvente utilizado [4]. Por exemplo, para o

extrato aquoso de uva, ocorre um pequeno aumento no rendimento com o aumento

do tempo de extrao, enquanto que, para o extrato etanlico, o rendimento aumen-

tou signicativamente com o tempo. Em outra anlise, extratos de frutas vermelhas

265


foram preparados com etanol, metanol e gua e tempos de extrao de 1, 12 e 24 h.

Analisando-se os resultados, o contedo de polifenis diminuiu no extrato aquoso

com maior tempo de extrao, mas, nos extratos metanlicos e etanlicos, houve

aumento do contedo desses compostos com o aumento do tempo [25].

Neste caso, uma hiptese seria que a alterao do rendimento em funo do tempo

de extrao depende de todas as variveis envolvidas no processo, no podendo ser

analisado mediante cada varivel isoladamente, pois pode ter alterao em funo da

matriz de extrao, bem como na classe de substncia fenlica envolvida (cidos or-

gnicos, avonoides, alcaloides etc). Nesse sentido, o PF a ferramenta que mais se

adequa a esse tipo de investigao.

Substncias fenlicas so passveis de oxidao [26], ou seja, sistemas que propi-

ciem maior contato com o oxignio podem desencadear reaes de oxidao nesses

compostos. Dessa forma, tal fator pode ter inuenciado na otimizao do mtodo

de extrao (ultrassom, vrtex, homogeneizador). O ultrassom propicia a imploso

de bolhas de cavitao, gerando grande quantidade de energia, oxidando os compos-

tos, explicando a menor quantidade de fenlicos obtida. O vrtex provoca agitao

com bastante aerao, ou seja, incorporando oxignio no sistema [27]. J a agitao

por inverso promove o choque das partculas com o lquido em funo da gravidade,

podendo ser entendida como um sistema que, possivelmente, desencadeie menor oxi-

dao que os anteriores, explicando, assim, os resultados obtidos.

A partir da extrao otimizada (etanol a 70%, em homogeneizador por 15 min),

mensurou-se o teor de fenlicos totais nas biofarinhas de bagao de ma,. A amostra

de biofarinha fermentada apresentou teores de fenlicos totais menores (0,04852 1,458.103% em APC, n=7 aps o teste Q, Desvio Padro Relativo - DPR=4,34%)que o teor encontrado na biofarinha sem fermentar (0,1098 1,246.103% , n=7aps o teste Q, DPR=1,53%) (ANOVA p=3,331.1016; Bonferroni p=2,910.1016;Tukey p=1,252.107) apresentado na gura 1.

Compostos fenlicos apresentam excelentes propriedades antioxidantes. Antio-

xidantes so compostos que previnem ou reduzem os efeitos nocivos dos processos ou

das reaes que levam oxidao de estruturas celulares, protegendo os sistemas bio-

lgicos [5]. Agem atravs de diferentes mecanismos, tais como quelantes de metais,

266

BENETTI, C. et al.

sequestradores de radicais livres, decomposio de perxidos, inibio de enzimas res-

ponsveis pela gerao de espcies reativas de oxignio e nitrognio entre outros [21],

sendo que os produtos intermedirios formados pela ao desses compostos so re-

lativamente estveis, pois o anel aromtico dessas estruturas apresentam ressonncia

[5].

A quanticao de compostos fenlicos realizada por vrios mtodos, todavia,

o reagente de Folin-Denis simples e comumente mais utilizado [28]. Este baseia-se

na reduo dos cidos fosfomolbdico e fosfotngstico pelas hidroxilas fenlicas em

meio alcalino, produzindo umcomplexo de colorao azul, medindo espectrofotome-

tricamente entre 620 e 740 nm. Porm este mtodo no especco, pois determina

todos os fenlicos presentes, mais substncias redutoras adicionadas aos alimentos ou

presentes naturalmente, interferindo nos resultados [20].

Figura 1. Teores de fenlicos totais em amostras de biofarinha fermentada com A. brasi-liensis e no fermentada.

Para doseamentos, a legislao brasileira preconiza ummximo de 5%para oDPR

[17]; portanto, os valores obtidos nos doseamentos esto dentro do exigido.

No processamento da ma para obteno de suco, ocorre a formao de uma

267


quantidade razovel de resduo industrial, composto pela mistura heterognea de

polpa, casca, semente, haste e clice, chamado de bagao. O bagao permanece com

seus componentes bioativos em sua biomassa fresca, mesmo aps o processo de pro-

duo do suco. A ma apresenta elevado teor de metablitos, tais como avonides,

polifenis e cidos fenlicos, encontrados na polpa e, principalmente, em sua casca,

que fornece as propriedades antioxidantes dessa fruta [29].

O contedo de fenlicos totais que permanece no bagao dema elevado (134,45

a 522,74 mg em cido glico.100 g1), o que indica o potencial antioxidante dessesubproduto. Com isso, so importantes estudos que avaliem os descartes da inds-

tria alimentcia [29]. Alm de que, a incorporao de A. brasiliensis, ao bagao, pode

ser til para potencializar, ainda mais, a atividade antioxidante, pois esse cogumelo

tambm apresenta metablitos com tais propriedades. Pesquisa anterior realizou o

doseamento de fenlicos totais em basidiomas jovens (corpo de fruticao) deA. bra-

siliensis com etanol a 70%, sob agitao por 3 h. A concentrao de fenlicos totais, de

acordo com o mtodo de Folin-Ciocalteu, foi de 1,94 0,39 mg de catequina.mL1de extrato ou 1,94% em catequina [5], ou seja, h fenlicos presentes no corpo de

fruticao. Em outro trabalho, foi mensurado o teor de fenlicos totais em extratos

de basidiomas de A. brasiliensis, obtidos por extraes de forma rpida (em liquidi-

cador por 30 min) ou de forma lenta (em shaker, por 3 h) em diferentes solventes:

gua, metanol:gua, etanol:gua, metanol e etanol. O experimento utilizou esquema

fatorial no delineamento inteiramente casualizado. Nesse, o melhor solvente de ex-

trao foi a gua, sem diferena estatstica entre a extrao rpida e lenta (em torno de

130 mg de cido glico.g1) [4]. J outros estudos em extratos etanlicos de gros detrigo fermentados com miclio de A. brasiliensis (2% p/v), apresentaram 0,576 mmol

de cido glico 100 g1 (98,03 mg.100 g1) no resduo seco (os gros de trigo semfermentar tiveram concentrao signicativamente inferior) [30]. Com base nisso,

o resultado obtido neste experimento no foi o esperado, pois o ideal seria que a bi-

ofarinha fermentada com A. brasiliensis tivesse fornecido um maior rendimento de

fenlicos totais em relao biofarinha no fermentada. Porm, o fungo pode ter

utilizado essas substncias fenlicas, tanto da ma quanto as prprias que ele pro-

duz, para seu crescimento e desenvolvimento. Deve-se levar em considerao o fato

268

BENETTI, C. et al.

de que fungos secretam enzimas durante seu desenvolvimento e degradam compostos

orgnicos e outros nutrientes para o seu crescimento [31], podendo ter desencade-

ado um processo de degradao e/ou alterao das estruturas fenlicas (por exemplo,

a estrutura molecular do composto passou a ter uma metoxila no lugar de uma hi-

droxila, ocasionando uma falsa diminuio na concentrao de compostos fenlicos,

pois o mtodo utilizado para o doseamento usa as hidroxilas fenlicas). Pode-se ga-

rantir que ocorreram as mesmas perdas desses compostos durante o processo, pois a

biofarinha fermentada e no fermentada foram submetidas s mesmas condies de

fermentao.

importante salientar que, em nosso grupo de trabalho, resultados anteriores de

avaliao antioxidante com a mesma biofarinha fermentada indicou uma capacidade

antioxidante expressa como 74,581 0,0225 mmol de cido ascrbico.100 g1, me-diante a extrao com metanol a 70% em vrtex por 15 min, na proporo de 50 mg

de farinha para 1,5 mL de lquido extrator. Inclusive, ocorreu diferena signicativa

(p = 0,0132) entre a biofarinha fermentada versus a no fermentada (69,152 0,0314mmol de cido ascrbico.100 g1) [32].

4 Concluses

O sistema de planejamento fatorial destaca-se como um instrumento ecaz para

otimizao de resultados. A melhor metodologia de extrao para compostos fen-

licos da biofarinha com granulometria superior a 0,25 mm utilizou como solvente

extrator o etanol a 70% em homogeneizador por 15 min. Com isso, obteve-se, para a

amostra de biofarinha no fermentada com A. brasiliensis, 0,1098 1,246.103% defenlicos totais expressos em APC, e na fermentada 0,04852 1,458.103 %, sendoque este valor foi inferior ao da biofarinha no fermentada, provavelmente em fun-

o de o fungo ter utilizado esses compostos para o seu crescimento. Com base nos

resultados obtidos, trabalhos futuros, com cromatograa acoplada espectrometria

de massas, podem auxiliar no real doseamento de substncias fenlicas de forma indi-

vidualizada.

269


5 Agradecimentos

UNICENTRO.

Referncias

[1] HENRIQUES, G.S.; SIMEONE, M.L.F.; AMAZONAS, M.A.L.A. Avaliao

in vivo da qualidade protica do champignon do Brasil (Agaricus brasiliensisWas-

ser et al.). Rev Nutr, v. 21, p. 535-543, 2008.

[2] KUROZAWA, L.E.; EL-AOUAR, .A.; MURR, F.E.X. Obteno de isoter-

mas de dessoro de cogumelo in natura e desidratado osmoticamente. Cinc

Tecnol Aliment, v. 25, p. 828-834, 2005.

[3] SIQUEIRA, F.G. Efeito do teor de nitrognio, inoculantes e mtodos de com-

postagem para cultivo de Agaricus blazei. Dissertao de Mestrado. Minas Ge-

rais, UFLA 2006.

[4] SILVA, A.C. Atividade antioxidante dos extratos de shiitake (Lentinus edodes) e

de cogumelo do sol (Agaricus blazei) aplicados em leo de soja sob aquecimento.

Dissertao de Mestrado. So Paulo, UNESP 2010.

[5] SOARES, A.A.Atividade antioxidante e compostos fenlicos do cogumeloAga-

ricus blazeiMurrill. Dissertao de Mestrado. Maring, UEM 2007.

[6] SOARES, S.E. cidos fenlicos como antioxidantes. Rev Nutr, v. 15, p. 71-81,

2012.

[7] PAGANINI, C.; NOGUEIRA, A.; DENARDI, F.; WOSIACKI, G. Anlise

da aptido industrial de seis cultivares de mas, considerando suas avaliaes

fsico-qumicas (dados da safra 2001/2002). Cinc Agrotec, v. 28, p. 1336-1343,

2004.

[8] MOREIRA,A.V.B.; MANCINI-FILHO, J. Inuncia dos compostos fenlicos

de especiarias sobre a lipoperoxidao e o perl lipdico de tecidos de ratos. Rev

Nutr, v. 17, p. 411-424, 2004.

270

BENETTI, C. et al.

[9] SILVA, A.C.; OLIVEIRA, M.C.; DEL R, P.V.; JORGE, N. Utilizao de ex-

trato de cogumelo como antioxidante natural em leo vegetal. Cinc Agrotec, v.

33, p. 1103-1108, 2009.

[10] MONTEIRO, C.S. Desenvolvimento de molho de tomate Lycopersicon

esculentum Mill formulado com cogumelo Agaricus brasiliensis. Tese de

Doutorado. Curitiba: Universidade Federal do Paran; 2008. Disponvel em:

. Acesso em: set/2012.

[11] SCHNITZLER, D.C.; GRASSI, M.T.; QUINIA, S.P. Aplicao de planeja-

mento fatorial a protocolo de extrao e xao de sulfetos volatilizveis por

acidicao (SVA) em amostras de sedimento. Qum Nova, v. 32, p. 1315-1320,

2009.

[12] ZANONI, T.B.; CARLOS, I.Z.; TOGNOLLI, J.O.; YAMANAKA, H.; FER-

REIRA, A.A.P. Otimizao de ELISA empregando uma protena Tc85-11 e pla-

nejamento fatorial . Eclet Qum, v. 31, p. 63-71, 2006.

[13] ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Farmacopeia Brasileira

5.ed. vol. 1, Braslia: ANVISA, 2010. p. 194.

[14] FOLIN, O.; DENIS, W. Tyrosine in proteins as determined by a new colori-

metric method. J Biol Chem v.12, p. 245-251, 1912.

[15] SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J. Fundamentals of analytical che-

mistry. 7a ed. Ford Worth: Saunders, 1996. Application of statistics to data tre-

atment and evaluation; p. 47-70.

[16] TEFILO, R.F.; FERREIRA, M.M.C. Quimiometria II: Planilhas eletrnicas

para clculos de planejamentos experimentais, um tutorial. Qum Nova, v. 29,

p. 338-350, 2006.

271


[17] ANVISA - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Brasil). Resoluo no 889,

de 29 de maio de 2003. Guia para a validao de mtodos analticos e bioanalti-

cos. Dirio Ocial da Unio, de 02 jun 2003.

[18] COSTA, L.M.; KORN, M.G.A.; CASTRO, J.T.; SANTOS, W.P.C.; CARVA-

LHO, E.V.; NOGUEIRA, A.R.A. Planejamento fatorial aplicado digesto

de amostras de feijo assistida por radiao micro-ondas. Qum Nova, v. 29, p.

149-152, 2006.

[19] BRASIL, J.L.; VAGHETTI, J.C.P.; ROYER, B.; SANTOS JR., A.A.; SIMON,

N.M.; PAVAN, F.A.; DIAS, S.L.P.; LIMA, E.C. Planejamento estatstico de

experimentos como uma ferramenta para otimizao das condies de biossor-

o de Cu (II) em batelada utilizando-se casca de nozes pec como biossorvente.

Qum Nova, v. 30, p. 548-553, 2007.

[20] ANGELO, P.M.; JORGE, N. Compostos fenlicos em alimentos uma breve

reviso. Rev Insti Adolfo Lutz, v. 66, p. 1-9, 2007.

[21] OLIVEIRA, A.C.; VALENTIM, I.B.; GOULART, M.O.F.; SILVA, C.A.; BE-

CHARA, E.J.H.; TREVISAN, M.T.S. Fontes vegetais naturais de antioxidan-

tes. Qum Nova, v. 32, p. 689-702, 2009.

[22] VIZZOTTO, M.; PEREIRA, M.C. Amora-preta (Rubus sp.): Otimizao do

processo de extrao para determinao de compostos fenlicos antioxidantes.

Rev Bras Frutic, v. 33, p. 1209-1214, 2011.

[23] HAKIME-SILVA, R.A.; VELLOSA, J.C.R.; KHALIL, N.M.; KHALIL,

O.A.K.; BRUNETTI, I.L.; OLIVEIRA, O.M.M.F. Chemical, enzymatic and

cellular antioxidant activity studies of Agaricus blazei Murrill. An. Acad. Bras.

Cienc. v. 85, p. 1073-1081, 2013.

[24] ANDREO, D.; JORGE, N. Antioxidantes naturais: Tcnicas de extrao. Bol

Cent Pesqui Process Aliment, v. 24, p. 319-336, 2006.

272

BENETTI, C. et al.

[25] LAPORNIK, B.; PROSEK,M.; WONDRA, A.G. Comparison of extracts pre-

pared fromplant by-products using different solvents and extraction time. J Food

Eng Essex, v. 71, p. 214-222, 2005.

[26] RODRIGUES, L.M. Estudo da corroso do ao para dutos API 5L X56 em

solos do RS. Tese de Doutorado. Porto Alegre, UFRGS 2006.

[27] KALAMUCK, K.M.; CHAHINE,G.L.; HISIAO, C. T.; CHIO, J. K. Remedi-

ation and disinfection of water using jet generated cavitation. Proceedings of 5t h

International Symposium on Cavitation, Osaka, Japan, 2003.

[28] FUNARI, C. S.; FERRO, V.O. Anlise de prpolis. Cinc Tecnol Aliment, v.

26, p. 171-178, 2006.

[29] SOARES, M.; WELTER, L.; GONZAGA, L.; LIMA, A.; MANCINI-FILHO,

J.; FETT, R. Avaliao da atividade antioxidante e identicao dos cidos fe-

nlicos presentes no bagao de ma cv. Gala. Cinc Tecnol Alimen. , v. 28, p.

727-732, 2008.

[30] CRDOVA, K.R.V.; DALLA SANTA, H.S.; DALLA SANTA, O.R.; PE-

REZ, E.; WASZCZYNSKYJ, N. Antioxidantes e beta-glucanas em barras de

cereais com Agaricus brasiliensis. Bol Cent Pesqui Process Aliment, v. 30, p. 209-

220, 2012.

[31] DONINI, L.P; BERNARDI, E.; NASCIMENTO, J.S. Desenvolvimento in vi-

tro de Agaricus brasiliensis emmeios suplementados com diferentes farelos. Pesq

Agropec Bras, v. 41, p. 995-999, 2006.

[32] COLUSSI, T.C.; BENETTI, C.; BOVO, F. DALLA-SANTA, H.S.; PEREZ,

E. Avaliao da capacidade antioxidante de uma biofarinha de Mac obtida com

Agaricus brasiliensis frente ao complexo fosfomolibdnico. Rev cienc exatas nat,

v. 15, p. 95-112, 2013.

273

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