2006 - estudo da variabilidade genética do cardinal (ostariophysi-characiformes - paracheirodon...
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E
RECURSOS NATURAIS
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO CARDINAL (OSTARIOPHYSI:
CHARACIFORMES: Paracheirodon axelrodi) NA BACIA DO RIO NEGRO
Audrey Alencar Arruda d’ Assunção
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Biologia
Tropical e Recursos Naturais do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia –
INPA para a obtenção do título de Mestre
em Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva.
MANAUS – AMAZONAS
2006
II
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E
RECURSOS NATURAIS
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO CARDINAL (OSTARIOPHYSI:
CHARACIFORMES: Paracheirodon axelrodi) NA BACIA DO RIO NEGRO
Audrey Alencar Arruda d’ Assunção
Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto, Dr.
Co-orientador: Tomas Hrbek, Dr.
MANAUS – AMAZONAS
2006
I
Ficha Catalográfica
D231e D'Assunção, Audrey Alencar Arruda Estudo da variabilidade genética do cardinal (Ostariophysi: Characiformes: Paracheirodon Axelrodi) na bacia do Rio Negro /
Audrey Alencar Arruda D' Assunção. -- Manaus : INPA/UFAM,
2007. xiv, 67f. : il. Dissertação(mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2007.
Orientador (a): Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto Co-Orientador: Dr. Tomas Hrbek
Área de concentração : Genética
1. Peixe ornamental. 2. Variabilidade genética. 3. Microssatélites. I. Título.
Sinopse:
Foi analisada a variabilidade genética do peixe ornamental – cardinal (Paracheirodon
axelrodi). Estudou-se 6 amostras populacionais, provenientes dos tributários do médio
Rio Negro próximos aos municípios de Barcelos (Igarapé Cajarizinho, Igarapé Zamula e
Lago Rainha) e Santa Izabel do Rio Negro (Rio Tea, Rio Urubaxi e Igarapé Iaha). Foi
desenvolvido e caracterizado 12 marcadores microssatélites para Paracheirodon
axelrodi, e adicionamente utilizado 5 outros microssatélites descritos na literatura. Foi
observado uma alta diversidade genética e no estudo populacional foi verificado
indícios de estruturação populacional. Foi sugerido que o rio Negro não é uma barreira
à dispersão do cardinal e que, no momento, esta espécie não está sendo afetada pela
exploração comercial intensa na região considerando seus níveis de diversidade
genética.
II
A meus pais Ednelza e Wagner,
Ao meu amor
&
Ao meu orientador
III
“ Até o Sol para enxergar com clareza
necessita que o céu se abra...”
Shakespeare
IV
AGRADECIMENTOS
Neste momento, revendo minha trajetória até aqui, como num filme passando
rapidamente pela cabeça me vem na memória vários momentos especiais de pura
alegria e porque não, também, de puro desespero. Nessa visão enlouquecida de final
de trabalho, sei que devo agradecer a muitos pela paciência, pelo ouvido, pelo tempo,
pelos pedidos e pelas palavras. De todas as formas, a experiência adquirida aqui ficará
para sempre por isso agradeço a todos que contribuíram para que finalmente esse
momento chegasse. Agradeço profundamente:
Ao CNPq – PRONEX / PNOPG, Projeto Piaba, INPA-PPI 2-3750, curso GCBEV
e FAPEAM pelo suporte financeiro. Especialmente a FAPEAM pela cessão da bolsa de
estudo.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA especificamente ao
Laboratório Temático de Biologia Molecular – LTBM, por disponibilizarem a estrutura
física e os equipamentos para o desenvolvimento desse mestrado. Ao laboratório da
UFAM e ao Projeto PIRADA por disponibilizarem os programas de genotipagens e
análise de microssatélites. À Universidade Federal do Amazonas - UFAM,
especificamente aos laboratórios de Genética (Bloco G) e LEGAL (Bloco E) pelo
“socorro” nos momentos difíceis ocorridos nesse tempo.
Aos que abasteceram-me com amostras de cardinal particularmente aos
pesquisadores Dr. Paulo Petry e Dr. Jansen Zuanon; ao Sr. Ribeiro, distribuidor de
peixes ornamentais em Barcelos, que mesmo sem conhecê-lo pessoalmente
conseguiu-me amostras e contribuiu no esclarecimento de minhas dúvidas sobre coleta
e exportação de cardinal; e ao Sr. Cleuder, técnico do projeto Piaba.
A Dra. Vera Scarpassa, que mostrou-me por meio de seus conhecimentos um
caminho ético de trabalho, auxiliando-me no esclarecimento de minhas dúvidas.
À Dra. Izeni Pires Farias e ao Dr. Tomas Hrbek pelos incentivos e disponibilidade
em ensinar. Ambos foram de fundamental importância durante o desenvolvimento dos
marcadores microssatélites e análise dos resultados.
V
A Dra. Eliana Feldberg pelo direcionamento, carinho, apoio, incentivo e pela co-
co-co-orientação. Foi fundamental para essa realização. Pois, não me vejo
profissionalmente sem enxergá-la por perto em todos os momentos!!!
Aos “filhos do mesmo pai” no LTBM: Carlos, Rebecca, Fabíola e Alexandra pela
paciência, pelo auxílio e pelo companheirismo. Especialmente, a Fafá e Xandra pela
cessão de seus braços e seu tempo na execução do trabalho.
Aos colegas de laboratório: Raquel, Jacqueline, Kyara, Tatiana e aos demais
PIRADOS pelos momentos de aprendizado e de divertimentos. Em especial, agradeço
a Tati pela sua disponibilidade em injetar placas intermináveis no Mega.
Aos colegas de curso: Renata, Carla, Taciana, William, aos “Danieis” Raid,
Dutra, Barros e Toffoli pelos momentos no GCBEV.
Aos colegas da UFAM: Doriane, Dina, Larissa, Neves, Themis, pelo auxílio.
Aos meus colegas do “Ensinando Genética Brincando”: Daniel Raid, Taciana
Amorim, Manuella Villar e Cleyton Fantini pelos momentos de coragem e decisão ao se
fazer um curso voltado à educação, apesar de todas as atribulações individuais.
Aos amigos do “Chicão”: Waldete Salem, Helio Saraiva e Inês Cardoso pelo
apoio e encorajamento.
Às minhas amigas de coração: Eleilza, Flaviane, Paula e Luciane por tudo e por
sempre!
À minha família (mãe, pai e irmãos) pela preocupação, compreensão e
confiança. A minha família pós-matrimônio pela torcida. Descobri a duras penas que
minha família é o meu amor, meu porto seguro!!
Ao Dr. Jorge Porto por ter me proporcionado um crescimento profissional e
pessoal imensurável após longos anos de trabalho juntos. Mostrou-me que o caminho é
árduo e de constantes batalhas. Agradecerei sempre pelo apoio incondicional, pela
paciência, pelas críticas e discussões, pelo tempo e especialmente pelo carinho e
preocupação.
Ao Alexandre Cavalcanti, que nos melhores e piores momentos estava sempre
ao meu lado, crendo em mim quando eu mesma não o fazia.
Obrigada!!!
VI
RESUMO
O peixe ornamental cardinal (Paracheirodon axelrodi) é um dos caracídeos
amazônicos mais exportados. Desde 1950, os cardinais vem sendo coletados para fins
comerciais ao longo de sua distribuição natural nos tributários dos rios Negro e Orinoco
(Brasil, Colômbia e Venezuela). Somente o cardinal é responsável por 80% do total de
peixes ornamentais exportados da região amazônica. Apesar dessa importância
atualmente não existe nenhum plano de gestão da pesca ornamental. Como parte de
um esforço para desenvolver marcadores moleculares hipervariáveis para os peixes
amazônicos e contribuir com informação genética para futuros planos de manejo e
conservação, foram desenvolvidos marcadores microssatélites para o cardinal (P.
axelrodi) e adicionalmente microssatélites previamente publicados foram utilizados. A
partir de protocolo de enriquecimento para microssatélites e hibridização seletiva com
sondas oligonucleotídicas 12 microssatélites foram desenvolvidos e caracterizados
sendo que cinco mostraram-se polimórficos e apenas dois mostraram-se aptos para as
análises populacionais. Usando 6 locos de microssatélites previamente publicados a
estrutura genética de seis populações selvagens de P. axelrodi coletados em anos
distintos e provenientes dos municípios de Barcelos (Igarapé Cajarizinho, Igarapé
Zamula e Lago Rainha) e Santa Izabel do rio Negro (rio Tea, rio Urubaxi e Igarapé Iaha)
foi investigada. O polimorfismo dos locos de microssatélites foi avaliado, tendo sido
encontrado um total de 17 alelos. Estes marcadores microssatélites detectaram
quantidades substanciais de variação genética, com a heterozigosidade observada (Ho)
variando de 0.1 a 0.967 e a heterozigosidade esperada (He) variando de 0.059 a 0.938.
A maioria dos locos nas populações analisadas estavam em equilíbrio de Hardy-
Weinberg (H-WE), mas em alguns casos desvios neste equilíbrio foram observados.
VII
Além disso, houve evidências de desequilíbrio de ligação em alguns locos. De uma
maneira geral, as populações do cardinal foram caracterizadas por uma alta diversidade
genética (d = 0,744) com evidência de uma pequena estruturação genética (Fst =
0,14309), a qual pode ser revertida ou minimizada pelo fluxo gênico estimado (Nm= 1 -
9). Foi sugerido que o rio Negro não é uma barreira à dispersão do cardinal e que as
populações amostradas ainda podem ser consideradas como parte de uma única
unidade de manejo. O teste de Mantel não mostrou nenhuma correlação entre a
distância genética e a distância geográfica para as amostragens de 1999, o mesmo não
podendo ser dito para as de 2005. Diferentes resultados foram obtidos com os testes
Bottleneck e Mvalues para detectar afunilamento populacional (“bottleneck”), sendo
observado afunilamento apenas no segundo teste e em algumas populações. Concluiu-
se que o cardinal do médio rio Negro não está imediatamente ameaçado pela perda de
potencial evolutivo por eventos de longo prazo, como a pesca extrativista, ou por
eventos cíclicos de curto prazo, como o El Niño.
VIII
ABSTRACT
The cardinal tetra Paracheirodon axelrodi is the most exported Amazonian
characin. Since the mid-1950s, cardinal tetras have been harvested along their natural
distribution in the Negro, and the upper Orinoco River drainages and their tributaries in
Brazil, Colombia and Venezuela. Just the cardinal tetra constitutes over 80% of total
catch all ornamental fish exported from the Amazon region. Despite its economic
importance, no fisheries management or conservation plans are available for the
ornamental fishes in the Amazon. As part of an effort to develop hypervariable molecular
markers for Amazonian fishes and to contribute genetic information for future
management and conservation plans, microsatellite loci were developed for the cardinal
tetra (Paracheirodon axelrodi) and additional previously published microsatellites were
assayed. Starting from a protocol of enrichment for microsatellite repeat regions and
selective hybridization by using oligonucleotides as a probe, a total of 12 microsatellites
loci were developed and characterized. Although five out of 12 loci were polymorphic,
only two were adequate for population analyses purposes. By using six previously
published microsatellite loci, the genetic structure of P. axelrodi from six wild populations
collected in distinct years in the municipalities of Barcelos (Igarapé Cajarizinho, Igarapé
Zamula and Lago Rainha) and Santa Izabel do Rio Negro (Rio Tea, Rio Urubaxi and
Igarapé Iaha) was investigated. Polymorphism at all loci was assessed, with a total of 17
different alleles found. These microsatellites markers detected substantial amounts of
genetic variation, with observed heterozygosity (Ho) ranging from 0,1 to 0,967 and the
expected heterozygosity (He) ranging from 0.059 to 0.938. The most loci were at Hardy–
Weinberg equilibrium (HWE) but in some cases deviations were observed. Also, partial
evidences for linkage disequilibrium was detected. Overall, the populations were
IX
characterized by high microsatellite genetic diversity (d= 0,744) and a low genetic
structure (FST = 0,14309) which may be reversed or minimized by the estimated gene
flow (Nm =1-9). It was suggested that the Negro River did not hinder dispersal of the
cardinal tetra and that sampled populations are a single unit of management. Mantel’s
test showed no correlation between genetic distance and geographical distance for the
populations sampled in 1999 but did show a weak but significant correlation for the 2005
samples. The detection of bottlenecks gave different results for the tests implemented in
the programs Bottleneck and Mvalues; genetic bottleneck was observed only in the
second test and only in some populations. In conclusion, it was found that the cardinal
tetra in the middle Negro River is not immediately threatened by loss of evolutionary
potential either due to long term events, i.e. extrativism fisheries, or by short term
events, i.e. the cyclic El Niño.
X
ÍNDICE
FICHA CATALOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I
DEDICATÓRIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I I
EPÍGRAFE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I I I
AGRADECIMENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV
RESUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII
LISTA DE TABELAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
XII
LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
XIV
1. INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.1. O Cardinal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2. A importância de estudos genéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.3. Os microssatélites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4. Teste de hipóteses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5.1. Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2. MATERIAL E MÉTODOS 9
2.1. Material biológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
2.2. Extração de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
2.3. Eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
2.4. Técnica de microssatélite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
2.4.1. Desenvolvimento dos marcadores microssatélites
de Paracheirodon axelrodi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
XI
2.4.2. Caracterização dos primers de microssatélite . . . . . . . . . .
20
2.5. Análise genotípica e populacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.1. Desenvolvimento dos microssatélites . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.2. Análises Populacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
4. DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
4.1. Caracterização dos locos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
4.2. Variabilidade espacial e temporal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
5. CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
7. ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
7.1. Anexos I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação dos microssatélites. 5
Tabela 2 - Sinopse da amostragem do cardinal efetuada para o trabalho. 10
Tabela 3 - Primers de microssatélites desenvolvidos para a estimar a variabilidade genética de Paracheirodon axelrodi.
26
Tabela 4 - Caracterização dos microssatélites do cardinal do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada e esperada dos locos polimórficos.
29
Tabela 5 - Novo conjunto de primers de microssatélites de Paracheirodon axelrodi.
30
Tabela 6 - Caracterização dos microssatélites do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He) dos locos polimórficos.
31
Tabela 7 - Resultado dos testes cruzados realizados com 4 espécies diferentes de peixes ornamentais amazônicos. Legenda: ++ boa amplificação, + amplificação fraca ou bandas múltiplas e – não amplificou.
32
Tabela 8 - Listagem dos primers desenvolvidos para o Cardinal por Behereharay et al.(2004). Em destaque os primers selecionados para esse trabalho.
35
Tabela 9 - Dados populacionais: No de alelos, Heterozigosidade observada (Ho) e Heterozigosidade esperada (HE). Níveis de significância de P< 0,004 (após a correção de Bonferroni) correspondem a desvio de H-WE.
36
Tabela 10 - Estimativas do índice de fixação (FST - abaixo da linha diagonal) e do número de migrantes por geração (Nm - e acima da linha diagonal) para as populações analisadas.
37
Tabela 11 - Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) no conjunto de populações de cardinal.
38
Tabela 12 - Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) entre grupos de populações de cardinal coletados em tributários de margens opostas (margem esquerda X margem direita).
39
Tabela 13 - Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) entre
XIII
grupos de populações de cardinal coletados em anos distintos (1999 X 2005).
40
Tabela 14 - Índices de diversidade entre as populações analisadas 40
Tabela 15 - Comparações dos testes para redução do tamanho populacional. Nível de significância antes (*P=0,05) e após a correção de Bonferroni (**P=0,004).
41
XIV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Foto do cardinal (Paracheirodon axelrodi) e mapa de localização das áreas de coleta nos municípios de Santa Izabel Rio Negro (? ) e Barcelos (? ). 1 = rio Urubaxi, 2 = rio Iahá, 3 = rio Tea, 4 = igarapé Zamula, 5 = igarapé Cajarizinho e 6 = lago Rainha.
10
Figura 2 – Etapas do desenvolvimento dos marcadores microssatélites. 12
Figura 3 – Esquema do protocolo econômico de marcação de fragmentos de PCR com fluorescência. Adaptado de Schuelke (2000).
21
Figura 4 - DNA genômico de P. axelrodi digerido pela endonuclease de restrição Sau3AI. O destaque em amarelo corresponde à área dos fragmentos excisados. M= marcador de peso molecular.
25
Figura 5 – Sequência e identificação dos microssatélites selecionados. 26
Figura 6 – Teste de amplificação em 11 pares de primers de microssatélites de cardinal.
27
Figura 7 – Eletroferograma do loco Mic03 evidenciando três indivíduos homozigotos (A) e três heterozigotos (B).
28
Figura 8 - Extração de DNA genômico de amostras populacionais do igarapé Cajarizinho.
32
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. O cardinal
A pesca de peixes ornamentais é uma das atividades mais rentáveis para os
municípios de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro (Amazonas) gerando mais de 2
milhões de dólares anuais pela exportação. Porém, esta atividade continua sendo uma
prática de subsistência para 80% das famílias ribeirinhas, as quais de algum modo
estão envolvidas na captura e comercialização de peixes ornamentais (Prang, 2001a;
Prang, 2001b).
Os pescadores de peixes ornamentais, denominados de piabeiros, são
contratados pelos grandes exportadores e saem para capturar os peixes entre o
período da vazante e da enchente (outubro a fevereiro). Os espécimes são capturados
com apetrechos regionais de pesca (cacuri e o rapiché) e colocadas em caçapas
plásticas (54 x 36 x 20 cm) com 12 a 15 litros de água. Como medida de prevenção a
doenças, contaminação e a morte dos animais, são aplicados na água fungicidas e
bactericidas, e também são realizadas trocas regulares da água dos recipientes
evitando a morte por hipóxia e por alta concentração de amônia (Prang, 2001a; Prang,
2001b; Waichman et al., 2001).
Ainda que seja permitida a exportação de aproximadamente 200 espécies de
peixes ornamentais (MMA, 2005), a demanda comercial recai sobre um pequeno
número de espécies. Somente o cardinal (Paracheirodon axelrodi) responde por mais
de 80% do total de peixes ornamentais exportados da região Amazônica. Estima-se que
cerca de 15 a 20 milhões de cardinais sejam retirados dos rios amazônicos todos os
anos, embora se acredite que esses valores possam atingir os 40 milhões. Sendo
assim, o cardinal é a mais importante espécie de peixe ornamental da Bacia do Rio
2
Negro e uma das mais populares no mercado internacional (Chao, 2001; Harris & Petry,
2001). Embora a importância sócio-econômica dessa espécie seja notória para a região
infelizmente o cardinal carece de um plano de manejo e conservação.
O cardinal é uma espécie de pequeno porte (2 - 3 cm), que apresenta um ciclo de
vida curto de aproximadamente dois anos possui uma elevada capacidade de
repovoamento em ambientes intactos. É encontrada em áreas rasas, sombreadas e
com pouca correnteza nos tributários de água preta do alto e médio Rio Negro, no
Brasil, e nos tributários do Rio Orinoco, na Colômbia e na Venezuela (Geisler & Annibal,
1987; Prada-Pedreros, 2002; Harris & Petry, 2001). Paracheirodon axelrodi juntamente
com outras duas espécies P. simulans e P. innesi são consideradas como incertae
sedis dentro da família Characidae (Lima et al., 2003).
De acordo com Geisler & Annibal (1987), o período de reprodução dessa espécie
geralmente tem seu início no final do mês de março ou começo de abril indo até o final
do mês de junho, dependendo do nível das águas. Estes autores apresentaram vários
fatores limnológicos que estão relacionados com a sua reprodução em tributários do rio
Negro e demonstraram que esta espécie depende de áreas alagadas como os igapós e
chavascais para sua reprodução e alimentação.
Walker (2004) estudou a estratégia alimentar do cardinal e observou que em sua
dieta alimentar são encontradas larvas da ordem Diptera (Chironomidae) e
microcrustáceos (Cladocera), tendo sido notado que os itens alimentares podem diferir
entre indivíduos coletados em tributários distintos.
Recentemente, Anjos & Anjos (2006) apresentaram informações fundamentais
sobre a reprodução e o desenvolvimento embrionário e larval do cardinal tetra,
Paracheirodon axelrodi, em condições laboratoriais.
3
1.2 A importância de estudos genéticos
Para entender melhor a dinâmica das populações de espécies exploradas e
tentar levantar dados que colaborem com planos de manejo e conservação, os estudos
genéticos têm se mostrado de grande importância na caracterização e identificação de
espécies e seus híbridos, na identificação de linhagens, na determinação da
variabilidade genética em populações selvagens e cultivadas, na avaliação de impactos
genéticos com a introdução de peixes cultivados em populações naturais, na
determinação de estratégias para fins de criação e repovoamento e na localização de
marcadores ligados a genes de interesse econômico (Carvalho & Hauser, 1998). Além
disso, são cruciais na formação de estratégias de manejo e identificação de unidades
de conservação.
O emprego de marcadores moleculares do genoma nuclear (nDNA) e
mitocondrial (mtDNA) vem sendo considerados ferramentas importantes em estudos
relacionados com a estrutura de populações de peixes, uma vez que esses marcadores
são úteis na detecção de polimorfismos e fornecem informações seguras sobre os
níveis de variabilidade e similaridade entre distintas populações ou estoques. Por meio
da detecção de diversidade genética e caracterização gênica de populações e espécies
é possível uma manutenção, em longo prazo, de estoques explotáveis e da
variabilidade necessária para o melhoramento genético de espécies em cativeiro
(Hilsdorf & Krieger, 1998). A manutenção da variabilidade genética é um fator
fundamental para qualquer espécie manter a vitalidade reprodutiva, a resistência a
doenças e a habilidade para se adaptar a mudanças ambientais (Primack et al., 2001).
Há décadas a identificação de padrões genéticos tem servido de base para a
definição de estoques, na seleção de áreas de preservação e na definição de políticas
4
de manejo e conservação de peixes. Contudo, os estudos genéticos publicados sobre o
cardinal ainda são incipientes estando restritos a descrição do número cromossômico
(Scheel & Christensen, 1970; Scheel, 1973), um trabalho preliminar de cunho molecular
(Harris & Petry, 2001) e um trabalho sobre o desenvolvimento de marcadores
microssatélites (Beheregaray et al., 2004a).
1.3. Os microssatélites
No genoma dos organismos ocorrem seqüências repetitivas organizadas em
tandem de tamanhos variados. Essas seqüências podem ser usadas como marcadores
moleculares possibilitando o estudo da diversidade genética, de investigação das
relações de parentesco, mapeamento gênico e análise de paternidade. Reconhecem-se
três tipos de marcadores moleculares com seqüências repetitivas: o DNA satélite com
seqüências longas acima de 100pb (Britten & Kohne, 1968), minissatélites com
seqüências médias variando de 10 a 64pb (Jeffreys et al., 1985) e microssatélites com
seqüências curtas variando de 1 a 6pb (Litt & Luty, 1989).
Apesar de haver problemas em relação ao desenvolvimento e caracterização de
marcadores microssatélites, o elevado nível de variabilidade que pode ser detectado
por esses marcadores e a rapidez no processamento da técnica tem feito com que os
microssatélites tenham se difundido amplamente na literatura mundial, quando
comparado a outros tipos de marcadores moleculares já conhecidos (O’Connel &
Wright, 1997).
Os microssatélites podem ser encontrados em qualquer lugar do genoma, em
regiões codificantes ou não codificantes, sendo menos freqüentes nos éxons do que
nos íntrons (Hancock, 1995). São encontrados em elevada freqüência e em ampla
5
distribuição nos genomas eucariotos (Weber & May, 1989; Weber & Wong, 1993),
sendo mais comum em vertebrados que invertebrados.
Segundo Chambers & MacAvoy (2000), os microssatélites podem ser
classificados de acordo com suas repetições em: puro ou perfeito, imperfeito,
composto, composto imperfeito e complexo (Tabela 1).
Tabela 1- Classificação dos microssatélites
Classes Seqüências Puro ou Perfeito A A A A A Aou (A)5 (mononucleotídeo)
AT AT AT AT AT AT ou (AT)6 (dinucleotídeo) ATGATGATG ATG ATG ou (ATG)6 (trinucleotídeo) ATGCATGCATGCATGCATGC ou (ATGC)6
(Tetranucleotídeo) Imperfeitos AT – (CA)4 – TA –(CA)6
Composto (CT)22 – (CA)6
Composto imperfeito (AC)14 – AG – AA – (AG)12
Complexo (TC)4 – (T)6 – (CT)4 – (TTCC)2-4
A natureza da variabilidade existente nesse marcador se deve ao número de
repetições que existem nas unidades repetidas (Tautz, 1989; Weber & May, 1989).
Essas variações podem ser explicadas por dois modelos: a slippage (“deslize” ou
“escorregão”) da DNA polimerase durante a replicação (Strand et al., 1993; Tautz &
Schlötterer, 1994) e a recombinação desigual (Majewski & Ott, 2000).
Desde a última revisão sobre os microssatélites em peixes (O’Connel & Wright,
1997), vários trabalhos foram publicados. No Brasil, o desenvolvimento de marcadores
microssatélites é um fenômeno recente podendo ser encontrados trabalhos em
algumas espécies de peixes tais como o de Calcagnotto et al. (2001) que descreveram
primers (oligonucleotídeos iniciadores) de microssatélites para o pacu (Piaractus
mesopotamicus); Farias et al. (2003) que descreveram primers de microssatélites para
6
o pirarucu (Arapaima gigas); Barroso et al. (2003; 2005) que descreveram primers de
microssatélites para a pirapitinga do sul (Brycon opalinus); Beheregaray et al. (2004a;
2004b; 2005; 2006) que descreveram primers de microssatélites para os peixes
ornamentais cardinal (Paracheirodon axelrodi), nanóstomo-lápis (Nannostomus
unifasciatus), rodóstomo (Hemigrammus bleheri) e borboleta (Carnegiella strigata);
Revaldaves et al. (2005) que descreveram primers de microssatélites para o pintado
(Pseudoplatystoma corruscans).
1.4. Teste de hipóteses
Com a descrição de marcadores microssatélites para o cardinal (Beheregaray et
al., 2004a) já é possível tentar aferir a magnitude e a distribuição da variabilidade
genética existente nas populações da espécie. Espera-se que a utilização desses
marcadores moleculares responda questionamentos relevantes sobre a genética
populacional do cardinal, ou seja: estariam as populações de cardinal geneticamente
estruturadas? Haveria relação entre distância geográfica ou barreiras geográficas com
a estruturação populacional? A variabilidade genética das populações explotadas de
cardinal tem diminuido ao longo dos anos?
A resposta a tais perguntas é o cerne do que se tem convencionado de chamar
Genética da Conservação e um dos objetivos desta área é tentar explicar, de maneira
integrada, os papéis relativos dos mecanismos microevolutivos como seleção, fluxo
gênico, deriva genética, na diferenciação de populações, relacionando-os à distribuição
dos indivíduos tanto no tempo como no espaço. A análise e interpretação de aspectos
genéticos podem ser de fundamental importância para o estabelecimento de políticas
de conservação de recursos genéticos. Esta abordagem é de particular interesse para
7
espécies como o cardinal que há pelo menos 50 anos é alvo de extrativismo intensivo
na Amazônia. Há de se considerar que, até o momento, nenhum dos estudos genéticos
realizados no cardinal conseguiu demonstrar se a espécie vem conseguindo ou não
manter sua integridade genética após mais de meio século de exploração comercial
intensa.
Nesse estudo, três hipóteses relacionadas à estrutura de populações do cardinal
serão testadas:
Ho = As populações de cardinal não estão geneticamente estruturadas.
H1 = As populações de cardinal estão geneticamente estruturadas.
Se a hipótese alternativa for verdadeira, então:
Ho = A distância geográfica não explica a estruturação populacional
H2 = A distância geográfica explica a estruturação populacional
Se a hipótese nula for verdadeira, então:
Ho = Barreiras geográficas não explicam a estruturação populacional.
H3 = Barreiras geográficas explicam a estruturação populacional.
Se a hipótese nula for verdadeira, então:
Ho = As populações explotadas de cardinal nas regiões do Rio Negro não apresentam
redução nos níveis de variabilidade genética ao longo dos anos.
H4 = As populações explotadas de cardinal apresentam diminuição nos níveis de
variabilidade genética ao longo dos anos provavelmente causados pela sobrepesca
deste recurso.
8
1.5. OBJETIVOS
1.5.1. Objetivo Geral
Estudar a variabilidade genética do cardinal (Paracheirodon axelrodi) em
populações do médio Rio Negro das proximidades dos municípios de Barcelos e Santa
Izabel do Rio Negro coletadas em anos distintos.
1.5.2. Objetivos Específicos
1) Desenvolver marcadores microssatélites adicionais para a espécie
Paracheirodon axelrodi.
2) Caracterizar os locos de microssatélites do cardinal nas populações
selecionadas.
3) Identificar se existem populações geneticamente diferenciadas.
4) Verificar se o cardinal vem conseguindo manter sua variabilidade genética ao
longo dos anos analisando os níveis de variabilidade genética das
populações sob uma escala temporal.
9
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material biológico
Amostras populacionais de cardinal foram coletadas em diferentes localidades
da Bacia do médio Rio Negro, nos municípios de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro.
As coletas do cardinal foram realizadas utilizando-se apetrechos de pesca, como cacuri
e rapiché, no período de seca dos rios. Algumas amostras foram obtidas diretamente de
piabeiros e de exportadores de peixes ornamentais. As amostras populacionais
coletadas foram colocadas em tubos Falcon de 50mL contendo álcool 70% e levadas
ao Laboratório Temático de Biologia Molecular do INPA.
Nesse trabalho, foram estudadas seis populações, sendo três delas localizadas
em Barcelos: igarapés Cajarizinho e Zamula e Lago Rainha e as outras três em Santa
Izabel do Rio Negro: rios Iahã, Urubaxi e Tea (Figura 1). O Lago Rainha foi
considerado como área controle em relação à exploração do cardinal, uma vez que esta
localidade é de difícil acesso. Por outro lado, o Rio Tea foi considerado como o mais
impactado devido ao histórico de intensa exploração nessa área.
O estudo da variabilidade genética temporal dessa espécie foi realizado a partir
da obtenção das amostras populacionais em pelo menos dois anos distintos. Amostras
anteriores a 2005 foram adquiridas a partir do banco de tecidos/espécimens do
Laboratório Temático de Biologia Molecular do INPA ou da coleção ictiológica do INPA
(Tabela 2). Além de amostras de cardinal, foram obtidas amostras de outras espécies
de peixes ornamentais Paracheirodon innesi e P. simulans, Hyphessobrycon
pyrrhonotus e Carnegiella strigata.
10
Figura 1 – Foto do cardinal (Paracheirodon axelrodi) e mapa de localização das áreas
de coleta nos municípios de Santa Izabel Rio Negro ( ) e Barcelos ( ). 1 = rio
Urubaxi, 2 = rio Iahá, 3 = rio Tea, 4 = igarapé Zamula, 5 = igarapé Cajarizinho e 6
= lago Rainha.
Tabela 2 – Sinopse da amostragem do cardinal efetuada para o trabalho.
Espécie Local População No. Indivíduos Ano
UR 1999 30 1999 P. axelrodi Ig. Urubaxi UR 2005 30 2005
IH 2002 20 2002 P. axelrodi Ig. Iaha
IH 2005 30 2005 TE 1999 30 1999
P. axelrodi Rio Tea TE 2005 30 2005 Z 1999 30 1999
P. axelrodi Ig. Zamula Z 2002 20 2002
CJ 1999 30 1999 P. axelrodi Ig. Cajarizinho
CJ 2005 30 2005 P. axelrodi Lago Rainha RA 1999 14 1999 P. innesi Rio Japurá ----- 02 ------- P. simulans Rio Japurá ----- 02 ------ H.pyrhronotus
Rio Mariuá ----- 01 ----- C.strigata Rio Mariuá ----- 02 ------
11
2.2. Extração do DNA
As amostras de DNA foram extraídas de acordo com o protocolo de Sambrook et
al. (1989). Utilizou-se o tampão de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10mM, NaCl 0,3M, EDTA
10mM, Urea 4M, SDS 1%) descrito por Estoup et al. (1993) e Ashida et al. (1996).
Foram descartadas as vísceras e as escamas de cada espécime, utilizando-se somente
o tecido muscular e esquelético para realizar a extração do DNA.
O tecido foi transferido para tubos de 1,5mL contendo 500 L de TNEs-Urea,
15 L de proteinase K (10mg/mL) e 10 L de RNAse (10mg/mL) incubando-se overnight.
As amostras, em seguida, foram submetidas a três lavagens sucessivas usando 1V de
fenol, 1V de clorofane (1:1) e por último, 1V de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1).
Levando-se a centrífuga a 13.000 rpm por 10 minutos, coletando-se o sobrenadante.
Para a precipitação do DNA foi adicionado ao sobrenadante 2V de etanol 100%
e 2 L de NaCl 3M deixando no freezer por 12h. Em seguida, foram adicionados 800mL
de álcool 70%, centrifugando-se a 13.000 rpm por 15 minutos, desprezando-se o
sobrenadante. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 L de água
milliQ.
2.3. Eletroforese
Após a extração de DNA foram feitos géis de agarose 0,8%, sendo aplicado 3 L
da amostra e 3 L de azul de bromofenol. O gel foi submetido a uma corrida
eletroforética de 70V. Posteriormente, o gel foi corado em brometo de etídio (10mg/mL).
A visualização do DNA no gel foi feita no fotodocumentador Eagle Eye II (Stratagene).
12
2.4. Técnica de microssatélite
2.4.1. Desenvolvimento dos marcadores microssatélites de Paracheirodon
axelrodi
Inicialmente, o DNA de um único indivíduo foi extraído usando-se o protocolo de
Sambrook et al. (1989). O desenvolvimento da técnica para obtenção de microssatélites
seguiu o protocolo de Tenzer et al. (1999) com modificações de Farias et al. (2003), que
incluem as seguintes etapas visualizadas na figura 2 e descritas a seguir.
Figura 2 - Etapas do desenvolvimento dos marcadores microssatélites
Digestão do DNA por endonucleases
Construção de uma biblioteca genômica - Recuperação do DNA
Anelamento a adaptadores
Enriquecimento da biblioteca e hibridização dos fragmentos
Lavagem dos fragmentos usando os DynaBeads
PCR dos fragmentos hibridizados
Clonagem dos fragmentos em plasmídios
Identificação dos clones e repiquete das colônias
Sequenciamento dos clones
Triagem e desenho dos “primers”
Caracterização dos microssatélites
13
a) Digestão do DNA genômico
O DNA extraído foi submetido à digestão enzimática pela endonuclease de
restrição - Sau3AI (2U/ug), com sítio de corte 5’-/GATC-3’ e 3’-CTGA/-5’, por 2 horas..
Em seguida a amostra digerida foi precipitada de acordo com o procedimento abaixo:
1. Foi adicionado 1/10V de NaAc 3M e 2V de etanol 100%, misturou-se bem, deixando
descansar por 30 minutos no gelo. Em seguida, foi centrifugada a 14.000rpm por 15
minutos a 4oC, desprezando-se o sobrenadante.
2. Foi feita uma lavagem com 1mL de etanol 70%, misturando-se bem. Em seguida, o
DNA foi centrifugado a 14.000g por 5 minutos a 4oC, descartando-se o sobrenandante.
3. Essa amostra então foi seca em estufa e ressuspendo-a em 50uL de TE.
b) Construção da biblioteca genômica
Para a construção da biblioteca genômica foram selecionados fragmentos entre
300 a 900pb fazendo-se um gel de agarose 1%, no qual foi aplicado 50uL do DNA da
amostra e um marcador de peso molecular de tamanho conhecido (1kb). Este gel foi
submetido a uma eletroforese horizontal por 2h a 60V.
Após a corrida, foi cortado um pedaço do gel correspondente ao tamanho dos
fragmentos desejados, em seguida os mesmos foram purificados. Os fragmentos
selecionados foram, então, ligados a adaptadores (Er1Bh1Blunt 5’ CGG AAT TCA GTG
GAT CCT GCC 3’ e Er1Bh1GATCSticky 3’ GCC TTA AGT CAC CTA GGA CGG CTA G
5’) por meio das pontas coesivas deixadas pelo corte da endonuclease de restrição.
Para que isso ocorresse foi feita uma solução dos adaptadores usando 10uL de cada
adaptador (500uM), 0,8uL de NaCl 5M e 79,2 uL de TE pH 8,0. Essa solução foi
submetida a um ciclo de 95oC por 3 minutos, 65oC por 2 minutos, 45oC por 2 minutos e
25oC por 1 minuto no termociclador (Eppendorf - Mastercycler Gradient), onde os
14
adaptadores se anelaram formando os linkers. Em seguida, foi feita uma reação para
efetuar a ligação dos linkers aos fragmentos de DNA da amostra e para isso foi
preparada uma reação com 50uL de água milli-Q, 25uL de DNA, 10uL da linkers, 10uL
do tampão da enzima ligase (5X) e 5uL de T4 ligase, esse mix foi colocado no
termociclador a 16oC por 12h e 65oC por 20 minutos.
Com o intuito de enriquecer o produto de ligação e evitar a seleção e exclusão
casual de fragmentos, o produto da reação da ligação foi reamplificado apenas com o
primer Blunt usando-se 11,7uL de água milli-Q, 2,5 uL dNTP (25mM), 3,0uL de MgCl2,
2,5 uL de Tampão 10X, 4ul de primer Blunt (2uM), 0,3 Taq DNA polimerase e 1,0uL do
produto de ligação. O perfil da reação foi de um ciclo de 72º C por 5 minutos e em
seguida 30 ciclos de 94º C por 35s, 53º C por 35s, 72º C por 1minuto e 30s, 72º C por 7
minutos e mantido a 4º C até a retirada do material do termociclador. O produto dessa
amplificação foi purificado usando kit de purificação GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification (GE - Amersham Bioscience). Nesse procedimento, em cada coluna de
purificação havia 5 reações da PCR.
c) Hibridização dos microssatélites
O primeiro passo para o enriquecimento da biblioteca genômica foi a hibridização
de fragmentos com sondas contendo repetições dinucleotídicas CA e CT marcadas
com biotina, que serão catalisadas pela enzima terminal transferase.
Para a biotinilização das sondas, inicialmente as sondas foram preparadas com
as repetições de CA e CT numa concentração de 40uM, e então num tubo de 1,5mL
adiciona-se uma solução contendo: 21uL de água, 8uL de tampão 5X da terminal
transferase, 8uL de sonda 100uM, 2,5uL de d-UTP biotina (Boehringer Mannheim) e
0,5uL de terminal transferase. Esse mix foi colocado em banho-maria a 37oC por 25
15
minutos. Após esse tempo, foi adicionado 100uL de etanol 100% e 4uL de acetato de
sódio 3M, colocando-se no freezer por uma noite (-20oC). No dia seguinte, o mix foi
submetido a uma centrifugação de 13.000 rpm por 30 minutos, desprezando-se
sobrenadante. Foi, então adicionado 100uL de etanol 70% e novamente foi centrifugado
a 13.000rpm por 30 minutos. O álcool foi descartado, o tubo foi seco em temperatura
ambiente e depois foi ressuspendido em 100uL de água milli-Q.
Em seguida foram preparados os dynabeads (contas magnéticas), fazendo-se
inicialmente uma lavagem prévia com solução tampão de ligação e lavagem para a
retirada da solução de 0,02% de NaN3 na qual vêm imersos os dynabeads. Somente,
então, foi seguido o procedimento abaixo:
1. Foi encostado um imã pela parte de fora do tudo de 1,5mL de forma que os
dynabeads ficassem aderidos a parede do tubo possibilitando a remoção do líquido
com uma pipeta.
2. Foi adicionado 200uL de solução PBS/BSA homogeneizando-se bem.
3. Encostou-se o imã novamente por fora do tubo para a retirada do líquido. Repetindo-
se esse procedimento por mais duas vezes.
4. Foi adicionado 200uL da solução tampão de ligação e lavagem e homogeneizando-
se manualmente.
5. Alíquotas de 100uL foram feitas, guardando-as na geladeira.
As sondas biotinizadas e os dynabeads foram ligados adicionando-se 100uL da
soda biotinizada em 100uL de dynabeads e em seguida, essa mistura ficou em
temperatura ambiente por 1 hora e depois foi colocada na geladeira.
Previamente o hibridizador foi colocado a temperatura de 60oC e em seguida
preparou-se soluções TE 1M com NaCl 5M; e soluções de SSC – SDS em diferentes
16
concentrações: 5X SSC (0,1% SDS), 10X SSC (0,2%SDS) e 2X SSC (0,1% SDS);
sendo que as soluções 5X SSC (0,1% SDS) e 2X SSC (0,1% SDS). Em um tubo de
0,2mL colocou-se 150ul do produto da PCR purificado e o submeteu a um ciclo de 95oC
por 5 minutos para desnaturar o DNA e imediatamente foi mantido em gelo.
Somente agora a hibridização dos fragmentos com microssatélites potenciais foi
realizada seguindo-se as etapas abaixo:
1. O volume de 200uL de sondas biotinizadas e os dynabeads foram lavados duas
vezes com 200uL de tampão ligação e lavagem.
1. Encostou-se um imã por fora do tubo para descartar o sobrenandante com a pipeta.
2. Foi feita uma lavagem com 200uL de 5X SSC (0,1% SDS) não aquecido.
3. Novamente foi encostado o imã na parede externa do tubo e foi descartado o
sobrenadante com a pipeta.
4. Foi adicionado 150uL da solução 10X SSC (0,2% SDS) aquecida. E esse mix foi
colocado no hibridizador.
5. Foi adicionado o produto de PCR da ligação desnaturado
6. Esse complexo permaneceu no hibridizador em rotação por 4h a 60oC, invertendo-
se o tubo manualmente algumas vezes.
7. Depois desse período, o complexo foi lavado invertendo-se vagarosamente o tubo
por 5 minutos, em temperatura ambiente, usando 200uL da solução 2X SSC
(0,1%SDS). Repetiu-se esse procedimento por mais 2 vezes.
8. O imã foi usado mais uma vez por fora do tubo e o sobrenadante foi descartado
9. Foi adicionado 200uL da solução 2X SSC aquecida recolocando-se o tubo no
hibridizador em rotação por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado usando-se
novamente o imã.
17
10. Foi adicionado 200uL da solução TE/NaCl. Foi usado novamente o imã por fora do
tubo para descartar o sobrenadante.
11. Esse produto foi ressuspendido em 200uL TE.
Ao final desse processo faz-se uma PCR teste com o objetivo de verificar o
produto hibridizado usando para isso: 9,2uL de água, 5,0uL de dNTP, 3,0uL de MgCl2,
2,5uL de Tampão da Taq, 4,0uL de Er1Bh1Blunt 10uM, 0,3 Taq. A PCR foi colocada
num termociclador por 30 ciclos de 94oC por 1 minuto, 55oC por 1 minuto, 72oC por 1
minuto e 72oC por 2 minutos. Em seguida foi feito um gel de agarose 1% para verificar a
amplificação numa corrida eletroforética a 70V.
d) Amplificação por PCR dos microssatélites hibridizados
Esta amplificação foi feita com 16 tubos de 0,2mL para cada repetição (CA e CT)
usando 11,2 uL de água, 3,0uL de dNTP (2,5uL) , 3,0uL de MgCl2 (25mM) , 2,5ul de
Tampão, 4,0uL de primer Blunt (10uM), 0,3uL de taq e 1,0uL de produto hibridizado,
colocou-se em um termociclador para 15 ciclos a 94oC por 1 minuto, 55oC por 1 minuto,
72oC por 1 minuto, 72oC por 30 segundos. Grupos de 4 PCRs foram misturados e
purificados numa única coluna eluindo-se o DNA purificado em 30uL de tampão TE. Ao
final, obteve-se 120uL do produto hibridizado para ser ligado ao vetor pela
transformação genética.
e) Ligação
O produto da PCR foi ligado então ao vetor usando o Original TOPO TA cloning
Vector Kit (Invitrogen), usando 4,5 uL de DNA, 0.5 uL de Topo vector e 1uL de Salt
(ATP, MgCl2), sendo homogeneizado a temperatura ambiente por 25 minutos. Em
seguida deu-se prosseguimento de acordo com os passos abaixo:
18
1. O material para a ligação foi colocado em tubos com células competentes e deixando
agir por 30 minutos sobre o gelo. Em seguida o material foi colocado a 42oC por 50
segundos e depois em gelo por 3 minutos.
3. Foi adicionado 600uL de SOC ou meio LB (pré-aquecido a 37oC) mantendo em baixa
agitação por 1 hora. Após esse procedimento o material foi inoculado em placas de
cultura. Deixando as bactérias crescerem overnight à 37oC.
Para fazer a transformação genética fez-se as seguintes etapas:
1. Foi coletada uma colônia isolada de DH5a, para que fosse inoculada num tubo
contendo 3 mL de meio L (líquido) e deixando-se overnight a 37oC. Posteriormente, foi
inoculado 300uL de meio de cultura e deixou-se overnight em 30mL de meio L.
2. Deixou-se crescer a 37oC (estufa) agitando-se (100-150rpm) por 4h até atingir 0,3 a
0,4OD, para que as células fossem coletadas e colocadas em 50mL de cultura.
3. As células foram centrifugadas a 200g por 15 minutos. E em seguida, descartou-se
o sobrenadante, ressuspendendo delicadamente o sedimento em 1mL de tris-cálcio.
Deixou-se no gelo por no mínimo 15 minutos.
4. Foi transferido 50uL de células competentes para um tubo pré-resfriado. E
adicionou-se 5uL de DNA plasmidial sendo mantido em gelo por 1 hora e depois se
executou um choque térmico de 42oC por 2 minutos. E deixando-se descansar à
temperatura ambiente.
5. Foi adicionado 800uL do meio líquido incubando o sistema por 1 hora a 37oC (para
restaurar as paredes das bactérias). Em seguida, fez-se o plaqueamento das células
transformadas em meio a-ágar sólido contendo marcador (ampicilina 10ug/mL) e foi
incubado a 37oC overnight.
19
f) Repique das colônias positivas
1. Após o crescimento bacteriano, fez-se o repiquete das bactérias crescidas em placas
de 96 poços contendo 150uL de LB-líquido com ampicilina (100ug/mL).
2. Com palitos de dentes esterilizados foram realizadas transferências das colônias
para cada poço. E em seguida, foram ser incubadas a 37oC overnight.
g) Amplificação dos SSR usando o primer universal M13
Foi feito uma PCR de alíquotas das células a partir do crescimento overnight
com 11,7uL de água, 3uL de MgCl2, 2,5uL de tampão (10X), 2,5uL de dDNTP (2.5mM),
2uL de cada primer (M13F e M13R à 2pmol/uL), 0,3uL de Taq (5U/uL) e 1uL de DNA
(clones). A PCR baseou-se no programa de 35 ciclos de 94oC por 5 minutos, 92oC por 1
minuto para a desnaturação, 50oC por 40 segundos para o anelamento dos primers,
72oC por 1minuto e 30 segundos extensão, 72oC por mais 5 minutos. O produto da
PCR em seguida foi purificado.
h) Sequenciamento dos fragmentos para o desenho dos primers.
Para os sequenciamento nucleotídico foram usados os primers internos T3: 5’-
ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA – 3’ e T7: – TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’
numa reação que foi utilizado 2uL de ET, 2uL de tampão, 2uL de primer e 4uL de DNA.
O termociclador foi programado para um total de 35 ciclos de 95oC de 20 segundos,
55oC para 15 segundos e 60o por 1 minuto. As amostras foram lidas no seqüenciador
automático MegaBace 1000 DNA Analysis system (Amersham Biosciences). Em
seguida as seqüências obtidas foram salvas em formato abd e analisadas no programa
BioEdit (Hall, 1999) verificando-se a existência, a qualidade, o polimorfismo e a
classificação dos microssatélites. Os marcadores microssatélites foram classificados de
acordo com Chambers & MacAvoy (2000). Os primers foram desenhados com auxílio
20
do programa Primer 3 (Rozen & Skaletsky, 2000) e posteriormente encomendados sua
síntese em firmas comerciais especializadas. Cada um dos primers forward foi
sintetizado com uma cauda do primer M13(-18pb) com vistas a posterior incorporação
de fluorescência, como sugerido pela metodologia econômica descrita por Schuelke
(2000). O primer universal M13: 5’- TGT AAA ACG ACG GCC AGT – 3’ marcado com
fluorescência FAM foi encomendado de firmas comerciais especializadas.
2.4.2. Caracterização dos marcadores de microssatélites
Uma vez sintetizados os primers, foram realizados testes de amplificação e de
genotipagens em 24 amostras de Paracheirodon axelrodi provenientes de uma mesma
localidade. No processo de genotipagem, as reações da PCR foram feitas utilizando
quantidade específicas das seguintes substâncias: 4,3 uL de água, 1,5uL de Tampão
(10x), 0,8uL de dNTP (2,5mM), 0,7uL de MgCl2(25mM), 0,5uL de Primer M13 Foward
(2mM), 1uL de Primer Reverse, (2mM), 0,3uL de Taq (5U/uL) e 1,5 uL de DNA.
As condições de termociclagem foram programadas de modo a ocorrer nos
ciclos iniciais a incorporação do primer M13 forward fluorescente ao produto da PCR.
Assim, utilizou-se o método “touchdown”. Desta forma quando o primer forward fosse
totalmente usado ao final dos 21 ciclos iniciais, a temperatura de anelamento nos 09
ciclos finais seria reduzida para 53oC facilitando o anelamento do primer universal M13
a região complementar no primers forward. Dessa maneira, o primer universal marcado
com a fluorescência M13(-18) agiria como o primer forward incorporando a
fluorescência FAM ao produto de PCR (Figura 3).
21
Figura 3 - Esquema do protocolo econômico de marcação de fragmentos de PCR com
fluorescência. Adaptado de Schuelke (2000).
Após a PCR foram selecionadas aleatoriamente algumas amostras para que
fossem verificadas as amplificações em gel de agarose 3,5%, dependendo da
intensidade de amplificação dos fragmentos as amostras foram diluídas 10 ou 20 vezes.
Foi feita uma reação de genotipagem em placa de 96 poços, usando-se 7,75uL de
Tween 0,1%, 0,25uL de ET size standard 400R e 2uL do DNA diluído. As amostras
foram lidas no analisador automático de DNA MegaBace 1000 DNA Analysis System
(Amersham Biosciences).
Os procedimentos de amplificações por PCR das regiões de microssatélites e
das reações de genotipagens foram usados também para os primers desenvolvidos
para essa espécie por Beheregaray et al. (2004a) nesse estudo.
22
2.5. Análise genotípica e populacional
A análise genotípica foi realizada no programa MegaBACE Fragment Profiler v.
2.0 (Amersham Biosciences) onde puderam ser verificados o tamanho e número de
repetições de cada alelo por indivíduo e por população. De posse desses dados, foi
construida uma matriz com as informações dos genótipos dos indivíduos de P. axelrodi
para serem feitas às análises estatísticas das populações amostradas.
Para as análises populacionais foi utilizado o programa Arlequin V. 3.0 (Excoffier
et al., 2005) verificando o nível de variabilidade genética e os parâmetros populacionais
da espécie. Desta forma, variações no tamanho dos locos microssatélites foram
determinadas através das heterozigosidades observada e esperada, testadas para o
equilíbrio de Hardy-Weinberg, para o desequilíbrio de ligação e para a divergência na
freqüência alélica e genotípica entre as populações, como descrito a seguir.
O polimorfismo genético foi estimado através do número de alelos (A) por loco
observado-se a heterozigosidade observada e heterozigosidade esperada. Foram
realizados testes para verificar se houve desequilíbrio de ligação para todos os pares
de locos dentro de cada população e para verificar se estavam em equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Foi realizado o teste exato para H-WE através do cálculo da Cadeia de
Markov, para fornecer uma estimativa imparcial da probabilidade do H-WE dos alelos
microssatélites em cada população. Foi realizado o cálculo da Cadeia de Markov, para
fornecer uma estimativa imparcial dos desvios do H-WE dos alelos microssatélites em
cada população.
A diferenciação entre as populações foi estimada pelos valores FST par-a-par
proposto por Wright (1969) enquanto as estimativas de fluxo gênico foram obtidas
número de migrantes entre as populações (Nm). Considerando que menos de 20 locos
23
de microssatélites foram utilizados no presente trabalho, optou-se em analisar os dados
usando-se o FST de Wright ao invés do RST de Slatkin (Slatkin, 1995), seguindo a
proposição de Gaggiotti et al. (1999) para situações desse tipo.
A análise da variância molecular foi efetuada com o auxílio do AMOVA (Excoffier
et al., 1992) com intuito de verificar a estrutura genética encontrada dentro e entre as
populações analisadas, levando-se em conta o número de mutações entre os alelos e a
variação total em diferentes componentes.
Ainda no Arlequin, foi realizado o teste de Mantel (Mantel, 1967) para testar a
significância das relações entre distância geográfica e os valores de FST para todos os
pares de população analisadas.
A significância de todos os resultados das análises foi avaliada por testes de
permutação (3000 replicações) e todos os níveis de significância para os testes
envolvendo comparações múltiplas foram ajustados seguindo a correção de Bonferroni
(Rice, 1989).
Para verificar se as populações experimentaram algum evento relacionado a
redução no tamanho populacional foram aplicados dois programas: Bottleneck (Piry et
al., 1999) e MValues (Garza & Williamson, 2001). O primeiro avaliou os casos de
excessos heterozigosidade observada (He), situação típica de populações que sofreram
afunilamentos (“bottleneck”). As probabilidades obtidas por este programa foram
derivadas do Teste de Wilcoxon que permite um bom poder de análise utilizando-se um
número pequeno de locos (Luikart et al.,1997). O segundo programa, avaliou a razão
(M) entre o número de alelos (k) e os seus tamanhos (r), visto que populações que
sofrem afunilamentos tendem a extinguir alelos em baixa frequência. Assim, a perda de
qualquer alelo contribuirá para a redução em k, enquanto que a perda do maior ou
24
menor alelo contribuirá para a redução de r. De acordo com Garza & Williamson (2001)
valores de M abaixo de 0.68 são uma forte indicação de redução no tamanho
populacional.
Os testes de redução populacional tiveram como base os seguintes modelos: o
modelo dos alelos infinitos (IAM - Kimura & Crow, 1964) em que cada nova mutação
produz um novo alelo e a similaridade de alelos entre as amostras é inferida como
resultado tanto de fluxo gênico como de tempo recente de coalescência; o modelo de
mutação aos passos (SMM - Ohta & Kimura, 1973; Kimmel et al., 1996) em que cada
mutação é causada por uma mudança simples no tamanho do alelos, indicando que a
mutação age aumentando ou diminuindo o tamanhos das unidades repetidas e que por
isso alelos com tamanhos próximos tendem a ser mais similares que aqueles com
tamanhos distantes e o modelo de duas fases mutacionais (TPM) que incorpora o SMM
permitindo, porém, uma variação maior na magnitude das mutações, assumindo que as
mutações ocorre através de múltiplas unidades de repetição (Di Rienzo et al., 1994).
25
3. RESULTADOS
3.1. Desenvolvimento dos microssatélites
A partir de um exemplar de Paracheirodon axelrodi foi estabelecida com sucesso
uma biblioteca genômica com vistas à obtenção de marcadores microssatélites. O DNA
foi clivado com a endonuclease de restrição Sau3AI para em seguida ter fragmentos
entre 300 a 900pb excisados, como mostra a Figura 4. No processo de varredura de
182 clones de bactérias transformantes, 384 seqüências de DNA foram geradas e
verificou-se que somente os clones enriquecidos com sondas CT proporcionaram bons
resultados.
Figura 4 - DNA genômico de P. axelrodi digerido pela endonuclease de restrição
Sau3AI. O destaque em amarelo corresponde à área dos fragmentos excisados. M=
marcador de peso molecular.
No processo de seleção das seqüências de DNA com microssatélites dois
critérios básicos foram observados: o tipo de repetição desse marcador (perfeitos,
imperfeitos ou compostos) e a proximidade dessa repetição em relação ao vetor de
clonagem. Dentro desses parâmetros foi possível selecionar 12 marcadores
microssatélites e desenhar primers para amplificá-los (Figura 5; Tabela 3).
SAU 3A IMarcador SAU 3A IMarcador
26
Figura 5 – Sequência e identificação dos microssatélites selecionados.
Tabela 3 – Primers de microssatélites desenvolvidos para estimar a variabilidade genética de Paracheirodon axelrodi.
Nome
Primer Primer pb Repetição Classificação
Mic01 F: CCCGGTGGGAATTAACTGCTC R:GGCCCTCTCTGGTGAGAATAGG
210 (CT)3CACTCG(CT)10 Composto
Mic02 F: TGGCCACATCACCACCACAT R: TGTTGGTCTCCCTACACTCTCTCC
208 (CT)20 Perfeito
Mic03 F: TGGGCCTAATATCCAACCCACA R:ACTCACAAATGGGTCAAAGTCCAC
160 (CA)15 Perfeito
Mic04 F: CAAGGGAATGTGATGAGAATGAAGG R: TCCTCATCCATACACAGTTCAATGAC
120 (CT)13 Perfeito
Mic05 F: GCGAGCCTGGGAGTCCACTA R: GCAGCGGATCCTGCTACAAAGC 224 (CT)14(CA)20 Composto
Mic06 F:TCGCAAGTTCTGCTGCCAAG R: GACACGCACTTGAGACGGACA
269 (TC)17 Perfeito
Mic07 F: AGGGCCGCGTTTCTAAAAGC R:GGTGGTTGAGCGAGCTTTTCA
106 (CT)12CACT Imperfeito
Mic08 F: CTGGTTGAGCGCTTCTGTACG R: TAATGCATGCTGATGGGGAGAAA
212 (TC)4ACCAC(TC)2(TTC)2(TC)6(AC)3(TC)5
Imperfeito
Mic09 F: CCTGTCCTCCTGTCCCTGCT R: CTGCCACAGAACCCGGAATG
120 (CA)10 Perfeito
Mic10 F: TGCCTGATAAACACCCGCTCT R: GTGCTGCTTTAAATGCATGGTTGA
152 (TC)3TT(TC)4TT(TC)3TT(TC)10
Composto
Mic11 F: GGTCGCGGTGAGAGCAAACT R:TGCCATCAAATTCTACTCGTAAGAACG
251 (TC)4TA(TC)9 Composto
Mic12 F: CCAAGCACAGTCGCTCTCCA R:TGCCAGGACTGTTTGTCCACAT 156 (CT)3TT(CT)7 Composto
27
Na fase de caracterização dos microssatélites, logo após a síntese dos
primers,
várias reações de PCR foram executadas para averiguar a amplificação ou não do DNA
amostral. Inicialmente, foram utilizados 8 indivíduos provenientes de uma única
população (Rio Uneiuxi), variando-se a temperatura de anelamento (53oC a 62o) para
cada primer. Objetivou-se com isso, verificar a qualidade e o tamanho dos produtos
amplificados. No gel de agarose, já foram detectadas diferenças no tamanho dos
produtos amplificados. Observou-se ainda, que a maioria dos primers teve uma
amplificação positiva, muito embora tenha sido identificada a amplificação de bandas
inespecíficas em alguns primers (Mic01, Mic 07 e Mic09) e a não amplificação do primer
Mic02 (Figura 6).
Figura 6 – Teste de amplificação em 11 pares de primers de microssatélites de cardinal.
28
Após os testes de amplificação que definiram as temperaturas ótimas de
anelamento de cada primer, foi realizada uma bateria de genotipagens com o objetivo
de caracterizar os alelos detectados por esses primers. O processo inicial de
genotipagem envolveu as seguintes etapas: 1) identificação dos primers monomórficos
e polimórficos; 2) identificação dos indivíduos homozigotos e heterozigotos; 3)
identificação do número e tamanho dos alelos; 4) identificação de problemas de picos
inespecíficos (ruído). Na Figura 7 e na Tabela 4 são mostradas algumas destas etapas.
A caracterização inicial dos microssatélites permitiu a separação desses
marcadores moleculares em três grupos genéricos: polimórficos (Mic03, Mic04N,
Mic05N, Mic06, Mic08, Mic09 e Mic11), monomórficos (Mic10) e nulos ou sem
amplificação (Mic01, Mic02, Mic07 e Mic12). O tamanho máximo alélico encontrado
entre todos os locos analisados foi de 278pb no Mic06 enquanto que o tamanho mínimo
encontrado foi de 145pb no Mic03. A variação alélica máxima encontrada dentre os
diferentes locos analisados foi de 12 alelos por loco (Tabela 4).
Figura 7 – Eletroferograma do loco Mic03 evidenciando três indivíduos homozigotos (A)
e três heterozigotos (B).
A B
29
Tabela 4 – Caracterização dos microssatélites do cardinal do rio Uneiuxi observando o
tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada e esperada dos
locos polimórficos.
Primers polimórficos Primer
Monomórfico
AMOSTRAS
Mic03 Mic04_N
Mic05_N
Mic 06 Mic 11 Mic08 Mic09 Mic10
UN 02 - - 231
266
196
198
- - 259
265
230
232
102
108
- -
UN 05 157
157
225
235
198
200
- - 263
265
230
232
102
108
- -
UN 06 - - - - 198
200
- - 263
265
230
232
102
108
- -
UN 07 - - 225
225
- - - - 230
232
102
108
154 154
UN 10 - - 231
237
198
200
- - 263
265
230
232
102
108
- -
UN 11 155
171
223
231
198
200
- - 263
265
- - - - - -
UN 13 149
153
- - 198
200
262
278
263
265
230
232
102
108
154 154
UN 14 151
165
231
233
198
200
264
278
263
265
230
232
102
108
- -
UN 15 149
157
- - 198
198
266
274
230
232
102
108
- -
UN 16 153
173
233
239
- - 258
266
263
265
230
232
102
108
154 154
UN 17 149
149
219
231
198
200
252
266
230
232
102
108
154 154
UN 18 145
165
- - 198
200
252
266
230
232
102
108
154 154
UN 19 165
165
219
223
198
200
264
266
263
265
230
232
102
108
- -
UN 20 - - 235
237
198
200
252
266
265
271
230
232
102
108
- -
UN 21 151
157
219
225
198
200
252
266
263
265
230
232
102
108
154 154
UN 22 149
177
227
231
198
200
262
266
277
267
230
232
102
108
- -
UN 23 149
165
227
227
- - 266
268
- - - - 102
108
154 154
UN 24 153
153
221
235
- - 262
264
263
265
230
232
102
108
154 154
UN 25 151
165
225
233
198
200
268
274
247
263
230
232
102
108
154 154
UN 26 149
175
221
235
- - 266
266
263
261
- - 102
108
154 154
UN 27 149
151
241
243
- - 264
266
263
265
230
232
102
108
- -
UN 28 155
153
231
239
- - 252
266
261
263
- - - 154 154
UN 29 155
153
225
233
- - 252
266
- - 230
232
102
108
154 154
UN 30 155
163
231
237
- - 252
274
265
263
230
232
102
108
- -
No.alelos 12 12 3 8 8 2 2 1
30
Alguns problemas foram detectados durante as genotipagens: 1) os primers Mic01,
Mic04, Mic05 e Mic08 apresentaram alelos com muitos ruídos. Para solucionar este
problema a temperatura de anelamento dos primers foi aumentada mas o problema
permaneceu, o que levou a síntese de novos primers com novas sequências (Tabela 5).
Mesmo assim, os problemas com o Mic01 não foram resolvidos; 2) No primer Mic02,
não foi possível detectar alelos; 3) os primers Mic4N, Mic5N, Mic06 e Mic10
apresentaram problemas no cálculo do número de repetições dos microssatélites e por
esse motivo não foram selecionados para as análises populacionais; 4) os primers
Mic08 e Mic09 só apresentaram indivíduos heterozigotos nas genotipagens (alelos
230/232 e 102/108, respectivamente). Esses marcadores foram novamente
genotipados e o padrão se manteve. Por essa razão, esses primers também não foram
selecionados para as análises populacionais.
Tabela 5 – Novo conjunto de primers de microssatélites de Paracheirodon axelrodi.
Nome Primer Primer pb Repetição Classificação
Mic01N F2: GAAATCAACCCGGTGGGAAT R2: GATGCGGCCTCCTTTCAGAG
149 (CT)3CACT CG(CT)10 Composto
Mic04N F2: TGCCCCTCGCACAACAGATA R2: CTCCTCATCCATACACAGTTCAATG
210 (CT)20 Perfeito
Mic05N F2: TCATGAGTGCTCTGGCTGAATACC R2: CTGCTACAAAGCGTGTAATAGCACT
280 (CA)15 Perfeito
Mic08N F2: CAGACAGGGTGGGGTCTAAAGAA R2: ATTGTAATGCATGCTGATGGGGAG
250 (CT)13 Perfeito
31
Para o cálculo da heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada
(HE) dos locos polimórficos inicialmente foram selecionados os primers Mic03, Mic04N,
Mic05, Mic06 e Mic11. Observou-se uma variação da He de 0,544 e 0,939, enquanto
que a variação na HO foi de 0,818 a 1.0. Foi observado nos locos mic05 e mic11 que a
heterozigosidade observada foi superior a heterozigosidade esperada (Tabela 6) isso
provavelmente deveu-se a desequilíbrio de ligação.
Tabela 6 – Caracterização dos microssatélites do rio Uneiuxi observando o tamanho,
temperatura de anelamento, heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade
esperada (He) dos locos polimórficos.
Tamanho
Locos (bp) No. de Alelos T( C)
Ho He
Mic03 163-195 12 59 0.818
0.919
Mic04N
237-265 11 58 0.916
0.939
Mic05N
190-220 3 62 0.933
0.544
Mic06 265-300 7 60 0.950
0.837
Mic11 245-280 8 61 1.000
0.764
Como parte da etapa de caracterização dos primers foram realizados testes de
amplificação cruzada (interespecífica) em 2 espécies do gênero Paracheirodon (P.
innesi e P. simulans) e duas outras espécies de peixes ornamentais (Hyphessobrycon
pyrrhonotus e Carnegiella strigata), utilizando-se 11 dos 12 primers sintetizados. Com
exceção de C. strigata, que não teve nenhum produto amplificado, foi observado uma
variação na qualidade do produto amplificado (Mic03, Mic04, Mic05, Mic06, Mic08,
Mic11) ou ausência de amplificação (Mic01, Mic07, Mic09, Mic10, Mic12) (Tabela 7).
32
Tabela 7 - Resultado dos testes cruzados realizados com 4 espécies diferentes de
peixes ornamentais amazônicos. Legenda: ++ boa amplificação, + amplificação fraca ou
bandas múltiplas e – não amplificou.
Espécies Mic01
Mic03
Mic04
Mic05
Mic06
Mic07
Mic08
Mic09
Mic10
Mic11
Mic12
P. innesi - + + - ++ - + - - + - P. simulans - + ++ ++ + - + - - ++ -
H. pyrrhonotus - - ++ + ++ - + - - ++ -
C. strigata - - - - - - - - - - -
3.2. Análises populacionais
As amostras populacionais analisadas totalizaram 294 espécimes de seis
populações coletadas. As populações do Tea, Urubaxi e Cajarizinho foram amostradas
nos anos de 1999 e 2005. A população do Iahá foi amostrada nos anos de 2002 e
2005. A população do Zamula foi amostrada nos anos de 1999 e 2002. Já a população
do Rainha foi amostrada apenas em 1999. O DNA de amostras representativas dessas
populações pode ser visto na Figura 8.
Figura 8 – Extração de DNA genômico de amostras populacionais do igarapé
Cajarizinho.
33
Após a etapa inicial de caracterização dos primers (item 3.1) apenas 2 primers
desenvolvidos nesse trabalho foram considerados ideais para análises populacionais:
Mic03 e Mic11. Os locos detectados por esses primers foram polimórficos em todas as
populações, tendo uma variação alélica de 06 a 20 alelos. Não foi observado nenhum
problema quanto ao número de repetições em todas as 11 populações amostradas
nesse estudo. Entretanto, próximo do final do trabalho esses primers pararam de
funcionar, não em relação a qualidade das amplificações mas sim em relação ao
padrão de genotipagem. Postulou-se que a fluorescência FAM adicionada aos primers
tenha perdido o seu poder de excitação e impossibilitado a detecção de alelos desses
microssatélites ao passar pelo feixe de laser do analisador de DNA.
Para não comprometer os objetivos propostos para o trabalho foram utilizados os
primers desenvolvidos por Beheregaray et al. (2004a) (Tabela 8). Todos os primers
desenvolvidos por estes autores foram testados e analisados conforme o item 3.1
atentando-se para as etapas: 1) identificação dos primers monomórficos e polimórficos;
2) identificação dos indivíduos homozigotos e heterozigotos; 3) identificação do número
e tamanho dos alelos; 4) identificação de problemas de picos inespecíficos (ruído). Dos
14 primers desenvolvidos pelos autores foram selecionados seis primers para serem
utilizados nas análises populacionais (Tabela 9).
Assim, a partir dos marcadores Pa07, Pa13, Pa19, Pa26, Pa32 e Pa 37 foi
construída uma matriz de dados com o tamanho dos alelos por locos (anexo 1)
verificando-se, ainda, a variação alélica de cada microssatélite nas 11 amostragens
populacionais e analisando-se o grau de polimorfismo apresentado.
34
Foram realizadas algumas análises no programa computacional Arlequin
(Excoffier et al., 2005) de forma que pudesse ser detectado os índices de variabilidade
genética da espécie e que respondessem as hipóteses propostas no trabalho.
Conforme observado na Tabela 9, o maior número de alelos foi encontrado nas
amostras populacionais coletadas em 2005 nos rios Urubaxi e Tea (Pa32 com 17
alelos), enquanto que o menor número de alelos foi encontrado em amostras
populacionais do Iaha (Pa26), Rainha (Pa13 e Pa19), Zamula (Pa26) e Cajarizinho
(Pa32) todas com apenas três alelos. As heterozigosidades observada (Ho) e esperada
(He) foram calculadas para todos os locos analisados, sendo que o menor valor de
heterozigosidade observada encontrado foi de Ho = 0.1 (Pa32 - CJ1999) e o maior valor
encontrado foi de Ho = 0.967 (Pa19 - UR1999), enquanto que o menor valor de
heterozigosidade esperada foi de He = 0.059 (Pa37 - TE1999) e o maior valor
encontrado foi He = 0.938 (Pa32 – UR2005). Observou-se que a maioria dos locos
(87,5%) apresentou níveis de heterozigosidade observada acima de 0.5 e que em
alguns locos houve um desvio no H-WE (P< 0.004) (Tabela 9). O equilíbrio de Hardy-
Weinberg (H-WE) pressupõe uma condição genética ideal caracterizada pela união
aleatória de alelos de uma população infinitamente grande, em que não há seleção ou
mutação como forças atuantes na população.
A comparação entre os FST e número de migrantes (Nm) por geração pode ser
visualizada na Tabela 10 onde pôde se observar que o Nm varia de 1 a 9 indivíduos na
população e que o padrão de FST entre as populações é praticamente o mesmo.
35
Tabela 8 – Listagem dos primers desenvolvidos para o Cardinal por Behereharay et
al.(2004). Em destaque os primers selecionados para esse trabalho.
Primer Seqüência do primer Primer Seqüência do primer
Pa1 F: TGAAGACGAGGCAAGCTACA
R: GTGGAGCACATGATCACAGC Pa26
F: TCAGGCTTGCTGTTCTCTG
R: CATTAAACCCAGCGTTAGC
Pa4 F: CAGTCCCTGCTGGAGTCCTA
R:TGGAACATATTGTGTCAGCAG
Pa27 F: CATATCGCCCACACATGAAG
R: GAAACGGAGCCTGTATTGGA
Pa7 F: CTGAGGTTTACCGACACTGC
R:CCGCCTTCAGATCTTTCTCA Pa32
F: TGGTTTTGACTTACCGCTG
R: CAACGATATTGTGTTCAACTC
Pa8 F: ACATGACCCAGAGCCAAGTC
R: TAGCCTCAAACGGTCAGAGA Pa33
F: ACAAGGAGACTAAACAAGGATG
R: CTGAGCCATGTAAGGCATAAGG
Pa11 F: GCGAATGGTCTCTGATTGG
R: TGTGAAAAATGAAGCGAGG Pa34
F: TAAGCAGGGACTGACCGAG
R: ATGCTGCAACACAAAAGATAC
Pa13 F: ACGAATGTGGGGACACAAAG
R: AACACATCAGGCTGGTCCTC Pa37
F: GGAGAAGGGGCGTTATTAGC
R: GTATACAGGCATATGGGGCG
Pa19 F: GAGGTGTGAGATGGTTG
R: CACGGTAAGCTGATAGTTTG Pa39
F: GCTAGACAGACCACAGTC
R: ACATCTGGCATCTTGCGTTA
36
Tabela 9 – Dados populacionais: No de alelos, Heterozigosidade observada (Ho) e Heterozigosidade esperada (HE). Níveis de significância de P< 0,004 (após a correção de Bonferroni) correspondem a desvio de H-WE..
Populações/Locos Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE1999 A 8 7 6 10 7 5
HO 0,533 0,655 0,731 0,667 0,8 0,571
HE 0,688 0,778 0,708 0,873 0,547 0,059
P 0,023 0,007 0,047 <0.004
0,059 <0.004
TE2005 A 7 6 5 8 17 9
HO 0,654 0,769 0,615 0,654 0,461 0,615
HE 0,69 0,703 0,737 0,824 0,934 0,880
P 0,836 0,536 0,005 <0.004
<0.004
<0.004
UR1999 A 9 6 4 5 12 7
HO 0.767 0.833 0.967 0.600 0.900 0.655
HE 0.807 0.712 0.679 0.665 0.811 0.712
P 0.080 <0.004
<0.004
0,015 0,012 0,42
UR2005 A 8 5 7 4 17 9
HO 0,654 0,538 0,692 0,541 0,923 0,615
HE 0,794 0,715 0,861 0,631 0,938 0,074
P 0,006 0,346 0,102 0,139 0,074 <0.004
IH2002 A 5 5 5 3 8 5
HO 0,85 0,75 0,765 0,5 0,55 0,6
HE 0,693 0,746 0,745 0,529 0,859 0,844
P <0.004
0,299 0,042 0,046 <0.004
0,359
IH2005 A 9 5 10 9 13 13
HO 0,8 0,7 0,893 0,8 0,6 0,767
HE 0,823 0,718 0,805 0,785 0,878 0,897
P 0,013 <0.004
0,285 0,017 <0.004
0,129
RA1999 A 7 3 3 4 6 7
HO 0,846 0,643 0,643 0,5 0,071 0,714
HE 0,809 0,611 0,553 0,624 0,873 0,817
P <0.004
0,023 0,753 0,129 <0.004
0,098
Z1999 A 11 6 8 4 16 14
HO 0,812 0,516 0,677 0,406 0,75 0,906
HE 0,796 0,756 0,854 0,477 0,894 0,86
P <0.004
<0.004
<0.004
0,57 <0.004
0,195
Z2002 A 10 6 9 3 14 13
HO 0,75 0,65 0,45 0,444 0,85 0,65
HE 0,892 0,768 0,863 0,613 0,902 0,946
P <0.004
0,07 <0.004
0,439 0,414 <0.004
CJ 1999 A 5 10 8 5 3 9
HO 0.815 0.586 0.931 0.500 0.100 0.700
HE 0.611 0.863 0.761 0.558 0.159 0.862
P <0.004
<0.004
<0.004
0.088 0.100 0.014
CJ2005 A 5 6 6 5 15 11
HO 0.700 0.800 0.733 0.333 0.633 0.733
HE 0.700 0.767 0.749 0.583 0.923 0.885
P 0.340 <0.004
0.121 <0.004
<0.004
<0.004
Média A 7,42 5,91 6,45 5,45 11,64 9,27
Média Ho 0,7437 0,6764 0,7361 0,5404 0,6035 0,6842
Média He 0,7548 0,7397 0,7559 0,6511 0,7925 0,7124
37
Tabela 10 – Estimativas do índice de fixação (FST - abaixo da linha diagonal) e do número de migrantes por geração (Nm -
acima da linha diagonal) para as populações analisadas.
Populações 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
CJ 1999 1 * 1.945 1.837 1.506 1.897 1.643 1.516 1.582 1.389 2.729 1.671
CJ 2005 2 0.204 * 6.492 3.904 2.506 2.877 3.104 3.788 4.281 5.245 6.263
UR 1999 3 0.214 0.072 * 4.033 2.567 3.459 2.604 3.099 5.062 4.776 4.790
UR 2005 4 0.249 0.113 0.110 * 3.205 4.277 2.423 7.191 6.572 3.161 5.507
TE 1999 5 0.208 0.166 0.163 0.135 * 3.087 1.835 2.663 2.432 2.614 2.759
TE 2005 6 0.233 0.148 0.126 0.104 0.139 * 2.362 2.639 2.929 4.191 4.194
RA 1999 7 0.248 0.139 0.161 0.171 0.214 0.174 * 2.030 2.241 4.394 4.019
Z 1999 8 0.240 0.116 0.139 0.065 0.158 0.159 0.198 * 9.929 2.568 4.161
Z 2002 9 0.265 0.104 0.089 0.070 0.170 0.145 0.182 0.048 * 2.895 4.662
IH 2002 10 0.155 0.087 0.095 0.136 0.160 0.106 0.102 0.163 0.147 * 5.511
IH 2005 11 0.230 0.074 0.094 0.083 0.153 0.106 0.110 0.107 0.097 0.083 *
38
Foi feita uma análise agrupando todas as populações como uma única unidade
comparativa (Tabela 11). Pôde-se observar que uma pequena estruturação
populacional poderia estar ocorrendo (FST = 0,143), contudo a maior diferença genética
encontrada foi interindividual (79,31%) e não interpopulacional (14,31%) ou mesmo
intrapopulacional (6,38%).
Posteriormente foi feita uma análise agrupando-se as populações de acordo com
seu posicionamento em relação às margens do rio Negro (Tabela 12). No grupo 1 foram
colocadas as populações localizadas na margem direita (oeste): Rio Tea, Rio Urubaxi e
Igarapé Cajarizinho. No grupo 2 foram colocadas as populações da margem esquerda
(leste): Rio Iahá, Igarapé Zamula e Lago Rainha. Nessa análise, verificou-se que quase
não há diferenças entre os grupos (0,25%) e que a maior diferença é a interindividual
(79, 22%) quando comparada a interpopulacional (14,16%) e intrapopulacional (6,37%).
Tabela 11 – Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) no conjunto de
populações de cardinal.
Fonte de Variação Componentes variantes
Percentagem de variação (%)
Fst P
Interpopulacional 0,29567Va 14,31 0.14309 P<0,004
Intrapopulacional 0,13181Vb 6,38
Interindividual 1,63889Vc 79,31
Obs.: Vb = variância inter-populacional, Vc = variância intra-populacional, Vt = variância
total, P estimado entre 10.000 permutações aleatórias.
39
Tabela 12 - Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) entre grupos de
populações de cardinal coletados em tributários de margens opostas (margem
esquerda X margem direita).
Fonte de Variação Componentes variantes
Percentagem de variação (%)
Fct P
Entre grupos 0,005 Va 0,25 0.00249 P=0,336
Interpopulacional 0,293 Vb 14,16
Intrapopulacional 0,132 Vc 6,37
Interindividual 1,639 Vd 79,22
Também foi realizada uma análise para verificar se estaria havendo perda de
variabilidade genética entre os anos amostrados (Tabela 13). Desta forma, três
populações foram separadas em dois grupos de acordo com o ano de coleta (1999 e
2005). Não se observou diferença significativa entre os grupos analisados (0%) e
verificou-se que a diferença intrapopulacional (79, 24%) é maior que a interpopulacional
(15,52%). Resumidamente, os valores de AMOVA permaneceram praticamente os
mesmos em todas as três análises executadas.
Uma análise individual de cada uma das populações indicou que o cardinal
apresenta uma diversidade genética considerável, variando entre 0,621 (CA1999) e
0,858 (ZA2005). A diferença entre os pares variou entre 2.483 +/- 1.359 (CJ1999) e
4.667 +/- 2.324 (TE2005). Novamente, não se verificou perda de diversidade genética
na comparação das amostras coletadas em anos distintos, ao contrário, observou-se
que a diversidade genética nas populações aumentou no segundo ano de amostragem
(Tabela 14).
40
No teste de desequilíbrio de ligação, após 15 comparações feitas por meio da
cadeia de Markov, detectou-se desequilíbrio nos locos das populações do rios Tea
(TE2005 - Pa26), Urubaxi (UR1999 - Pa13 e Pa26) e Iaha (IH2002 - Pa13) e do Igarapé
Zamula (ZA1999 - Pa7).
Pelo teste de Mantel, não foi detectado co-relação entre distância genética e
distância geográfica nas amostras populacionais de 1999 (P = 0.313) mas o mesmo
não pode ser dito para as coletas de 2005 (P= 0.051).
Tabela 13 – Resultados da análise de variância molecular (AMOVA) entre grupos de
populações de cardinal coletados em anos distintos (1999 x 2005).
Fonte de Variação Componentes variantes
Percentagem de variação (%)
Fct P
Entre grupos 0,0001 Va 0,0 0.00198 P=0,367
Interpopulacional 0,38846 Vb 15,52
Intrapopulacional 2,11378 Vc 84,47
Tabela 14 - Índices de diversidade entre as populações analisadas
População/ano Divers. Gênica Diferenças entre os pares
TE 1999 0.703 +/- 0.417 2.8124 +/- 1.505 TE 2005 0.778 +/- 0.429 4.6667 +/- 2.324 UR 1999 0.718 +/- 0.399 4.3096 +/- 2.163 UR 2005 0.818 +/- 0.459 4.0889 +/- 2.071 IH 2002 0.701 +/- 0.420 2.8051 +/- 1.513 IH 2005 0.812+/- 0.455 4.0593 +/- 2.054 RA 1999 0.678 +/- 0.398 3.3915 +/- 1.789 ZA 1999 0.753 +/- 0.416 4.5169 +/- 2.253 ZA 2005 0.858 +/- 0.482 4.2923 +/- 2.171 CJ 1999 0.621 +/- 0.377 2.483 +/- 1.359 CJ 2005 0.765 +/- 0.423 4.5938+/- 2.287
41
Foram executados testes nos programas Bottleneck e MValues para verificar se
em alguma população houve uma recente redução populacional. A análise no
Bottleneck não indicou a ocorrência de redução populacional recente no modelo
evolutivo de microssatélite mais aceito (modelo de mutação aos passos - SMM);
entretanto no outros modelos (modelo dos alelos infinitos - IAM, modelo de duas fases
mutacionais - TPM) foram observados valores de heterozigosidade um pouco abaixo
que os demais nas populações do Urubaxi e Iaha amostradas em 1999. Por outro lado,
a análise no MValues detectou uma sutil redução populacional pois verificou-se que em
amostras populacionais dos rios Iaha (IH1999) e Tea (TE1999 e TE2005) houve um
decréscimo não acentuado no número de alelos (Tabela 15).
Tabela 15 - Comparações dos testes para redução do tamanho populacional. Nível de
significância antes (*P=0,05) e após a correção de Bonferroni (**P=0,004).
IAM SMM TPM “M value” População
(Wilcoxon)
(Wilcoxon)
(Wilcoxon)
(Valor de P)
TE 1999 0,9609 0,9844 10,000 0,6875 (0,02)* TE 2005 0,9844 1,0000 0,9922 0,6323 (0,03)* UR 1999 0,3437 0,7812 0,5781 0,7811 (0,16) UR 2005 10,000 10,000 10,000 0,8354 (0,42)
IH 1999 0,5781 0,7812 0,5781 0,6193 (0,05)* IH 2005 0,7812 0,9844 0,9766 0,7391 (0,06) RA 1999 0,9766 0,9766 0,9766 0,7812 (0,29) ZA 1999 10,000 10,000 10,000 0,8245 (0,39)
ZA 2002 10,000 10,000 10,000 0,8182 (0,38)
CJ 1999 0,7812 0,9766 0,9609 0,8057(0,26) CJ 2005 0,9219 0,9844 0,9219 0,7961 (0,21) Todas 0,8480 0,9517 0,74 0,8340 (0,17) .
42
4. Discussão
4.1. Caracterização dos locos
No Brasil, há mais de 30 anos vêm-se usando marcadores citológicos e
moleculares para acessar a variabilidade genética de peixes. Alguns trabalhos de
cunho revisional destacam que os estudos genéticos conduzidos em peixes de água
doce do Brasil abordam aspectos da caracterização cromossômica, conservação
genética, sistemática molecular, aquacultura, biotecnologia e processos de hibridização
(Toledo-Filho et al., 1992a; Toledo-Filho et al., 1992b; Toledo-Filho et al., 1996; Hilsdorf
& Krieger, 1998; Artoni et al., 2000; Marques et al., 2002; Martins et al., 2002; Torres et
al., 2004; Hilsdorf et al., 2006).
De uma maneira geral, observa-se que à medida que novas metodologias
surgem a tendência é de que elas substituam as mais antigas. Nos últimos tempos os
marcadores microssatélites talvez sejam a classe de marcadores moleculares que mais
despontou na literatura mundial, tendo como principais aplicações estudos de genética
populacional, análises de parentesco, mapeamento genômico, dentre outras (O’Connel
& Wright, 1997).
Vários protocolos de isolamento de microssatélites estão disponíveis na literatura
(Zane et al., 2002). A metodologia aplicada para o isolamento de marcadores
microssatélites para o cardinal foi a mesma que vem sendo utilizada em outras
espécies amazônicas (Farias et al., 2003; Rodrigues et al., 2004; Farias et al., 2006) e
que se baseia no protocolo de enriquecimento para microssatélites e hibridização
seletiva com sondas oligonucleotídicas.
Mesmo assim, a obtenção de microssatélites está sujeita a vários contratempos
como a não amplicação de bandas e as bandas de gaguejo (stutter bands). No caso
43
específico desse trabalho, os seguintes problemas foram detectados: não amplificação,
diferença para menos no número de repetições esperadas e não detecção de alelos.
Diferenças no número de repetições podem ter ocorrido por duas razões:
deslizes na polimerase e calibragem nos analisadores de DNA. No processo de análise
das seqüências nucleotídicas dos clones hibridizados e seleção de primers, não se
atentou a existência de pequenas repetições em tandem dentro da região a ser
amplificada. Sabe-se que durante a PCR podem ocorrer deslizes no processo de
polimerização pela Taq polimerase, o que poderia acarretar diferenças nos tamanhos
das repetições a cada nova PCR e assim aumentar ou diminuir a quantidade de pares
de bases adicionadas durante o processo de amplificação do DNA in vitro.
A utilização de dois aparelhos de análises de DNA durante o estudo, no caso um
do INPA e um da UFAM, também poderia ter causado as diferenças no tamanho das
repetições observadas, caso a calibragem dos aparelhos fossem diferentes, o que
justificaria o resultado negativo no cálculo das repetições dos microssatélites.
Dos 12 marcadores microssatélites desenvolvidos na dissertação apenas dois
foram considerados ideais para a continuidade das análises populacionais (Mic03 e
Mic11). Ainda assim os mesmos apresentaram problemas na segunda metade do
projeto. A não detecção dos alelos pelos primers Mic03 e Mic11 ao final do trabalho
pode ter sido pela perda da atividade da fluorescência (FAM), visto que no protocolo
utilizado (Shuelke, 2000) foi adicionada uma cauda fluorescente na porção 5’ do primer
forward. A falta de fluorescência impossibilitaria a detecção de alelos pelo aparelho
MegaBace pois o mesmo necessita identificar a atividade fluorescente do FAM durante
o processo de genotipagem, quando os fragmentos de DNA são sugados por
capilaridade e detectados pelo leitor ótico (feixe de laser) presente nesse equipamento.
44
Contudo, convém destacar que sempre foi observado excelentes produtos de
amplificação nesses primers pois a falta de atividade da fluorescência não impede a
amplificação do DNA.
No processo de desenvolvimento de marcadores microssatélites, a busca por
soluções técnicas é uma etapa crítica. Devido aos problemas expostos, certamente
será necessário uma retomada das atividades laboratoriais para verificar se parte dos
problemas abordados acima tem solução.
4.2. Variabilidade espacial e temporal
A importância histórica no aspecto sócio-econômico do cardinal para a região
amazônica é notória sendo a mesma relatada por diferentes autores na literatura
(Geisler & Aníbal, 1987; Prada-Pedreros, 1998; Prang, 2001a; Prang, 2001b; Chao,
2001).
Prang (2001a; 2001b) mostrou que a exploração extrativista do cardinal por meio
da pesca do peixe ornamental na região de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro vem
se desenvolvendo desde a década de 50.
Em todo esse período não houve nenhum plano de manejo e conservação para
essa espécie. De uma maneira geral, esperava-se que os níveis de variabilidade
genética do cardinal fossem baixos. Entretanto, o que se observou foi que os 6 locos
analisados indicaram níveis consideráveis de diversidade genética (0.621 a 0.858) e de
heterozigosidade observada (0.1 a 0.967) e heterozigosidade esperada (0.059 a 0.938).
Dada a situação observada acima, os índices detectados nas amostras populacionais
de cardinal são muito similares aos descritos na literatura para outras espécies de
peixes.
45
Vrijenhoek (1996) analisando populações naturais de duas espécies de truta
Oncorhynchus clarki lewisi e Oncorhynchus mykiss, encontrou uma heterozigosidade
observada de Ho = 0.676 e Ho = 0.850, respectivamente. Kohlman et al. (2003)
analisando amostras populacionais de carpa (Cyprinus carpio) detectou uma
heterozigosidade esperada de HE = 0.851. Barroso et al. (2005) estudou a estrutura
genética de Brycon opalinus, uma espécie endêmica da Bacia da Paraíba do Sul (SP)
altamente ameaçada, detectaram uma Ho = 0,23 a 1,00 e uma HE = 0.756 – 0.892.
Spruell et al. (2003), encontrou baixos níveis de heterozigosidade nas populações de
Truta (Salvelinus confluentus) Ho = 0.000 - 0.404 e HE = 0.010 em todas as 4
populações analisadas no estudo ao compará-las a outros salmonídeos.
Desvios no equilíbrio de H-WE também foram observados mesmo após a
correção de Bonferroni (Tabela 9). Pode-se observar que em alguns locos houve
deficiência e em outros excesso de heterozigotos. Acredita-se que esses desvios
tenham sido causados pela presença de alelos nulos, por desequilíbrio de ligação ou
mesmo por migração. Embora na literatura, haja outras explicações para a deficiência
de heterozigotos como endocruzamento, cruzamentos preferenciais, deriva genética e
estruturação de população (Crouau-Roy, 1988).
O índice de diferenciação populacional obtido para a espécie foi de FST = 0,143
com uma variação entre populações de 14,31%, isto indica que está havendo uma
pequena estrutura de populações, porém, as diferenças existentes estão sendo
minimizadas pela a presença de fluxo gênico entre elas (número de migrantes - Nm –
entre 1 e 9). Loveless & Hamrick, (1984) vem demonstrando que uma pequena
quantidade de fluxo gênico a longas distâncias é suficiente para retardar a
diferenciação das populações para alelos neutros. Wright (1969) afirma que basta um
46
único migrante por geração para se contrapor aos efeitos da deriva genética impedindo
uma diferenciação populacional.
Observando-se o mapa hidrográfico da região do médio rio Negro bem como
imagens orbitais, percebe-se que algumas áreas alagadas nos interflúvios (chavascais)
podem perfeitamente facilitar o fluxo de migrantes entre os igarapés de uma mesma
margem, particularmente no período da enchente. Além dessa possível migração via os
interflúvios, pode-se pensar que o cardinal também poderia utilizar as margens do rio
Negro, migrando de um igarapé para outro, visto que algumas amostras populacionais
desse trabalho (particularmente as do Iahá) foram obtidas na boca dos tributários que
deságuam no rio principal.
Porém, há de se considerar que a característica migratória do cardinal
aparentemente se restringe as migrações laterais (entrada nos igapós para forrageio e
proteção) e as reprodutivas (durante a enchente dos rios quando sobem para as
cabeceiras e chavascais).
Contudo, não podemos descartar a hipótese de que a ação antrópica esteja
influenciando na homogeneização das populações ao longo do Rio Negro, visto que há
mais de 50 anos a pesca de cardinais é feita na região, o que potencialmente
promoveria a mistura de amostras ao longo do tempo.
Para um melhor entendimento sobre a estrutura populacional da espécie e sua
variabilidade genética foram realizadas diferentes análises de variancia molecular.
Primeiramente, as amostras analisadas foram separadas em grupos distintos de acordo
com o posicionamento de suas localidades às margens do rio Negro (margem direita X
margem esquerda). Por não haver relatos da presença do cardinal na calha principal do
rio Negro, esperava-se encontrar diferenças significativas entre os grupos populacionais
47
de margens opostas, o que não aconteceu. Isto sugere que o rio Negro não estaria
funcionando como barreira física a dispersão dessa espécie.
Além das comparações genéticas espaciais buscou-se entender se houve
variações temporais. Vários trabalhos com microssatélites demonstram a efetividade
desse tipo de abordagem em espécies comercialmente explotadas (Heath et al., 2002;
Meldgaard et al., 2003; Saisa et al., 2003; Hansen et al., 2006). Desse modo, somente
as amostras dos rios Tea, Urubaxi e Cajarizinho participaram dessa análise. Observou-
se que não houve diferenças genéticas entre os anos analisados e verificou-se que a
diferença intrapopulacional (79,24%) é maior que a interpopulacional (15,52%).
Individualmente, as amostras populacionais não perderam variabilidade genética de
1999 para 2005, ao contrário, de uma maneira geral a diversidade genética nas
populações aumentou.
Além disso, pode-se observar ainda que as diferenças interindividuais foram
bastantes significativas e mais expressivas que as diferenças inter/intrapopulacionais.
Essas diferenças podem ter sido ocasionadas por eventos ambientais históricos como o
El Niño, ocorrido em 1997 e 1998 (Prang, 2001a; Prang, 2001b; Chao, 2001). Esse
fenômeno pode ter atuado de maneira diferenciada em cada tributário ao longo do rio
Negro. Prang (2001a; 2001b) relata que esse fenômeno afetou a reprodução do
cardinal devido ao período extensivo de seca, prejudicando as gerações seguintes
devido ao pouco alimento disponível. Esse fato pode ter ocasionado a mortalidade de
alguns indivíduos reduzindo o tamanho populacional da espécie podendo ter alterado o
seu número de alelos. Chao (2001, pág 171) demonstrou que realmente houve um
decréscimo no número de indivíduos coletados.
48
Mesmos sendo explorado continuamente há mais de 50 anos os níveis de
diversidade genética no cardinal são elevados (0.621 a 0.858) e a explicação provável
para isso talvez esteja na biologia da espécie. O cardinal apresenta um ciclo de vida
curto e uma reprodução anual associado ao regime sazonal de cheia e vazante do rio
Negro (Geisler & Anníbal, 1987). Na época de cheia do rio, os cardinais migram para
dentro dos igapós onde se reproduzem, havendo uma maior dificuldade na captura
dessa espécie e assim permitindo uma recuperação das populações. A reprodução
dessa espécie é tão vinculada ao pulso das águas, que no momento em que há
repiquete em determinada área, uma desova parcelada pode ocorrer (Prang, 2001a;
Prang, 2001b), o que acarretaria no aparecimento de indivíduos mais novos no meio de
uma população anual adicionando variabilidade a população existente.
Alguns estudos vêm assumindo que eventuais diferenças populacionais
observadas sejam devido a mudanças recentes na diversidade genética como resultado
aos processos ambientais ou medidas humanas ou os dois casos associados, como por
exemplo o observado em coelhos domésticos (Queney et al., 2002).
Características populacionais importantes como migração e tamanho
populacional podem variar no tempo e no espaço (Whitlock, 1992). A análise de
variabilidade genética de uma espécie numa perspectiva temporal pode fornecer dados
sobre a ocorrência de crises demográficas e reduções no tamanho populacional.
Os testes nos programas Bottleneck e M values foram executados para verificar
se em alguma população houve uma recente redução populacional. O resultado
utilizando o programa Bottleneck, não indicou a ocorrência de redução populacional
recente em nenhum dos modelos evolutivos para microssatélites. Observou-se,
49
entrentanto, que em algumas populações houve uma redução no excesso de
heterozigotos que provavelmente seja devido a presença de alelos nulos.
Já o programa MValues foi mais sensível a detecção de redução populacional
recente, o que é esperado uma vez que o número de alelos é reduzido mais
rapidamente do que a heterozigosidade. Garza & Williamson (2001) sugerem que
populações cujos valores de P sejam menores que 0,70 já estariam sofrendo uma
redução populacional. Isto foi observado nos rios Tea e Iahá. Entretanto, a população
do rio Iahá conseguiu se recuperar no segundo ano analisado, o mesmo não ocorrendo
no rio Tea (Tabela 11). Prang (2001a; 2001b) relata que o rio Tea tem um histórico de
exploração intensa de peixes ornamentais, sendo, portando, possível que esta
localidade ainda não tenha se recuperado desse período intenso de exploração.
Segundo Ryman (1991), a habilidade de uma população para se adaptar a um
determinado ambiente é inteiramente dependente de suas características genéticas - os
alelos que carrega, suas combinações e suas freqüências. Em alguns exemplos de
peixes é notória a capacidade dos mesmos se recuperarem demografica e
geneticamente em curto, médio ou longos períodos (Ruzzante et al., 2001; Larsen et
al., 2005). Se observarmos a exploração continua de cardinal no médio rio Negro com
estimativas de captura na faixa de 40 milhões de espécimes/ano; pode-se assumir que
as populações de cardinal podem estar sofrendo bruscas perdas no tamanho
populacional e se recuperando logo em seguida. Isso indica um potencial inerente da
espécie em responder a essas modificações ambientais e pressões antrópicas.
50
5. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos por meio do uso de marcadores moleculares
microssatélites permitiu chegar as seguintes conclusões:
1) O cardinal apresenta níveis consideráveis de variabilidade genética tendo se como
base os parâmetros de diversidade gênica, índice de fixação, heterozigosidades
observada e esperada.
2) Detectou-se uma sutil estruturação populacional que pode ter sido ocasionada por
eventos históricos como El Niño ou pela intensa exploração. Porém, seus efeitos estão
sendo minimizados pela ocorrência de fluxo gênico entre as populações.
3) O isolamento por distância detectado nas amostragens de 2005 pode ser um reflexo
das mudanças de atitude em relação ao descarte de cardinais na calha principal do rio,
pela não comercialização. Diminuindo, assim, a mistura de amostras de cardinal
pertencentes a tributários geograficamente distantes.
4) O rio Negro parece não estar funcionando como barreira física a dispersão do
cardinal, uma vez que não foi encontrado diferenciação entre as populações da
margem direita e esquerda do rio Negro. Porém, não pode se descartar a possibilidade
de influência antrópica na homogeniezação de estoques.
5) A análise da variabilidade temporal nas amostras populacionais dos rios Tea,
Urubaxi e Cajarizinho nos anos de 1999 e 2005 mostraram que não há perdas de
diversidade genética e de heterozigosidade, ao contrário, houve um aumento
siginificativo em todas as amostragens populacionais de 1999 e 2005. Embora, tenha
sido detectado um afunilamento populacional nas amostras do rio Tea.
51
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Anexo 1 – Matriz de dados dos microssatélites utilizados contendo o número de
repetições por locos e por indivíduo.
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE1 12 13 9 24 18 34
13 13 9 24 20 34 TE2 10 13 8 24 18 32
13 13 8 24 20 35 TE3 10 13 8 24 18 33
13 14 8 26 20 34 TE4 10 13 8 25 20 33
20 15 8 25 20 34 TE5 10 13 8 24 20 33
10 13 8 25 27 34 TE6 13 ? ? 21 20 34
13 ? ? 24 22 34 TE7 10 10 6 21 20 34
13 13 11 24 32 34 TE8 13 12 11 21 20 34
13 13 11 25 20 34 TE9 9 12 11 24 20 34
13 13 14 27 38 34 TE10 13 12 11 26 20 34
13 13 13 24 20 34 TE11 13 12 11 24 18 34
13 12 13 24 20 34 TE12 12 12 11 21 18 34
13 13 13 31 20 35 TE13 10 10 8 21 18 33
10 14 11 29 20 37 TE14 10 12 8 21 18 34
10 14 11 21 20 34 TE15 13 10 8 19 18 33
13 14 11 19 20 35 TE16 12 12 ? 19 18 33
14 12 ? 19 20 34 TE17 10 12 11 25 18 33
13 12 14 25 20 34 TE18 9 12 8 26 18 34
13 12 11 27 20 34 TE19 15 11 11 26 18 33
20 12 14 31 20 37
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE20 13 14 8 26 18 34
13 14 11 27 20 34 TE21 12 9 11 21 18 33
13 12 14 29 20 35 TE22 10 10 8 21 18 33
10 13 11 29 20 34 TE23 13 10 11 21 18 ?
17 13 11 32 20 ? TE24 10 10 8 24 18 ?
13 13 11 29 20 ? TE25 10 10 9 19 18 33
10 13 11 32 20 37 TE26 13 10 8 21 18 34
13 13 11 32 20 34 TE27 13 10 8 25 20 33
17 13 11 25 20 35 TE28 13 14 ? 21 20 33
17 14 ? 32 29 34 TE29 10 14 11 21 20 33
10 14 14 21 20 34 TE30 10 10 ? 21 20 34
10 13 ? 34 20 34 TE31 13 13 12 22 22 17
13 14 12 35 22 17 TE32 13 13 12 22 31 16
16 14 13 35 31 21 TE33 11 11 11 35 14 16
11 12 11 35 26 21 TE34 11 12 11 38 26 18
13 13 11 41 40 28 TE35 11 9 13 27 24 14
13 13 14 27 24 14 TE36 11 9 11 25 33 17
13 12 12 45 33 17 TE37 11 12 11 38 19 18
12 13 11 41 27 20 TE38 11 12 11 38 29 18
11 13 11 41 29 21
62
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE39 12 13 11 27 20 17
13 14 11 27 22 17 TE40 11 12 8 38 14 16
18 13 12 41 26 21 TE41 13 11 12 25 26 18
13 14 12 45 42 20 TE42 11 13 8 25 24 18
13 13 12 27 24 20 TE43 11 9 11 38 20 19
13 11 12 41 36 19 TE44 12 13 11 25 19 16
13 14 12 45 34 18 TE45 11 13 8 25 29 19
13 13 12 27 29 22 TE46 11 13 14 36 18 19
11 13 14 36 33 19 TE47 11 13 12 25 22 16
18 13 12 27 32 18 TE48 13 11 12 27 32 16
13 14 13 27 32 18 TE49 11 9 11 38 34 16
13 13 11 41 34 18 TE50 11 14 11 27 29 16
13 15 12 27 29 16 TE51 10 13 11 38 29 19
13 13 12 41 29 19 TE52 13 11 11 27 24 20
20 13 12 27 31 21 TE53 13 9 8 25 17 18
13 13 12 27 17 18 TE54 10 13 8 27 24 20
13 13 12 27 32 21 TE55 11 13 12 25 29 19
11 14 13 27 29 19 TE56 13 9 12 27 29 20
13 13 13 27 29 25 UR1 15 10 12 8 20 18
17 10 12 12 33 20 UR2 11 10 12 8 18 20
12 14 13 12 19 20 UR3 11 10 12 8 19 17
11 14 13 12 19 20 UR4 11 10 8 8 18 20
13 14 13 12 19 22 UR5 11 10 12 12 18 20
17 14 13 12 19 22
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 UR6 11 10 12 8 19 17
17 14 13 12 28 20 UR7 11 10 11 12 18 20
13 14 13 14 21 22 UR8 12 10 11 8 19 20
13 14 12 12 23 22 UR9 12 10 12 8 20 20
13 14 13 12 31 20 UR10 12 13 11 12 18 20
13 14 12 14 19 20 UR11 13 10 11 12 20 20
13 14 12 14 21 21 UR12 15 10 11 10 19 20
16 14 12 12 19 21 UR13 13 13 11 12 30 20
13 14 13 12 31 20 UR14 10 10 11 10 18 20
13 10 12 13 19 21 UR15 13 13 12 10 22 20
13 14 13 12 22 20 UR16 11 10 11 12 18 19
18 13 12 12 20 22 UR17 13 12 11 12 18 20
13 12 12 12 20 21 UR18 13 13 11 8 18 21
13 14 12 12 21 22 UR19 12 13 11 12 17 18
16 14 13 12 21 17 UR20 11 10 11 12 19 18
17 10 12 14 24 18 UR21 11 10 12 10 19 17
13 14 13 10 22 22 UR22 17 13 11 12 19 20
18 14 12 12 22 20 UR23 11 13 11 10 18 20
13 14 12 14 20 20 UR24 15 10 11 10 19 18
15 13 12 10 22 22 UR25 13 10 11 10 18 ?
19 14 12 12 19 ? UR26 13 13 11 12 18 20
19 14 12 12 19 22 UR27 13 10 11 8 18 22
16 10 12 12 19 22 UR28 12 10 11 13 18 20
17 14 13 13 19 20
63
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 UR29 11 10 11 14 20 21
17 11 12 14 22 26 UR30 11 12 12 12 18 22
17 15 13 12 19 26 UR61 15 10 8 11 22 18
17 10 13 13 32 29 UR62 11 10 8 9 18 21
11 10 9 13 19 21 UR63 11 10 14 9 22 13
11 14 14 11 23 19 UR64 11 10 13 9 21 16
13 14 13 11 21 21 UR65 13 13 9 11 25 20
13 14 9 11 32 21 UR66 11 10 13 11 20 18
18 14 14 11 36 21 UR67 11 12 14 9 18 18
18 13 14 11 20 18 UR68 11 10 8 9 29 20
13 10 11 11 30 20 UR69 13 12 13 12 18 18
13 14 13 12 19 18 UR70 12 9 11 9 18 20
13 10 13 11 25 22 UR71 12 10 11 9 18 20
13 10 11 11 24 21 UR72 13 10 9 9 17 20
13 13 9 9 30 20 UR73 15 10 11 11 19 19
16 13 12 11 32 20 UR74 17 13 9 9 25 20
18 13 11 11 32 20 UR75 11 10 9 ? 19 18
13 13 11 ? 25 19 UR76 13 13 8 11 17 18
13 14 11 13 31 23 UR77 13 10 14 11 21 18
13 13 14 11 23 21 UR78 12 13 9 11 18 20
16 13 10 13 31 20 UR79 11 10 9 9 20 18
17 10 10 13 32 18 UR80 13 12 12 9 17 20
13 13 13 9 19 22 UR81 11 13 8 11 19 20
13 13 12 11 32 21
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 UR82 17 13 9 9 30 20
18 13 11 9 33 20 UR83 11 13 8 ? 21 21
13 13 13 ? 21 21 UR84 15 13 10 11 27 13
15 13 12 11 28 19 UR85 15 14 9 9 22 16
19 14 14 9 33 21 UR86 13 9 10 9 18 16
16 13 13 11 25 21 IH11 11 11 8 10 31 ?
13 13 12 12 39 ? IH12 10 12 12 10 28 ?
13 15 12 10 33 ? IH13 11 14 8 10 19 ?
11 15 12 10 19 ? IH14 11 12 11 12 20 ?
13 13 11 12 20 ? IH15 10 12 8 10 25 ?
13 15 12 10 28 ? IH16 10 12 12 10 25 ?
13 15 12 12 25 ? IH17 11 13 8 10 19 ?
13 13 12 10 19 ? IH18 11 13 ? 8 19 ?
11 13 ? 8 17 ? IH19 11 13 11 10 14 19
11 13 11 12 17 20 IH20 11 11 8 10 20 19
13 13 12 10 25 22 IH21 10 12 11 10 20 20
13 14 13 12 25 20 IH22 13 11 12 10 20 14
18 15 13 10 20 14 IH23 11 13 11 10 25 20
13 14 13 12 28 21 IH24 10 13 ? 10 25 ?
13 13 ? 12 25 ? IH25 11 12 ? 10 19 ?
13 13 ? 12 19 ? IH26 10 12 11 10 19 ?
13 15 14 12 17 ? IH27 11 14 11 10 14 ?
13 15 12 10 17 ? IH28 10 13 11 10 20 ?
19 14 12 12 25 ?
64
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 IH29 11 13 8 12 19 ?
13 13 12 12 19 ? IH30 10 13 8 10 20 ?
13 15 12 12 20 ? IH31 13 22 9 12 19 18
13 22 14 21 20 18 IH32 13 13 10 9 20 18
13 13 13 13 30 18 IH33 11 22 10 12 19 18
14 22 14 12 24 22 IH34 11 13 9 10 22 19
16 14 14 14 22 19 IH35 11 11 8 12 19 15
11 13 11 24 19 15 IH36 13 13 6 12 19 15
16 14 8 24 24 18 IH37 11 14 9 12 25 24
11 14 11 24 29 24 IH38 11 11 8 12 28 17
18 13 11 24 29 20 IH39 13 11 9 9 30 17
18 13 11 12 30 20 IH40 13 11 7 12 24 20
16 13 9 14 28 26 IH41 12 13 ? 12 24 16
17 15 ? 12 24 22 IH42 11 14 7 12 19 20
13 14 9 12 31 20 IH43 12 14 ? 10 19 18
17 14 ? 14 29 19 IH44 13 14 8 8 22 20
16 14 9 10 30 20 IH45 16 11 8 8 22 14
17 14 9 10 22 20 IH46 11 13 8 8 17 15
18 13 11 11 21 22 IH47 11 13 9 10 19 18
17 14 9 12 25 20 IH48 9 11 6 12 22 16
13 14 9 13 22 21 IH49 9 13 9 10 19 19
10 14 9 12 19 22 IH50 9 11 5 10 19 16
10 13 8 12 25 19 IH51 11 11 4 10 22 17
13 13 11 12 22 22
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 IH52 11 13 8 12 22 18
17 14 9 12 27 20 IH53 9 11 8 8 22 18
10 13 11 11 22 21 IH54 11 11 8 10 22 18
13 13 9 11 22 19 IH55 11 11 6 8 18 14
17 13 9 10 18 20 IH56 11 13 9 8 27 20
11 14 9 10 27 25 IH57 11 11 8 12 22 17
13 13 9 12 31 21 IH58 11 13 8 8 22 21
13 14 10 11 29 29 IH59 11 13 8 8 24 17
11 14 10 11 25 20 IH60 9 13 8 12 18 16
10 13 10 12 22 20 RA1 11 13 6 10 11 19
12 14 6 14 20 23 RA2 11 14 6 10 19 19
12 15 11 10 19 23 RA3 10 14 6 10 19 20
14 15 11 10 19 23 RA4 10 14 6 10 20 19
14 15 12 12 20 19 RA5 11 13 6 12 19 19
12 13 12 14 19 20 RA6 10 13 6 10 20 17
14 13 6 11 20 22 RA7 10 14 6 10 22 19
14 15 12 11 22 22 RA8 10 13 6 10 16 19
15 13 12 10 16 22 RA09 11 13 6 10 17 18
12 13 11 10 17 24 RA10 11 13 6 10 21 20
12 14 6 10 21 20 RA11 11 13 6 12 19 19
11 14 11 12 19 19 RA12 11 13 6 10 20 17
11 13 11 11 20 19 RA13 ? 13 6 10 22 18
? 14 6 11 22 24 RA14 13 13 6 12 21 20
16 14 6 12 21 20
65
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 Z21 9 13 7 11 18 18
11 14 8 13 29 20 Z22 11 21 7 11 24 19
13 21 9 11 29 26 Z23 9 21 7 11 19 18
17 21 9 11 19 31 Z24 11 21 8 10 18 16
13 21 9 12 22 18 Z25 13 21 7 11 18 20
16 21 8 11 22 22 Z26 16 11 7 11 22 15
18 14 8 11 22 20 Z27 11 10 7 11 23 18
12 15 9 13 32 21 Z28 11 12 9 11 22 18
13 12 9 11 22 20 Z29 13 12 8 11 20 18
13 12 8 11 31 20 Z30 11 12 7 11 19 18
13 12 8 13 19 19 Z31 9 10 9 11 18 18
18 14 9 11 27 20 Z32 11 10 9 11 24 20
12 14 9 11 29 22 Z33 11 10 9 12 18 20
13 14 9 12 22 20 Z34 11 10 9 11 19 20
12 14 12 11 23 20 Z35 13 12 8 11 18 19
15 12 8 12 24 22 Z36 11 12 9 11 20 17
12 12 12 11 31 19 Z37 11 10 12 11 18 20
12 14 12 12 22 23 Z38 11 ? 11 12 18 10
13 ? 14 13 24 20 Z39 13 14 11 10 19 19
16 14 13 10 21 21 Z40 9 10 11 11 18 19
11 14 13 11 32 22 Z41 12 10 11 11 14 18
14 14 13 12 24 25 Z42 11 10 8 11 18 17
11 14 11 11 19 18 Z43 13 12 8 11 17 17
13 12 10 12 21 18
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 Z44 11 12 10 11 20 19
13 12 13 11 35 23 Z45 13 12 10 11 20 19
13 14 13 13 20 21 Z46 11 12 ? 11 25 19
13 14 ? 12 28 22 Z47 11 12 10 11 18 18
15 14 10 13 19 24 Z48 16 12 10 11 20 17
19 14 10 12 20 18 Z49 10 10 10 11 18 17
10 12 13 11 19 18 Z50 13 12 10 11 20 19
15 12 13 11 20 23 Z51 11 12 11 11 20 18
13 12 11 11 20 18 Z52 13 12 8 11 18 19
13 12 9 11 19 21 Z1 15 10 12 11 18 12
16 10 13 11 27 12 Z2 11 9 12 11 19 18
16 10 13 12 31 18 Z3 12 12 12 11 22 11
17 12 12 11 29 16 Z4 13 9 12 11 24 18
13 12 12 11 29 22 Z5 12 10 14 ? 18 18
14 13 14 ? 22 21 Z6 9 10 18 11 19 15
11 10 23 11 19 18 Z7 13 10 22 11 28 9
13 12 23 11 28 20 Z8 12 10 22 11 25 26
16 12 22 12 29 26 Z9 11 12 13 9 29 16
16 14 14 12 35 16 Z10 9 14 23 11 19 19
11 14 23 11 22 19 Z11 13 11 14 12 19 20
19 14 14 12 21 26 Z12 11 10 14 12 26 18
13 12 15 12 28 19 Z13 9 10 14 11 21 17
11 10 14 12 22 19 Z14 10 12 23 ? 22 14
15 14 23 ? 25 14
66
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 Z15 11 12 14 11 18 17
13 14 20 12 22 19 Z16 9 12 13 11 18 15
11 12 12 12 22 22 Z17 10 12 13 9 18 16
10 14 14 12 24 21 Z18 9 12 19 9 19 14
11 14 19 11 20 19 Z19 17 12 19 12 18 17
17 14 19 12 32 22 Z20 10 10 14 12 22 20
10 10 14 12 22 20 CJ01 10 21 9 12 20 19
13 28 10 12 20 19 CJ02 11 26 9 8 20 20
13 26 9 12 20 24 CJ03 11 23 9 10 20 19
13 23 11 10 20 20 CJ04 11 ? 11 10 20 16
13 ? 12 10 20 20 CJ05 ? 21 12 10 20 17
? 28 12 10 20 20 CJ06 11 26 12 6 18 17
13 26 13 10 20 22 CJ07 11 23 12 ? 20 15
13 23 13 ? 20 15 CJ08 13 26 ? 10 20 22
13 26 ? 12 20 22 CJ09 11 23 8 6 20 17
12 23 12 10 20 19 CJ10 11 21 12 10 20 15
13 26 13 10 20 15 CJ11 11 26 12 10 20 17
13 26 13 10 20 20 CJ12 11 23 11 10 19 19
13 23 12 10 20 19 CJ13 11 21 11 6 20 19
13 28 12 10 20 19 CJ14 11 26 13 6 20 18
13 31 14 10 20 22 CJ15 11 23 11 10 20 20
11 23 12 12 20 22 CJ16 13 23 12 10 20 18
13 25 14 10 20 20 CJ17 ? 23 12 10 20 16
? 25 14 10 20 20
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 CJ18 11 21 11 10 20 17
13 25 12 14 20 19 CJ19 11 30 12 6 20 17
13 30 13 10 20 19 CJ20 11 26 11 12 20 20
13 31 12 12 20 20 CJ21 11 21 12 ? 20 18
13 23 13 ? 20 19 CJ22 13 21 9 10 20 17
13 31 10 10 20 24 CJ23 ? 20 12 10 20 17
? 21 13 14 20 22 CJ24 13 22 11 6 20 19
19 23 12 10 20 24 CJ25 11 21 12 6 20 20
13 23 13 10 20 20 CJ26 11 28 12 10 20 16
13 28 13 12 20 21 CJ27 11 22 9 6 20 19
13 23 11 10 20 19 CJ28 11 27 11 10 20 18
13 27 12 10 20 22 CJ29 11 22 11 10 20 20
12 31 12 10 20 22 CJ30 9 22 12 10 18 18
9 23 15 10 19 20 CJ51 12 11 9 10 37 19
12 14 11 12 40 22 CJ52 12 12 9 10 27 19
13 13 9 10 27 24 CJ53 11 12 8 10 20 18
12 12 10 12 29 20 CJ54 11 10 10 12 19 16
12 13 13 12 29 21 CJ55 12 10 10 10 18 22
13 14 13 14 29 22 CJ56 12 11 11 10 18 22
13 12 10 12 19 22 CJ57 11 13 10 10 22 18
13 14 10 12 22 22 CJ58 12 10 10 10 21 20
12 14 10 12 32 20 CJ59 12 12 10 10 20 12
16 12 13 12 20 18 CJ60 10 10 10 10 28 17
13 14 13 12 28 20
67
POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 CJ61 12 10 11 10 28 17
13 14 11 12 28 17 CJ62 12 10 10 10 21 17
12 14 13 10 33 17 CJ63 11 13 10 12 37 17
13 15 10 12 40 19 CJ64 13 14 10 12 27 18
13 14 10 12 27 24 CJ65 13 10 9 12 20 16
13 14 11 12 29 19 CJ66 13 14 10 10 19 18
13 14 11 10 29 23 CJ67 11 12 9 11 18 19
12 13 10 13 29 20 CJ68 11 13 10 12 18 19
13 14 10 12 19 24 CJ69 13 10 11 12 22 17
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13 15 13 12 32 17 CJ71 10 14 13 12 19 19
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13 13 13 10 19 19 CJ73 11 13 10 10 19 17
12 15 11 10 25 19 CJ74 11 13 13 10 17 19
12 13 15 10 32 24 CJ75 13 10 13 10 22 18
13 14 15 10 33 20 CJ76 13 10 10 10 20 16
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13 14 13 12 30 22 CJ78 11 10 13 12 19 18
13 14 15 12 19 20 CJ79 11 10 11 12 19 16
12 14 13 12 25 21 CJ80 11 14 10 11 22 16
13 15 10 11 33 21
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