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2. Células madre hematopoyéticas

JORDI BARQUINERO MÁÑEZ

RESUMEN

Las células madre hematopoyéticas (CMH) son, con diferencia, lasmejor conocidas de las células madre adultas. Se definen como aquéllascapaces de repoblar a largo plazo todos los linajes hematopoyéticoscuando son trasplantadas a receptores sometidos a un tratamiento mie-loablativo que permita su injerto. En humanos adultos, las CMH seencuentran fundamentalmente en la médula ósea (MO), con una fre-cuencia relativa de 1 entre 104 a 1 entre 105 células nucleadas. Aunquequedan muchas lagunas por conocer, y de hecho aún no es posible suidentificación ni su aislamiento de forma prospectiva con una certeza opureza absoluta, los últimos años han sido pródigos en avances relativosa su caracterización y aplicaciones clínicas.

En cuanto a sus aplicaciones, las CMH fueron las primeras en sertrasplantadas con éxito hace más de medio siglo. Inicialmente sólopodían obtenerse a partir de la MO, pero actualmente se obtienen me-diante un proceso mucho menos traumático llamado aféresis, tras sermovilizadas a la sangre periférica o, más recientemente, a partir de lasangre del cordón umbilical. Los trasplantes hematopoyéticos han salva-do miles de vidas de pacientes con hemopatías malignas y enfermedadeshereditarias. Otra potencial aplicación de las CMH es la inducción detolerancia inmunológica. Finalmente, las CMH constituyen una dianaexcepcional para la terapia génica (TG), y no es casualidad que los dosprimeros éxitos de esta joven disciplina estén basados en CMH.

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ABSTRACT

Hematopoietic stem cells (HSC) are by far the best known amongadult stem cells. They are defined by their ability to repopulate all hema-topoietic lineages long-term upon transplantation into myeloablated hosts.In human adults, HSC are primarily found in the bone marrow at a rela-tive frequency of 1 in 104 to 1 in 105 nucleated cells. Although many gapsremain and their prospective identification and isolation in pure form arestill not possible, considerable progress has been made in the recent yearsboth in their characterization and in their clinical applications.

Regarding their applications, HSC were the first stem cells to besuccessfully transplanted, more than 50 years ago. Initially they couldonly be obtained from the bone marrow, but now they can be harvestedusing a much less painful procedure called apheresis, upon mobilizationof the progenitor cells into the peripheral blood or, more recently, fromumbilical cord blood. Hematopoietic transplants have saved thousandsof patients with hematological malignancies and with genetic diseases.Another potential application of HSC is the induction of immune tole-rance. Finally, HSC constitute a preferred target for gene therapy, andit is not by chance that the first two successful clinical trials reported sofar were based on HSC.

INTRODUCCIÓN

El creciente éxito del trasplante hematopoyético ha constituido du-rante más de medio siglo el paradigma de la existencia de células madreadultas. Hasta hace poco más de una década, hablar de células madre noembrionarias era referirse casi inequívocamente a la MO o a las CMH,ya que fueron éstas las primeras en conocerse y en ser aplicadas altratamiento de enfermedades humanas. Al ser el hematopoyético untejido líquido trasplantable que se puede cultivar y manipular ex vivo,las CMH se han convertido en una herramienta insustituible para unsinfín de terapias celulares y aplicaciones en medicina regenerativa, asícomo en una diana preferida para la TG.

La hematopoyesis (palabra que literalmente significa fabricación oproducción de sangre, y que indirectamente lleva implícita la noción de

CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS

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células madre) es un proceso que garantiza una producción continua decélulas sanguíneas que permita mantener unas concentraciones de éstasdentro de unos rangos o niveles normales, a lo largo de toda la vida deun individuo. La hematopoyesis humana tiene una organización jerár-quica, que está esquematizada en la figura 1. La tabla 1 da una idea delas ingentes cantidades de células que se deben estar produciendo cadadía para mantener esta homeostasis. Es una obviedad que las célulassanguíneas se están produciendo (en la MO) a la misma velocidad quese destruyen (principalmente en el bazo). Si tenemos en cuenta que ensu inmensa mayoría las CMH son quiescentes, se hace evidente quetodas estas células maduras que cada día acceden a la circulación san-

FIGURA 1. Esquema simplificado de la hematopoyesis. Una rara población de CMH generade manera continua y regulada una progenie de células maduras, que pasan a la circulaciónsanguínea. La multipotencialidad se va perdiendo a medida que las células se van diferen-ciando en los distintos linajes. La MO también alberga otros tipos de progenitores, como losmesenquimales y los endoteliales. (Tomado de http://stemcells.nih.gov, modificado por laDra. H. Eixarch).


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guínea proceden de unas pocas CMH. Si se tiene en cuenta que un ratónnormal tiene unas 5000 CMH, y que cuando se analiza un preparaciónen fresco sólo un 1-3% de éstas se encuentran en una fase activa delciclo celular (aunque se van alternado de manera continua), se puedecomprobar que la hematopoyesis es un proceso que se produce de unaforma relativamente oligoclonal.

Por otra parte, esta producción ha de estar muy finamente regulada,pues las necesidades de cada tipo celular pueden ir variando a cadamomento; por ejemplo, tras una hemorragia aguda o durante un cuadroséptico. Esta regulación depende de factores exógenos, que incluyenmediadores solubles (factores de crecimiento hematopoyético, citocinas,factores inhibidores, etc), que serían liberados de forma endocrina oparacrina, o contactos directos célula-célula que tendrían lugar en elnicho hematopoyético, así como de substancias neuroendocrinas libera-das por las terminaciones nerviosas que inervan la MO, y también defactores intrínsecos de las propias CMH, como la mayor o menor expre-sión de determinados factores de transcripción (PU-1, GATA-1, GATA-2 o SCL/TAL-1) o de modificaciones epigenéticas (1).

Aunque muchos libros de texto definen las CMH como pluripoten-ciales, en realidad, estrictamente hablando son multipotenciales, puespor el momento no se ha descrito que puedan generar cualquier tipocelular del organismo, sólo los de los distintos linajes hematopoyéticos,y quizás algún otro no hematopoyético, pero no todos.

TABLA 1

Tipo celular Vida media Valores normales Cantidad total ProducciónTipo celular Vida media normales (por (en L de diaria

µL de sangre) sangre)

Hematíes 120 días 4.5 x 106 22.5 x 1012 1,8 x 1011

Granulocitos 8-10 horas 7.5 x 103 37,5 x 109 9 x 1010

Plaquetas 7-10 días 3 x 105 15 x 1011 2,1 x 1011

Valores normales de los principales tipos de células sanguíneas y estimación de la produc-ción diaria de éstas. Las cifras son aproximadas y están calculadas a partir de las mediaspara un adulto humano varón de 70 Kg de peso (5 L de sangre), y no se tiene en cuenta laproducción de otros tipos celulares (monocitos o linfocitos), más minoritarios. Sólo la pro-ducción de los tres tipos celulares indicados supone generar aproximadamente 5 x 1011

células cada día. Tampoco se tiene en cuenta posibles situaciones patológicas o de estrés, enlas que esta producción basal puede estar muy aumentada.


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Se ha descrito que muchas poblaciones de células madre en general,y de CMH en particular son altamente heterogéneas (2), lo que tendríaun papel en hacerlas más o menos receptivas a influencias externas o delmicroambiente y ayudaría a explicar que, en un momento dado, sóloalgunas de ellas respondan a determinados estímulos. Las principalesvías de señalización que regulan la toma de decisiones celulares enrelación a la diferenciación o la autorrenovación son las de Notch, Wnty Hedhehog, entre otras. La proteína Bmi-1, codificada por un oncogénde la familia polycomb, también ha demostrado jugar un papel esencialen la autorenovación de las CMH (3).

Recientemente también se ha demostrado la existencia de CMH condistintos patrones de repoblación in vivo. Estos patrones se mantendríanen la progenie de cada una de estas CMH, pero pueden ser modificadospor factores externos (4). Un aspecto que debe estar finamente reguladoes el mantenimiento de un número relativamente constante de CMH a lolargo de la vida. Hay evidencias que, en el ratón, este número está deter-minado genéticamente. De acuerdo con el conocimiento actual, las CMHexperimentarían divisiones asimétricas, de manera que una de las célulashijas conservaría la multipotencialidad, mientras que la otra entraría enprocesos de diferenciación/amplificación, con lo que se tendería a man-tener constante el número de CMH. En relación a este hecho, una carac-terística que define las CMH es su capacidad autorregenerativa que debemantenerse durante toda la vida del individuo. Así, se ha comprobado quelas CMH expresan telomerasa, si bien la reposición de los telómeros concada división celular no es del todo completa, por lo que con los años lostelómeros de sus cromosomas se van acortando (5).

Durante el desarrollo embrionario humano la primeras CMH apa-recen en el saco vitelino hacia las 2 semanas de vida, aunque lasprimeras que tienen capacidad de repoblación se originan en el interiordel propio embrión, primero en la esplacnopleura paraaórtica y poste-riormente en la región aorta-gonadal-mesonefros (AGM). A partir dela sexta semana el principal órgano hematopoyético es el hígado, y loseguirá siendo hasta poco antes del parto, produciéndose la migraciónde las CMH hacia la MO (y ello explica que la sangre del cordónumbilical durante el periodo perinatal contenga progenitores hemato-poyéticos), que será el lugar que albergará la hematopoyesis adultadefinitiva.


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Un tema muy controvertido es la plasticidad de las CMH, es decir,si éstas pueden transdiferenciarse a células maduras de otros linajes nohematopoyéticos. En los últimos diez años diversos estudios han descri-to aparente transdiferenciación a diversos tejidos (músculo, hígado,miocardio, o sistema nervioso). Sin embargo, otros investigadores hanpuesto en duda el rigor de dichos estudios, y han demostrado que enalgunos casos lo que se produce es fusión de células hematopoyéticascon células de otras estirpes, y no verdadera transdiferenciación. Lo quees seguro es que la transdiferenciación, si ocurre, no lo hace con unafrecuencia elevada, al menos en circunstancias normales. Dado que yaexisten otros capítulos en este monográfico que profundizan en estacuestión, dejaremos este tema abierto.

ALGUNOS APUNTES HISTÓRICOS SOBRE LAS CMH

La primera evidencia de la existencia de progenitores hematopoyé-ticos de vida media larga fue desvelada hace ya más de 60 años. En1945, R.D. Owen observó que, en el ganado bovino, los hermanos noidénticos de una misma camada que habían compartido la misma pla-centa eran en realidad quimeras que compartían ambos tipos de célulassanguíneas (las suyas y las de su hermano) de por vida. A partir de ellodedujo correctamente que debían existir células ancestrales a los hema-tíes de los animales adultos. Por pura casualidad, el siguiente avance eneste terreno también derivó de otra observación en el ganado bovino.Billingham y Medawar practicaban injertos cutáneos entre hermanosidénticos y no idénticos, y se sorprendieron al comprobar que en lamayoría de casos éstos no eran rechazados. En su búsqueda de unaexplicación satisfactoria se encontraron con los estudios de Owen ydemostraron, en una elegante serie de experimentos en el modelo mu-rino, que la creación de quimerismos hematopoyéticos mixtos en ratonesneonatos inducía tolerancia específica frente a las células del donante(6), resultados que se publicaron en 1953 y que le valieron a PeterMedawar el Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1960.

Desafortunadamente, otras evidencias procedían de las víctimas deexplosiones atómicas, como los habitantes de Hiroshima y Nagasaki en1945. Si bien en un primer momento no se comprendió demasiado bien,


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mirado retrospectivamente, las personas que fallecieron tras la exposi-ción a una mínima dosis letal lo hicieron debido a una aplasia medular,transcurridos varios días desde la exposición, ya que la normal renova-ción de las células sanguíneas (principalmente leucocitos y plaquetas)había quedado interrumpida. Sin embargo, en experimentos realizadosen ratones irradiados se observó que si se protegía el bazo con unapantalla de plomo se evitaba el síndrome hematológico (7), y tambiénque podían rescatarse animales sometidos a una dosis letal de radiacióninfundiéndoles células del bazo o de la MO de un ratón no irradiado (8),hallazgos que sentaban las bases de los trasplantes hematopoyéticos,que desde los años 70-80 del pasado siglo se realizan de manera rutina-ria en muchos de nuestros hospitales.

Con todas estas evidencias indirectas, a partir de los años 60 se inicióla búsqueda prospectiva de las CMH. Se había observado que los proge-nitores de la MO podían formar colonias en el bazo de ratones sometidosa irradiación letal, de ahí su nombre CFU-S (Colony Forming Unit-Spleen). Till y McCulloch demostraron que las CFU-S eran en realidadclonales, es decir, que procedían de una única célula. También se produ-cían colonias (CFU) de tamaños y morfologías diversas si los progenito-res hematopoyéticos se cultivaban in vitro en determinados medios semi-sólidos (agar, metilcelulosa). Cada uno de estos tipos de CFU se llegó aidentificar con un tipo de progenitor, más o menos inmaduro. Así, sedescribieron las CFU-GM (unidades formadoras de colonias de granulo-citos y macrófagos), las CFU-E (unidades formadoras de colonias deeritrocitos), las CFU-Meg (unidades formadoras de colonias de megaca-riocitos) o las CFU-Mix (unidades formadoras de colonias mixtas), entreotras. Las colonias hematopoyéticas constituían otra demostración de laexistencia de una jerarquía de progenitores con diferentes potencialida-des, y de la naturaleza clonal de la hematopoyesis. Estos ensayos clono-génicos todavía se usan en investigación o para evaluar indirectamente lacalidad de un producto celular (por ejemplo, una muestra de sangre decordón umbilical, o de MO congelada) pero, aunque proporcionan una in-formación funcional, actualmente no se consideran indicadores del con-tenido en CMH, sino de progenitores más o menos diferenciados. Otrosensayos clonogénicos que permitían analizar progenitores más inmadurosque las CFU son el LTC-IC (long-term culture initiating cell) (9) y losCAFC (cobblestone area forming cell) (10), o células formadoras de áreas


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en empedrado, por la disposición que adoptan las células de la colonia,que recuerda a la de los adoquines de las calles antiguas. En ambos en-sayos se emplean cultivos a largo plazo, y requieren un soporte estromal.Con todo, ningún ensayo in vitro permite por el momento evaluar riguro-samente la funcionalidad de las CMH, los únicos que lo hacen son los queatienden a la propia definición de estas células, es decir, que demuestransu capacidad de repoblación in vivo y de diferenciación hacia los princi-pales linajes hematopoyéticos, y a largo plazo (un mínimo de 4 meses enel ratón y varios años en un humano). Por otra parte, los ensayos de re-población in vivo también tienen sus limitaciones, pues una vez se docu-menta que se ha producido repoblación, las CMH que la originaron ya handesaparecido. Además, en los ensayos de repoblación in vivo hay quetener en cuenta que las células que se trasplantan tienen que llegar a al-canzar los tejidos hematopoyéticos y anidar (o hacer homing) en los ni-chos adecuados, un factor que puede ser crítico cuando se trasplantannúmeros muy reducidos de células (hay estudios en los que se trasplantauna sola célula). Una solución a estos problemas son los ensayos de re-población competitiva, en que una población de células «problema» estrasplantada simultáneamente con otra población «control», de maneraque unas puedan ser cuantificadas y diferenciadas de las otras en lasmuestras de tejidos hematopoyéticos de los animales receptores median-te algún marcador fenotípico. Así, se han definido las unidades de repo-blación competitiva (o CRU), que equivaldría a una única célula que escapaz de producir linaje mieloide y linfoide a largo plazo cuando es tras-plantada a un animal irradiado letalmente. En el caso de las CMH huma-nas, ante las dificultades para utilizar personas como herramienta experi-mental, se han utilizado desarrollado modelos de trasplante de célulashematopoyéticas humanas en diversas cepas de ratones inmunodeficien-tes, como los NOD/scid u otros, en los que se pueden realizar estudioscuantitativos (11). Así, se ha llegado a definir la unidad de repoblaciónen ratones NOD/scid (o SRC) (11). Con todo, estas exigencias de los en-sayos de repoblación in vivo imponen enormes restricciones y dificulta-des para el estudio de las CMH, y ello ha impulsado la búsqueda demétodos alternativos que permitan identificar CMH de una manera pros-pectiva. En este sentido, aunque por el momento no existe ninguna técni-ca que permita identificar CMH de forma inequívoca y apriorística, se hanproducido avances muy notables en este terreno, de manera que, utilizan-do distintos marcadores fenotípicos, en humanos se pueden conseguir po-


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blaciones celulares que enriquecen la capacidad de repoblaciónen varios órdenes de magnitud, mientras que, en el ratón se pueden llegara obtener poblaciones prácticamente puras de CMH, así como de la ma-yoría de los distintos tipos de progenitores hematopoyéticos más diferen-ciados.

En la MO, las CMH se localizan en unas zonas llamadas nichos, quejuegan un importantísimo papel en su regulación. Estos nichos hemato-poyéticos están divididos en tres partes: 1) una zona osteoblástica (cer-cana a los osteoblastos), 2) una zona medular de CMH quiescentes yproliferativas y, 3) una zona vascular (cerca de los sinusoides) quepermite que salgan las células maduras a la circulación (12).

HACIA UNA CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS CMH

Tras los primeros intentos de enriquecimiento basados en el tamañoy la densidad celular, la aparición de anticuerpos policlonales o mono-clonales frente a distintos marcadores inmunofenotípicos, acoplados anuevos y mejores fluorocromos y los avances en la citometría de flujo,que permiten análisis multiparamétricos a tiempo real y la separación depoblaciones celulares con fenotipos cada vez más complejos, han revo-lucionado el conocimiento sobre la hematopoyesis.

En 1984, Kurt Civin descubrió el antígeno My10 en la línea leucé-mica humana KG-1a. El marcador, que posteriormente se denominóCD34, se expresaba en la membrana del 1-4% de las células nucleadasde la MO humana, y se comprobó que dicha población contenía lapráctica totalidad de la capacidad de repoblación hematopoyética, lo queindicaba que, al menos de forma mayoritaria, las CMH humanas expre-saban dicho marcador. De hecho, se ha utilizado la selección positiva decélulas CD34+ como un método para depleccionar o purgar ex vivo decélulas tumorales contaminantes en productos hematopoyéticos (MO,productos de aféresis) autólogos antes de ser trasplantados, bien seacomo único método de purga o en combinación con la selección nega-tiva (por ejemplo, de células B en algunos linfomas). Más tarde sedescubrió que la mayoría de progenitores con capacidad de repoblación,además de ser CD34+, eran CD38-, lo que permite enriquecerlos al menosen una orden de magnitud más. El fenotipo que mejor define las CMH


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humanas se describió recientemente la sangre de cordón umbilical comoLin- CD34+ CD38-/low CD45RA- CD90- (13).

En el ratón, con mucho la especie en que los distintos progenitoreshematopoyéticos están mejor caracterizados, y a pesar de que muchos delos marcadores que los identifican se han conservado bien a lo largo dela evolución, las cosas son algo distintas (por ejemplo, en el ratón lasCMH son CD34-). Una característica que define a los progenitores inma-duros es que no expresan ninguno de los marcadores específicos de losdistintos linajes maduros (CD3, CD4 o CD8 para células T, CD11b o Gr1para células mieloides, B220 para células B, o el Ter-119 para células dela serie roja), es decir son Lin-. La denominada depleción Lin- utiliza unamezcla de anticuerpos frente a estos marcadores y permite eliminar lainmensa mayoría de células maduras y de precursores diferenciados, en-riqueciendo unas 20 veces en capacidad de repoblación en comparacióncon la MO no fraccionada. Los marcadores c-Kit y Sca-1 suponen unpaso más allá en la purificación de las CMH murinas. Las células Lin-

Sca-1+ c-kit+ (o simplemente KLS) están enriquecidas unas 1000 veces encapacidad de repoblación a largo plazo, en comparación con las de MOno fraccionada. Aún así, sólo una de cada 10 células KLS es una CMH.La tabla 2 es un listado de los principales marcadores que se utilizan en

TABLA 2. Marcadores utilizados en el fenotipado de los diversos tipos de célulashematopoyéticas murinas.

Marcador Función

CD45 Antígeno panleucocitario (marca todas la células nucleadas de origenhematopoyético). Se trata de una tirosina fosfatasa.

Sca-1 Stem cell antigen-1c-Kit Receptor para el factor de células madre (SCF)Flk-2 Fetal liver kinase-2Tie-2 Receptor tirosina cinasa específico de endotelioCD34 Sialomucina, ligando para L-selectinaCD41 Integrina αIIbCD48 Ligando para el CD2CD150 SlamF1 (molécula de la familia SLAM)CD201 Receptor de proteína C endotelial (EPCR)IL7Rα Subunidad alfa del receptor de la IL-7CD16/32 Receptor de baja afinidad para el fragmento Fc de la IgG murinaGlicoforina A Sialoglicoproteína específica de la serie roja (desde el proeritroblasto al

hematíe maduro)


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TABLA 3. Inmunofenotipo de los principales progenitores hematopoyéticos murinos.Modificado de Challen y Goodell (36).

Fenotipo Tipo celular y referencia

KLS CMH y progenitores (30)Flk-2- CD34- KLS CMH (repoblación a largo plazo) (31)CD150+ CD48- CD41- KLS CMH (repoblación a largo plazo) (32)Flk-2+ CD34+ KLS célula repobladora a corto plazo (33)IL7rá+ KLS progenitor linfoide común (CLP) (34)Lin- IL7Rα+ c-Kit+ Sca-1- progenitores mieloides (35)Lin- IL7Rα- c-Kit+ Sca-1- CD34+ CD16/32- progenitor mieloide común (CMP) (35)Lin- IL7Rα- c-Kit+ Sca-1- CD34- CD16/32- megacariocito-eritrocito (MEP) (35)Lin- IL7Rα+ c-Kit+ Sca-1- CD34+ CD16/32+ progenitores de granulocitos y macrófagos

(35)CD3 células TCD14 monocitosCD15 granulocitosCD33CD41 serie plaquetarB220 células BTer-119 serie rojaGlicoforina A serie roja

la identificación de progenitores hematopoyéticos murinos, mientras quela tabla 3 describe los fenotipos más aceptados de los distintos tipos deéstos.

En 1996, Goodell y colaboradores describieron en la MO una subpo-blación celular muy minoritaria (representaría entre el 0.01 y el 0.07% deltotal de las células nucleadas), que en presencia de Hoechst 33342(Ho342), un fluorocromo que se une al DNA, se tiñen menos que lasdemás, pudiéndose ser identificadas y aisladas por citometría de flujo,pues forman una exigua cola adyacente a la población mayoritaria decélulas en fase G0G1 del ciclo celular (figura 2), por lo que se denominóSide Population o células SP. Posteriormente estas células se han encon-trado en la mayoría de los tejidos de muchas especies de mamíferos es-tudiadas. En la MO murina, es un marcador de células altamente inmadu-ras, que permite enriquecer 1000 veces la capacidad de repoblaciónhematopoyética. En humanos no se ha conseguido demostrar este enri-quecimiento (14). La molécula responsable del fenotipo SP es el trans-


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FIGURA 2. Histograma de citometría de flujo correspondiente al análisis de células de MOmurina marcadas con Hoechst 33342. Este fluorocromo se une al DNA y, al excitarse con unláser ultravioleta, tiene una emisión dual, en el rojo y el azul (la señal en cada uno de loscanales se representa en los ejes de abscisas y ordenadas). Nótese la distribución de lapoblación celular de la ventana poligonal (de ahí el nombre de side population, o poblaciónlateral), menos fluorescente debido a que pueden extruir el fluorocromo por la acción deltransportador de membrana ABCG2. (Cortesía del Dr. Jordi Pétriz).

portador de membrana ABCG2, un miembro de la familia ABC (ATP-bin-ding cassette), que se encargaría de extruir agentes genotóxicos en célu-las o tejidos que estén expuestos a éstos y que deban ser protegidos(CMH, placenta, riñón, intestino, epitelio biliar, células germinales). Susobreexpresión en tumores también confiere resistencia a agentes quimio-terápicos. El marcaje con Ho342 puede acoplarse al de diversos marca-dores inmunofenotípicos, lo que permite análisis multiparamé-tricos mediante citometría de flujo que pueden afinar más aún en la ca-racterización y aislamiento de las células hematopoyéticas más inmadu-ras (15).


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TRASPLANTES HEMATOPOYÉTICOS

Los supervivientes a largo plazo de trasplantes hematopoyéticosalógenicos han constituido durante casi medio siglo la prueba más pal-pable de la existencia de CMH adultas, y concretamente el hecho deencontrar en su sangre células de vida media corta (como los granulo-citos) derivadas del donante, décadas después del trasplante.

Existen dos tipos de trasplantes, autólogos y alogénicos, en funciónde si las células trasplantadas proceden del mismo individuo o de otrodistinto. A éstos habría que añadir los xenogénicos, si las células tras-plantadas proceden de otra especie distinta, aunque éstos sólo se hanrealizado de forma experimental. Durante muchos años la MO constitu-yó la única fuente de células hematopoyéticas para el trasplante, pero araíz de la observación pionera de la existencia de CMH en sangre pe-riférica de ratones por Goodman y Hodgson (16), y tras comprobarseque las CHM podían ser movilizadas de la MO a la sangre periféricamediante quimioterapia y/o factores de crecimiento como G-CSF, apartir de los años 90 se popularizaron los trasplantes de progenitoreshematopoyéticos movilizados a sangre periférica, de forma que en laactualidad los trasplantes de células movilizadas de sangre periféricahan desplazado en gran medida a los de MO.

Una tercera fuente de progenitores que se ha revelado con un enormepotencial es la sangre de cordón umbilical (SCU). En 1989 el grupo deBroxmeyer describió la existencia de CHM en la SCU en cantidadessuficientes para utilizarlas en trasplantes (17). Muy poco después se rea-lizó el primer trasplante exitoso utilizado esta fuente en un niño con ane-mia de Fanconi (18). Las principales ventajas de la SCU son su disponi-bilidad y una menor aloreactividad en comparación con otras fuentes(MO o sangre periférica) debido que las células inmunitarias que contie-ne son las de un recién nacido, lo que se traduce en una menor incidenciade EICH, y en que puedan utilizarse unidades de SCU menos histocom-patibles que en el caso de las otras fuentes. Sus mayores desventajas sonsu escaso volumen (y por tanto el relativo bajo número de progenitoresque contiene), lo que limita su aplicabilidad en adultos y se traduce enmás largos periodos de aplasia tras el trasplante, y la defectuosa recons-titución inmunológica en adultos, que pone a los receptores en un eleva-do riesgo de infecciones graves. A pesar de todo, los trasplantes de SCU


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se aplican cada vez más y existe una red internacional cada vez mayor debancos públicos (NETCORD, https://www.netcord.org) y también priva-dos de SCU que en conjunto ya almacenan cientos de miles de unidades.

Las principales aplicaciones de los trasplantes son las hemopatíasmalignas (leucemias, linfomas), aunque también se han utilizado enalgunos tumores sólidos, y en un buen número enfermedades heredita-rias que afectan a células hematopoyéticas (Tabla 4).

TABLA 4. Lista de las principales enfermedades en las que el trasplante hematopoyéticotiene algún valor terapéutico.

Leucemias• Leucemia linfoblástica aguda (LLA)• Leucemia mieloide aguda (LMA)• Leucemia linfática crónica (LLC)• Leucemia mieloide crónica (LMC)• Leucemia mielomonocítica (LMM)

Linfomas• Enfermedad de Hodgkin• Linfomas no-Hodgkin

Mieloma múltiple

Síndromes mielodisplásicos (SMD)

Tumores sólidos• Sarcoma de Ewing• Neuroblastoma• Carcinoma de células renales• Tumores cerebrales

Enfermedades por depósito• Adrenoleucodistrofia• Síndrome de Hurler• Enfermedad de Krabbe• Leucodistrofia metacromática• Síndrome de Maroteaux-Lamy

Anemia aplásica

Inmunodeficiencias primarias• Inmunodeficiencia severa combinada• Síndrome de Wiskott-Aldrich• Enfermedad granulomatosa crónica

Otras enfermedades hereditarias• Anemia falciforme• Anemia de Fanconi• Osteopetrosis• Talasemia


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En el caso de las hemopatías malignas, la base racional del trasplan-te hematopoyético depende de si es autólogo o alogénico. En el primercaso se persigue la eliminación de los clones malignos mediante quimio-terapia (con o sin radioterapia) a dosis elevadas (mieloablativas). Enestos pacientes el trasplante debe realizarse para rescatar su hematopo-yesis de una aplasia potencialmente mortal, y no se busca un efecto delinjerto contra el tumor. Tras los trasplantes autólogos el implante sueleser rápido y no suelen producirse complicaciones inmunológicas, si bientienen como inconveniente una mayor tasa de recaídas de la enfermedadde base. En los trasplantes alogénicos, además de eliminar el máximonúmero de células malignas mediante la quimioterapia (con o sin radio-terapia) también es decisiva la aloreactividad, es decir, la respuesta porparte de las células inmunitarias del donante frente a las malignas delreceptor, el llamado efecto «injerto contra leucemia o contra tumor»,que en muchos casos llega a erradicar las células malignas y se asociaa una menor tasa de recaídas que en los trasplantes autólogos. Sinembargo, la otra cara de la aloreactividad, muchas veces indisoluble delefecto antileucémico, es la respuesta inmunitaria frente a antígenos pre-sentes en otros tejidos del receptor (hígado, tubo digestivo, piel), lo queclínicamente se traduce en la llamada enfermedad del injerto contra elhuésped (EICH), una grave complicación que puede llegar a ser invali-dante y mortal. Otra limitación de los trasplantes alogénicos es la nece-sidad de encontrar donantes histocompatibles adecuados, sólo disponi-bles en aproximadamente un tercio de los casos.

Una modalidad de trasplante alogénico que reduce la mieloablacióncon la idea de reducir la toxicidad asociada a ésta son los llamadosminialoinjertos (o simplemente minialos) (19). Ideados por Rainer Storby su grupo de Seattle, utilizan un acondicionamiento de intensidad másreducida cuyo objetivo es facilitar un mínimo injerto de las célulastrasplantadas en una fase inicial (es decir crear un quimerismo mixto)para, en una segunda fase, conseguir el quimerismo completo medianteinfusiones de linfocitos del donante (DLI). De esta forma se sigue apro-vechando el efecto inmunológico frente al tumor. Al ser mucho mejortolerados, los minialos han permitido trasplantar a personas de mayoredad o con patologías de base.


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EL PROBLEMA DE LA MIELOABLACIÓN

Uno de los principales inconvenientes que presentan los trasplanteshematopoyéticos es que no basta con infundir las células a trasplantarcomo si se tratara de una simple transfusión. Para que las células tras-plantadas tengan alguna oportunidad de injertar y repoblar, hay queeliminar, total o parcialmente, las células hematopoyéticas endógenaspara «crear espacio» en la MO, para lo cual antes del trasplante hay quesometer al receptor a un tratamiento mieloablativo llamado acondiciona-miento. Por desgracia, estos tratamientos se basan en el empleo de ra-diación y/o agentes quimioterápicos y se asocian a una elevada morbi-lidad que resulta asumible para tratar una leucemia mortal, pero quizásno ser tan aceptable en muchos pacientes con enfermedades hereditarias,especialmente cuando existen terapias alternativas menos tóxicas, comolos tratamientos substitutivos (aunque sean caros y haya que adminis-trarlos de por vida). La introducción de nuevas pautas de acondiciona-miento menos tóxicas y mejor toleradas por los pacientes facilitaríaenormemente la aplicación de los trasplantes hematopoyéticos a muchasenfermedades hereditarias. En el caso de la TG, el problema de la mie-loablación es especialmente limitante, como se comentará en el siguien-te apartado.

TERAPIA GÉNICA

Una de las aplicaciones más novedosas de las CMH es la TG. Losmotivos que hacen de estas células una de las diana preferidas para lamodificación genética incluyen en primer lugar la idea de que su correc-ción afectará a toda su progenie, que incluye nuevas CMH que se iránregenerando a lo largo de toda la vida del individuo. Así, cualquierenfermedad que afecte a alguna de las series hematopoyéticas, incluidaslas que constituyen el sistema inmunitario, son teóricamente abordablesmediante TG en CMH. Además, a esto hay que añadir su relativa faci-lidad de obtención, de manipulación ex vivo, y el hecho de que seantrasplantables. Otra de sus grandes ventajas es que, en las condicionesen las que se realizan estos tratamientos, las CMH transducidas no sue-len desencadenar respuestas inmunes frente al producto transgén, comoocurre con la mayoría de otros tipos celulares. Como inconveniente, sin


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embargo, hay que destacar la necesidad de someter al receptor a untratamiento parcial o totalmente mieloablativo.

Con todos estos antecedentes probablemente no ha sido casual quelos dos primeros ensayos de TG que pueden considerarse exitosos hayanestado basados en CMH. Tras una década de fracasos (en general contodas las modalidades de TG), en 2000 se publicaron los resultados delprimer ensayo con resultados positivos. Los pacientes eran niños coninmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X (SCID-X1), una rara y grave enfermedad debida a mutaciones en el gen de lasubunidad gamma común (γc) de una serie de receptores para interleu-cinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21). Algunas de éstas sonfactores de crecimiento para células del sistema inmunitario, de formaque los pacientes sufren una ausencia casi total de células T, B y NKfuncionales, lo que resulta en infecciones graves y frecuentes que suelenser fatales durante los primeros meses de vida.

Los investigadores introdujeron una copia sana del gen αc utilizan-do un vector retrovírico en las células CD34+ de la MO de los propiospacientes, que se reinfundieron en ausencia de tratamiento mieloablativo(en este caso innecesario por la inmunosupresión de base y la enormeventaja selectiva de las células corregidas). Pocos meses después de lainfusión de las células corregidas genéticamente, los recuentos de célu-las T alcanzaron cifras normales y la función inmunitaria mejoró signi-ficativamente en prácticamente todos los niños tratados. Estos resulta-dos fueron confirmados independientemente por investigadoresbritánicos usando un protocolo análogo en otros seis pacientes. La clavedel éxito radicaba en el hecho que las células genéticamente modifica-das, ya capaces de responder a los factores de crecimiento adecuados,podían proliferar y diferenciarse y tenían una ventaja selectiva pararepoblar los nichos virtualmente vacíos de células T y B, mientras quelas células no corregidas seguían desapareciendo por apoptosis, lo queda como resultado una repoblación completa por células corregidasgenéticamente (20).

El segundo éxito reconocido de la TG para enfermedades monogé-nicas se produjo en pacientes con SCID-ADA (21). El enzima ADAcataliza la desaminación de la desoxiadenosina a adenosina, resultandosu ausencia en un acúmulo de metabolitos altamente tóxicos para las


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células T. Como ocurre en la SCID-X1, el trasplante de MO de unhermano compatible, si está disponible, constituye una buena alternativaterapéutica. Si no hay donante adecuado, los pacientes pueden ser tra-tados con ADA bovino pegilado, como tratamiento substitutivo.

El primer ensayo clínico de TG se había realizado en 1990 en niñoscon esta misma enfermedad. Consistió en la modificación genética decélulas T enfermas, que fueron reinfundidas a los pacientes. Doce añosmás tarde, los pacientes tratados, a los que se les mantuvo la terapia conPEG-ADA, expresaban el enzima, pero a unos niveles subterapéuticos.Este ensayo clínico se consideró fallido, probablemente porque la tera-pia substitutiva con ADA recombinante estaba anulando la ventaja se-lectiva para las células modificadas genéticamente. En el nuevo ensayo,realizado en Italia y cuyos resultados se publicaron en 2002, los inves-tigadores utilizaron una mieloablación a dosis bajas, y retiraron el tra-tamiento substitutivo con ADA pegilado, lo que favoreció la repobla-ción selectiva por parte de las células modificadas genéticamente. Eléxito conseguido es tal que hoy día podría considerarse la TG el trata-miento de eleccion para los pacientes con esta enfermedad.

Estos primeros éxitos aportaron renovadas esperanzas a esta jovendisciplina. El hecho que dos tipos de SCID fueran las primeras enferme-dades en ser curadas mediante TG no fue una sorpresa. Ya se ha comen-tado la poderosa ventaja selectiva que opera en las células genéticamen-te corregidas para proliferar o escapar de la apoptosis, y por tanto pararepoblar in vivo. Por desgracia, no se espera que resulte tan fácil parala mayoría de enfermedades candidatas a ser corregidas usando genesque no proporcionan ninguna ventaja selectiva a las células modificadas(que son la inmensa mayoría). Una prometedora línea de investigaciónconsiste en el empleo de genes seleccionables que, una vez introducidosjunto al gen terapéutico permiten seleccionar in vivo las células transdu-cidas usando agentes farmacológicos (22).

INSERCIONES RETROVIRALES Y RIESGO ONCOGÉNICO

Por definición, todas las inserciones en el genoma son mutagénicas.Sin embargo, el riesgo de oncogénesis por inserción tras los procedi-mientos de transferencia génica estándar usando vectores integrativos en


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los modelos preclínicos se consideraba extraordinariamente remoto. Porello, el hallazgo que cuatro de los once niños tratados en el ensayoclínico francés para SCID-X1 antes mencionado y uno tratado con elprotocolo inglés desarrollaran leucemias, varios años después de recibirla TG, sorprendió a toda la comunidad médica y científica, especialmen-te cuando se descubrió la existencia de una zona «caliente» para lasinserciones retrovirales y crítica para la transformación leucémica en ellocus del protoncogén LMO2 (23).

Previamente no se habían descrito efectos adversos similares en loscerca de 200 pacientes tratados en ensayos clínicos análogos que tam-bién usaban vectores integrativos, incluyendo la SCID-ADA o, excep-tuando casos puntuales, en los miles de animales experimentales some-tidos a procedimientos de transferencia génica integrativa (aunque quizásestos no habían sido estudiados con el suficiente detalle). Esto planteóla pregunta crucial de si la TG basada en este tipo de vectores era máspeligrosa de lo que se pensaba, o de si estos casos estaban más relacio-nados con factores dependientes del contexto (por ejemplo, asociados ala propia enfermedad o al propio transgén terapéutico), y por lo tanto nopodían ser extrapolables a otras situaciones. Es significativo que ningu-no de los pacientes con SCID-ADA tratados ha desarrollado este tipo decomplicación, a pesar de que los vectores utilizados son muy similares.

Buscando en una base de datos de varios miles de cánceres hema-tológicos murinos inducidos por inserciones retrovirales experimentales(http://RTCGD.ncifcrf.gov), Dave et al. encontraron dos casos asocia-dos a inserciones cercanas al locus LMO2 y dos con inserciones en ellocus IL2RG (el del gen terapéutico en esta enfermedad) (24). Una deellas contenía una inserción en cada uno de ambos loci. Las probabili-dades de que esos dos eventos se produjeran en la misma célula son tanremotas que el hallazgo sugiere que la expresión no regulada del trans-gén αc dirigida por el LTR retrovial (que contiene la secuencia promo-tora y el enhancer) se convirtió en un inesperado cofactor para la trans-formación leucémica. Un estudio posterior realizado para analizarprospectivamente la capacidad oncogénica tanto de la subunidad αccomo del LMO2, utilizando vectores retrovirales codificando para am-bos transgenes de manera independiente reveló que ambos tenían poten-cial oncogénico, si bien para que éste se hiciera evidente era necesarioun periodo suficientemente largo de observación (mínimo 5-6 meses),


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más de los que se habían utilizado en los estudios preclínicos previos alensayo clínico por parte del grupo francés (25).

Estos casos de leucemia descritos por los investigadores francesesgeneraron una respuesta desmedida por parte de los medios de comuni-cación y la sociedad, así como escepticismo por parte de la comunidadcientífica, y se llegaron a paralizar todos los ensayos clínicos basados envectores integrativos. Sin embargo, en estos momentos muchos paíseshan levantado el veto a los vectores integrativos, que se han rediseñadoy optimizado para minimizar sus potenciales riesgos.

INDUCCIÓN DE TOLERANCIA A TRAVÉS DEL QUIMERISMO

Los estudios pioneros de Billingham y Medawar sobre la inducciónde tolerancia a través de la creación de quimerismos hematopoyéticoshan sido retomados por algunos investigadores. La idea es que la crea-ción de estos quimerismos mixtos vía trasplante de CMH daría lugar aun estado de tolerancia que podría ser útil en receptores de trasplantesde órganos, pues les haría innecesario el tratamiento inmunosupresor,muchas veces de por vida, que estos pacientes requieren para no recha-zar sus injertos. En este caso las CMH deben proceder del mismo do-nante del órgano que se trasplanta, pues la tolerancia es específica dedonante. La disponibilidad de donantes ya supone una enorme limita-ción, y la otra es la enorme toxicidad asociada a los trasplantes hema-topoyéticos alogénicos, tanto por la mieloablación como por la posibi-lidad de una EICH. Posibles vías de abordaje frente a estosinconvenientes, son el uso de minialos, ya comentados, la búsqueda depautas de acondicionamiento mínimamente ablativas y de inmunosupre-sión que permitan la creación de quimerismos mixtos estables (26), asícomo otras estrategias como el empleo de dosis muy elevadas de pro-genitores inmaduros, un tema revisado recientemente por I. Weissmany colaboradores (27).

En nuestro laboratorio, comprobamos que el trasplante de célulashematopoyéticas que expresaban la proteína verde fluorescente comomarcador a ratones mínimamente acondicionados (con 3 Gy de irradia-ción corporal total —ICT—) resultaba en la expresión del transgén alargo plazo (22 semanas), lo que sugería que se estaba induciendo tole-rancia frente a la EGFP (28).


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Tras estas observaciones, en colaboración con investigadores de laUnidad de Neuroinmunología Clínica de nuestra institución, investigamossi dicha estrategia para inducir tolerancia podría ser aplicable a situacio-nes de mayor relevancia clínica como la encefalomielitis autoinmuneexperimental (EAE), el modelo animal de esclerosis múltiple. La EAE seinduce experimentalmente inmunizando animales susceptibles con au-toantígenos de la vaina de mielina, lo que desencadena una enfermedadmediada por células T muy similar a la esclerosis múltiple. Observamosque, de manera preventiva, el quimerismo e incluso el microquimerismomolecular se asociaban a una protección muy robusta frente a la enfer-medad inducida. En cuanto a la aplicación de modo terapéutico, es decir,en animales con la enfermedad establecida, comprobamos que no eraindispensable crear quimerismo molecular con células que expresan elautoantígeno para inducir tolerancia. Tras la infusión de células de MOtransducidas a receptores con EAE establecida sometidos a mieloablaciónparcial, éstos experimentaban mejorías clínicas muy significativas, inclu-so remisiones completas, a pesar de que las células trasplantadas no in-jertaban (eran rechazadas porque la inducción de la enfermedad experi-mental pasa por la generación de una respuesta inmune frente alautoantígeno expresado en las células transducidas). Observamos que losesplenocitos de los animales tratados producían más IL-5 e IL-10 trasexposición al autoantígeno que los de los controles, lo que nos sugería quela tolerancia que se inducía estaba mediada por células T reguladoras,probablemente del tipo inducible o Tr1. Además, tras comprobar que elinjerto de las células hematopoyéticas transducidas no era necesario paraobtener un beneficio terapéutico, infundimos las células de MO transdu-cidas a ratones con EAE en ausencia de mieloablación y obtuvimos re-sultados similares (29). Esta no necesidad de mieloablación reduce nota-blemente la toxicidad del procedimiento y lo acerca mucho más a unapotencial aplicabilidad clínica.

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