UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA

CONTAMINAÇÃO BACTERIANA EM AMOSTRAS DE MÉIS DE Apis mellifera L. COMERCIALIZADOS NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

LIGIA PORTUGAL GOMES

Sob a Orientação da Professora Miliane Moreira Soares de Souza

Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências, no Curso de Pós-Graduação em Microbiologia Veterinária.

Seropédica, RJ Fevereiro de 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE VETERINÁRIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA VETERINÁRIA

LIGIA PORTUGAL GOMES

Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências, no Curso de Pós-graduação em Microbiologia Veterinária. DISSERTAÇÃO APROVADA EM 17/ 02/ 2006.

____________________________________________________ Profª . Miliane Moreira Soares de Souza (Dr.) - UFRRJ

(Orientador)

___________________________________________________ Profª Maria Cristina Affonso Lorenzon (Dr.) - UFRRJ

___________________________________________________ Profª Míriam Teresinha dos Santos (Dr.) - UFV

___________________________________________________ Prof. Francisco de Assis Baroni (Dr.) – UFRRJ

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“Aos meus amados pais, por me fazerem

entender que a humildade e a sabedoria

são a base de nosso crescimento”

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me mostrado o caminho certo nas horas de desespero, por ter me

capacitado de tal maneira que somente Ele poderia fazer. Agradeço ao Senhor, meu Deus, por não ter desistido de mim nem um segundo, por ter feito enxergar as coisas que estavam obscuras aos meus olhos, por ter colocado as pessoas certas na hora exata durante todo esse período, por ter segurado a minha mão, me pegado no colo me capacitando para executar cada passo desse projeto. Hoje sei que sem Ti não sou nada. Por isso, Senhor, te agradeço de todo meu coração por ter me tocado e abençoado e, além disso, ter trilhado meu caminho segundo a Sua verdade. TE AMO mais que tudo!!! E agradeço por me amar tanto, a ponto de fazer tudo isso por mim.

À minha mãe, Nelia Duarte Portugal, que mesmo distante sempre está ao meu lado. Agradeço pelo apoio, carinho, estímulo, pelo exemplo de mãe e mulher, por acreditar em seus filhos e investir em nossa formação, acreditando que o conhecimento e a educação são as maiores heranças que podemos obter nessa vida. A meu pai, César Martins Gomes, por estar sempre disponível a ajudar. Agradeço pelo incentivo, pelo apoio sentimental e pelas conversas. Aos meus queridos irmãos, Fernando César Portugal Gomes e Bernardo Frederico Portugal Gomes, por estarem sempre ao meu lado. Agradeço a vocês, minha família de origem, tudo que fizeram e fazem por mim. Muito obrigada por me entenderem, aceitarem como eu sou e acreditarem que daquele casulo, tímido, muitas vezes opaco e sem graça que eu era, sairia uma borboleta assim como eu. AMO VOCÊS INCONDICIONALMENTE!

Ao meu sobrinho, Rafael Frade Gomes, que ainda não conhecendo a essência desse nosso “mundão”, veio trazer alegria de maneira tão ingênua. Confesso que em certos momentos somente você conseguia me fazer sorrir.

À toda minha família, avós, tios e tias, primos e primas que mesmo separados por quilômetros de distância, estavam juntos comigo, em pensamento e orações, sempre torcendo por cada momento, acreditando que no final, vibrariam por mais uma conquista. Muito obrigada!

À Professora, Orientadora, Amiga e Irmã Miliane Moreira Soares de Souza que apostou na minha competência, me ajudou a dar os primeiros passos e a evoluir na vida profissional. Sou muito grata, pela paciência, pelos ensinamentos, pela confiança e carinho. Que Deus continue te abençoando!

À professora Maria Cristina Affonso Lorenzon, por ter me incentivado a pensar e a refletir sobre as abelhas, maravilhosas criaturas que produziram a matéria-prima dessa pesquisa. Obrigada por apoiar meu trabalho e incentivar meu sucesso. E, além disso, fazer despertar em mim um amor especial por essas adoráveis abelhas.

Ao professor Laerte da Cunha Azeredo e à professora Vera Lúcia Mores Rall que mesmo sem terem ciência de sua tamanha importância, estiveram sempre dispostos e foram grandes auxiliadores e motivadores para elaboração dessa pesquisa.

Aos apiários e apicultores que doaram não só as amostras de mel para o desenvolvimento da pesquisa, mas também seu tempo e dedicação para que, juntos, pudéssemos terminar esse trabalho.

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Obrigada pelo empenho em conseguir amostras, pelos ensinamentos concedidos e por todo carinho que sempre me deram.

Ao Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento, por incentivar essa pesquisa. Em especial, agradeço ao Dr. Décio Araújo de Menezes, pelo apoio e por todas as amostras coletadas.

Aos estagiários do Laboratório de Bacteriologia pela responsabilidade, disponibilidade e dedicação que sempre me presentearam. Especialmente agradeço à Débora Fontes Barbosa de Oliveira por ter sido meu “braço direito”, estando comigo em todas as etapas desse trabalho, sempre me estimulando, mesmo quando achávamos que tudo iria dar errado. Em você, muitas vezes, encontrei incentivo e força para continuar a buscar outras saídas.

À minha amiga e irmã Shana de Mattos de Oliveira Coelho, por todas as palavras de apoio e incentivo, por ter me emprestado seus ouvidos nos momentos de lamentações, sua família nos momentos de solidão, por ter me aconselhado de maneira tão sábia e por estar comigo vinte e quatro horas por dia, literalmente. Eu poderia dizer mais um milhão de coisas, mas nada, ou melhor, tudo, não seria o suficiente para te agradecer. TE AMO!

Às amigas e companheiras de laboratório Lidiane de Castro Soares e Ingrid Annes Pereira, agradeço pela ajuda, pela paciência, pela amizade e companheirismo, pelos aprendizados em conjunto, pelas brincadeiras e por simplesmente aturarem meu jeitinho diferente de ser.

Aos amigos aqui conquistados Marcelo Carvalho Gomes e Tatiani Abreu Gomes, tenho muito prazer em agradecer a vocês que sempre abriram a porta de casa para que eu pudesse entrar e compartilhar momentos tão maravilhosos. Obrigada, por todas as vezes que estiveram prontos a me ajudar, seja no que fosse... Obrigada por terem sorrido e chorado ao meu lado. Muito obrigada pela amizade íntegra, de todos os instantes e também, de todo bem que até hoje me proporcionaram. Espero que sempre estejamos juntos, mesmo a quilômetros de distância!

Ao meu querido namorado Mateus Ottomar da Silva, que bem devagar chegou em minha vida e se instalou de maneira tão perfeita, trazendo alegria e motivação a cada dia. Você é sem dúvida um presente de Deus para mim! Obrigada por estar ao meu lado quando preciso, por rir e chorar comigo, por sempre me confortar e por trazer em si a segurança que necessito. Te amo muitão!

À todos os meus velhos e também aos novos amigos (os quais não me atrevo a citar pois não quero esquecer de nenhum) que me apoiaram e de alguma forma me ajudaram no desenvolvimento dessa pesquisa.

À minha amada família em Cristo - Igreja Congregacional de Agronomia, que me acolheu de braços abertos e sempre me apoiou e incentivou. Aos irmãos que estiveram comigo nos momentos mais difíceis e desanimadores dessa pesquisa. Muito obrigada pelas orações! Em Cristo amo vocês!

À minha querida turma de mestrado e aos colegas que compartilharam comigo das disciplinas, conversas nos corredores, almoços em turma e tornaram os momentos mais difíceis e complicados em momentos agradáveis e divertidos.

Aos funcionários do Projeto de Sanidade Animal e do Instituto de Veterinária, que direta ou indiretamente contribuíram para a execução deste projeto, em especial, Luiz Jorge Soares e Gilberto Flausino.

Ao Curso e aos professores do Curso de Pós-Graduação em Microbiologa Veterinária, pela dedicação, respeito e ensinamentos transmitidos com profissionalismo.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro concedido a este trabalho através de bolsa de estudo.

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BIOGRAFIA

LIGIA PORTUGAL GOMES, filha de César Martins Gomes e Nelia Duarte Portugal Gomes, nasceu em 06 de julho de 1982, no município de Bom Jesus do Itabapoana, Estado do Rio de Janeiro, onde passou a infância e parte da adolescência.

Aos 16 anos mudou-se para Niterói-RJ, onde terminou o ensino médio e prestou vestibular. Em março de 2000 ingressou no Curso de Economia Doméstica – Bacharelado e Licenciatura - na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro em Seropédica, diplomando-se em março de 2004. Durante este período, foi bolsista de iniciação científica da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro – FAPERJ, sob a orientação do professor Dr. Francisco de Assis Baroni, estagiária do Laboratório de Bacteriologia da UFRuralRJ onde pode desenvolver projetos na área de Bacteriologia e Microbiologia de Alimentos, sob a orientação da professora Dr.ª Miliane Moreira Soares de Souza e, supervisora – estagiária de análises laboratoriais e do setor de Controle de Qualidade da empresa La mole serviços de alimentação Ltda no Rio de Janeiro-RJ.

Foi aprovada no Processo de Seleção para o Curso de Pós-Graduação em Microbiologia Veterinária, do Instituto de Veterinária desta Instituição em 2004, sob a orientação da professora Drª . Miliane Moreira Soares de Souza, sendo bolsista de pós-graduação da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

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RESUMO

GOMES, Ligia Portugal. Contaminação bacteriana em amostras de méis de Apis mellifera L. comercializados no Estado do Rio de Janeiro. 2006. 46p Dissertação (Mestrado em Microbiologia Veterinária). Instituto de Veterinária, Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.

O presente estudo teve como objetivo proceder ao isolamento e a identificação das espécies bacterianas presentes em amostras de méis comercializados e produzidos no Estado do Rio de Janeiro com finalidade de estabelecer o perfil da microbiota bacteriana prevalente neste tipo de amostra. Foram randomicamente coletadas 102 amostras de mel de Apis mellifera L., de floradas distintas, adquiridas em embalagens comerciais próprias dos apiários e apicultores, regularizados ou não. Para traçar o perfil de contaminação bacteriana, foram realizadas a contagem e a identificação de bactérias aeróbias mesófilas; a pesquisa de Bacillus cereus e pesquisa de a Clostridium botulinum utilizando metodologias descritas na literatura. Das 102 amostras analisadas, 62 apresentaram crescimento bacteriano e em 40 amostras não foi possível detectar algum crescimento. As contagens padrão de aeróbios mesófilos variaram de 1,0 x 102 UFC/g a 8,0 x 102 UFC/g. Das amostras contaminadas, os seguintes gêneros foram isolados Bacillus spp (66,33%), Listeria spp (20,41%), Corynebacterium spp (4,08%), Staphylococcus spp coagulase negativo (3,06%), Streptococcus spp saprófita (3,06%), Micrococcus spp (2,04%) e Clostridium spp (1,02%). Bacillus cereus (36,92%) foi a espécie mais encontrada. Foram detectados também esporos de Clostridium botulinum em uma amostra do Estado do Rio de Janeiro. Os resultados mostraram que, estatisticamente, a presença ou ausência de selo de inspeção e a matéria-prima da embalagem não interferiram no grau de contaminação do produto. A contaminação encontrada nas amostras não diferiu entre as diferentes regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro. Entretanto, contatou-se que as condições físico-químicas de certas floradas de origem do mel podem influenciar na microbiota contaminante do produto. Frente aos resultados encontrados, faz-se necessária a implantação de programas de controle de qualidade na cadeia de produção e beneficiamento do mel, com rigor na fiscalização, além do desenvolvimento de novos padrões para análise microbiológica deste produto, visando garantir a saúde do consumidor.

Palavras chave: mel, microbiota bacteriana, Rio de Janeiro.

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ABSTRACT

GOMES, Ligia Portugal. Contamination of bacteria in honey samples produced by Apis melliferas L. commercialized in the state of Rio de Janeiro. 2006. 46p Dissertation (Master Science in Veterinary Microbiology). Instituto de Veterinária, Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.

The present work aimed to isolate and identify bacterial species presented in honey samples commercialized or produced in the regions of apiculture of Rio de Janeiro in order to establish a profile of its bacterial microbiota.102 samples of honey produced by Apis mellifera L. were randomically collected of distinct blooms, acquired in suitable commercial packages from apiaries and beekeepers, registered or not. To achieve the contamination profile, procedures of mesophile bacteria counting and identification, search of Bacillus cereus and Clostridium botulinum were performed using described methodology. From 102 samples analyzed, 62 presented bacterial growth, in the others 40 no growth was detected. Results of standard counting for aerobes mesophiles ranged from 1,0 x 102 UFC/g to 8,0 x 102 UFC/g. The following genus were isolated Bacillus spp (66.33%), Listeria spp (20.41%), Corynebacterium spp (4.08%), Micrococcus spp (2.04%), Staphylococcus spp coagulase negative (3.06%), saprophytic Streptococcus spp (3.06%) and Clostridium spp (1.02%). Bacillus cereus (36.92%) was the most abundant species. It was also detected spores of Clostridium botulinum in a sample originated from the state of Rio de Janeiro. Statistically, the results showed that presence or absence of inspection stamp and the material of packing did not interfere in the contamination level of the product. There was no difference in the ratio of contamination between samples produced in different apiculture regions of Rio de Janeiro. Otherwise blooms could influence contamination pattern. Results obtained point out the need of implantation of quality control programs in the production and processing of honey with rigor in the fiscalization associated with the development of new patterns to microbiological analysis, in order to guarantee consumer health. Key words: honey, bacterial contamination, Rio de Janeiro.

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LISTA DE ABREVIAÇÕES

APGF: Água Pepto Glico Fosfatada

BHI: Infusão de Cérebro e Coração

CDC: Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos da América

CMM: Meio carne cozida

EDTA: Etileno-diamina-tetra-acetato

g: Gramas

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Kcal: Quilocalorias

KW teste: Teste de Kruskal Wallis

ml: Mililitro

M X2: Teste de qui-quadrado de Mantel

MYP: Manitol gema de ovo polimixina

PCA: Agar padrão para contagem

SIE: Selo de Inspeção Estadual

SIF: Selo de Inspeção Federal

SIM: Selo de Inspeção Municipal

SIM: Agar Sulfeto Indol Motilidade

SPS: Sulfito Polimixina Sulfadiazina

TPGY: Tripticase peptona glicose extrato de levedura

UFC: Unidade Formadora de Colônia

W: Teste de Wilcox

X2: Teste de qui-quadrado de Pearson com correção de Yates

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ÍNDICE DE QUADROS

Página

Quadro 1. Composição físico-química do mel

5

Quadro 2. Produção de mel no Brasil no período entre 1999 e 2002.

8

Quadro 3. Testes de identificação para diferenciação de gênero dos

isolados do grupo 2, segundo Koneman et al. (2001).

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ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro.

4

Figura 2. Amostras obtidas diretamente do apicultor ou, em

estabelecimento comercial localizado no Estado do Rio de

Janeiro.

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Figura 3. Demonstração do método de “Spread plate”.

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ÍNDICE DE TABELAS

Página

Tabela 1. Distribuição da amostras de méis analisadas entre as diferentes

regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro e outros Estados

brasileiros

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Tabela 2. Distribuição de amostras analisadas segundo a florada declarada

pelo fabricante Quantidade de amostras coletadas segundo a

distribuição em florada de origem

20

Tabela 3. Bactérias isoladas a partir das amostras de mel contaminadas

22

Tabela 4. Identificação dos microrganismos isolados nos meios PCA

Difco e MYP Micromed

24

Tabela 5. Distribuição de amostras contaminadas e bactérias isoladas por

região apícola do estado do Rio de Janeiro e outros Estados

brasileiros

24

Tabela 6. Distribuição de amostras contaminadas e bactérias isoladas por

florada declarada na embalagem.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 01 2. REVISÃO DE LITERATURA. 02 2.1. Apicultura 02 2.2. Mel: definição e composição físico-química 05 2.2.1. Usos do mel 06 2.2.2. Produção e importância econômica no Brasil 07 2.3. Microrganismos no mel 09 2.3.1. Contaminação fúngica 10 2.3.2. Contaminação bacteriana 11 2.4. Bactérias de importância em saúde pública isoladas do mel

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3. MATERIAL E MÉTODOS

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3.1. Obtenção das amostras e período de amostragem 14 3.2. Processamento das amostras 14 3.3. Análises microbiológicas 15 3.3.1. Contagem de bactérias aeróbias mesófilas 15 3.3.2. Pesquisa de bactérias esporuladas de importância em saúde pública 17 3.4. Análises estatísticas

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 20

5. CONCLUSÕES 26

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27

7. APÊNDICES 37

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1. INTRODUÇÃO

O mel é um alimento produzido a partir do néctar das flores que as abelhas coletam, transformam, combinam a substâncias e estocam nas colméias. É um produto mundialmente consumido sendo considerado um alimento importante para saúde do seres humanos. Atualmente, novas tecnologias e usos inovadores do mel representam um mercado em expansão.

O mel produzido por Apis mellifera, quando comparado com outros produtos de origem animal, apresenta um baixo número e variedade de microrganismos, porém não é um alimento estéril e está susceptível a contaminações. A sua contaminação pode estar associada à veiculação de microrganismos pelas próprias abelhas melíferas, ao seu beneficiamento ou à manipulação inadequada, além de más condições de armazenamento e acondicionamento.

É um alimento de grande relevância e interesse, uma vez que pode ser usado tanto como ingrediente quanto como produto final. São atribuídas ao mel, várias propriedades medicinais, além de sua qualidade como alimento. O mel pode ser usado como ingrediente em drogas, cosméticos, rações e como conservante de tecidos animais além de outros usos. Apresenta conhecida propriedade antibiótica e, sua aplicação tópica é útil no tratamento de processos gangrenosos e queimaduras. No entanto, o mel também constitui um veículo para agentes microbianos, em especial leveduras e bactérias formadoras de esporos. Estas últimas são de grande importância em saúde pública, uma vez que o mel é oferecido como alimento para crianças, sendo considerado um dos principais alimentos de risco na ocorrência do botulismo infantil.

Apesar do amplo uso do mel no Brasil, e do destacado papel do país na exportação, não há regulamentação adequada para análise microbiológica deste produto. No entanto, em outros países, existe uma forte preocupação ao risco potencial de veiculação de patógenos, em especial o Clostridium botulinum, agente do botulismo infantil. Neste contexto, esta pesquisa visou demonstrar a importância da existência de uma legislação que contemple microrganismos de possível veiculação através do mel, para oferecer ao produto uma qualidade higiênico-sanitária satisfatória e, não oferecer riscos à saúde do consumidor.

A hipótese levantada é de que a presença de bactérias esporuladas em méis pode comprometer a qualidade higiênico-sanitária do produto, bem como a saúde do consumidor. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo geral proceder ao isolamento e a identificação das espécies bacterianas presentes em amostras de méis de Apis mellifera L., comercializados no Estado do Rio de Janeiro de modo a traçar um perfil da microbiota bacteriana prevalente nas amostras.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1.Apicultura

Apicultura é a criação de abelhas melíferas, Apis mellifera L., alojadas em colméias artificiais, utilizando métodos e equipamentos desenvolvidos para melhor aproveitar a capacidade produtiva natural destes insetos (PERUCA et al., 2002). É uma atividade de grande importância, capaz de causar impactos positivos, tanto sociais quanto econômicos, por apresentar uma alternativa de ocupação e renda para o homem do campo, além de contribuir para a manutenção e preservação dos ecossistemas existentes. A cadeia produtiva da apicultura propicia a geração de inúmeros postos de trabalho, empregos e fluxo de renda, principalmente no ambiente da agricultura familiar, sendo desta forma, determinante na melhoria da qualidade de vida e fixação do homem no meio rural. Além destes fatos pode ser caracterizada por sua fácil manutenção e por baixo custo inicial em relação às demais atividades agropecuárias (FREITAS et al., 2004).

Por sua natureza, a apicultura é uma atividade econômica conservadora das espécies, devido ao baixo impacto ambiental que ocasiona, possibilitando a utilização permanente dos recursos naturais e a não destruição do meio rural. Assim, é uma das poucas atividades preenchedoras de todos os requisitos do tripé da sustentabilidade: o social, o econômico e o ambiental. No âmbito social por se tratar de uma forma de geração de ocupação e emprego no campo, com diminuição do êxodo rural. Quanto ao fator econômico, além da geração de renda para os produtores, há a possibilidade de obtenção de bons lucros. E na questão ambiental, por não haver necessidade de desmatamento para criar abelhas, são necessárias plantas vivas para a retirada do pólen e do néctar de suas flores, os quais são fontes alimentares básicas. Além disso, as abelhas atuam como polinizadores naturais de espécies nativas e cultivadas, preservando-as e conseqüentemente contribuindo para o equilíbrio do ecossistema e manutenção da biodiversidade (PAXTON, 1995; ALCOFORADO FILHO, 1997; 1998).

Os principais produtos obtidos e comercializados a partir da atividade apícola são: mel, cera, própolis, geléia real e o veneno (apitoxina). Há também um segmento da apicultura que vem se desenvolvendo ao longo dos últimos anos, que é o de serviços de polinização, em que as colméias são alugadas para produtores de outra cultura agrícola com a finalidade de aumento da produção desta cultura (FREITAS, 1998).

No Brasil, a apicultura com a utilização de abelhas importadas teve inicio no século XVIII, quando padres jesuítas trouxeram abelhas da Península Ibérica (WIESE, 1995). As abelhas africanas Apis mellifera scutellata foram introduzidas no Brasil em 1956. Cerca de um ano depois, 26 enxames com suas respectivas rainhas, escaparam e cruzaram com as demais subespécies de abelhas melíferas européias: a italiana Apis mellifera ligustica, a alemã Apis mellifera mellifera e a austríaca Apis mellifera carnica. Com isto surgiram populações poli-híbridas, denominadas africanizadas, com predominância de características das abelhas africanas, tais como a grande capacidade de enxamear e a rusticidade (KERR, 1967).

A alta capacidade de defesa, de adaptação a ambientes inóspitos e um ciclo de vida mais curto que as demais subespécies aqui existentes, são características das abelhas africanizadas que muito se assemelham às das africanas nativas. Tais características permitem a ambas, uma rápida ampliação da biomassa e significativo aumento populacional (GONÇALVES, 1994). A conjunção de todos esses

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fatores contribuiu para que as abelhas africanizadas atualmente ocupem quase todo continente americano (GONÇALVES, 2001; KREBS, 2001).

Se por um lado, antes da introdução das abelhas africanas, a produção brasileira de mel oscilava entre 3 a 5 mil toneladas/ano, algumas décadas depois passou a aproximadamente 40 mil toneladas/ano (GONÇALVES, 1994), por outro lado, ainda se discute sobre os prováveis impactos dessa introdução na competição com as espécies de abelhas nativas, sobre as relações entre polinizadores e plantas nos ambientes naturais e sobre o sucesso reprodutivo das plantas nativas (SILVEIRA et al., 2002).

Na década de 1990, na sua produção de mel e seus derivados o Estado do Rio de Janeiro não teve evolução expressiva, chegando até mesmo a importar grande quantidade dos países do Mercosul para atender seu mercado interno. A partir do ano de 2000, a produção de mel, não só no Estado do Rio como em outros estados da federação cresceu e se modernizou para atender às exportações que se tornam mais freqüentes. Com a introdução e permanência de enfermidades em apiários de países exportadores, a procura pelo mel brasileiro tem sido alta, visto que até o momento, o Brasil não detectou doenças que desqualifique seu produto no mercado, sendo considerado um mel de qualidade satisfatória devido ao seu grau de pureza, consistência, aroma e sabor (MAPA, 2005).

Segundo a Pesquisa Apícola Fluminense (OSÓRIO; ROCHA, 1994) realizada pela Cooperativa Apícola do Rio de Janeiro Ltda (Coapi-Rio), o Estado do Rio de Janeiro está dividido em seis regiões apícolas de acordo com o critério de divisão adotado pela EMATER-Rio, são elas: região sul que compreende os municípios de Angra dos Reis, Barra do Piraí, Barra Mansa, Engenheiro Paulo de Frontin, Itatiaia, Mandes, Miguel Pereira, Paracambi, Paraíba do Sul, Parati, Paty do Alferes, Pirai, Resende, Rio Claro, Rio das Flores, Sapucaia, Três Rios, Valença, Vassouras e Volta Redonda, totalizando vinte municípios. A região centro que engloba 12 municípios: Cachoeiras de Macacu, Duque de Caxias, Itaboraí, Itaguaí, Maga, Mangaratiba, Nilópolis, Niterói, Nova Iguaçu, Rio de Janeiro, São Gonçalo e São João do Meriti. A região noroeste que compreende: Bom Jesus do Itabapoana, Cambuci, Italva, Itaocara, Itaperuna, Lage do Muriaé, Miracema, Natividade, Porciúncula, Santo Antônio de Pádua, perfazendo dez municípios. A região norte que compreende apenas seis municípios: Campos dos Goytacazes, Conceição de Macabu, Macaé, Quissamã, São Fidelis, São João da Barra. A região serrana com treze municípios compreende: Bom Jardim, Cantagalo, Carmo, Cordeiro, Duas Barras, Nova Friburgo, Petrópolis, São José do Vale do Rio Preto, São Sebastião do Alto, Santa Maria Madalena, Sumidouro, Teresópolis, Trajano de Moraes. E a região da baixada litorânea que engloba nove municípios: Araruama, Arraial do Cabo, Cabo Frio, Casimiro de Abreu, Maricá, Rio Bonito, São Pedro da Aldeia, Saquarema, Silva Jardim.

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De acordo com Osório e Rocha (1994), a maior parte das pessoas que exercem atividade

apícola no Estado do Rio de Janeiro possui cursos ligados a apicultura, está inserida de alguma forma em organização associativista e exerce apicultura fixa com manejo de produção. O contingente de indivíduos envolvidos nesta atividade não está diretamente relacionado ao padrão quantitativo da produção, que é bastante diferenciado entre as regiões.

Osório e Rocha (1994) afirmam que as regiões serrana, sul e centro são as que apresentam, quando observadas isoladamente, os melhores resultados em termos de produção apícola. E que a visão geral dos números referentes à região serrana mostram ser esta a mais equilibrada em relação as demais, podendo seus valores ser considerados como “parâmetro médio” da apicultura do Estado do Rio de Janeiro. A região sul apesar de ter um contingente ligeiramente superior ao da região serrana (5%) tem a produção de cera e pólen menor (8,7% e 531% respectivamente), enquanto a região centro, que possui um número bem maior de pessoas exercendo apicultura e também a mais expressiva produção melífera, produz proporcionalmente menos cera e pólen que a região serrana. A região noroeste, à exceção da produção de pólen, apresenta valores para mel, cera e própolis que indicam uma proporcionalidade quando comparados aos da região serrana. Na baixada litorânea, embora o quantitativo de pessoas que exercem a apicultura seja o menor de todas as regiões, pode-se afirmar que a produção de mel, cera e própolis não é baixo. Na região norte, apesar de existirem 44% mais pessoas exercendo apicultura, do que na região noroeste, a produção de mel representa um decréscimo de 16,8% .Ao comparar os dados da região norte e serrana, o total de pessoas exercendo a apicultura apresenta um declínio de 49,3% e de 165,8% na produção de mel.

Figura 1. Regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro. (Fonte: www.ibge.gov.br)

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2.2. Mel: definição e composição físico-química

Segundo o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (2001), o mel é um produto alimentício produzido pelas abelhas melíferas, a partir do néctar das flores ou das secreções procedentes de partes vivas das plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com substâncias específicas próprias, armazenam e deixam maturar nos favos da colméia. É uma solução concentrada de açúcares com predominância de glicose e frutose (MAPA, 2001; CODEX, 2001). Contém ainda uma mistura complexa de outros hidratos de carbono, enzimas, aminoácidos, ácidos orgânicos, minerais, substâncias aromáticas, pigmentos e grãos de pólen podendo conter cera de abelhas procedente do processo de extração (MAPA, 2001; CODEX, 2001). É considerado um alimento de alto valor energético para o organismo humano (CRANE, 1987) uma vez que, 1 grama de mel contém 6,4 kcal (ETTINGER, 2002).

O mel é um produto complexo, cuja composição varia notadamente em conseqüência da florada original, das zonas geográficas e das condições climáticas (Quadro 1). A diferença entre os méis depende da variedade e quantidade de plantas que florescem e produzem néctar no mesmo período (KRAMER, 1997; SILVA et al., 2004).

Quadro 1. Composição físico-química do mel. Componentes Quantidade aproximada Frutose 38,4 % Glicose 30,3 % Sacarose 1,3 % Outros carboidratos 12 % Minerais 0,169 % Proteínas 169/100 mg/g Água 17,2 % Fonte: White et al. (1963) apud IURLINA, 2005.

Rigorosamente, não existe mel monofloral. Contudo, uma pequena quantidade de néctar de outras plantas melíferas não influi marcadamente no sabor e cor de um mel onde predomine o néctar de uma única espécie florífera. Existem dezenas de variedades de mel de abelhas que podem ser diferenciadas pela flora, pelo local ou época de colheita, ou ainda, segundo as técnicas de preparação (BASTOS et al., 2002). De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento (2001), o mel pode proceder do néctar das flores de uma única espécie vegetal sendo denominado de mel monofloral ou unifloral, ou de várias espécies, sendo neste caso denominado, mel multifloral ou polifloral.

Como os demais produtos alimentícios, o mel deve satisfazer numerosos critérios de qualidade e certificações antes da comercialização (DEVILLERS et al., 2004). Entretanto, com o incremento de consumo de produtos naturais, o mel tem sido utilizado e comercializado mais intensamente, de modo que aumenta também a possibilidade de fraudes, adulterações e manipulação inadequada (CANO et. al., 1992).

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2.2.1. Usos do mel

Evidências do uso do mel pelo ser humano aparecem desde a pré-história, com inúmeras referências em pinturas rupestres, assim como em manuscritos e outros tipos de pinturas (PEREIRA et al., 2003).

O mel é considerado o produto apícola mais fácil de ser explorado, sendo também o mais conhecido e aquele com maiores possibilidades de comercialização. É um produto consumido mundialmente e de alta relevância na saúde humana. Além de ser um alimento, é também utilizado em indústrias farmacêuticas (IOIRISH, 1985) e cosméticas (ARROYO, 1975), na fabricação de rações, como conservantes de tecidos animais e outros, devido as suas conhecidas ações terapêuticas (FREITAS et al., 2004; SNOWDON; CLIVER, 1996).

Industrialmente, tem uso restrito devido às oscilações de preço e dificuldade de obtenção do produto padronizado, por apresentar variações de cor, sabor, umidade e conteúdo de açúcares (SQUIRES et al., 1997). Entretanto, freqüentemente, é utilizado na fabricação de produtos alimentícios, industrializados ou artesanais (SNOWDON; CLIVER, 1996; SQUIRES et al., 1997; STRAIT, 1997).

Na medicina, seu uso é uma antiga tradição. Os asiáticos, os gregos e os egípcios usavam para cura de feridas e doenças intestinais. (ZUMLA; LULAT, 1989). Nos dias de hoje, esse produto apresenta reconhecida propriedade antibiótica, inclusive tendo um papel importante no tratamento de feridas colonizadas por bactérias resistentes a antibióticos (COOPER et al., 2002; MOLAN, 1992). Sua aplicação tópica tem sido frequentemente abordada em publicações sobre o tratamento de feridas infectadas, tratamento de processos gangrenosos e queimaduras (SUBRAHMANYAM, 1991), com excelentes resultados na redução de infecção e diminuição do tempo de cura das lesões. O uso de açúcar ou mel como agente tópico no tratamento de feridas, tem se incorporado definitivamente à rotina dos serviços de saúde por todo mundo (TOSTES; LEITE, 1994). Segundo Efem (1992), o mel é superior a qualquer solução de açúcar hipertônica quanto à atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de Streptococcus pyogenes, Enterococcus fecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus spp, Bacteroides fragilis, Clostridium tetani e Clostridium welchii. A administração oral é citada no tratamento e proteção contra infecções gastrintestinais como gastrite, duodenites, ulcerações gástricas causadas por bactérias e rotavírus (MEN`SHIKOV; FEIDMAN, 1949; TALLET et al., 1977; HAFFEJEE, 1985; SAMAL et al., 1994; TOPHAM, 2002; ALNAQDY et al., 2005) e de úlceras crônicas (EFEM, 1998; GREENWOOD, 1993). O mel ainda tem comprovada eficácia na prevenção do crescimento de Helicobacter pylori no estômago, na redução de gastrites alcoólicas, e de processos cancerígenos (SAMAL et al., 1994).

Além das propriedades citadas, Amendola (2001) e Gaiga e Schossler (2003), afirmam que o mel demonstra ser um meio adequado para preservação de xenoenxerto ósseo. Subrahmanyam (1993) e Gupta (1977) apontam o mel como substância eficaz na preservação de tecidos animais.

As propriedades antimicrobianas do mel foram relatadas pela primeira vez no século passado por Sackett et al. (1919). O agente responsável pela atividade antimicrobiana foi denominado inibidor. Posteriormente, White et al. (1962) identificaram esse fator inibitório como peróxido de hidrogênio. Esse composto é formado pelo sistema de glicose oxidase, que é um processo enzimático ativado somente em méis que não estão em ponto de colheita, denominados não maduros. A enzima glicose oxidase é a peça chave deste processo e pode ser destruída através do tratamento térmico de pasteurização, que comumente é aplicado aos méis. Nesse sistema, a glicose é quebrada, produzindo ácido glicônico e peróxido de hidrogênio. Fungos e leveduras parecem não ser sensíveis a este composto (WHITE et al., 1962 apud Snowdon; Cliver, 1996).

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Atualmente, outros fatores têm sido mencionados como responsáveis pela atividade antimicrobiana do mel: alta pressão osmótica, baixa atividade de água (Aa), pH baixo, formação de peróxido de hidrogênio pelo sistema glicose oxidase, baixo teor de proteínas, alta relação carbono - nitrogênio, baixo potencial redox devido a alta concentração de açúcares, alta viscosidade (limitando o oxigênio disponível), presença de substâncias com atividade antimicrobiana como lisozima, ácidos fenólicos e flavonóides (WHITE, 1966, MOLAN, 1992; ADCOCK,1962 ; WAHDAN,1998, TYSSET, 1974).

Acredita-se que devido a estas propriedades naturais e as medidas de controle empregadas em seu beneficiamento, este produto pode conter poucos tipos e baixos índices de microrganismos (SNOWDON; CLIVER, 1996). No entanto, existem escassos dados na literatura que suportem esta idéia.

2.2.2. Produção e importância econômica no Brasil

Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), estudos sobre a produção apícola no Brasil mostram dados contraditórios quanto ao número de apicultores e colméias, produção e produtividade. Quanto aos apicultores, as pesquisas apontam os extremos entre 26 e 300 mil; que possuem entre 1,3 e 2,5 milhões de colméias e um faturamento anual entre 85 e 506 milhões de reais. Os dados conflitantes refletem a dificuldade em se obter informações precisas quanto à produção e comercialização no setor agropecuário, entretanto, conseguem passar a idéia da importância dessa atividade para o país. Dimensionar o volume de mel produzido e comercializado é uma tarefa difícil, devido aos poucos dados confiáveis sobre o assunto são conflitantes (PEREIRA et al., 2003). Estima-se que a produção mundial de mel durante o ano de 2001 foi de, aproximadamente, 1,2 milhões toneladas, sendo a China o maior produtor (256 mil toneladas). Segundo os dados do IBGE, a produção de mel em 2000 no Brasil foi de pouco mais de 21,8 toneladas, gerando um faturamento de 84 milhões de reais. Os maiores exportadores mundiais são: China, Argentina, México, Estados Unidos e Canadá. Juntos, esses países comercializaram durante o ano de 2001 cerca de 240 mil toneladas, movimentando, aproximadamente, 238 milhões de dólares.

Com vendas externas de apenas 2,8 milhões de dólares, em 2001, o Brasil não aparecia na lista dos maiores exportadores mundiais (com 1% ou pouco mais do total). Já em 2002, o país surge como o nono maior exportador, com 23,1 milhões de dólares, ultrapassando países como Vietnã, Austrália, Uruguai, Romênia, Índia, França, Itália, e outros (FAO/ONU, 2004). O valor das exportações de mel brasileiro em 2003 ultrapassou os 39,4 milhões de dólares, aproximando nosso país dos líderes do mercado mundial (SECEX, 2004).

Nos últimos anos, a Alemanha, é o principal importador do mel brasileiro. O valor de 20,9 milhões de dólares das aquisições germânicas foi mais que o dobro do valor registrado em 2002 e quase dez vezes o de 2001. A disputa internacional pelo produto brasileiro elevou o seu preço, de US$ 1,13 o quilo em 2001 para US$ 2,34/kg em 2003. Estados Unidos, Reino Unido, Bélgica e Espanha também incrementaram significativamente suas compras, contribuindo para o excelente desempenho brasileiro (PEREIRA et al., 2003).

De 1999 a 2002, a produção brasileira de mel natural aumentou 21,49% (Quadro 2), segundo o IBGE cabe ressaltar a grande expansão da atividade no Nordeste, que evoluiu de uma participação de 14% do total nacional para 23%, e a redução da participação sulina de 60% para 51%.

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Quadro 2: Produção de mel no Brasil no período entre de 1999 e 2002.

Estados toneladas/ano Variação

(%)

1999 2000 2001 2002 1999-2002

São Paulo 1,8 1,8 2,0 2,0 13,99 Minas Gerais 1,9 2,1 2, 0 2, 4 27,77 Espírito Santo 0,18 0,17 0,18 0, 27 50,58 Rio de Janeiro 0,41 0, 4 0,38 0, 36 -14,04

Regiões Sudeste

4, 2

4, 5

4, 6

5, 1

18,87

Norte 0, 18 0, 30 0, 31 0, 37 100,37 Nordeste 2,7 3, 7 3, 8 5, 5 99,00 Sul 11, 8 12,6 12,7 12, 2 3,44 Centro-Oeste 0, 60 0, 63 0, 67 0, 68 12,06 Brasil 19 22 22 24 21,49

Fonte: IBGE – http://www.ibge.gov.br

A produção do Sudeste apresentou crescimento próximo à média brasileira e manteve a sua participação em 21%. A unidade da federação que apresentou maior crescimento relativo foi o Maranhão (639,57%) e a que teve o maior aumento absoluto de produção foi o Ceará (mais de 852 toneladas), seguido do Piauí (635 toneladas). A região Nordeste foi responsável pelo aumento de 2.767 toneladas (65 % do aumento brasileiro de 4.244 toneladas, entre 1999 e 2002).

Segundo Vilela (2000), seguindo-se a tecnologia recomendada na produção e comercializando o mel de maneira adequada, espera-se rentabilidade satisfatória na atividade principalmente se comparada aos demais negócios agropecuários.

2.3. Microrganismos no mel

Embora o mel seja um produto que por suas características físicas e químicas não apresente alta susceptibilidade à proliferação de microrganismos, a ação de fatores externos (ambientais, condições de manipulação e estocagem) pode influenciar negativamente sua qualidade final (CAMARGO, 2002).

Segundo a Portaria nº 367, de 4 de setembro de 1997 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, os padrões microbiológicos para o mel são: ausência de coliformes totais/g em cinco amostras analisadas de um lote, ausência de Salmonella spp e Shigella spp em 25g em dez amostras de um mesmo lote e presença de no máximo 100 UFC/g de bolores e leveduras em duas amostras de

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cinco analisadas de um mesmo lote. Esta portaria foi revogada pela instrução normativa no 11 de 20 de outubro de 2000 onde consta em anexo o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do mel, entretanto, esta instrução normativa não apresenta padrões microbiológicos para mel.

As características microbiológicas do mel estão relacionadas à qualidade e a segurança deste alimento. Os microrganismos de importância são primariamente leveduras, fungos filamentosos e bactérias formadoras de esporos. Estes microrganismos estão envolvidos em atividades de deterioração do produto, através da produção de enzimas, toxinas, pela conversão metabólica do alimento, assim como pela produção de fatores do crescimento (vitaminas e aminoácidos) e fatores de inibição de microrganismos competidores (GOERZEN, 1991).

Tysset e Rousseau (1981) acreditam que as fontes de contaminação do mel são: os seres humanos, os equipamentos, os recipientes, a poeira,o ar, os insetos, os animais e a água. Eles advertem que os microrganismos podem sobreviver no mel e, ressaltam as boas práticas de fabricação como fator essencial no controle de microrganismos em todos os alimentos, incluindo o mel. Estudo realizado por Martins e colaboradores (2003), demonstra esta preocupação emergente, ao observar a insuficiência de parâmetros definidos para avaliar a qualidade higiênico-sanitária do mel comercializado em Portugal.

As fontes primárias de contaminação microbiana do mel como o pólen, o trato digestório de abelhas melíferas, a poeira, o ar, a terra e o néctar são considerados de difícil controle, quando comparadas com as fontes secundárias que podem ser controladas através da implantação de boas práticas de fabricação no entreposto. As fontes secundárias incluem: a exposição ao ar durante a extração do mel; os manipuladores (infecções de pele, espirros ou contaminação fecal); as contaminações cruzadas (animais ou produtos animais) e os equipamentos (incluindo resíduos de alimento e água). Além destas, pisos, paredes e tetos, também podem ser reservatórios de microrganismos e contaminar o alimento. Um alto índice de unidades formadoras de colônias de microrganismos vegetativos (os quais não são esperados e não podem se desenvolver no mel) por grama pode indicar uma contaminação recente por vias (SNOWDON; CLIVER, 1996).

Segundo Sonwdon e Cliver (1996), relatos e pesquisas sobre contaminação de vírus e parasitas em mel, até o momento, são inexistentes em publicações científicas. Entretanto, bactérias e fungos encontrados nos ambientes da cadeia produtora do mel (favos, pólen, flores, solo e outros) estão comumente presentes no produto final. Dentre estes encontram-se Actinetobacter spp, Bacillus spp, Clostridium spp, Corynebacterium spp, Pseudomonas spp, Psychrobacter spp e Vagococcus spp, provenientes do solo; espécies de Bacillus spp, Clostridium spp e Micrococcus spp do ar e poeira. Leveduras do gênero Saccharomyces spp e Torula spp e outros microrganismos existentes em vegetais como Brochothrix spp, Citrobacter spp, Enterobacter spp, Erwinia spp, Flavobacterium spp, Lactobacillus spp, Luctococcus spp, Listeria spp e Pediococcus spp também podem ser isolados a partir do mel (SNOWDON; CLIVER, 1996).

2.3.1. Contaminação fúngica

A contaminação fúngica é importante, considerando a grande capacidade de dispersão destes microrganismos. A simples presença de estruturas fúngicas em substratos adequados pode implicar não somente em seu desenvolvimento, mas como na possível produção de micotoxinas concomitantemente (SNOWDON; CLIVER, 1996).

O mel pode apresentar várias mudanças durante a estocagem, especialmente decorrentes da fermentação por leveduras osmofílicas (CRANE, 1979). Estas leveduras podem se desenvolver em

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condições ácidas e não são inibidas pela presença de sacarose (SNOWDON; CLIVER, 1996; RÍOS DE SELGRAD et al., 1992), sendo assim, consideradas um problema na indústria de mel. Tysset (1981), afirma que méis provenientes de regiões úmidas possuem mais leveduras e são deteriorados ainda na colméia.

Segundo Crane (1979), o aumento da umidade e temperatura na estocagem do mel favorecem o desenvolvimento de leveduras, contribuindo para a fermentação do produto. Durante a fermentação, as leveduras atacam os açúcares, produzindo álcool e dióxido de carbono. Na presença de oxigênio, o álcool pode ser convertido em ácido acético. A fermentação usualmente acontece em micro-ambientes (como no topo da embalagem) onde existe maior concentração de água (CRANE, 1979; ROOT, 1983). De acordo com White (1978), outro fator a ser considerado é que, mesmo em condições sanitárias adequadas, o processo natural de cristalização do mel promove o enriquecimento da fase líquida contribuindo, também, para sua fermentação.

Em relação aos fungos filamentosos, alguns estão associados ao conteúdo intestinal das abelhas, à colméia e ao ambiente de forrageamento. Aspergillus spp foi isolados de intestinos de larvas de abelhas (HASIG; KAMBUROY, 1966), assim como os gêneros: Atichia spp, Coniothecium spp, Hormiscium spp, e Triposporium spp (HASIG; KAMBUROY, 1966). Morse e Hooper (1985) constataram que quando as colméias são mantidas em áreas úmidas, fungos filamentosos, frequentemente, se desenvolvem nas superfícies das mesmas e as abelhas possuem uma extraordinária habilidade para limpa-las e restaurá-las. Além disso, observaram que o estoque de pólen pode ser atacado por fungos. Tysset et al. (1970) isolaram Ascosphaera spp, Aspergillus spp, Cephalosporium spp, e Penicillium spp no mel. Entretanto, os trabalhos que quantificam os níveis decontaminação por fungos no mel ainda são escassos (SNOWDON; CLIVER, 1996).

A baixa contagem de fungos reportada por Piana et al. (1991) sugere que os fungos podem sobreviver, mas não tendem a crescer no mel. Rios de Selgrad et al. (1992) constataram que uma vez que o mel está contaminado por fungos e leveduras, estes microrganismos permanecem na forma latente, sem se multiplicarem. A proliferação de fungos pode ter como conseqüências: perdas econômicas por deterioração do produto e danos a saúde devido à possibilidade de serem fungos produtores de micotoxinas, como por exemplo, as (MARTINS et al., 2003).

2.3.2. Contaminação bacteriana

As bactérias formadoras de esporos são de importância na qualidade do mel principalmente as (SNOWDON; CLIVER, 1996). Uma vez que estas possuem potencial genético para formarem esporos que sobrevivem no alimento podendo permanecer dormentes durante períodos de tempo extremamente longos, resistindo aos tratamentos térmicos. Os esporos bacterianos são resistentes a agentes como, calor, dessecamento, radiação, ácidos e desinfetantes químicos (MADIGAN et al., 2004).

Segundo Snowdon e Cliver (1996), as contagens bacterianas determinados no mel, variam de 1 a 5000 UFC/g. Esta variação pode estar associada ao tipo de amostra (artesanal ou industrializada), o tempo de estocagem do mel, época de colheita e a técnica de beneficiamento utilizada.

Com exceção da pesquisa de Clostridium botulinum, há poucos relatos na literatura a respeito de bactérias no mel (IURLINA; FRITZ; 2005; SNOWDON; CLIVER, 1996). Desde o século passado, diversos trabalhos reportam a presença de esporos de Clostridium botulinum em mel de várias partes do mundo (SUGIYAMA et al., 1978; MIDURA et al., 1979; FLEMMING; STOJANOWIC, 1980; HARTGEN, 1980; HUHTANEN et al., 1981; KAUTTER et al., 1982;

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STIER et al., 1982; GUILFOYLE; YAGER, 1983; KOKUBO et al., 1984; AURELI et al., 1985; SAKAGUCHI et al., 1987; HAUSCHILD et al., 1988; NAKANO et al., 1990; NAKANO; SAKAGUCHI, 1991; NAKANO et al., 1989; DU et al., 1991, RALL et al. 2003; CENTORBI et al., 1999; SCHOCKEN-ITURINO et al., 1999; DELMAS et al., 1994; NEVAS et al., 2005; KÜPLÜLÜ et al., 2006; MONETO et al. 1999).

Tysset e colaboradores (1970) detectaram os seguintes gêneros bacterianos no mel: Bacillus spp, Brevibacterium spp, Enterobacter spp, Flavobacterium spp, Micrococcus spp, Neisseria spp, Pseudomonas spp, e Xanthomonas spp. O maior número de isolados foram membros do gênero Bacillus spp, especificamente, B. cereus e B. pujilus. Martins e colaboradores (2003) isolaram Clostridium perfringens e Bacillus cereus em amostras de mel, colhidas aleatoriamente a partir do comércio não especializado em Portugal.

A maior parte de estudos sobre a sobrevivência bacteriana no mel envolve a introdução de formas vegetativas patogênicas, os quais, normalmente, não estão presentes no mel. Sackett (1919) partindo da hipótese que as abelhas podem carrear microrganismos patogênicos de excrementos humanos para o mel, inoculou espécies de enterobactérias em mel puro e verificou sobrevivência por apenas poucas horas ou dias. Entretanto, uma solução de aproximadamente 50% de mel em água permitiu sobrevivência por um período maior, 40 dias. Esse mesmo autor considerou impossível que mel carreasse os agentes da febre tifóide e desinteria.

De acordo com Snowdon e Cliver (1996), formas vegetativas de bactérias patogênicas ainda não foram isoladas em mel, se introduzidas podem sobreviver por períodos determinados de tempo, principalmente sob baixas temperaturas. A sobrevivência de microrganismos no mel pode ser influenciada pelo tipo e pela composição do mesmo.

2.4. Bactérias de importância em saúde pública isoladas do mel

As bactérias de importância em saúde pública que têm sido isoladas a partir do mel são Bacillus cereus e Clostridium botulinum.

O Bacillus cereus é uma bactéria Gram positiva, aeróbica, formadora de esporos esféricos, e muitas estirpes são capazes de produzir toxinas. Esta bactéria é comumente encontrada em solos, vegetais, poeira, água e em vários alimentos crus e processados tais como arroz, condimentos, leites, vegetais, carnes, farináceos, sobremesas e bolos (JAY, 2005; JACQUETTE; BEUCHAT, 1998; CHRISTIANSSON et al., 1999). A intoxicação por B. cereus tem período de incubação geralmente curto (média de 6 a 12 horas) e a principal manifestação clínica é representada pelos vômitos persistentes, decorrentes da intoxicação pela toxina emética. Esta toxina é termoestável, resistente às proteases e aos extremos de pH, além de induzir alterações mitocrondriais nos linfócitos “T helper” tipo 2 (ÁGATA et al., 1996). Outros tipos de toxinas produzidas são as enterotoxinas, responsáveis pela manifestação de diarréia e de dor abdominal; podem ser de três tipos, a hemolítica, a não hemolítica e a enterotoxina (FINLAY et al., 2002).

O consumo de alimentos que contenham uma concentração superior a 106 B. cereus/g pode resultar em intoxicação alimentar (APHA, 2001; RHODEHANEL, 2001). Esta bactéria tem sido associada com intoxicações alimentares na Europa desde 1906 (JAY, 2005) e, atualmente está entre as bactérias predominantes em surtos de intoxicação alimentar, causando diarréia e emese (FINLAY et al., 2002). Desse modo, a presença desta bactéria em alimentos representa um aumento potencial de risco à saúde, uma vez que os consumidores se tornam mais sujeitos a sofrerem processos diarréicos e eméticos. (AGATA et al., 2002; RADHIKA et al., 2002).

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Iurlina e colaboradores (2006) avaliaram a distribuição de Bacillus spp em 70 amostras de mel argentino, encontrando uma prevalência de: 23% Bacillus cereus, 4% Bacillus pumilus e 8% Bacillus laterosporus. Kokubo et al. (1984), avaliou presença de esporos bacterianos em 71 amostras de mel, das quais 67 (94%) estavam contaminadas com níveis de 10-100 esporos por grama. A maior parte desses esporos presentes foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus spp e a espécie predominante Bacillus cereus seguida por B. coagulans, B. megaterium, e B. alvei. Esporos de B. cereus também foram isolados em 24 de 50 amostras testadas por Piana et al. (1991) com contagem em média de 0.1- 1 UFC/g.

Clostridium botulinum é uma bactéria anaeróbica, Gram positiva, possui capacidade de esporulação, o que lhe confere resistência ao calor e mantém a sua sobrevivência em alimentos não processados. É o agente etiológico do botulismo e tem como habitat natural, o solo (SOLOMON; LILLY, 2001; JAY, 2005; JUNEJA; MARKS, 1999). Este microrganismo produz a toxina botulínica (neurotoxina) que é o mais potente toxina natural conhecida, cuja dose letal é de 1x 10-7 mg/kilo de peso vivo. Esta pequena quantidade na corrente sanguínea pode causar a morte em minutos através de paralisia muscular (SOLOMON; LILLY, 2001).

A maioria dos casos de botulismo está associada ao consumo de alimentos caseiros, especialmente vegetais, frutas e peixes inadequadamente conservados (JAY, 2005; KÜPLÜLÜ et al., 2006). A intoxicação por Clostridium botulinum é uma doença rara com ocorrência de 24 casos/ano nos Estados Unidos.

Raramente são identificados casos de botulismo após o consumo de alimentos processados.

Os alimentos enlatados, defumados ou em conserva, cujo tratamento térmico não permitiu a destruição dos esporos, também podem ser fontes de contaminação (JAY, 2005).

O botulismo infantil foi reconhecido inicialmente em 1976, na Califórnia, ocorrendo em lactentes

menores de um ano pela ingestão dos esporos do Clostridium botulinum contidos em alimentos mal conservados. A partir desse relato, vem sendo confirmado na maioria dos estados dos Estados Unidos da América e em alguns outros países como Inglaterra, França, Canadá, Japão e Argentina (JAY, 2005; SCHOCKEN-ITURRINO et al., 1999; CENTORBI et al., 1999; NAKANO et al., 1990). No caso de botulismo infantil, esporos botulínicos viáveis são ingeridos e, após germinação no trato intestinal, a toxina é sintetizada. A ingestão de esporos por indivíduos adultos, de modo geral, não acarreta alterações, embora seja possível que, sob condições especiais (adultos imunossuprimidos), isto ocorra, pois, o trato intestinal colonizado não favorece a germinação dos esporos (CDC, 2003; JAY, 2005). Por outro lado, nas crianças com menos de um ano de idade, o trato gastrointestinal ainda não apresenta a microbiota protetora e os ácidos biliares que inibem o desenvolvimento do Clostridium botulinum, estando mais suscetível à colonização, devido ao ambiente favorável à germinação dos esporos e a produção da toxina botulínica (KÜPLÜLÜ et al., 2006; JAY, 2005; NEVAS et al., 2005; RALL et al., 2003; CDC, 2003).

Estudos epidemiológicos e clínicos vêm mostrando um crescimento na incidência desta patologia nos últimos anos. De todos os alimentos que oferecem risco para o botulismo infantil, o mel é a fonte mais freqüente (SOLOMON; LILLY, 2001; RALL et al. 2003; CENTORBI et al., 1999; SCHOCKEN-ITURINO et al., 1999; DELMAS et al., 1994; NEVAS et al., 2005; KÜPLÜLÜ et al., 2006; MONETO et al. 1999; CDC, 2003; METHNER; MERTIN, 2001). Neste contexto, o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC) não recomenda que crianças menores de um ano de idade consumam mel (RALL, 2003; SOLOMON; LILLY, 2001; CDC, 2003). No Brasil, esporos de C. botulinum foram detectados em méis do Estado de São Paulo por Rall et al. (2003) e em méis de vários Estados brasileiros por Schocken-iturino et al. (1999). Entretanto, não constam na literatura casos brasileiros de botulismo infantil causados por mel.

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3. MATERIAL E METÓDOS

3.1. Obtenção das amostras e período de amostragem

As amostras de méis foram adquiridas randomicamente pelo Estado do Rio de Janeiro, respeitando os limites de território, utilizamos como pontos de coleta supermercados e mercearias, apiários e casas de mel situados no Estado. Algumas amostras foram encaminhadas por apicultores fluminenses, ao escritório do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento situado no município de Niterói-RJ.

No período de dezembro de 2004 a outubro de 2005 foram obtidas 102 amostras em embalagens (Figura 2), contendo no mínimo 200 gramas de mel de Apis mellifera L., comercializada no Estado do Rio de Janeiro, independente de terem sido produzidos neste estado. Estas amostras, de floradas distintas, foram adquiridas em embalagens comerciais próprias dos apiários, regularizados (possuíam algum selo de inspeção) ou não, de diferentes regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro e outros Estados do país. Todas as amostras foram conduzidas ao Laboratório de Bacteriologia Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, onde foram analisadas.

Figura 2. Amostras obtidas diretamente do apicultor ou, em estabelecimento comercial localizado no Estado do Rio de Janeiro. 3.2. Processamento das Amostras

As amostras foram divididas em nove grupos de dez e um de doze unidades para facilitar a manipulação das mesmas. Em cabine de segurança biológica, a superfície da embalagem de mel foi desinfetada com algodão embebido em álcool 70% e aberta assepticamente. Em seguida, foram pesados 25g da amostra e transferidos para um erlenmeyer contendo 225ml de água peptonada 0,1%, sendo esta mistura homogeneizada por três minutos. A partir desta diluição (1/10), as suspensões foram semeadas em meios próprios para o tipo de agente que se pretendia isolar.

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3.3. Análises Microbiológicas

Foram priorizadas a contagem total de bactérias e as pesquisas de agentes com importância em saúde pública como Bacillus cereus e Clostridium botulinum, pesquisados através de metodologia específica. 3.3.1. Contagem de bactérias aeróbias mesófilas

A semeadura foi feita em duplicata, utilizando o método de “spread plate” (Figura 3): 0,1ml da diluição (10-1) foi inoculado em superfície de placas de Petri descartáveis estéreis contendo Agar padrão para contagem (PCA / Difco®) e espalhado com alça de Drigalski previamente imersa em álcool etílico e flambada, cobrindo toda superfície das placas, as quais foram incubadas a 37oC por 24 - 48 horas. Os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônias por grama de amostra (UFC/g) (APHA, 2001; MATURIN; PEELER, 2001). As colônias crescidas em Agar PCA após a realização da identificação presuntiva foram reisoladas e identificadas segundo Koneman e colaboradores (2001).

1 2 3 Figura 3. Demonstração do método de “Spread plate”. 1- Inoculação de 0,1ml da diluição (10-1) em superfície de placas de Petri contendo Agar padrão para contagem; 2- Distribuição sobre o ágar com alça de Drigalski previamente imersa em álcool etílico e flambada; 3- Placa com crescimento após ser incubada a 37oC por 24 a 48 horas. Testes de identificação presuntiva - Características das colônias, Método de Gram, Prova do hidróxido de potássio a 3% (KOH) e Prova da catalase

Após a observação das características de crescimento das colônias, estas foram submetidas ao método de Gram, para confirmação das suas características morfotintoriais. O teste da catalase foi realizado através de teste em lâmina. Para tal, foi depositada uma partícula da colônia bacteriana, à qual se adicionava uma gota da solução de peróxido de hidrogênio (H2O2). A formação de bolhas de O2 indicou teste positivo. A prova do hidróxido de potássio foi efetuada através da adição de uma gota de KOH (3%) à uma partícula da colônia bacteriana. A não formação de um gel viscoso indicou um resultado negativo confirmando a prova do Gram, uma vez que todas as bactérias Gram positivas são negativas na prova do KOH a 3% (KONEMAN et al., 2001).

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Identificação de grupos bacterianos

Após a identificação presuntiva das colônias, estas foram divididas nos seguintes grupos: GRUPO 1 -Bastonetes Gram (+), esporulados, catalase (+) GRUPO 2 -Bastonetes Gram (+), não esporulados, catalase (+) GRUPO 3 -Cocos Gram (+), catalase (+) GRUPO 4 -Cocos Gram (+), catalase (-)

As colônias do grupo 1, foram reisoladas em Agar nutritivo (microMed) incubado a 35ºC por 24 horas e a partir desse isolado, realizou-se as provas bioquímicas pertinentes ao gênero Bacillus spp, descrito no item 3.3.2.1.2.

Para as colônias do grupo 2, foi feito reisolamento em Ágar Muller Hinton (Biobrás) incubado a 35ºC por 24 horas. As provas de identificação utilizadas para diferenciação entre gêneros (Quadro 3) foram: comportamento em Agar sulfeto indol motilidade (SIM - Vetec), teste da catalase e hidrólise da esculina, conforme descrito no item 3.3.2.1.2.. Para isolados do gênero Listeria spp, foram realizados testes para verificação de possíveis estirpes de Listeria monocytogenes. Como redução de nitrato, fermentação de açúcares (raminose, xilose, lactose, glicose, maltose, manitol e salicina), conforme descrito no item 3.3.2.1.2., teste da presença da enzima citocromo oxidase, utilizando fita reativa PROBAC, prova de produção de urease e capacidade hemolítica.

Quadro 3. Testes de identificação para diferenciação de gênero dos isolados do grupo 2, segundo Koneman et al. (2001)

Gêneros Catalase Motilidade H2S Esculina

Listeria spp + + - +

Corynebacterium spp + - - -

O reisolamento das colônias do grupo 3, foi realizado em Agar Manitol Vermelho de Fenol

(microMed) incubado a 35ºC por 24 horas. A partir desse isolado, foi efetuada prova da coagulase e teste de sensibilidade à bacitracina. Prova da coagulase - O teste para a detecção da atividade da enzima coagulase, foi realizado utilizando o crescimento bacteriano obtido em caldo BHI (infuso de cérebro e coração), incubado a 35ºC, por 24 horas. Uma alíquota de 0,1 ml de cada amostra foi adicionada a 0,5 ml de sangue total de carneiro, acrescido de etileno-diamina-tetra-acetato (EDTA-1%) e, incubados a 35ºC por 6 horas a fim de obter a visualização do coágulo. As amostras coagulase-negativas foram submetidas à prova de sensibilidade à bacitracina para diferenciação entre estafilococos coagulase-negativos e Micrococcus spp (KONEMAN et al., 2001). Sensibilidade à bacitracina por difusão em disco – Foi retirada uma alíquota de (0,5ml) da mesma suspensão bacteriana utilizada para prova da coagulase, a qual foi distribuída com o auxílio da alça de Drigalski previamente imersa em álcool etílico e flambada, por toda a superfície de uma placa contendo meio sólido (Agar Müeller Hinton - Biobrás). O disco de bacitracina foi depositado sobre a superfície do meio de cultura, já contendo o inóculo. Após incubação por 24 horas a 350C, os diâmetros formados na zona de inibição ao redor do depósito dos fármacos foram observados e medidos em milímetros (KONEMAN et al., 2001).

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Os microrganismos que se apresentaram sensíveis (halo de inibição � 10 mm) foram identificados como pertencentes ao gênero Micrococcus spp e os isolados resistentes (halo de inibição ‹ 10 mm) identificadas como Staphylococcus spp coagulase negativo.

As colônias do grupo 4 foram inoculadas em caldo Casoy incubado a 35ºC por 24-48 horas. Em seguida, realizou-se o teste de redução de azul de metileno. Para esta prova, retirou-se 0,2 ml da suspensão em caldo Casoy, a qual foi inoculada em leite com azul de metileno a 1%. Os isolados capazes de utilizar o oxigênio presente reduzindo o azul de metileno foram considerados microrganismos saprófitas.

3.3.2. Pesquisa de Bactérias Esporuladas de Importância em Saúde Pública Pesquisa de Bacillus cereus

Uma alíquota de 0,1 ml da diluição 10-1 foi semeada em duplicata, de acordo com o método de “spread plate” (Figura 3), em superfície de placas de Petri descartáveis estéreis contendo meio seletivo para Bacillus cereus (MYP / microMed). As placas foram incubadas a 30ºC por 24 a 48 horas. Posteriormente, a identificação presuntiva das colônias foi realizada de acordo as características de crescimento das colônias, observando-se a formação de zonas de precipitação ao redor da colônia indicando a produção de lecitinase e a ocorrência ou não, da fermentação do manitol. As colônias suspeitas foram transferidas para tubos contendo Agar Nutritivo (microMed) inclinado e incubado a 30ºC por 24 horas, posteriormente foram realizados testes para identificação (APHA, 2001; KONEMAN et al., 2001; RHODEHAMEL, 2001).

As colônias que não apresentaram crescimento característico de B. cereus também foram identificadas (Anexo B).

Testes de identificação: Identificação Presuntiva: Conforme item 3.3.1. Identificação Confirmatória: (Anexo B) - Fermentação de Açúcares

As cepas foram submetidas à avaliação da atividade fermentadora de glicose, xilose, manitol, lactose, sacarose e maltose. A fermentação dos açúcares foi testada utilizando o caldo contendo o indicativo de pH vermelho de fenol e o açúcar a 1%. A produção de ácido, indicada pela diminuição do pH e conseqüente mudança de cor de vermelho para amarelo, foi avaliada após 24 horas na temperatura de 35ºC. A fermentação de glicose foi realizada em anaerobiose sendo, adicionados a estes tubos de ensaio, 1ml de óleo mineral esterilizado, os quais foram incubados e interpretados igualmente aos outros tubos (APHA, 2001; KONEMAN et al., 2001; RHODEHAMEL, 2001).

- Prova de Voges-Proskauer (VP), Redução de nitrato e Hidrólise de gelatina

O caldo APGF apresenta na sua composição glicose, peptona, água e fosfato. A utilização da glicose, apresentando a produção de acetilmetilcarbinol, é indicada pela coloração rosa após a adição

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de 0,3 ml de á-naftol a 5% e 0,6 ml de KOH (40%) no caldo contendo o inóculo incubado por 24 a 48 horas a 35ºC.

Para avaliação da redução de nitrato, foi utilizado caldo contendo nitrato de potássio (KNO3). A leitura da redução do nitrato a nitrito foi realizada adicionando-se em uma lâmina, uma gota do caldo inoculado após 24 horas a 35ºC e, uma gota de ácido sulfanílico e outra de á-naftilamina, reativos A e B de Griess Ilosway. A coloração rósea avermelhada indica presença de nitrito no caldo e, conseqüentemente prova de redução positiva.

A capacidade de hidrolisar gelatina através da enzima gelatinase, foi testada inoculando uma partícula da colônia em meio contendo gelatina e incubando em estufa bacteriológica a 35ºC por 24 a 48. Em seguida, os tubos foram levados em geladeira por 15 minutos para realização da leitura, nos tubos onde a gelatina permaneceu liquefeita mesmo após o resfriamento, foram considerados positivos (KONEMAN et al., 2001; RHODEHAMEL, 2001).

- Prova de motilidade, Produção de indol e Hidrólise de esculina

Para as provas de motilidade e produção do indol, utilizou-se Agar sulfeto indol motilidade (SIM - Vetec). Após inoculação em picada com auxílio de alça moldada em agulha, incubou-se a 35º por 24 a 48 horas. A interpretação do teste de motilidade foi realizada através da observação do tubo contra a luz sendo possível visualizar o tipo de crescimento da colônia, sendo considerado motilidade negativo o microrganismo crescido apenas na linha inoculada e positivo o que ultrapassou a mesma. A leitura da produção de indol, resultada da degradação metabólica do aminoácido triptofano, foi realizada adicionando-se gotas de reativo de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldeído em álcool) no tubo. A mudança de coloração do reativo de amarela para vermelha indica a presença de indol, sendo a prova considerada positiva (KONEMAN et al., 2001).

A capacidade da cepa hidrolisar a esculina foi observada pela inoculação das mesmas em caldo nutritivo contendo esculina e incubado a 35ºC por 24-48 horas. A hidrólise da esculina em esculetina e glicose foi detectada pela adição de 0,2ml de solução de citrato férrico, a prova foi considerada positiva quando apresentava cor preta- esverdeada na ação do indicador (KONEMAN et al. 2001).

Na etapa de identificação de Bacillus cereus além da metodologia padrão utilizada, comparamos todos os resultados com o comportamento da cepa padrão de B.cereus (ATCC 14579) para maior embasamento metodológico. Pesquisa de Clostridium botulinum

Foram utilizados dois meios de enriquecimento, caldo de carne cozida (CMM/ BBL) e caldo tripticase - peptona - glicose - extrato de levedura (TPGY) (KÜPLÜLÜ et al., 2006; RALL et al., 2003; SOLOMON; LILLY, 2001). Em cabine de segurança biológica, foram retiradas quatro alíquotas de 2ml de cada amostra de mel, as quais foram inoculadas em duplicata, em 15ml de cada caldo de enriquecimento. Imediatamente, todos os tubos foram levados para banho-maria (90ºC) por 15 minutos e resfriados em banho de gelo. Os tubos que continham CMM foram incubados a 35ºC (cepas proteolíticas) e, os de TPGY a 28ºC (cepas não proteolíticas) por sete dias. Os caldos que não apresentaram crescimento durante os sete dias, foram novamente incubados por mais 10 dias. Aqueles que não apresentaram crescimento nesse período foram considerados negativos (RALL et al., 2003; SOLOMON; LILLY, 2001).

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Após o período de incubação, as culturas foram observadas quanto à turbidez, produção de gás, digestão das partículas de carne no caldo CMM e odor. Após essa caracterização, as suspensões foram submetidas ao método de Gram, para confirmação das suas características morfotintoriais, bastonetes Gram positivos esporulados, similares a raquete de tênis (RALL et al., 2003; SOLOMON; LILLY, 2001). Para eliminar a microbiota indesejada, nos tubos com crescimento positivo, foi realizado o seguinte procedimento: em cabine de segurança biológica, foram retirados 2ml do caldo de enriquecimento que apresentava células características e adicionados em um volume igual etanol filtrado em Millipore 0,22 ì m. Esta suspensão foi incubada em temperatura ambiente por uma hora (RALL et al., 2003; SOLOMON; LILLY, 2001). Em seguida, uma alíquota desta suspensão foi estriada, em duplicata, em Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS - Vetec) acrescido de 5% de emulsão de gema de ovo para obtenção de colônias isoladas (MONETTO et al., 1999). As placas foram incubadas em jarra de anaerobiose a 35º C por 48 horas. As colônias típicas (curva ou plana, lisa ou áspera e com zona de precipitação) foram re-isoladas em duplicata no Agar SPS, sendo uma placa icubada em ambiente aeróbio e outra em anaerobiose, ambas a 35ºC por 48-72. As colônias que apresentaram crescimento apenas em anaerobiose foram consideradas puras (RALL et al., 2003; SOLOMON; LILLY, 2001).

3.4. Análises Estatísticas

Estas análises (Anexo C) foram realizadas através dos seguintes testes: Qui-quadrado de Pearson com correção de Yates (X2) para avaliar a significância entre a variação da contaminação encontrada nas amostras que apresentam ou não algum selo de inspeção, bem como o perfil de contaminação das amostras produzidas no Estado do Rio de Janeiro (RJ) em relação a outros estados do Brasil. O teste de Wilcox (W) para avaliar a eficiência de isolamento dos meios PCA e MYP utilizados para isolamento de B. cereus. O teste de qui-quadrado de Mantel-Haenszel, M (X2), para avaliar a interferência da matéria-prima da embalagem, vidro ou plástico, na probabilidade de contaminação e teste de Kruskal Wallis (KW test) para avaliar a diferença no crescimento bacteriano entre as floradas e entre as distintas regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro. (PAULA, 2002; http://www.R-project.org, 2005).

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

No período de janeiro a novembro de 2005, foram analisadas 102 amostras de mel comercializadas ou produzidas em regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro (Tabela 1), provenientes de diferentes floradas de acordo com as informações contidas na embalagem (Tabela 2). Tabela 1. Distribuição das amostras de méis analisadas entre as diferentes regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro e outros Estados do Brasil.

Região de origem Número de amostras (%) Sul 36 (35,30) Centro 15 (14,70) Serrana 14 (13,75) Baixada litorânea 5 (4,90) Noroeste 1 (0,95) Outros Estados do Brasil 31 (30,40) 102 (100%)

Tabela 2. Distribuição de amostras analisadas segundo a florada declarada pelo fabricante.

Florada Número de Amostras (%)

Silvestre 62 (60,80)

Assa-Peixe 10 (9,80) Laranjeira 8 (7,80)

Eucalipto 8 (7,80)

Uva Japonesa 3 (3,00) Marmeleiro 2 (1,95)

Girassol 2 (1,95) Sacurá 2 (1,95)

Morrão de Candeia 2 (1,95)

Capixingui 1 (1,00) Jamelão 1 (1,00)

Cambará 1 (1,00)

102 (100%)

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De acordo com a distribuição por região apícola das amostras de méis analisadas, o maior percentual de amostras coletadas foi da região sul, seguida pelas regiões centro e serrana. Acredita-se que por estas regiões apresentarem maior índice de produção apícola (OSÓRIO; ROCHA, 1994) foram representadas com um número maior de amostras quando comparadas às outras regiões. A região da baixada litorânea e a região noroeste disponibilizaram um menor percentual de amostras. A região norte, que segundo Osório e Rocha (1994) apresenta a menor produção apícola do estado, não foi representada neste estudo. Os outros Estados brasileiros apresentaram o segundo maior percentual de amostras analisadas, indicando a existência de um intercâmbio no comercio de mel no Estado do Rio de Janeiro.

A distribuição por floradas foi realizada levando em consideração a florada declarada na embalagem pelo próprio fabricante. Segundo Bastos e colaboradores (2002), rigorosamente, não existe mel monofloral. Entretanto, uma pequena quantidade de néctar de outras plantas melíferas não influi marcadamente no sabor e cor de um mel onde predomine o néctar de uma única espécie florífera. Foram recebidas amostras de méis de 12 floradas distintas. Ao distribuirmos as amostras entre as floradas, a florada silvestre destaca-se com 60,8% das amostras em seguida estão assa-peixe (9,8%), laranjeira (7,8%) e eucalipto (7,8%). Em menor percentual, também foram avaliadas as floradas de uva japonesa (3%), marmeleiro (1,95%), girassol (1,95%), sacurá (1,95%), morrão de candeia (1,95%), capixingui (1%), jamelão (1%) e cambará (1%). Segundo Silva et al. (2004) e Kramer (1997) um dos fatores que influencia na composição físico-química do mel é a florada de origem. Foram analisadas através do teste de Kruskal Wallis (KW teste) amostras de nove floradas distintas, com P � 0,1. Não é possível considerar a hipótese de igualdade entre méis das diferentes floradas, ou seja, pelo menos méis de uma florada diferem dos demais. Nesse contexto, acredita-se que as condições físico-químicas de certas floradas de origem também podem interferir na microbiota presente no mel. Na tabela 5, encontram descritas as bactérias isoladas e o número de amostras contaminadas por florada.

Do total de amostras analisadas, 85 (83,3%) estavam acondicionadas em embalagens plásticas e apenas 17 (16,7%) em embalagens de vidro. Estes dados divergem dos resultados de Osório e Rocha (1994), que constataram que a maioria (85,5%) dos apicultores do Estado do Rio de Janeiro utilizava embalagem de vidro e apenas 12,1% usam embalagem plástica para acondicionar o mel. Acredita-se que devido ao maior custo da embalagem de vidro, ao longo dos anos, ela tenha sido substituída pela embalagem plástica. Em relação à probabilidade de contaminação entre embalagens de vidro e plástico (M X2, n plástico= 85/ n vidro= 17, P � 0, 05), existe a mesma probabilidade de contaminação entre as embalagens de vidro e plástico, para proporções homogêneas, independente da presença ou não de selo de inspeção.

Das amostras analisadas, apenas 33 (32,35 %) continham Selo de Inspeção (SI) seja este, Municipal (SIM), Estadual (SIE) ou Federal (SIF) e 69 (67,65%) não apresentavam nenhum tipo de registro ou selo de inspeção. Em 40 amostras (39,22%) não foi detectado qualquer tipo de crescimento bacteriano, destas, 15 (37,5 %) eram oriundas de estabelecimentos inspecionados. O teste de Qui-quadrado de Pearson com correção de Yates considera a hipótese da igualdade entre os níveis de contaminação tanto para os produtos que possuem selo de inspeção ou não, quando P� 0,05.

A análise específica da contaminação do produto não seguiu a regulamentação técnica proposta na Portaria nº 367, de 4 de setembro de 1997 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a única que contempla análises microbiológicas para o produto mel, por esta não estabelecer um padrão microbiológico confiável. Esta portaria não contempla a análise de bactérias do gênero Clostridium, especificamente, a espécie Clostridium botulinum que é de grande relevância, por ser o agente causador do botulismo infantil e ter sido detectado em méis de países europeus e asiáticos causando

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botulismo. Por outro lado, a portaria aborda análise de presença de Salmonella sp e Shigella spp que não são microrganismos comumente isolados neste produto. Apesar desta portaria ter sido revogada pela instrução normativa nº11 de 20 de outubro de 2000, onde consta em anexo o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do mel, não constam exigências de padrões microbiológicos para este alimento. Outra portaria que poderia abranger os padrões microbiológicos do mel é a Resolução -RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) que apesar de regulamentar dos padrões microbiológicos para alimentos, não regulamenta padrões para mel.

Os microrganismos isolados a partir das 62 amostras (60,78%) contaminadas estão listados na Tabela 3.

Tabela 3. Bactérias isoladas a partir das amostras de mel contaminadas.

Dentre os gêneros bacterianos isolados, as espécies de Bacillus spp foram observadas em

maior número, destacando-se B. cereus (36,92%), B. subitilis (27,69%), B. licheniformis (10,77%) e B. mycoides (7,69%), os demais não ultrapassaram 5% das amostras. Estes resultados são similares aos encontrados por Iurlina et al. (2006) que avaliaram a distribuição de Bacillus spp em 70 amostras de mel argentino, encontrando 23% Bacillus cereus, 4% Bacillus pumilus e 8% Bacillus laterosporus. Kokubo et al. (1984) ao avaliarem a presença de esporos bacterianos no mel detectaram em 71 amostras, 67 (94%) contaminadas com níveis de 10-100 esporos por grama. A maior parte desses esporos presentes foi identificada como pertencente ao gênero Bacillus spp, sendo a espécie predominante Bacillus cereus, seguido por B. coagulans, B. megaterium, e B. alvei. Esporos de B. cereus também foram isolados em 24 de 50 amostras testadas por Piana et al. (1991) com contagem

Microrganismos Número de amostras contaminadas Bacillus cereus 24 Bacillus subtilis 18 Bacillus licheniformis 7 Bacillus mycoides 5 Bacillus brevis 3 Bacillus sphaericus 2 Bacillus megaterium 2 Bacillus thuringiensis 1 Bacillus lateroporus 1 Bacillus stearothermophilus 1 Bacillus lentus 1 Listeria spp 20 Corynebacterium spp 4 Staphylococcus spp coagulase negativo 3 Streptococcus spp saprófita 3 Micrococcus spp 2 Clostridium botulinum 1

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em média de 0.1- 1 UFC/g. Tysset et al. (1970) obtiveram como o maior número de isolados, membros do gênero Bacillus spp, especificamente, B. cereus e B. pujilus. Martins e colaboradores (2003) isolaram Bacillus cereus em amostras de mel, colhidas aleatoriamente em estabelecimentos comerciais de Portugal.

A espécie mais pesquisada em méis, Clostridium botulinum, foi isolada de uma amostra de mel não inspecionada, acondicionada em embalagem plástica, de florada silvestre, produzida na região centro do Estado do Rio de Janeiro. Este resultado é similar aos encontrados na literatura, Rall et al. (2003) detectaram a presença dessa espécie em 3% das 100 amostras analisadas no Estado de São Paulo. Schocken-Iturrino et al. (1999) analisaram 80 amostras de mel brasileiro das quais, seis (7,50%) estavam contaminadas com C. botulinum. Küplülü et al. (2006), analisaram 88 amostras turcas encontrando seis (6,80%) contaminadas com esporos de C. botulinum. Na França, Delmas et al. (1994) isolaram C. botulinum em 6,7% das amostras analisadas. Nevas e colaboradores (2005) analisaram 529 amostras de mel dos países nórticos, sendo 83 (15,69%) destas positivas para presença de C. botulinum.

Quando analisados os isolados pertencentes ao gênero Listeria spp para possível identificação da espécie Listeria monocytogenes, os resultados não foram positivos para nenhum dos isolados. Tal fato corrobora com a afirmativa de Snowdon e Cliver (1996) que formas vegetativas de bactérias patogênicas ainda não foram isoladas em mel.

Snowdon e Cliver (1996) discutiram a possibilidade de microrganismos existentes no ambiente de beneficiamento e da cadeia produtora estarem presentes no produto final. Alguns gêneros isolados nas amostras de mel deste trabalho validam essa discussão como exemplo, Micrococcus spp, Bacillus spp, e Clostridium spp os quais estão presentes no ar e poeira, Listeria spp são encontrados em plantas e seus derivados, Staphylococcus spp coagulase negativo, Streptococcus spp saprófita e Corynebacterium spp os quais podem estar presentes na pele e mucosa de manipuladores e também podem ser inseridos ao produto final por contaminações cruzadas.

A avaliação da eficácia dos meios utilizados para o isolamento de B. cereus foi realizada através da comparação do crescimento quantitativo de colônias de mesma espécie nos meios PCA e MYP. O meio padrão para contagem (PCA) obteve em média 1,93 x 102 UFC/g enquanto, a média de unidades formadoras de colônia por grama de mel no meio manitol gema de ovo polimixina (MYP) foi de 1,81 x 102. Foi possível observar que o Agar PCA Difco foi mais eficiente para o isolamento de B. cereus ao comparar com o Agar MYP microMed, considerando-se a seletividade deste para a espécie B. cereus. Existe diferença entre os meios de cultura (W teste, n=102, P � 0,05). O meio PCA promoveu um desenvolvimento de B. cereus superior a 62,3%, em comparação com o meio MYP. A diferença de crescimento entre os meios de cultura pode ser observada na tabela 4.

Em relação à distribuição dos índices de contaminação entre as regiões apícolas do Estado do Rio de Janeiro (tabela 5), pelo teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade, aceita a hipótese nula (H0), ou seja, todas as regiões são iguais. Quando comparadas as amostras produzidas nas regiões fluminenses e a de outros Estados brasileiros, o teste de Qui-quadrado de Pearson com correção de Yates, considera a hipótese de igualdade entre proporções de contaminação para as amostras do Estado do Rio de Janeiro e outras localidades, quando P�0,05.

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Tabela 4. Identificação dos microrganismos isolados nos meios PCA Difco e MYP microMed.

Microrganismos isolados Nº de amostras que apresentaram crescimento PCA MYP

Bacillus cereus 19 12 Bacillus subitilis 12 8 Bacillus licheniformis 6 2 Bacillus mycoides 4 1 Bacillus brevis 3 0 Bacillus megaterium 2 0 Bacillus thuringiensis 1 0 Bacillus sphaericus 1 0 Bacillus lentus 1 0 Bacillus lateroporus 0 2 Bacillus sterothermophilus 0 1 Bacillus polymyxa 0 1 Listeria spp 15 8 Staphylococcus spp coag. negativa 4 1 Streptococcus spp saprófita 3 1 Corynebacterium spp 3 1 Micrococcus spp 0 2

Tabela 5. Distribuição de amostras contaminadas e bactérias isoladas por região apícola do Estado do Rio de Janeiro e outros Estados brasileiros.

Procedência Regiões / Estados

Nº de amostras contaminadas (%)

Bactérias isoladas

Sul 22 (35, 48) B. lentus, B. cereus, B. subtilis, B. mycoides, B. brevis, B. licheniformis, Listeria spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Streptococcus spp saprófita e Staphylococcus spp coagulase negativo.

Centro 12 (19, 35) B. cereus, B. licheniformis, B. subitilis, B. mycoides, B. megaterium, Listeria spp, Corynebacterium spp e Clostridium botulinum.

Serrana 7 (11, 30) B. cereus, B. mycoides, B. subitilis, B. sphaericus, B. megaterium, B. brevis Staphylococcus spp coagulase negativo e Corynebacterium spp

Baixada litorânea 2 (3, 22) B. cereus e B. subtilis

Noroeste 0 Não se observou qualquer tipo de crescimento bacteriano.

Fora do estado 19 (30, 65) B. cereus, B. thuringiensis, B. subtilis, B. lateroporus, B. brevis, B. sphaericus, Staphylococcus spp coagulase negativo, Listeria spp, Micrococcus spp e Streptococcus spp saprófita.

Total 62 (100%)

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Tabela 6. Distribuição de amostras contaminadas e bactérias isoladas por florada declarada na embalagem.

Florada Nº de amostras contaminadas (%)

Bactérias isoladas

Silvestre 37 (59,60) B. cereus, B. stearothermophilus, B. sphaericus, B. mycoides, B. licheniformis, B. subitilis, B. megaterium, B. brevis, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Streptococcus spp saprófita, Listeria spp e Clostridium botulinum.

Eucalipto 8 (12,90) B. subtilis, B. brevis, B. cereus, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. mycoides, Listeria spp e Corynebacterium spp.

Laranjeira 5 (8,06) B. licheniformis, B. subtilis, B. cereus, B. lateroporus, B. megaterium, Listeria spp e Staphylococcus spp coagulase negativo.

Assa-peixe 4 (6,45) B. cereus, B. subitilis, B. licheniformis, B. sphaericus e Listeria spp.

Girassol 2 (3,25) B. cereus e B. subtilis

Morrão-de- Candeia 2 (3,25) B. licheniformis e B. cereus

Sacurá 2 (3,25) B. cereus e Sthapylococcus spp coagulase negativo

Marmeleiro 1 (1,62) B. lentus

Jamelão 1 (1,62) Listeria spp

Capixingui 0 Não houve crescimento bacteriano

Cambará 0 Não houve crescimento bacteriano

Uva Japonesa 0 Não houve crescimento bacteriano

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5. CONCLUSÕES

• Na maior parte das amostras (60,78%) há presença de contaminação bacteriana. O mel não é um produto estéril podendo veicular bactérias que causam danos à saúde humana.

• Foi possível detectar a presença de esporos de Clostridium botulinum em amostra de mel do

Estado do Rio de Janeiro. • A presença ou ausência de selo de inspeção não interferiu no nível de contaminação das

amostras analisadas. • A matéria-prima da embalagem não influenciou no nível de contaminação das amostras. • O índice de contaminação das amostras de mel não foi diferente entre as regiões apícolas do

Estado do Rio de Janeiro, nem entre as amostras produzidas no Estado do Rio do Janeiro e outros Estados brasileiros.

• As condições físico-químicas das floradas de origem podem interferir na microbiota presente no

mel. • A qualidade dos meios PCA (Difco) e MYP (Micromed) utilizados neste trabalho interferiu

no crescimento bacteriano. • Frente aos resultados encontrados, faz-se necessário a implantação de programas de controle

de qualidade na cadeia de produção e beneficiamento do mel com rigor na fiscalização além do desenvolvimento de novos padrões para análise microbiológica desde produto, visando garantir a saúde do consumidor.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. APÊNDICES

ANEXO A Tabela contendo a identificação das 102 amostras analisadas, por ordem de região de origem, demonstrando alguns dos itens que foram considerados nesse estudo:

• Selo de Inspeção (SI) – Incluindo SIF, SIE e SIM.

Presença = P Ausência = A

• Florada de origem - Declarada na embalagem pelo fabricante. • Embalagem

Vidro=V Plástico= PL • Origem Estado Cidade Região apícola do Estado do Rio de Janeiro sendo:

SU = sul SE = serrana BL = baixada litorânea CE = centro NO = noroeste NI = não identificado

37

Origem Identificação da amostra

Selo de Inspeção

(SI)

Florada Embalagem

Estado Cidade

Região Apícola

Fluminense 33 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 37 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 38 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 39 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 40 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 41 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 42 A SILVESTRE PL RJ Valença SU 88 P SILVESTRE PL RJ Valença SU 83 P ASSA-PEIXE PL RJ Valença SU 86 P GIRASSOL PL RJ Valença SU 44 P SILVESTRE V RJ Barra Mansa SU 3 P SILVESTRE PL RJ Barra Mansa SU 4 P EUCALIPTO PL RJ Barra Mansa SU 5 P ASSA-PEIXE PL RJ Barra Mansa SU 6 P LARANJEIRA PL RJ Barra Mansa SU

20 P GIRASSOL PL RJ Barra Mansa SU 2 P MARMELO PL RJ Barra Mansa SU

69 A SILVESTRE V RJ Paty do Aferes SU 74 A SILVESTRE PL RJ Paty do Aferes SU 70 A EUCALIPTO PL RJ Paty do Aferes SU 73 A JAMELÃO PL RJ Paty do Aferes SU 87 A ASSA-PEIXE V RJ Paty do Aferes SU 57 A SILVESTRE PL RJ Paraíba do Sul SU 94 A SILVESTRE PL RJ Paraíba do Sul SU 92 A ASSA-PEIXE PL RJ Paraíba do Sul SU 95 A Morrão-de-candeia PL RJ Paraiba do Sul SU 7 P EUCALIPTO PL RJ Paracambi SU 8 P SILVESTRE PL RJ Paracambi SU

10 A SILVESTRE V RJ Seropédica SU 99 A LARANJEIRA PL RJ Seropédica SU 23 A SILVESTRE PL RJ Paulo de Frontin SU 30 A CAMBARÁ PL RJ Lidice SU 50 A SILVESTRE V RJ Sapucaia SU 68 A ASSA-PEIXE V RJ Rio das Flores SU 93 A SILVESTRE PL RJ Avelar SU 101 A ASSA-PEIXE V RJ Mendes SU 34 A SILVESTRE V RJ Nova Iguaçu CE 35 A SILVESTRE V RJ Nova Iguaçu CE 36 A SILVESTRE V RJ Nova Iguaçu CE 25 A SILVESTRE PL RJ Rio de Janeiro CE 62 A SILVESTRE PL RJ Rio de Janeiro CE 96 A SILVESTRE PL RJ Rio de Janeiro CE 60 A SILVESTRE PL RJ Niterói CE 81 A SILVESTRE PL RJ Niterói CE 80 A EUCALIPTO PL RJ Niterói CE

38

Origem Identificação da amostra

Selo de Inspeção

(SI)

Florada Embalagem Estado Cidade

Região Apícola

Fluminense 31 A SILVESTRE PL RJ Guaratiba CE 32 A SILVESTRE PL RJ Guaratiba CE 59 A SILVESTRE PL RJ Itaboraí CE 82 A SILVESTRE PL PR Itaboraí CE 56 A SILVESTRE PL RJ São Gonçalo CE 58 A Morrão-de- candeia PL RJ São Gonçalo CE 11 A SACURÁ PL RJ Nova Friburgo SE 12 A SACURÁ PL RJ Nova Friburgo SE 14 A ASSA-PEIXE PL RJ Nova Friburgo SE 47 P ASSA-PEIXE PL RJ Nova Friburgo SE 48 P EUCALIPTO PL RJ Nova Friburgo SE 49 P LARANJEIRA PL RJ Nova Friburgo SE 1 P SILVESTRE PL RJ Teresópolis SE

66 P CAPIXINGUI PL RJ Teresópolis SE 100 A SILVESTRE V RJ Teresópolis SE 67 A SILVESTRE PL RJ Petrópolis SE 102 A ASSA-PEIXE PL RJ Petrópolis SE 21 A SILVESTRE V RJ Itaipava SE 22 A SILVESTRE V RJ Itaipava SE 28 A SILVESTRE V RJ Santa Maria Madalena SE 43 P SILVESTRE PL RJ Bacaxá BL 55 P SILVESTRE PL RJ Bacaxá BL 63 P SILVESTRE PL RJ Saquarema BL 76 P SILVESTRE PL RJ Saquarema BL 98 A SILVESTRE PL RJ Maricá BL 9 A SILVESTRE V RJ Bom Jesus do

Itabapoana NO

54 A SILVESTRE PL MG NI NI 61 A SILVESTRE PL MG NI NI 65 P SILVESTRE PL MG NI NI 79 A SILVESTRE PL MG NI NI 16 A LARANJEIRA PL MG NI NI 72 P LARANJEIRA PL MG Lima Duarte NI 78 A SILVESTRE PL MG Lima Duarte NI 17 P SILVESTRE PL MG Dom Silvestre NI 24 P EUCALIPTO PL MG Contagem NI 45 P SILVESTRE V MG Campestre NI 29 A SILVESTRE PL MG Viçosa NI 71 P SILVESTRE PL MG Caete NI 97 P SILVESTRE V MG Belo Horizonte NI 15 P SILVESTRE PL SP São Paulo NI 84 A LARANJEIRA PL SP São Paulo NI 85 A EUCALIPTO PL SP São Paulo NI 89 A EUCALIPTO PL SP São José NI 90 A SILVESTRE PL SP São José NI 64 P LARANJEIRA PL SP Pirassununga NI

39

Origem Identificação da amostra

Selo de Inspeção

(SI)

Florada Embalagem

Estado Cidade

Região Apícola

Fluminense 13 A MARMELO PL SP Queluz NI 46 P SILVESTRE PL RS Cachoeirinha NI 51 A Uva Japonesa PL RS NI NI 52 A Uva Japonesa PL RS NI NI 77 A Uva Japonesa PL RS NI NI 53 A LARANJEIRA PL RS NI NI 19 P SILVESTRE PL ES Domingos Martins NI 26 A SILVESTRE PL ES Domingos Martins NI 18 P ASSA-PEIXE PL ES Guarapari NI 75 A SILVESTRE PL PR NI NI 91 A SILVESTRE PL PR NI NI 27 A SILVESTRE PL PR Maringá NI

40

ANEXO B

Caracterização bioquímica das espécies de Bacillus spp.

ESPÉCIES

Mot

ilida

de

Glic

ose

Xilo

se

Man

itol

Lac

tose

Saca

rose

Mal

tose

Red

. NO

3

Indo

l

VP

Gel

atin

a

Esc

ulin

a

B. anthracis - + - - - + + + - V +* V B. cereus + + - - - V + + - + + V B. mycoides - + - - - V + V - V + V B.megaterium V + V + V + V - - - + V B.licheniformis V + V + - + + + - V V + B. subtitlis V + - + - + V V - V + + B. firmus + + V + V + + V + - V V B. punilus + + - + - + - - - V + + B. macerans V + V + + + + + - - V + B. polymyxa + + + V + + + + - + V + B.circulans + + + + + + + V - - - + B.stearothermophilus + + - - V + + + - - V + B.lateroporus + + - + - - + + V - + + B. alvei + + - - - + + V + V + + B. brevis + V + + - V V V - V V V B. sphaericus + - - - - - - V - - - - B. coagulans + + - - - - + - - + - - B.thuringiensis + + - - - + + V - + + V B. lentus + E - E E E E - - - V +

* =Tardia; E= Fermentação escassa; V= 50-50% das amostras são positivas

Fonte: APHA (2001) e Koneman et al.(2001)

41

ANEXO C

1. Programa em R para SI SI <- + array(c(42,20,27,13), + dim=c(2,2), + dimnames=list( + Delay = c("NÃO","SI"), + Response = c ("Presença", "Ausência"))) > chisq.test(SI) Pearson's Chi-squared test with Yates' continuity correction data: SI X-squared = 0.0366, df = 1, p-value = 0.8483 Não rejeita-se a hipótese da igualdade entre proporções para os níveis de contaminantes com efeito dos produtos que possuem SI ou não a 5% de probabilidade, pelo teste de qui-quadrado Proporções de contaminantes entre produtos com SI ou não SI Contaminante Sim Não Sim 0,60 0,40 Não 0,61 0,39 2. Programa em R para diferença entre RJ e outros Estados brasileiros > BReRJ <- + array(c(20,42,12,28), + dim=c(2,2), + dimnames=list( + Delay = c("BR", "RJ"), + Response = c("Presença", "Ausência"))) > chisq.test(BReRJ) Pearson's Chi-squared test with Yates' continuity correction data: BReRJ X-squared = 5e-04, df = 1, p-value = 0.983

42

Não rejeita-se a hipótese de igualdade entre proporções de contaminação para as amostras do RJ e outros Estados brasileiros pelo teste de qui-quadrado a 5% Proporções de contaminantes entre produtos do Brasil comparados com produtos do Estado do Rio de Janeiro Região Contaminante Sim Não BR 0,62 0,38 RJ 0,60 0,40 3.Diferença entre meios de cultura PCA e MYP wilcox.test(CONT~a) Wilcoxon rank sum test with continuity correction data: CONT by a W = 17532.5, p-value = 0.001230 alternative hypothesis: true mu is not equal to 0 Existe diferença entre os meios de cultura a 5% de probabilidade pelo teste de Wilcoxon. O meio PCA promoveu um desenvolvimento bacteriano superior de 62,3% em comparação com o meio MYP. 4.Programa em R para razões de chances homogêneas, através do teste de Mentel-Hanszel Embalagem <- + array (c(34,18,21,12, + 8,2,6,1), + dim = c(2,2,2), + dimnames = list ( + Delay = c("Presença", "Ausência"), + Delay = c("NÃO", "SI"), + > > Embalagem <- + array (c(34,18,21,12, + 8,2,6,1), + dim = c(2,2,2), + dimnames = list ( + Delay = c("NÃO", "SI"),

43

+ Response = c("Presença", "Ausência"), + Embalagem = c("Plástico", "Vidro"))) > Embalagem , , Embalagem = Plástico Response Delay Presença Ausência NÃO 34 21 SI 18 12 , , Embalagem = Vidro Response Delay Presença Ausência NÃO 8 6 SI 2 1 > mantelhaen.test(Embalagem) Mantel-Haenszel chi-squared test without continuity correction data: Embalagem Mantel-Haenszel X-squared = 0.0026, df = 1, p-value = 0.9592 alternative hypothesis: true common odds ratio is not equal to 1 95 percent confidence interval: 0.4336036 2.4127646 sample estimates: common odds ratio 1.022831 > mantelhaen.test(Embalagem, exact = TRUE) Exact conditional test of independence in 2 x 2 x k tables data: Embalagem S = 42, p-value = 1 alternative hypothesis: true common odds ratio is not equal to 1 95 percent confidence interval: 0.3942391 2.6021123 sample estimates: common odds ratio 1.022432 Existe a mesma probabilidade de contaminação entre as embalagens de vidro e plástico, através do teste de Mantel-Haenszel para proporções homogêneas a 5% de probabilidade, independente da presença ou não de SI.

44

Tabela com as proporções para do teste de Mantel-Haenszel para proporções homogêneas de contaminação entre embalagens de plástico e vidro com a presença ou não de SI

Embalagem SI Plástico Vidro

Sim Não Sim Não SIM 0,60 0,40 0,66 0,34 NÃO 0,62 0,38 0,57 0,43 5.Teste de Kruskal.Wallis para diferença entre floradas declaradas pelo fabricante > kruskal.test(CONT~FL) Kruskal-Wallis rank sum test data: CONT by FL Kruskal-Wallis chi-squared = 13.8308, df = 8, p-value = 0.08628 Não aceita-se a hipótese de igualdade entre as floradas, através do teste de Kruskal Wallis a 10% de probabilidade, ou seja pelo menos uma florada difere das demais. Tabela de proporções para contaminação de mel em relação à Florada Florada Proporção Assa-peixe 0,40 Eucalipto 0,87 Girassol 1,0 Laranjeira 0,87 Marmeleiro 0,50 Morão Candeia 1,0 Sacurá 1,0 Silvestre 0,58 Uva Japonesa 0,0 6. Teste de Kruskal.Wallis para diferença entre regiões do RJ > kruskal.test(CONT~REG) Kruskal-Wallis rank sum test data: CONT by REG

45

Kruskal-Wallis chi-squared = 3.8697, df = 3, p-value = 0.2759 Não rejeita-se a hipótese de igualdade entre as regiões do Estado do Rio e Janeiro, através do teste de Kruskal Wallis a 5% de probabilidade, ou seja todas as regiões são iguais. Tabela de proporções para contaminação de mel em relação à Região do Estado do Rio de Janeiro Região Proporção BL 0,40 CE 0,80 SE 0,50 SU 0,61