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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
THALITA MONTORIL FERREIRA
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DE PLANTAS DE SORGO
FORRAGEIRO SUBMETIDAS AO ESTRESSE SALINO
FORTALEZA - CE
2012
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THALITA MONTORIL FERREIRA
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DE PLANTAS DE SORGO
FORRAGEIRO SUBMETIDAS AO ESTRESSE SALINO
Dissertação apresentada à coordenação do curso de Pós-graduação em Bioquímica, como requisito básico para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal Orientador: Prof. Enéas Gomes Filho
FORTALEZA - CE
2012
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Ao meu Pai:
Valmi Neto (in memoriam), verdadeiramente o maior mestre que tive.
À minha Mãe:
Loide Montoril, que sempre acreditou em mim e, apesar das
circunstâncias mostrarem o contrário, manteve a fé.
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“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas
lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que
deveria ser, mas, graças a Deus, não sou o que era
antes.”
Martin Luther King
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo o que tem feito na minha vida, por ter me sustentado nesta
caminhada e renovar minhas forças a cada dia.
Ao Professor Dr. Enéas Gomes Filho, pela confiança, amizade, apoio e orientação
durante toda a minha vida acadêmica. Obrigada pelos valiosos conselhos e pelo tempo
dedicado a mim.
Aos professores Dr. Joaquim Enéas Filho e Dr. José Tarquinio Prisco, da Universidade
federal do Ceará, pela contribuição na minha formação acadêmica.
Ao meu amigo e namorado Carlos Eduardo Braga de Abreu, que mesmo atarefado,
sempre teve um tempinho para me dar uma força. Por ter me ajudado a caminhar nos
momentos mais difíceis da minha vida, e por todo amor e carinho a mim dispensados.
Simplesmente, não sei o que seria de mim sem você.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Vegetal I e II: Alexcyane Feijão, Cibelle
Gadelha, Daniel Farias, Elaine Angelim, Elton Marques, Franklin Aragão, Gyedre Araújo,
Hugo Leite, Ian Valença, Michella de Albuquerque, Thiago Augusto, Nara Lídia, Paulo
André, Rafael Miranda, Jones Vidal, Vitor Freitas, Valdinéia Soares e Viviane Pinho pela
amizade e por todos os momentos maravilhosos de convivência que pude vivenciar com
vocês.
Aos colegas: Celso Marinones, Antônio Xavier, pela contribuição na realização deste
trabalho, e por tê-lo tornado mais agradável.
A minha amiga Marcela Cristina Rabelo, por sempre estar disposta a me ouvir, por
toda força, e por todos os momentos de conversa e distração em meio a tanto trabalho.
Ao amigo Luckas Huriel, pela amizade fiel e por sua indescritível dedicação e
paciência. Obrigada por toda a ajuda na realização deste trabalho e por ter tornado os dias e
noites de trabalho mais divertidos.
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A todos os laboratórios da Bioquímica, que de alguma forma me ajudaram na
realização deste trabalho. Agradeço, especialmente, à Jacilane Ximenes, e à Mirella Leite,
pela valiosa ajuda no início dos meus experimentos com a ribonuclease.
À minha família, minha mãe, Loide, e minhas irmãs Quelyta e Quézia, pela força,
apoio e segurança para superar todas as dificuldades da vida. Esta vitória também é de vocês.
Ao professor Dr. Edir e ao Dr. Edângelo, da Embrapa Agroindústria Tropical, pela
colaboração na realização das análises das poliaminas.
Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Salinidade (INCTSal/CNPq).
Ao CNPq pela bolsa concedida durante o meu mestrado.
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RESUMO
FERREIRA, T. M. Respostas fisiológicas e bioquímicas de plantas de sorgo forrageiro submetidas ao estresse salino. Fortaleza: UFC. 116f. (Dissertação). As plantas estão freqüentemente expostas a estresses ambientais, os quais causam desequilíbrios no metabolismo fisiológico e bioquímico. Este trabalho teve por objetivo estudar as alterações fisiológicas e bioquímicas de plantas de sorgo forrageiro [Sorghum bicolor (L.) Moench], genótipo CSF 18, em função do tempo de exposição ao estresse salino. As sementes foram semeadas em vermiculita umedecida com água destilada, em casa de vegetação e, após sete dias, as plântulas foram transferidas para bandejas com solução nutritiva de Hoagland diluída 1:2. Após sete dias, foi estabelecido o tratamento de estresse salino (NaCl a 75 mM), sendo um grupo de plantas mantido em solução nutritiva na ausência de sal (controle). As coletas foram realizadas aos 0, 5, 10 e 15 dias após o início do estresse. Avaliou-se o crescimento, as trocas gasosas, os teores e a fluorescência da clorofila, os teores de solutos orgânicos (prolina, N-aminossolúveis, carboidratos solúveis, proteínas solúveis e poliaminas livres) e inorgânicos (Na+, Cl- e K+), bem como a atividade da ribonuclease (RNase). Também foram determinadas as atividades das enzimas catalase (CAT), dismutase do superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX) e peroxidase do guaicol (GPX), bem como os teores de H2O2, glutationa e ascorbato em folhas e raízes. O estresse salino reduziu o crescimento das plantas, sendo observadas reduções na área foliar, e nas matérias fresca e seca da parte aérea e das raízes. Isto foi relacionado com a redução na taxa de fotossíntese líquida, mesmo com a taxa de transpiração e a condutância estomática não sendo afetadas. A salinidade aumentou os teores de Na+ e Cl- nos tecidos das plantas, porém, diminuiu os de K+. Os teores de solutos orgânicos em folhas e raízes aumentaram, principalmente aos cinco e dez dias de estresse. As poliaminas putrescina e espermidina foram encontradas em níveis muito baixos tanto em folhas como raízes, enquanto a espermina não foi detectada em qualquer dos tecidos analisados. Embora a putrescina tenha aumentado em condições de estresse salino, pouco deve ter contribuído para o ajustamento osmótico, contudo, foi sugerida sua participação na proteção oxidativa. A salinidade aumentou a atividade das enzimas SOD, APX e GPX e o estado redox do ascorbato, especialmente nas folhas, sendo isto relacionado com a manutenção dos níveis de H2O2 e com o aumento da proteção contra os danos oxidativos. A CAT mostrou-se a principal enzima removedora de H2O2 nas folhas, enquanto nas raízes esse papel foi desempenhado pela GPX. A atividade da RNase, em folhas, colmos e raízes de sorgo aumentou em condições de estresse, porém seu papel na proteção contra os efeitos deletérios da salinidade ainda não está totalmente esclarecido. Em geral, os dados mostram que o sistema antioxidativo (enzimático e não-enzimático) pode desempenhar papel fundamental na aclimatação das plantas de sorgo ao estresse salino e que os efeitos deletérios da salinidade no crescimento das plantas, devem-se, provavelmente, à inibição da fase bioquímica da fotossíntese, causada pelo acúmulo de íons tóxicos, Na+ e Cl-, reduzindo a relação K+/Na+ a níveis prejudiciais ao metabolismo. Palavras-chave: Antioxidantes, estresse oxidativo, enzimas antioxidativas, salinidade, Sorghum bicolor.
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ABSTRACT FERREIRA, T. M. Biochemical and physiological responses of sorghum plants submitted to salt stress. Fortaleza: UFC. 116f. (Dissertation). The plants are frequently exposed to environmental stresses, which cause imbalances in physiological and biochemical metabolism. This work aimed to study the physiological and biochemical changes of plant forage sorghum (Sorghum bicolor) genotype CSF18, depending on the time of salt stress. The seeds were sown in vermiculite moistened with distilled water, in a greenhouse conditions, and after seven days, the seedlings were transferred to trays with Hoagland solution diluted 1:2. After seven days, treatment was established stress saline (75 mM NaCl), one group of plants kept in nutrient solution in the absence of salt (control). Samples were collected at 0, 5, 10 and 15 days after the initiation of stress. We evaluated the growth, gas exchange, contents and chlorophyll fluorescence, the concentration of organic solutes (proline, N-amino solutes, soluble carbohydrates, soluble proteins and polyamines free) and inorganic (Na+, Cl- and K+), as well as the activity of ribonuclease (RNase). We also determined the activities of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX) and guaicol peroxidase (GPX), as well as the levels of H2O2, ascorbate and glutathione in leaves and roots. Salinity reduced plant growth, being observed reductions in leaf area, and fresh and dry weights of shoots and roots. This was related to a reduction in net photosynthesis rate, even with the transpiration rate and stomatal conductance is not affected. The salinity increased contents of Na+ and Cl- in plant tissues, but the K+ decreased. The levels of organic solutes in leaves and roots increased, particularly at five and ten days of stress. The polyamines putrescine and spermidine were found at very low levels in both leaves and roots, while spermine was not detected in any analyzed portion of the plant. Although putrescine increased in salt stress, some must have contributed to the osmotic adjustment, however, their participation in oxidative protection was suggested. The salinity increased the activity of SOD, APX and GPX and the redox state of ascorbate, especially in the leaves, and this is related to the maintenance of H2O2 levels and increased protection against oxidative damage. The CAT showed the main enzyme remover H2O2 in the leaves while the roots that role was played by GPX. The RNase activity in leaves, stems and roots of sorghum increased in stress conditions, but their role in protection against the deleterious effects of salinity is not yet fully understood. In general, the data show that the antioxidative system (enzymatic and non-enzymatic) can play a key role in the acclimation of sorghum plants to salt stress, and that the reduction of plant growth was probably due to inhibition of biochemical phase of photosynthesis, caused by accumulation of toxic ions, Na+ and Cl-, reducing the relation K+/Na+ at levels harmful to the metabolism.
Keywords: Antioxidants, antioxidant enzymes, oxidative stress, salinity, Sorghum bicolor
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Matérias frescas da parte aérea (MFPA), das raízes (MFR) e total (MFT) e relação MFR/MFPA de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .............................................................................................................................
48
Figura 2. Matérias secas da parte aérea (MSPA), das raízes (MSR) e total (MST) e relação MSR/MSPA de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .............................................................................................................................
49
Figura 3. Área foliar de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino) em função do tempo de estresse ...........................................................................................................
51
Figura 4. Teor de água em folhas, colmos + bainha e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
52
Figura 5. Suculência de folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ..............................................................................................
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Figura 6. Fotossíntese líquida, condutância estomática, transpiração e relação entre a concentração de CO2 interna e externa de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ...........................................................................................................
55
Figura 7. Rendimento máximo do fotossistema II, rendimento quântico efetivo do fotossistema II, dissipação fotoquímica (quenching fotoquímico) e dissipação não fotoquímica (quenching não-fotoquímico) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18), crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .............................................................................................................................
58
Figura 8. Teores relativos de clorofila em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ........................................................................
60
Figura 9. Teores de sódio de folhas, colmos + bainha e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
62
Figura 10. Teores de potássio de folhas, colmos + bainha e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
63
Figura 11. Teores de cloreto de folhas, colmos + bainha e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
65
Figura 12. Relação potássio/sódio (K+/Na+) em folhas, colmos + bainha e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ...........
67
Figura 13. Teores de prolina e de carboidratos solúveis em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .........................
69
11
Figura 14. Teores de N-aminossolúveis e de proteínas solúveis em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ...........
71
Figura 15. Teores de putrescina e espermidina em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
74
Figura 16. Atividade da dismutase do superóxido em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
76
Figura 17. Atividade da peroxidase do ascorbato e da peroxidase do guaiacol em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ..................................................................................................................................................
78
Figura 18. Atividade da catalase em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ........................................................................
81
Figura 19. Teores de ascorbato reduzido, total e estado redox do ascorbato em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ...........
83
Figura 20. Teores de glutationa reduzida, total e estado redox da glutationa em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse ..................................................................................................................................................
85
Figura 21. Teores de peróxido de hidrogênio em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................
88
Figura 22. Teores de malondialdeído em folhas e raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .......................................................
89
Figura 23. Atividade da ribonuclease em folhas, colmos + bainha e em raízes de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle), ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino), em função do tempo de estresse .........................
91
12
SUMÁRIO
Pág.
Resumo ............................................................................................................................... 6
Abstract ............................................................................................................................... 7
Lista de figuras ................................................................................................................... 8
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 14
2.1. O sorgo ......................................................................................................................... 14
2.2. Aspectos fisiológicos e bioquímicos do estresse salino .............................................. 15
2.3. Fotossíntese e fluorescência da clorofila em plantas sob estresse salino .................... 17
2.4. Mecanismos de tolerância das plantas à salinidade...................................................... 20
2.4.1. Ajustamento osmótico ........................................................................................... 21
2.4.2. Exclusão de sais: homeostase iônica ..................................................................... 23
2.4.3. Defesa antioxidativa: mecanismos enzimáticos e não enzimáticos ....................... 25
2.5. Ribonucleases .............................................................................................................. 30
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 31
3.1. Geral ............................................................................................................................ 31
3.2. Específicos ................................................................................................................... 31
4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 33
4.1. Material vegetal e condições de cultivo ....................................................................... 33
4.2. Coleta das plantas e medidas de crescimento .............................................................. 34
4.3. Teor de água e suculência foliar .................................................................................. 34
4.4. Parâmetros fotossintéticos, fluorescência e teor de clorofila ....................................... 34
4.5. Determinação de teores de solutos inorgânicos ........................................................... 35
4.6. Determinação dos teores de solutos orgânicos ............................................................ 36
4.6.1. Obtenção dos extratos ............................................................................................ 36
4.6.2. Carboidratos solúveis ............................................................................................. 36
4.6.3. Prolina livre ........................................................................................................... 37
4.6.4. N-aminossolúveis .................................................................................................. 37
4.6.5. Proteínas solúveis .................................................................................................. 38
13
4.6.6. Determinação de poliaminas livres ........................................................................ 38
4.7. Determinação de H2O2 ................................................................................................. 40
4.8. Determinação de antioxidantes não enzimáticos ......................................................... 41
4.8.1. Determinação de glutationa ................................................................................... 41
4.8.2. Determinação de ascorbato .................................................................................... 41
4.9. Atividade das enzimas do sistema anioxidativo .......................................................... 42
4.9.1. Catalase .................................................................................................................. 43
4.9.2. Peroxidase do ascorbato ........................................................................................ 43
4.9.3. Peroxidase do Guaiacol ......................................................................................... 44
4.9.4. Dismutase do superóxido ....................................................................................... 44
4.10. Determinação da peroxidação de lipídios .................................................................. 45
4.11. Atividade da ribonuclease .......................................................................................... 45
4.12. Delineamento experimental ....................................................................................... 46
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 47
5.1. Crescimento das plantas de sorgo ................................................................................ 47
5.2. Teor de água e suculência das folhas ........................................................................... 50
5.3. Trocas gasosas ............................................................................................................. 53
5.4. Fluorescência da clorofila ............................................................................................ 57
5.5. Teor de clorofila .......................................................................................................... 59
5.6. Teores de sódio, potássio, cloreto e relação K+/Na+ .................................................... 61
5.7. Teores de solutos orgânicos ......................................................................................... 68
5.7.1. Prolina livre ........................................................................................................... 68
5.7.2. Carboidratos solúveis ............................................................................................. 68
5.7.3. N-aminossolúveis .................................................................................................. 70
5.7.4. Proteínas solúveis .................................................................................................. 72
5.7.5. Poliaminas livres .................................................................................................... 73
5.8. Atividade das enzimas do estresse oxidativo ............................................................... 75
5.9. Mudanças no conteúdo e no estado redox do ascorbato e da glutationa ..................... 82
5.10. Teores de peróxido de hidrogênio ............................................................................. 87
5.11. Peroxidação de lipídios .............................................................................................. 87
5.12. Atividade ribonucleásica ........................................................................................... 90
6. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 93
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 95
12
1. INTRODUÇÃO
As plantas frequentemente se encontram sob situações de estresses, ou seja, sob
condições externas que afetam desfavoravelmente seu crescimento, desenvolvimento e/ou
produtividade (YU; WANG; WANG, 2012). Dentre os estresses abióticos que mais limitam a
produção agrícola em grandes áreas do mundo, destaca-se a salinidade (FAO, 2005). Em
áreas salinas ou irrigadas com águas salinas, a maioria das culturas exibe reduções
significativas na produção. Isto é devido à redução do potencial osmótico da solução do solo,
dos desequilíbrios nutricionais ou uma combinação desses fatores (ASHRAF; HARRIS,
2005).
O grau com que a salinidade afeta o crescimento depende de fatores intrínsecos à
planta (espécie, cultivar e estádio de desenvolvimento), fatores relacionados ao estresse (tipo
de sal, concentração salina, tempo e frequência de exposição aos sais e modo de aplicação ou
exposição aos sais) e fatores ambientais (luz, temperatura e umidade relativa do ar), bem
como da interação entre eles (BRAY et al., 2000; GREENWAY; MUNNS, 1980; LACERDA
et al., 2003a; MUNNS; TERMAAT, 1986; PRAXEDES et al., 2011; TRINDADE et al.,
2006). Enquanto algumas espécies apresentam elevada tolerância à salinidade (halófitas),
outras são altamente susceptíveis (glicófitas). Convém salientar que a maioria das espécies
cultivadas tem seu crescimento inibido ou retardado, mesmo em baixas concentrações de sais
(AZEVEDO-NETO et al., 2004; FREITAS et al., 2011; GONDIM et al., 2012).
A habilidade das plantas para tolerar o estresse osmótico resultante do acúmulo de sais
é determinada por múltiplas vias e envolve processos fisiológicos, bioquímicos e moleculares.
As diferentes vias bioquímicas têm como finalidade a ativação da expressão gênica, a qual
possibilita às plantas executar as respostas fisiológicas para enfrentar o estresse salino
(CHAKRABORTY; SAIRAM; BHATTACHARYA, 2012; LIU; INOUE; MORIGUCHI,
13
2008). Tais respostas incluem: a retenção e/ou aquisição de água; a manutenção da
fotossíntese e da homeostase iônica; a prevenção e reparo de danos; e o restabelecimento do
crescimento. Além dessas respostas, para contornar esse problema, as plantas se utilizam de
ajustes fisiológicos tais como: compartimentalização de íons tóxicos no vacúolo, ajustes
osmóticos e produção de osmólitos compatíveis e, em especial, o aumento de produtos
gênicos para a reestruturação da homeostase celular (VERSULES et al., 2006). Contudo,
estas respostas são bastante complexas e de difícil entendimento por resultar de modificações
na expressão de vários tipos genes (DUAN et al., 2012; HASEGAWA et al., 2000). Além
disso, o fato de muitos dos genes induzidos não serem específicos para um determinado tipo
de estresse tem dificultado ainda mais o estudo e a compreensão dos mecanismos de
tolerância.
O sorgo forrageiro [Sorghum bicolor (L.) Moench] é uma cultura de grande
importância econômica, sendo considerada moderadamente tolerante à salinidade. Apesar de
haver vários estudos sobre as respostas desta espécie ao estresse salino, poucos são os estudos
acompanhando as alterações que ocorrem ao longo do tempo de desenvolvimento e em cada
órgão da planta. Portanto, o presente trabalho é um estudo sobre as alterações fisiológicas e
bioquímicas envolvidas na resposta de um genótipo de sorgo ao estresse salino.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O sorgo
O sorgo (Sorghum bicolor) é uma planta C4, herbácea anual, de origem africana, com
altas taxas fotossintéticas, pertencente à família Poaceae. Os colmos são eretos, dispostos em
forma de touceira e suculentos, com folhas medindo de 25 a 50 mm de largura e de 50 a 100
cm de comprimento. A inflorescência é do tipo espiga terminal, com ramificações curtas. É
uma planta de clima temperado e tropical, com ciclo vegetativo curto e que se adapta bem a
solos arenosos e medianamente arenosos (VILELA, 2008).
O sorgo é uma importante cultura forrageira, especialmente para o semiárido, devido a
sua tolerância à seca e ao calor, sendo a quinta maior cultura de grãos no mundo, seguindo-se
logo depois do milho, trigo, arroz e cevada (FAO, 2011). Ele pode substituir parcialmente o
milho nas rações para aves e suínos e, totalmente para ruminantes, com a vantagem de menor
custo de produção e valor de comercialização de 80% do preço do milho. Além disso, a
cultura tem demonstrado bom desempenho como alternativa para uso no sistema de
integração lavoura/pecuária e para produção de biomassa, proporcionando maior proteção do
solo contra a erosão, maior quantidade de matéria orgânica disponível e melhor capacidade de
retenção de água nos solos, além de propiciar condições para o uso no plantio direto
(MAGALHÃES; DURÃES; RODRIGUES, 2010). A cultura do sorgo, no Brasil, apresentou
crescimento significativo a partir da década de 70. O aumento da demanda por fontes de água
doce e do uso de terras marginais, bem como as tendências climáticas globais, sugerem que
culturas de sequeiro, como o sorgo, sejam de importância fundamental para alimentar
populações do mundo em expansão (PATERSON, 2008).
O fato de ser uma espécie considerada moderadamente tolerante à salinidade tem
despertado grande interesse nas pesquisas que visam o entendimento dos efeitos da salinidade
dos solos nas culturas de grãos economicamente importantes (TANJI; KIELEN, 2002).
15
2.2. Aspectos fisiológicos e bioquímicos do estresse salino
O solo é o principal meio para nutrição mineral das plantas terrestres e é a partir dele
que elas absorvem a água e os nutrientes minerais na forma de íons inorgânicos. O acúmulo
excessivo de sais no solo é um problema grave para a agricultura, pois muitas áreas plantadas
no mundo tornam-se improdutivas devido aos efeitos prejudiciais que os sais exercem sobre o
crescimento e o desenvolvimento das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2009).
Os efeitos do estresse salino sobre o crescimento das plantas podem ser de natureza
iônica ou hídrica (GREENWAY; MUNNS, 1980; MUNNS, 2002). Os efeitos iônicos
resultam da elevada absorção de íons, especialmente, Na+ e Cl-, que em altas concentrações,
alteram a homeostase iônica, perturbando as funções fisiológicas e bioquímicas da célula
(ZHU, 2001). Os efeitos hídricos, decorrentes da diminuição do potencial osmótico do
ambiente radicular, acarretam a diminuição da disponibilidade de água para a planta.
Os problemas osmóticos afetam processos fisiológicos da planta como as taxas de
transpiração e o próprio crescimento, uma vez que a expansão celular é diminuída. A hipótese
que melhor parece adequar-se às observações é que a salinidade excessiva reduz o
crescimento da planta por causar aumento do dispêndio de energia para absorver água do solo
e produzir metabólitos e componentes celulares para sobreviver em condições de estresse
salino (MUNNS, 1993). Esta energia é desviada dos processos que conduzem o crescimento e
à produção.
Dentre os problemas iônicos que as plantas enfrentam quando crescem em solos com
altas concentrações de sais, está a alteração nos processos de transportes de nutrientes
essenciais, tais como o potássio e o nitrogênio, resultando em desbalanços nutricionais e
toxidez (MUNNS, 2002). A deficiência nutricional de potássio resulta das semelhanças
existentes entre os íons Na+ e K+ com relação a algumas propriedades físico-químicas, tais
como o raio iônico e a carga elétrica (TESTER; DAVENPORT, 2003). Portanto, são essas
16
características comuns que determinam que o Na+ seja um competidor do K+ pelas proteínas
de transporte que controlam sua absorção, sendo as concentrações elevadas de Na+ no meio
externo e o potencial negativo de membrana, fatores adicionais que favorecem o influxo de
Na+ para o citosol. O acúmulo excessivo de íons tóxicos, como o sódio, afeta a atividade de
algumas enzimas citosólicas que requerem o potássio como cofator, tanto em glicófitas quanto
em halófitas (ZHU, 2002).
Em adição aos aspectos iônicos e osmóticos, a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS, do inglês reactive oxygen species) é uma das principais alterações
metabólicas que ocorrem em plantas submetidas à salinidade. Essas espécies são geradas,
principalmente, a partir da redução monovalente do O2 durante o fluxo de elétrons em
compartimentos subcelulares, tais como cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos (APEL;
HIRT, 2004). As ROS são altamente reativas e podem prejudicar o metabolismo celular
normal, causando danos oxidativos às proteínas, ácidos nucléicos e lipídios de membrana
(MITTLER, 2002; MØLLER; JESSEN; HANSSON, 2007).
De forma geral, durante o estresse salino, vários processos fisiológicos, bioquímicos e
moleculares são alterados, incluindo: taxa de fotossíntese líquida, condutância estomática,
transpiração, respiração, produção de biomassa, expansão e divisão celular, metabolismo dos
lipídios, equilíbrio celular redox, síntese de proteínas, biossíntese de solutos orgânicos,
transporte de nutrientes, ativação de vias de sinalização, expressão gênica e de fatores de
transcrição, etc. (CHARTZOULAKIS; KLAPAKI, 2000; PARIDA; DAS, 2005; PRAXEDES
et al., 2011; SAIRAM; TYAGI, 2004; ZHU, 2001).
Com base na capacidade de suportar os efeitos causados pelos sais, as plantas são
classificadas em glicófitas e halófitas (GREENWAY; MUNNS, 1980). As halófitas são
tolerantes a elevadas concentrações salinas, crescendo em concentrações de NaCl em torno de
200 mM ou mais. Elas desenvolveram ao longo da evolução mecanismos que as tornaram
17
capazes de enfrentar o excesso de sais presentes na solução do solo, no entanto, representam
apenas 1% da flora mundial (FLOWERS; COLMER, 2008). As glicófitas, por sua vez,
apresentam menor tolerância à salinidade e seus crescimentos são inibidos em cerca de 25%
em concentrações de NaCl abaixo de 100 mM.
2.3. Fotossíntese e fluorescência da clorofila em plantas sob estresse salino
A fotossíntese constitui a base da produção de uma cultura. Estima-se que 90% da
matéria seca total de um vegetal resultem diretamente do processo fotossintético (JIAO; JI;
LI, 2003). Durante o estresse salino, as mudanças nas relações hídricas associadas com o
acúmulo de íons no interior dos tecidos fotossintéticos têm implicações consideráveis para a
atividade fotossintética das plantas. Vários estudos mostram que a redução no crescimento das
plantas pode ser acompanhada por decréscimo na taxa de fotossíntese (AZEVEDO NETO et
al., 2004; CHARTZOULAKIS et al., 2002; ROMERO-ARANDA; SORIA; CUARTERO,
2001).
O decréscimo da taxa fotossintética com o aumento da salinidade pode ser devido
tanto ao fechamento estomático (que minimiza a perda de água nessas condições) como a
limitações não estomáticas (AZEVEDO-NETO et al., 2011; BRUGNOLI; BJÖRKMAN,
1992; DREW; HOLE; PICCHIONI, 1990). Inicialmente, quando a concentração de sal na
folha é moderada, observa-se um aumento da resistência à difusão do CO2 através do mesofilo
até o sítio de redução nos cloroplastos, afetando desfavoravelmente os processos bioquímicos
envolvidos na fotossíntese (PARIDA; DAS; MITTRA, 2004). Em cultivares de oliveira (Olea
europea L.), a baixa concentração de CO2 nos cloroplastos resultante da baixa condutância
estomática e da elevada resistência difusiva do mesofilo foi a principal limitação para a
fotossíntese em condições de estresse salino (LORETO; CENTRITTO; CHARTZOULAKIS,
2003). Por outro lado, em situações de estresse prolongado, o acúmulo excessivo de íons
18
tóxicos no mesofilo inibe a fotossíntese por meio de mecanismos não-estomáticos, como
mudanças no conteúdo de pigmentos e redução na atividade de enzimas fotossintéticas
(PARIDA; DAS; MITTRA, 2003). Bañuls e Primo-Millo (1992) consideram que a inibição
na taxa de assimilação de CO2, em plantas do gênero Citrus submetidas à salinidade, é
conseqüência do acúmulo de cloreto nas folhas. Garg e Singla (2004) observaram reduções no
conteúdo de clorofila e na atividade da Rubisco em cultivares de grão-de-bico submetidos à
salinidade. É relativamente comum em estresses mais severos a ocorrência de necrose dos
tecidos foliares e aceleração da senescência de folhas maduras, o que reduz a área destinada à
fotossíntese. A limitação da fotossíntese também pode ser atribuída a uma inibição por
feedback exercida pelas altas concentrações de açúcar no mesofilo das células foliares
frequentemente observadas em plantas sob estresse salino (RABHI et al., 2010).
Parte da energia luminosa absorvida pelos pigmentos cloroplastídicos, especialmente a
clorofila a, durante a fotossíntese é emitida como fluorescência (GLYNN; FRASER;
GILLIAN, 2003). As mudanças na composição e função do aparato fotossintético das plantas
em resposta à salinidade têm sido descritas na literatura recente (BROETTO; DUARTE;
LÜTTGE, 2007, MATEOS-NARANJO et al., 2010). Demonstrações de que a fluorescência
das clorofilas a pode ser usada para estimar, rapidamente e de forma não invasiva, a eficiência
do transporte de elétrons através do fotossistema II (PSII), e de que a eficiência de operação
deste fotossistema está correlacionada à assimilação de CO2, tem levado à utilização de
parâmetros da fluorescência da clorofila a com objetivo de examinar o desempenho
fotossintético de plantas sob condições de laboratório, em condições controladas e em campo
(BAKER; ROSENQVIST, 2004; MOUGET; TREMBLIN, 2002). Essa técnica tem permitido
também estudos de possíveis mudanças conformacionais dos complexos protéicos dos
tilacóides, o que afetaria a capacidade de absorção e transferência da energia luminosa
(KRAUSE; WEIS, 1991). Nesse caso, parâmetros como a eficiência quântica máxima do
19
PSII, estimada através da razão entre a fluorescência variável e a máxima (Fv/Fm), expressam
o rendimento quântico dos processos fotoquímicos no PSII, quando todos os centros de reação
estão abertos, dando uma idéia da eficiência relativa da captura de energia luminosa
(BAKER; ROSENQVIST, 2004; PEREIRA; FERNANDES; BELTRÃO, 1998). Essa relação
tem sido utilizada para detectar perturbações no sistema fotossintético causadas pelo estresse
salino, visto que sua diminuição indica um declínio na eficiência fotoquímica do PSII e um
distúrbio ou dano no aparato fotossintético (GLYNN; FRASER; GILLIAN, 2003;
PERCIVAL; FRASER, 2001). A eficiência quântica efetiva do PSII (Φ PSII) indica a fração
de energia absorvida pela clorofila associada a esse fotossistema que foi utilizada em
atividade fotoquímica e, como tal, informa a quantidade de elétrons transportados, sendo um
indicativo da fotossíntese (LICHTENTHALER; BUSCHMANN; KNAPP, 2005). O principal
fator determinante desta eficiência é a habilidade com que os elétrons são removidos da
quinona receptora do PSII, o que está diretamente relacionado com a taxa de consumo de
ATP e NADPH, produtos do transporte fotossintético de elétrons (BAKER; ROSENQVST,
2004).
Quando as plantas são expostas à luz, os centros de reação do PSII são
progressivamente reduzidos, ocorrendo um aumento da fluorescência da clorofila. Em
seguida, a fluorescência decai em um fenômeno chamado extinção da fluorescência
(quenching). Na literatura relacionada à fisiologia vegetal, a palavra “quenching” tem sido
definida como qualquer decréscimo (dissipação) da fluorescência. Dois parâmetros básicos
descrevem a extinção da fluorescência variável da clorofila durante o período de indução da
radiação: a extinção fotoquímica (qP) e a extinção não fotoquímica (NPQ) da fluorescência
variável da clorofila (LICHTENTHALER; BUSCHMANN; KNAPP, 2005). A extinção
fotoquímica (qP) é iniciada em função do aumento dos elétrons exportados do PSII devido à
ativação das enzimas envolvidas no metabolismo do carbono e da abertura estomática
20
(BAKER; ROSENQVST, 2004). Krause e Weis (1991) relatam que qP representa a fração de
centros de reação abertos do PSII em relação à fração total deste fotossistema. O decaimento
da fluorescência máxima da clorofila também ocorre por processos não-fotoquímicos, sendo
que o NPQ indica a dissipação do excesso de energia radiante na forma de calor (radiação
infravermelha) nos complexos antena do PSII. Esse processo está intimamente relacionado
com a fotoproteção através da dissipação térmica de energia e tem sido correlacionado com a
formação de zeaxantina (AZEVEDO-NETO et al., 2011).
Em geral, as medidas da fluorescência da clorofila a têm se mostrado uma ferramenta
muito informativa para o estudo dos efeitos de diferentes estresses ambientais sobre a
fotossíntese (KALAJI et al., 2011). Estes parâmetros têm sido utilizados inclusive na seleção
de plantas com tolerância à salinidade (AZEVEDO-NETO et al., 2011; GLYNN; FRASER;
GILLIAN, 2003). A avaliação desses parâmetros durante todo o ciclo de desenvolvimento das
plantas possibilita informações mais precisas, já que eles apresentam variações nos diferentes
estádios de desenvolvimento (BACARIN; MOSQUIN, 2002). Portanto, medidas simultâneas
de fluorescência da clorofila a e de trocas gasosas das plantas permitem um melhor
entendimento dos efeitos da salinidade sobre o aparato fotossintético durante o crescimento e
desenvolvimento vegetal.
2.4. Mecanismos de tolerância das plantas à salinidade
Os mecanismos de tolerância ocorrem em três níveis de organização: 1- planta inteira,
2- celular e 3- molecular (MUNNS, 2002). Ao nível de planta inteira a tolerância depende da
habilidade da planta em controlar a absorção e o transporte de sal. Os pontos específicos que
merecem destaque são: a) seletividade no processo de absorção pelas células das raízes; b)
carregamento do xilema, preferencialmente com K+ e exclusão do Na+; c) remoção do sal do
xilema na parte superior das raízes, do caule, pecíolo ou bainhas foliares; d) pequena
21
retranslocação de Na+ e Cl- no floema, garantindo a ausência de translocação para tecidos da
parte aérea em crescimento; e) excreção de sais através de glândulas ou pêlos vesiculares,
presentes apenas em halófitas (MUNNS, 2002; TESTER; DAVENPORT, 2003). Portanto, de
acordo com esses autores, a tolerância das glicófitas depende dos três primeiros mecanismos,
sendo que eles ocorrem em diferentes graus, em função da espécie e/ou cultivar.
2.4.1. Ajustamento osmótico
De acordo com Prisco e Gomes-Filho (2010), o ajustamento osmótico se faz à custa da
absorção e acúmulo de íons (principalmente os tóxicos) no vacúolo e de íons não tóxicos e
solutos orgânicos no citosol, compatíveis com a manutenção da atividade metabólica das
células. Como resultado desse processo, o potencial osmótico celular e, como consequência o
hídrico, são reduzidos com a finalidade de manter a absorção de água e o turgor celular
(KRASENSKY; JONAK, 2012).
Os solutos orgânicos acumulados em resposta ao abaixamento do potencial osmótico
do meio garantem um fluxo contínuo de água. Além do mais, tem sido sugerida a participação
desses solutos como osmoprotetores de macromoléculas como proteínas e lipídeos, assim
como de membranas, substituindo a água na superfície das mesmas e, portanto, favorecendo
sua estabilização (SERRAJ; SINCLAIR, 2002; SMIRNOFF, 1998). Os principais solutos que
se acumulam em condições de estresse são os carboidratos (trealose, frutose e sacarose),
polióis (glicerol, pinitol, sorbitol, manitol e ornitol), aminoácidos livres, iminoácidos (prolina,
hidroxiprolina), betaínas (glicina, glicina betaina), além de poliaminas (putrescina,
espermidina e espermina) (ALCÁZAR et al., 2006; FREITAS et al., 2011; HASEGAWA et
al., 2000; LACERDA et al., 2003b; PRAXEDES et al., 2011).
Recentemente, novos argumentos baseados em análises bioquímicas e moleculares
utilizando mutantes ou plantas transformadas sugerem o papel dos solutos compatíveis na
22
tolerância ao estresse salino (CHEN; MURATA, 2002; SAKAMOTO; MURATA, 2000). No
entanto, a relação entre o acúmulo de solutos orgânicos e a tolerância ao estresse osmótico é
ainda bastante controversa e uma grande quantidade de estudos mostram resultados
contraditórios que comprometem a hipótese do ajustamento osmótico. O acúmulo de prolina é
um exemplo. Em condições de estresse, o desequilíbrio entre a captura da luz e a utilização do
NADPH na fixação do carbono pode diminuir a disponibilidade de NADP+ nos cloroplastos e
causar fotoinibição. Dessa forma, a síntese de prolina, que é dependente de NADPH, poderia
atuar como uma válvula protetora por meio da qual a regeneração do NADP+ proporcionaria o
efeito protetor observado (HARE; CRESS, 1997). Em adição, acredita-se que a prolina
participe dos processos de remoção de radicais livres e estabilização de proteínas e/ou
membranas, podendo também servir como reserva de carbono e nitrogênio (ASHRAF;
FOOLAD, 2007).
As poliaminas, por sua vez, são aminas alifáticas de baixo peso molecular que estão
envolvidas nos processos de crescimento e desenvolvimento das plantas (CROZIER et al.,
2000). Em pH fisiológico, essas aminas apresentam-se carregadas positivamente e, dessa
maneira, são capazes de interagir com proteínas, ácidos nucléicos, fosfolipídios e constituintes
de parede celular, ativando ou estabilizando essas moléculas (BARON; STASOLLA, 2008).
Em plantas, os níveis intracelulares de poliaminas são extremamente regulados por processos
metabólicos e catabólicos, bem como por reações de conjugação (ALCÁZAR et al., 2010).
As três maiores classes de poliaminas são: putrescina (Put), espermidina (Spd) e
espermina (Spm) e podem estar presentes nas formas livre, conjugada solúvel ou conjugada
insolúvel. As poliaminas conjugadas solúveis estão covalentemente ligadas a pequenas
moléculas, tais como compostos fenólicos, enquanto que as poliaminas conjugadas insolúveis
estão ligadas covalentemente a macromoléculas, tais como ácidos nucléicos e proteínas
(DUAN et al., 2008). Uma vez que estejam na forma conjugada, as poliaminas contribuem
23
para a estabilização de proteínas do tonoplasto e para a prevenção da desnaturação protéica,
protegendo dessa maneira a atividade de enzimas sob condições de estresse (LIU et al., 2007).
Sob condições de estresses abióticos, como seca, frio, calor, metais pesados e
salinidade, há acúmulo acentuado dos teores de poliaminas, paticularmente Put, Spm e Spd,
em diferentes espécies de plantas (ALCÁZAR et al., 2006; GROPPA; BENAVIDES, 2008),
entretanto, a significância desse aumento permanece não elucidada, já que não existe
consenso se os teores aumentados de poliaminas são conseqüência das injúrias ocasionadas
pelo estresse ou apenas resposta de proteção contra ele (ALCÁZAR et al., 2010). Também
não há consenso se esses metabólitos se acumulam sob condições de estresse abióticos, como
a salinidade (ERDEI et al., 1996).
O ajustamento osmótico por meio do acúmulo de solutos orgânicos, entretanto, tem
um custo energético alto que pode afetar negativamente a produtividade da planta e o uso
eficiente da água (TURNER; JONES, 1980). O acúmulo de carboidratos solúveis desvia a
energia disponível dos processos ativos do crescimento para o ajustamento osmótico
(MUNNS; TERMAAT, 1986; TATTINI; MONTAGNI; TRAVERSI, 2002). Além disso,
aumentos na concentração de carboidratos podem afetar negativamente a taxa de fotossíntese
líquida por um mecanismo de feedback (RABHI et al., 2010).
2.4.2. Exclusão de sais: homeostase iônica
A sobrevivência das plantas em ambientes salinos depende da manutenção da
concentração iônica intracelular, a qual é importante para a manutenção dos processos
metabólicos que controlam o crescimento e o desenvolvimento da planta (NIU et al., 1995).
Contudo, a absorção elevada de íons Na+ em condições de salinidade pode gerar toxicidade e
impedir a aquisição de alguns nutrientes essenciais, gerando desbalanço iônico (ZHU, 2003).
Para a maioria das glicófitas (plantas sensíveis à salinidade), o Na+ não é considerado um
24
macronutriente essencial para o crescimento e desenvolvimento, porém, sua adição ao meio
em pequenas doses, pode promover o crescimento das plantas quando o suprimento de K+ é
limitado (MÄSSER; GIERTH; SCHROEDER, 2002). Embora o Na+ possa substituir o K+ nas
suas funções osmóticas dentro do vacúolo, um excesso de Na+ é indesejável, pois prejudica os
sistemas enzimáticos do citosol. Dessa forma, a capacidade das plantas de manterem altas
relações K+/Na+ no citosol tem sido sugerida como um dos elementos-chave para tolerar o
estresse salino e é muitas vezes utilizada como critério para selecionar materiais sensíveis e
tolerantes à salinidade (AKTAS; ABAK; CAKMAK, 2006; ASHRAF; HARRIS, 2004).
A manutenção da relação K+/Na+ no citosol depende dos processos que controlam a
absorção, a translocação e a compartimentalização do íon Na+ nos vacúolos (MAATHUIS;
AMTMANN, 1999). Infelizmente, na maioria das glicófitas esses processos não ocorrem
como nas halófitas, e as plantas parecem acumular parte dos íons tóxicos no citosol. Com
relação a este último fator, uma atenção maior tem sido dada ao estudo dos efeitos do estresse
salino sobre a nutrição potássica das plantas. Isto se deve, principalmente, às similaridades
físico-químicas entre os íons Na+ e K+ (MAATHUIS; AMTMANN, 1999; MÄSSER;
GIERTH; SCHROEDER, 2002). De fato, inúmeras evidências apontam para a participação de
transportadores de alta e de baixa afinidade por K+ no transporte de Na+ para dentro da célula,
quando este se encontra em altas concentrações no solo (BLUMWALD, 2000; MAATHUIS;
AMTMANN, 1999).
O principal mecanismo para o efluxo de Na+ tem sido relacionado com a atividade das
H+-ATPases de membrana plasmática, bombas eletrogênicas que realizam o transporte ativo
primário de H+ para fora da célula utilizando a energia proveniente da hidrólise do ATP
(BLUMWALD, 2000). O gradiente de potencial eletroquímico gerado pelas H+-ATPases é
utilizado na extrusão de Na+ mediada por transportadores Na+/H+ do tipo antiporte presentes
na membrana plasmática ou, ainda, na compartimentalização dos íons no vacúolo mediada
25
por um transportador vacuolar Na+/H+ do tipo antiporte (APSE; BLUMWALD, 2002). O
acúmulo de grandes quantidades de Na+ e Cl- no vacúolo, evita seus efeitos deletérios em
outras partes do citoplasma e favorece a entrada de água para dentro da célula mesmo em um
ambiente de baixo potencial osmótico e hídrico (BLUMWALD, 2000; ZHU, 2003). A
comparação dos níveis de expressão da H+-ATPase de uma glicófita (Nicotiana tabacum) e de
uma halófita (Atriplex nummularia), mostraram que a tolerância ao sal estava positivamente
correlacionada com os níveis de transcritos (NIU et al., 1993).
2.4.3. Defesa antioxidativa: mecanismos enzimáticos e não enzimáticos
Estresses ambientais que limitam a fotossíntese podem aumentar o dano celular
induzido pelo oxigênio, devido ao aumento na produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS), gerando o chamado estresse oxidativo (MITTLER et al., 2004). Uma das principais
razões para isto é que o estresse salino limita as trocas gasosas e, dessa forma, o suprimento
de CO2 para as folhas. A limitada fixação do CO2 causa, então, um decréscimo na velocidade
do ciclo de Calvin e, conseqüentemente, na disponibilidade de NADP+ para captar os elétrons
provenientes do fotossistema I. Tal situação favorece a redução monovalente do oxigênio
molecular nesse fotossistema, gerando o radical superóxido (reação de Mehler) a partir do
qual são originadas as outras ROS nas células (AZEVEDO NETO; GOMES-FILHO;
PRISCO, 2008; DEMIRAL; TÜRKAN, 2005; EDREVA, 2005).
As principais ROS acumuladas em condições de estresse são o radical superóxido
(•O2
-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (•OH). As ROS são altamente
reativas e causam danos oxidativos em moléculas importantes dentro da célula, como lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos (MØLLER; JENSEN; HANSSON, 2007). O radical superóxido
pode ser produzido em vários compartimentos celulares, incluindo mitocôndrias, cloroplastos
e peroxissomos ou ainda ser produzido enzimaticamente na membrana plasmática pela
26
oxidase do NADPH, a qual transfere elétrons do NADPH citosólico para o O2 (BÉRCZI;
MØLLER, 2000). Uma vez produzido, o •O2
- é rapidamente dismutado em H2O2 e O2.
Embora o cloroplasto seja a fonte primária de H2O2 nas plantas, durante o processo de
fotorrespiração nos peroxissomos a ação da enzima oxidase do glicolato representa uma outra
fonte de produção de H2O2 (SIEDOW; DAY, 2000). O H2O2 produzido na célula pode ser
convertido, na presença de íons Fe2+, em radicais (•OH) através da reação de Fenton, um
componente do ciclo de Haber-Weiss (McKERSIE; LESHEM, 1994). O oxigênio singleto,
por sua vez, é formado principalmente nos processos fotoquímicos no cloroplasto (EDREVA,
2005).
Para mitigar os danos oxidativos causados pelas ROS, as plantas possuem um
complexo sistema de defesa, que envolve antioxidantes não enzimáticos de baixa massa
molecular (hidrofílicos, como o acido ascórbico e a glutationa, ou lipofílicos, como o α-
tocoferol e os carotenoides) e enzimas antioxidativas, tais como, dismutase do superóxido
(SOD), catalase (CAT), peroxidase do ascorbato (APX), peroxidase do guaiacol (GPX),
redutase da glutationa (GR), redutase do monodesidroascorbato (MDHAR) e redutase do
desidroascorbato (DHAR) (MITTLER, 2002). Estudos têm demonstrado que a redução nos
danos oxidativos e o aumento da tolerância a estresses ambientais, incluindo o estresse salino,
estão correlacionados a sistemas antioxidativos mais eficientes (FAROUK, 2011; GILL;
TUTEJA, 2010).
A SOD é considerada como a primeira linha de defesa das plantas contra as ROS
(ALSCHER; ERTURK; HEATH, 2002). Esta enzima é responsável pela dismutação do •O2-
em O2 e H2O2 e é encontrada em basicamente todos os compartimentos celulares. Baseado no
metal que é usado como cofator da enzima, as SOD são classificadas em três grupos de
isoenzimas: 1) a Fe-SOD, encontrada nos cloroplastos; 2) a Mn-SOD, nas mitocôndrias e
27
peroxissomos; 3) a Cu/Zn-SOD, nos cloroplastos e citosol (ALSCHER; ERTURK; HEATH,
2002).
A CAT, que se encontra sob diferentes isoformas, é uma enzima tetramérica contendo
grupo heme e que catalisa a dismutação do H2O2 a O2 e H2O, impedindo os efeitos
potencialmente danosos provocados pelas mudanças na homeostase do peróxido de
hidrogênio (BREUSEGEM et al., 2001). A CAT exerce importante papel fisiológico na
eliminação do H2O2 produzido na fotorrespiração e na oxidação dos ácidos graxos nos
peroxissomos (DEL RIO et al., 2002; GONDIM et al., 2012).
A APX, da mesma forma que a CAT, também se encontra na forma de diferentes
isoformas. Essa enzima utiliza o ascorbato como doador específico de elétrons para reduzir o
H2O2 a água com a geração concomitante de monodesidroascorbato (MDHA). O ascorbato é,
então, regenerado através do ciclo ascorbato-glutationa utilizando equivalentes redutores do
NAD(P)H (SHIGEOKA et al., 2002). A APX é encontrada em, pelo menos, quatro
compartimentos celulares (estroma, membrana do tilacóide, membrana dos microcorpos e
citosol) e está associada com a eliminação do H2O2 gerado a partir do •O2- pela ação da SOD
(ALSHER; ERTURK; HEATH et al., 2002; SHIGEOKA et al., 2002). Além da APX, um
outro grupo de peroxidases encontrado em plantas é o das isoenzimas que utilizam o guaiacol
(GPX) como doador de elétrons. A GPX é encontrada no citosol, vacúolo, parede celular e
espaços intracelulares, e realiza importante papel na fisiologia das células vegetais (ASADA,
1992).
Uma importante evidência do papel do estresse oxidativo na indução da resposta ao
estresse salino foi relatada por Uchida et al. (2002). Esses autores pré-trataram plântulas de
arroz com concentrações crescentes de H2O2 (0 a 1000 µM) antes da aplicação do NaCl e
observaram um aumento na tolerância das plântulas ao estresse salino. Em baixas
concentrações, o H2O2 parece agir na expressão de algumas enzimas importantes, conferindo
28
uma aclimatação prévia ao estresse (tolerância cruzada), enquanto que em concentrações
elevadas, essa molécula passa a ter um efeito tóxico ao crescimento das plantas (UCHIDA et
al., 2002). Tanaka et al. (1999) relataram que as plantas de arroz transgênicas expressando
altos níveis de Mn-SOD de levedura nos cloroplastos tornaram-se mais resistentes ao estresse
salino. Além disso, um mutante pst1 (photoautotrophic salt tolerance1) de Arabidospis
thaliana, que exibe tolerância a 200 mM de NaCl, apresentou uma maior capacidade para
eliminar as ROS (TSUGANE et al., 1999). Esses resultados sugerem uma forte correlação
entre o sistema antioxidante e a tolerância ao estresse salino.
Outro mecanismo de proteção oxidativa são os antioxidantes não enzimáticos,
representados pelo ácido ascórbico (ASA), glutationa (GSH), tocoferóis e carotenóides
(BONIFACIO et al., 2011; WANG; QUINN, 2000). O ASA, a forma reduzida do ascorbato,
tem um importante papel na proteção das plantas contra as ROS que são formadas nos
processos fotossintéticos e respiratório (GUO et al., 2005). O ASA é considerado o mais
importante substrato para a remoção do H2O2, convertendo-o em água e oxigênio molecular
dentro da célula vegetal. A enzima APX utiliza duas moléculas de ascorbato como doadoras
de elétrons para cada molécula de H2O2, produzindo duas moléculas do ácido
monodesidroascórbico (MDHA), que é uma molécula instável, podendo ser rapidamente e
espontaneamente convertida em ASA e ácido desidroascórbico (DHA) (SMIRNOFF, 2000).
Além de substrato para a APX, o ascorbato pode ainda interagir diretamente com diferentes
ROS (KELLÔS et al., 2008). A utilização do ascorbato como antioxidante, diretamente, ou
por meio enzimático, leva ao acúmulo de sua forma oxidada, o MDHA. A sequência de
reações para a regeneração do ascorbato é conhecida como ciclo do ascorbato-glutationa, uma
importante via metabólica que mantém estável a relação ASA/DHA e o equilíbrio redox do
ambiente celular (NOCTOR; FOYER, 1998).
29
O estado redox do ascorbato, representado pela fração do ascorbato reduzido presente
no pool total de ascorbato celular (ASA/ASA+DHA), representa a fração do ASA
efetivamente capaz de atuar na proteção oxidativa (CONKLIN; BARTH, 2004). Como é uma
das primeiras linhas de defesa oxidativa, a manutenção do estado redox do ascorbato durante
a exposição a vários tipos de estresse pode conferir maior resistência aos danos oxidativos
causados pelo estresse (BONIFACIO et al., 2011; CONKLIN; BARTH, 2004; KWON et al.,
2003; SANMARTIN et al., 2003; SHEN; YEH, 2010).
A glutationa, um antioxidante não enzimático, é encontrada nas células vegetais
predominantemente na sua forma reduzida (GSH), mas também ocorre na forma oxidada
(GSSG), formando o par redox GSH/GSSG. A glutationa reduzida está envolvida na remoção
de oxigênio singleto, de peróxidos e de radicais hidroxil, além de participar também do ciclo
ascorbato-glutationa (ALSHER; ERTURK; HEATH, 2002). O estado redox da glutationa,
conteúdo de GSH em relação ao pool total (GSH+GSSG), a exemplo do ascorbato, representa
o conteúdo da glutationa realmente capaz de atuar na proteção oxidativa e na homeostase
redox celular. Sob condições fisiológicas normais, o estado redox da glutationa (GSH/GSSG
+ GSH), que é mantido próximo de 9 a 10, pode mudar transitoriamente, e passar para níveis
de maior oxidação (TAUSZ; SIRCELJ; GRILL, 2004). Além de apresentar mudanças
endógenas, essa alteração pode ser intensificada sob condições de estresse que acarretam
acúmulo excessivo de ROS (VRANOVÁ; INZÉ; BREUSEGEM, 2002). Nessas condições, a
capacidade de remoção de ROS aumenta pela indução do ciclo ascorbato-glutationa, e um
novo nível de equilíbrio do estado redox GSH/GSSG é estabelecido (TAUSZ; SIRCELJ;
GRILL, 2004).
30
2.5. Ribonucleases
A ribonuclease (RNase) é uma enzima que desempenha importante papel no
metabolismo, tendo em vista que o nível de RNA, um dos componentes do processo de
síntese protéica, pode ser alterado pela mesma (GOMES-FILHO et al., 1994). Esta enzima
apresenta variações em sua atividade que podem se manifestar em funções de diversos
estímulos endógenos ou exógenos, tais como, injúrias físicas (SACHER; MORGAN; DE
LAROSA, 1975), patógenos e processos infecciosos (CHAKRAVORTY; SHAW; SCRUBB,
1974), seca, frio e salinidade (GOMES-FILHO et al., 2008).
Dentre as estratégias de defesa das plantas contra os mais diversos tipos de estresse,
estão alguns tipos de proteínas com função de proteção. Dentre essas proteínas produzidas
pelas plantas, há um grupo denominado de “proteínas relacionadas à patogenicidade”, as
chamadas PR-proteínas, as quais são reconhecidas por seus importantes papéis de proteção
contra agentes patogênicos e em adaptações a estresses ambientais (EDREVA, 2005). As PR-
proteínas são classificadas em 17 famílias, com base em seus papéis fisiológicos. É conhecido
que algumas proteínas da família 10 (as PR10), especialmente aquelas de massa molecular de
aproximadamente 16 kDa, são capazes de hidrolisar o RNA, sendo, portanto, RNases e estão
presentes em várias espécies vegetais (SELS et al., 2008). Embora as PR10 com atividade
ribonucleásica sejam detectadas em diversas espécies de plantas e conhecidas por serem
induzidas por patógenos ou estresses abióticos, suas funções biológicas específicas ainda não
foram completamente estabelecidas (SRIVASTAVA et al., 2004). Também há uma escassez
de estudos de como a atividade dessa enzima varia com o tempo de estresse salino em plantas
em estádio de desenvolvimento vegetativo.
31
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Estudar as respostas fisiológicas e bioquímicas de plantas de sorgo forrageiro
submetidas ao estresse salino, com a finalidade de contribuir para o entendimento dos
mecanismos envolvidos na inibição do crescimento e da produção do sorgo sob condições de
salinidade.
3.2. Específicos
Utilizando plantas de sorgo forrageiro, sob condições controle e de estresse salino,
pretende-se analisar possíveis alterações:
a) Nas medidas de crescimento (área foliar e matérias fresca e seca da parte aérea e
raízes das plantas);
b) No estado hídrico das plantas, medindo a suculência foliar e os teores de água em
folhas, colmos + bainha e raízes;
c) Nas trocas gasosas (fotossíntese líquida, transpiração, condutância estomática e
concentração interna de CO2) e nos teores de clorofila;
d) Nos parâmetros de fluorescência: qP (quenching fotoquímico), NPQ (quenching
não-fotoquímico) e Φ PSII (eficiência fotoquímica efetiva do PSII);
e) Nos teores de solutos orgânicos (carboidratos solúveis, prolina livre, N-
aminossolúveis e poliaminas livres) e de proteínas solúveis, em folhas e raízes; e de solutos
inorgânicos (Na+, K+ e Cl-), em tecidos de folhas, colmos + bainha e raízes;
32
f) Na atividade das enzimas antioxidativas: catalase, dismutase do superóxido,
peroxidase do ascorbato, peroxidase do guaiacol, e nos teores dos antioxidantes não-
enzimáticos, glutationa e ascorbato em folhas e raízes;
g) Na peroxidação dos lipídios de membrana, determinando os teores de
malondialdeído, em folhas e raízes;
h) Na atividade da ribonuclease (RNase) em tecidos de folhas, colmos + bainha e
raízes.
33
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material vegetal e condições de cultivo
No presente trabalho, sementes de sorgo forrageiro [Sorghum bicolor (L.) Moench],
genótipo CSF 18, provenientes do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife-PE,
foram tratadas superficialmente com NaOCl a 1% (v/v), por 5 min, antes de serem semeadas
em copos plásticos contendo vermiculita umedecida com água destilada. Decorridos sete dias
da semeadura, as plântulas mais uniformes foram transferidas para bacias plásticas (10 plantas
por bacia), contendo 10 L de solução nutritiva de Hoagland (diluída 1:2), pH 5,5. Após sete
dias de aclimatação nas bandejas, as plântulas foram divididas em dois grupos e os
tratamentos foram iniciados. A um grupo foi adicionado NaCl na dose de 75 mM. O outro
grupo de plântulas permaneceu em solução nutritiva 1:2 na ausência de NaCl (controle). Os
níveis das soluções nos vasos foram mantidos diariamente pela adição de água destilada e, a
cada cinco dias, as soluções nutritivas foram trocadas por uma nova com a finalidade de evitar
deficiências nutricionais.
O experimento foi realizado em casa de vegetação, pertencente ao Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, durante os meses de
fevereiro e março de 2012. Durante o experimento, a intensidade de fluxo de fótons
fotossintéticos, ao meio-dia, foi de 1.500 µmol m-2 s-1, com temperatura e umidade relativa do
ar médias de 29,7 ± 0,6 °C e 69,7 ± 1,5%, respectivamente. As análises químicas e
bioquímicas foram realizadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, exceto a de poliaminas
livres que foram realizadas na EMBRAPA Agroindústria Tropical.
34
4.2. Coleta das plantas e medidas de crescimento
As coletas do material vegetal foram realizadas aos 0, 5, 10 e 15 dias do início dos
tratamentos. Durante a coleta, as plantas foram divididas em folhas, colmos + bainha e raízes,
sendo, em seguida, determinada a matéria fresca (MF) do material. A área foliar (AF) foi
determinada com um medidor de área LI-3100 (Area Meter, LI-Cor., Inc., Lincoln, Nebraska,
USA). O material vegetal foi congelado em nitrogênio (N2) líquido e armazenado a -25 ºC até
posterior utilização nas análises bioquímicas. Para a obtenção das matérias secas (MS), as
folhas, colmos + bainha e raízes foram postos em estufa a 60 °C para secagem durante três
dias, quando atingiram peso constante. Com essas medidas, e com base nos valores das
matérias frescas (MF) foram estimadas as matérias secas da parte aérea (MSPA), das raízes
(MSR), total (MST) e a relação MSR/MSPA.
4.3. Teor de água e suculência foliar
Os teores de água (TA) foram determinados em folhas, colmos + bainha e raízes,
empregando-se a fórmula: TA = [(MF-MS)/MF] x 100, conforme Barrs (1968), sendo
expressos em percentagens.
A suculência foliar (SF) foi determinada segundo Benincasa (1988), empregando-se a
fórmula: SF= (MFfolha – MSfolha) (AF)-1, sendo expressa em mg H2O cm-2.
4.4. Parâmetros fotossintéticos, fluorescência e teor de clorofila
Os parâmetros de trocas gasosas (fotossíntese líquida, transpiração, condutância
estomática e concentração interna de CO2) e de fluorescência da clorofila foram determinados
na primeira folha completamente expandida, no dia anterior à coleta, entre 9:00 e 12:00 h,
com um analisador portátil de gás no infravermelho (mod. Li-6400XT, Li-COR, NE, USA)
acoplado com uma câmara de fluorescência (mod. 6400-40, Li-COR, NE, USA). A
35
intensidade luminosa utilizada nas medições de trocas gasosas foi de 1.000 µmol m-2 s-1,
enquanto que para as medidas de fluorescência da clorofila utilizou-se uma intensidade de
3.000 µmol m-2 s-1. Com as folhas na presença de luz, foram determinados os parâmetros de
fluorescência do estado adaptado à luz: qP (quenching fotoquímico), NPQ (quenching não-
fotoquímico) e Φ PSII (eficiência fotoquímica efetiva do PSII). As leituras de fluorescência
variável (Fv) e máxima (Fm) foram determinadas em folhas adaptadas ao escuro por 30 min e
utilizadas para o cálculo da eficiência fotoquímica potencial do PSII, expressa pela relação
Fv/Fm.
Nos mesmos dias, entre 15:00 e 16:00 h, foram realizadas as determinações dos teores
relativos de clorofila total, na primeira folha completamente expandida, utilizando-se de um
medidor portátil (SPAD-502, Minolta Co., Ltd., Osaka, Japan). Para essa análise foram
realizadas três medições por folha, e destas foi obtida uma média.
4.5. Determinação dos teores de solutos inorgânicos
Os teores dos íons sódio, potássio e cloreto foram determinados em tecidos de folhas,
colmos + bainha e raízes. Para a preparação dos extratos utilizou-se o método descrito por
Cataldo et al. (1975), com a homogeneização de 100 mg do material vegetal seco em estufa,
finamente triturado, com 10 mL de água desionizada por 1 h em banho-maria a 40 °C. Os
tubos foram agitados vigorosamente a cada 15 min e, em seguida, o homogenato foi
centrifugado a 3.000 x g por 10 min. O sobrenadante obtido foi então filtrado em papel de
filtro e armazenado a -25 °C. Os teores de sódio e potássio foram determinados por fotometria
de chama, segundo Malavolta, Vitti e Oliveira (1989). Para a determinação dos teores de
cloreto, a 3,0 mL do extrato, convenientemente diluído, foram adicionados 0,5 mL do
reagente formado pela mistura de Hg(SCN)2 a 13,2 mM, em metanol e Fe(NO3)3.9H2O a
20,2%, em água desionizada, na proporção de 4:1. Após agitação vigorosa, os tubos
36
permaneceram em repouso por 15 min, sendo os teores de cloreto estimados através de
leituras de absorbância em 460 nm, utilizando-se o NaCl como padrão (GAINES; PARKER;
GASCHO, 1984).
Nas análises dos íons sódio e potássio foi realizada uma única leitura do extrato,
convenientemente diluído, no fotômetro de chama, enquanto que, para a determinação de
cloreto, cada extrato (repetição) foi dosado em duplicata. Os teores de solutos inorgânicos
foram expressos em µmol g-1 MS.
4.6. Determinação dos teores de solutos orgânicos
4.6.1. Obtenção dos extratos
Os extratos brutos foram obtidos a partir da homogeneização de 1 g do tecido fresco
de folhas e raízes com 10 mL de tampão fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,0, contendo
EDTA a 0,1 mM e ascorbato a 1 mM. O homogenato resultante foi filtrado em tecido de
musselina e centrifugado a 20.000 x g durante 15 min. Todas as operações descritas
anteriormente foram conduzidas à temperatura de aproximadamente 4 °C. Esses extratos
também foram utilizados nas determinações das atividades das enzimas do sistema
antioxidativo (item 4.8).
4.6.2. Carboidratos solúveis
Os teores de carboidratos solúveis foram determinados de acordo com Dubois et al.
(1956). A 0,5 mL do extrato, convenientemente diluído, foram adicionados 0,5 mL de fenol a
5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi agitada vigorosamente e deixada
em repouso por 10 min para o seu resfriamento, sendo em seguida, submetida à leitura de
absorbância em 490 nm. A quantificação dos carboidratos solúveis foi feita com base em uma
37
curva padrão de D(+) glicose anidra. Cada extrato (repetição) foi dosado em duplicata, sendo
os resultados expressos em µmol g-1 MF.
4.6.3. Prolina livre
Os teores de prolina livre foram determinados de acordo com Bates, Waldren e Teare
(1973). Em uma alíquota de 1,0 mL do extrato, convenientemente diluído, foram adicionados
1,0 mL do reagente da ninhidrina ácida e 1,0 mL de ácido acético glacial. Para um total de 50
amostras, o reagente da ninhidrina ácida foi preparado dissolvendo-se 1,25 g de ninhidrina em
30 mL de ácido acético e 20 mL de ácido fosfórico a 6 M. Os tubos de ensaio foram
hermeticamente fechados e, após a homogeneização da mistura de reação, foram colocados
em banho-maria a 100 °C por 1 h. A reação foi interrompida colocando-se os tubos de ensaio
em banho de gelo. Após o resfriamento, foram adicionados 2,0 mL de tolueno ao meio de
reação. Após agitação vigorosa da solução, a fase superior menos densa (cromóforo +
tolueno) foi aspirada com o auxílio de uma pipeta Pasteur e submetida à leitura de
absorbância em 520 nm, sendo o tolueno utilizado como branco. Os teores de prolina livre
foram estimados com base em uma curva padrão ajustada a partir de concentrações crescentes
de prolina. Cada extrato (repetição) foi dosado em duplicata, sendo os resultados expressos
em µmol g-1 MF.
4.6.4. N-aminossolúveis
Os teores de N-aminossolúveis foram determinados de acordo com o método de
Yemm e Cocking (1955). Em tubos de ensaio, foram adicionados 0,5 mL dos extratos,
convenientemente diluídos, 0,25 mL de tampão citrato a 0,2 M (pH 5,0), 0,5 mL de KCN a
0,2 mM em metilcelosolve a 100% e 0,1 mL de ninhidrina a 5% em metilcelosolve a 100%.
Em seguida, os tubos foram fechados, agitados vigorosamente e colocados em banho-maria a
38
100 °C durante 20 min. A reação foi interrompida abruptamente colocando-se os tubos em
banho de gelo e, após resfriamento, foram adicionados 0,65 mL de etanol a 60%. Os teores de
N-aminossolúveis foram estimados através de leituras de absorbância em 570 nm, com base
em uma curva padrão ajustada a partir de concentrações crescentes de glicina. Cada extrato
(repetição) foi dosado em duplicata, sendo os resultados expressos em µmol g-1 MF.
4.6.5. Proteínas solúveis
Os teores de proteínas solúveis foram determinados pelo método de ligação ao corante
“Coomassie Blue” descrito por Bradford (1976). Para um volume final de 1,0 L, o reagente
foi preparado dissolvendo-se 153,84 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 (Sigma
Chemical, St. Louis, MO, USA) em 50 mL de etanol a 95%, seguindo-se da adição de 100
mL de ácido fosfórico a 85%. O volume final foi completado pela adição de água destilada. A
0,1 mL da amostra foi adicionado 1,0 mL do reagente de Coomassie. A mistura foi deixada
em repouso por 15 min e, em seguida, submetida a leituras de absorbância em 595 nm,
utilizando-se como branco a mistura de 0,1 mL de água destilada e 1,0 mL do reagente de
coomassie. As concentrações de proteína solúveis foram estimadas com base numa curva
padrão ajustada a partir de concentrações crescentes de albumina sérica bovina (Sigma
Chemical Co., Saint Louis, MO, USA). Os resultados foram expressos em mg g-1 MF, sendo
cada extrato (repetição) dosado em duplicata.
4.6.6. Determinação de poliaminas livres
A extração e a determinação das poliaminas livres foram feitas segundo Xu et al.
(2011), com pequenas modificações. Amostras de 1,5 g de folhas e de raízes foram
pulverizadas com nitrogênio líquido e, em seguida, homogeneizadas com 3,0 mL de solução
de ácido perclórico (PCA) a 5% (v/v) com auxilio de almofariz e pistilo, a 4 oC. Após
39
completa homogeneização, as amostras foram incubadas em banho de gelo por 1 h e
posteriormente centrifugadas a 12.000 x g por 30 min, a 4 oC. O precipitado foi ressuspendido
com 2,0 mL de PCA a 5% e submetido a nova centrifugação. Esse procedimento foi repetido
por mais três vezes. Os quatro sobrenadantes coletados (extrato) foram utilizados para
determinação das poliaminas livres.
As poliaminas livres presentes nos extratos foram, em seguida, derivatizadas, segundo
metodologia descrita por Duan, Guo e Kang (2008). Para isso, 200 µL de cada extrato foram
misturados com 2,0 mL de NaOH a 2 N e 15 µL de cloreto de benzoíla. As amostras foram
então agitadas vigorosamente por 10 s e incubadas por 30 min a 37 oC. Em seguida, foram
adicionados às amostras 4,0 mL de uma solução saturada de NaCl, com a finalidade de parar
a reação. As poliaminas derivatizadas foram extraídas com 2,0 mL de éter dietílico. Após
isso, retirou-se 1,0 mL da fase orgânica, que foi em seguida evaporada sob fluxo de nitrogênio
gasoso, sendo o material remanescente ressuspendido em 100 µL de metanol.
A identificação e quantificação das poliaminas foram feitas por cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC). O equipamento utilizado foi o LC-DAD-ESI/MS, que consiste de
um HPLC 250 Varian (Varian, CA) acoplado a um detector de arranjo de diodos (DAD) e um
espectrômetro de massas 500-MS IT (Varian). Foi utilizada a coluna C18 (Varian Inc., Lake
Forest, CA - 3 μm, 150 x 2 mm), sendo o fluxo de 400 μL/min à temperatura de 35 oC. A fase
móvel consistiu da combinação de A (0,1% de ácido fórmico em água) e B (0,1% de ácido
fórmico em acetonitrila). A análise se deu de modo isocrático, utilizando 60% da fase móvel
B por 15 min. O espectro de massas foi simultaneamente obtido usando ionização por
eletrospray nos modos positivo e negativo (PI e NI), em uma voltagem de fragmentação de 80
V para uma faixa de massas de 100 – 2000 mAU (milli absorbance unit). A pressão do gás de
secagem foi de 35 psi; a pressão do nebulizador de 40 psi; a temperatura do gás de secagem
40
de 370 oC; voltagens de 3500 V para PI e 3500 V para NI; e a voltagem de campo do spray de
600 V foram utilizados.
A identificação dos compostos foi baseada nos espectros de massas dos íons
moleculares, os quais foram comparados com os padrões de putrescina (Put), espermidina
(Spd) e espermina (Spm). Os picos correspondentes às poliaminas foram detectados e
comparados com curvas padrões construídas a partir de diferentes concentrações (Xu et al.,
2011). Os resultados foram expressos em µmol g-1 MF.
4.7. Determinação de H2O2
Os extratos para a determinação dos teores de peróxido de hidrogênio foram obtidos a
partir da homogeneização do material fresco (0,5 g) com 5,0 mL de ácido tricloroacético
(TCA) a 5%, seguido de centrifugação a 12.000 x g por 15 min a 4º C. O sobrenadante
resultante (extrato) foi utilizado tanto para as determinações de peróxido de hidrogênio quanto
para as determinações de ascorbato e glutationa e malondialdeído (MDA).
A determinação de H2O2 foi feita de acordo com método desenvolvido por Sergiev,
Alexieva e Karanov (1997). Para isso, alíquotas de 0,2 mL do extrato foram adicionados a 0,2
mL de tampão fosfato de potássio a 10 mM (pH 7,0) e 0,4 mL de KI a 1 M. A mistura foi
deixada no escuro por 1 h e, em seguida, foram realizadas leituras de absorbância a 390 nm.
Os teores de peróxido de hidrogênio foram estimados a partir de uma curva padrão,
utilizando-se H2O2 a concentrações conhecidas, sendo os resultados expressos em µmol g-1
MF.
41
4.8. Determinações de antioxidantes não enzimáticos
4.8.1. Determinação de glutationa
Os conteúdos de glutationa total [glutationa reduzida (GSH) + glutationa oxidada
(GSSG)] e de GSH foram determinados conforme Griffth (1980), com algumas modificações.
Para a determinação de GSH, alíquotas de 0,2 mL do extrato foram adicionadas ao meio de
reação contendo 2,6 mL de tampão fosfato de sódio a 150 mM (pH 7,4) e 0,2 mL de tampão
fosfato de sódio a 100 mM (pH 6,8), contendo 5-5’-ditio-bis-2-ácido-nitrobenzóico (DTNB) 6
mM. A mistura, após agitação, foi deixada em banho-maria a 30 °C por 10 min, sendo a
reação parada pela imersão dos tubos de ensaio em banho de gelo.
O conteúdo de GSH + GSSG foi determinado após a redução da GSSG pela ação da
enzima redutase da glutationa (GR). O meio de reação consistiu da adição de 0,2 ml do
extrato ao meio de reação composto por 1,6 mL de tampão fosfato de sódio a 150 mM (pH
7,4), contendo 1 U de redutase da glutationa (GR) por mL; 1,0 mL de NADPH a 150 µM, em
tampão fosfato de sódio a 150 mM; e 0,2 ml de tampão fosfato de sódio a 100 mM (pH 6,8),
contendo DTNB 6 mM. A mistura de ração foi mantida em banho-maria a 30 ºC por 10 min,
sendo seguida de banho de gelo para cessar a reação.
Para ambas as reações descritas acima, as determinações de GSH e glutationa total
foram feitas através de leituras de absorbância em 412 nm, sendo os conteúdos estimados com
base em uma curva padrão feita com concentrações conhecidas de GSH. Os resultados foram
expressos em µmol g-1 MF. O estado redox para a glutationa foi obtido pela fórmula: (GSH)
(GSH+GSSG)-1 x 100, sendo o resultado expresso em percentagem.
4.8.2. Determinação de ascorbato
Os conteúdos de ascorbato total [ascorbato reduzido (ASA) + ascorbato oxidado
(DHA)] e de ASA foram determinados conforme Kampfenkel, Van Montagu e Inzé (1995),
42
com algumas modificações. Para determinação do ASA, a mistura de reação constou de uma
alíquota de 0,1 mL do extrato em um meio contendo: 0,3 mL de tampão fosfato de potássio a
200 mM (pH 7,4); 0,1 mL de água destilada; 0,5 ml de TCA a 10%; 0,4 mL de H3PO4 a 42%;
0,4 ml de bipiridil a 4%; e 0,2 mL de FeCl3 a 3%. A mistura foi agitada e mantida em banho-
maria a 42 °C, por 40 min, seguida de banho de gelo para interromper a reação.
O ascorbato total foi determinado após a redução do DHA pelo ditiotreitol (DTT).
Para isso, a mistura de reação constou da adição de 0,1 mL de extrato a um meio contendo:
0,1 mL de DTT a 10 mM (em tampão fosfato de potássio a 200 mM, pH 7,4) e 0,2 mL de
tampão fosfato de potássio a 200 mM, pH 7,4, sendo a mistura agitada e mantida em banho-
maria a 42 °C por 15 min. Em seguida, adicionaram-se 0,1 mL de N-etilmaleiamida a 0,5% e
aguardou-se o tempo de 2 min para então acrescentar os demais reagentes: 0,5 mL de TCA a
10%; 0,4 mL de H3PO4 a 42%; 0,4 mL de bipiridil a 4%, em etanol a 70%; e 0,2 mL de FeCl3
a 3%. A mistura foi agitada e mantida em banho-maria a 42 °C, por 40 min, seguida de banho
de gelo para interromper a reação.
Para ambas as reações acima descritas, as determinações de ASA e de ascorbato total
foram estimadas pelas leituras de absorbância em 525 nm, com base em uma curva padrão
construída com concentrações conhecidas de L-ascorbato (ASA). Os resultados foram
expressos em µmol g-1 MF e o estado redox para o ascorbato foi obtido pela fórmula: (ASA)
(ASA + DHA)-1 x 100, sendo o resultado expresso em percentagem.
4.9. Atividade das enzimas do sistema antioxidativo
Foram determinadas as atividades da catalase (CAT - EC 1.11.1.6), da peroxidase do
ascorbato (APX - EC 1.11.1.1), da peroxidase do guaiacol (GPX - EC 1.11.1.7), e da
dismutase do superóxido (SOD - EC 1.15.1.1). Nas determinações da atividade enzimática,
cada extrato (repetição) foi dosado em duplicata.
43
4.9.1. Catalase
A atividade da CAT foi determinada segundo Beers e Sizer (1952), com algumas
modificações. O meio de reação consistiu de uma mistura contendo 50 µL de extrato, tampão
fosfato de potássio a 100 mM (pH 7,0), contendo EDTA a 0,1 µM, e H2O2 a 20 mM, em um
volume final de 1,5 mL. Os tubos contendo o meio de reação foram deixados em banho-maria
a 30 °C até o momento das leituras espectofotométricas. O consumo de H2O2 foi monitorado
através do decréscimo da absorbância a 240 nm durante 5 min. A diferença na absorbância
(∆A240) foi dividida pelo coeficiente de extinção molar do H2O2 (36 M-1 cm-1) e os resultados
foram expressos em µmol H2O2 g-1 MF.
4.9.2. Peroxidase do ascorbato
A atividade da APX foi avaliada pelo método de Nakano e Asada (1981), sendo a
oxidação do ascorbato medida pelo decréscimo da absorbância a 290 nm. O ensaio consistiu
da adição de 50 µL do extrato enzimático a um meio de reação contendo 1,35 mL de tampão
fosfato de potássio 0,05 M com EDTA 0,05 mM (pH 6,0); 50 µL de H2O2 a 3 mM e 50 µL de
ácido ascórbico a 15 mM. Os tubos contendo o meio de reação foram deixados em banho-
maria a 30 °C até o momento das leituras espectrofotométricas. O volume final de reação foi
de 1,5 mL. A oxidação do ascorbato foi monitorada pela leitura de absorbância a 290 nm no
momento da adição do H2O2, numa concentração final de 1 mM, juntamente com o extrato e
ascorbato numa concentração final de 0,5 mM. A diferença de absorbância (ΔA290) foi
dividida pelo coeficiente de extinção molar do ascorbato (2,8 mM-1 cm-1) e a atividade
enzimática foi expressa em µmol H2O2 g-1 MF, considerando que 2 moles do ascorbato são
necessários para a redução de 1 mol de H2O2.
44
4.9.3. Peroxidase do guaiacol
A atividade da GPX foi determinada como descrito por Urbanek, Kuzniak-
Gebarowska e Herka (1991). O meio da reação consistiu em uma mistura contendo 50 µL do
extrato enzimático, 950 µL de tampão fosfato de potássio a 0,1 M (pH 7,0), contendo EDTA a
0,1 µM, 0,5 mL de guaiacol a 5 mM e 0,5 ml de H2O2 a 15 mM, perfazendo um volume total
de 2,0 mL. Os tubos contendo o meio de reação foram deixados em banho-maria a 30 °C até o
momento das leituras espectofotométricas. A oxidação do guaiacol (formação do
tetraguaiacol) foi monitorada pela leitura da absorbância a 470 nm, através do incremento da
absorbância, devido à formação do tetraguaiacol, no momento da adição do H2O2 e 1 min
após. A diferença na absorbância (ΔA470) foi dividida pelo coeficiente de extinção molar do
tetraguaiacol (26,6 mM-1 cm-1) e a atividade enzimática expressa em µmol H2O2 g-1 MF,
considerando que quatro moles de H2O2 são necessários para produzir 1 mol de tetraguaiacol.
4.9.4. Dismutase do superóxido
A atividade da SOD foi determinada através da redução fotoquímica do cloreto de
tetrazolium nitroblue, como descrito por Giannopolitis e Ries (1977). O ensaio consistiu da
adição de 50 µL de extrato enzimático a um meio contendo 1,0 mL de tampão fosfato a 50
mM (pH 7,8), contendo EDTA a 1 µM e metionina a 19,5 mM; 0,15 mL de tetrazolium
nitroblue (NBT) a 75 µM; e 0,3 mL de riboflavina a 2 µM em um volume total de 1,5 mL. A
riboflavina foi adicionada por último e os tubos foram então agitados e deixados sob luz
fluorescente de 20 W. A reação teve duração de 15 min, após o qual as luzes foram desligadas
e os tubos cobertos com tecido escuro para evitar a entrada de luz. As absorbâncias das
misturas de reação foram monitoradas a 560 nm devido à produção de azul de formazana,
resultante da fotorredução do NBT. Para os cálculos da atividade, considerou-se que a leitura
do branco correspondia a 100% de fotorredução do NBT, e que uma unidade de atividade
45
(UA) da SOD foi definida como a quantidade de enzima requerida para causar uma inibição
de 50% na taxa de fotorredução do NBT. Os resultados de atividade da SOD foram expressos
em UA g-1 MF.
4.10. Determinação da peroxidação dos lipídios
Os danos causados pela salinidade nas membranas foram estimados pela determinação
de malondialdeído (MDA), um produto da peroxidação dos lipídios, segundo metodologia
descrita por Heath e Packer (1968). Os mesmos extratos utilizados para a determinação dos
antioxidantes não enzimáticos (item 4.8.1) foram homogeneizados com uma solução de ácido
tiobarbitúrico a 0,5% (p/v) contendo TCA a 20% (p/v). A mistura foi aquecida a 95 °C por 30
min e, após resfriamento, centrifugada a 3.000 x g por 10 min. Os teores de MDA foram
estimados através do seu coeficiente de extinção molar (ε = 155 mM-1 cm-1) e utilizando-se a
seguinte equação: (A532 – A660)/ε. Cada extrato (repetição) para a determinação de MDA foi
dosado em duplicata.
4.11. Atividade da Ribonuclease
O extrato bruto para a determinação da atividade da ribonuclease (RNase) foi
preparado de acordo com Gomes-Filho e Enéas-Filho (1991), sendo os tecidos vegetais, na
proporção 1:5 (p/v), macerados em almofariz, com tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 5,7),
por cerca de 40 min a 4 ºC. O homogenato foi filtrado em tecido de musselina e centrifugado
a 9.000 x g por 20 min a 4 ºC. O precipitado foi descartado e o sobrenadante (extrato bruto)
foi utilizado para as análises de atividade enzimática. A atividade RNásica foi determinada
segundo método de Tuve e Anfinsen (1960), com algumas modificações. A reação foi
desencadeada pela adição do substrato (RNA na concentração final de 2 mg mL-1, em tampão
acetato de sódio 0,1 M, pH 5,8) à enzima (extrato bruto), à temperatura de 40 ºC em banho-
46
maria, em um volume final de reação de 2,0 mL, sendo retiradas alíquotas de 0,5 mL da
mistura de reação nos tempos de 5 e 35 min. Essas alíquotas foram colocadas em tubos
Eppendorf contendo 0,1 ml de acetato de uranila a 0,75% em ácido perclórico a 25%, com o
propósito de interromper a reação enzimática por precipitação do substrato, o RNA. Após
repouso em banho de gelo por, no mínimo, 20 min, a mistura foi centrifugada a 12.000 x g
por 15 min, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi diluído em água destilada (1:25) a
teve sua absorbância determinada em 260 nm (A260). Definiu-se uma unidade de atividade
(UA) como sendo igual ao acréscimo de A260 de 0,01, sendo a atividade total expressa em UA
g-1 MF h-1.
4.12. Delineamento experimental
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x
4, correspondendo a duas concentrações de NaCl (0 e 75 mM) e quatro épocas de coletas (0,
5, 10 e 15 dias do início dos tratamentos), com cinco repetições. Os resultados foram
analisados com base nas médias e erro padrão.
47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Crescimento das plantas de sorgo
A salinidade reduziu o crescimento das plantas de sorgo (Figuras 1 e 2). Foram
observadas reduções na matéria fresca da parte aérea (MFPA) de 50, 71 e 80%, aos 5, 10 e 15
dias de estresse, respectivamente, em relação ao controle (Figura 1A). Já para a matéria fresca
das raízes (MFR), tais reduções somente foram detectadas aos 10 e 15 dias de estresse, com
valores, respectivamente, 26 e 51% menores que os das plantas controle (Figura 1B). Por
outro lado, a matéria fresca total (MFT) apresentou reduções de 26, 58 e de 72% aos cinco,
dez e quinze dias de estresse, respectivamente (Figura 1C). A relação MFR/MFPA, por sua
vez, se mostrou, em média, 152% mais elevada sob condições de estresse salino (Figura 1D).
Da mesma forma que o observado para as matérias frescas, as matérias secas da parte
aérea (MSPA), das raízes (MSR) e total (MST) das plantas também foram reduzidas pela
salinidade, porém isso somente foi observado após o 5º dia de estresse (Figura 2). A MSPA
foi reduzida de 65 e 75%, enquanto a MSR foi reduzida de 26 e 56% aos 10 e 15 dias de
estresse, respectivamente (Figura 2A e B). A matéria seca total (MST) também foi afetada
pela salinidade, apresentando reduções de 58 e de 72% aos 10 e 15 dias de estresse,
respectivamente (Figura 2C). A relação MSR/MSPA, da mesma forma que a relação
MFR/MFPA, também se mostrou mais elevada sob condições de estresse salino, sendo, em
média, 152% maior que aquela do controle (Figura 2D).
Reduções no crescimento das plantas pela salinidade tem sido observada por Azevedo
Neto et al. (2006) e Gondim et al. (2012), em plantas de milho; Alvarez Pizarro et al. (2011)
e Trindade et al. (2006), em plantas de sorgo; Guimarães et al. (2012), em plantas de feijão de
corda.
48
Figura 1. Matérias frescas da parte aérea (MFPA; A), das raízes (MFR; B) e total (MFT; C) e relação MFR/MFPA (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
MF
T
(g p
lant
a-1 )
0
8
16
24
32
MF
PA
(g p
lant
a-1 )
0
7
14
21
28
MF
R
(g p
lant
a-1 )
0,0
2,4
4,8
7,2
9,6
Tempo (dias)
0 5 10 15
MF
R/M
FP
A
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
A B
C D
49
Figura 2. Matérias secas da parte aérea (MSPA; A), das raízes (MSR; B) e total (MST; C) e relação MSR/MSPA (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
MS
T
(g p
lant
a-1 )
0,0
0,8
1,6
2,4
3,2
MS
PA
(g p
lant
a-1 )
0,0
0,6
1,2
1,8
2,4
MS
R
(g p
lant
a-1 )
0,0
0,1
0,2
0,4
0,5
Tempo (dias)
0 5 10 15
MS
R/M
SP
A
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
A B
C D
50
Os aumentos observados nas relações MFR/MFPA (Figura 1D) e MSR/MSPA das
plantas sob estresse salino (Figura 2D) indicam que a parte aérea das plantas de sorgo foi mais
afetada pela salinidade do que as raízes. A maior redução no crescimento da parte aérea em
relação ao das raízes tem sido observada por outros autores (FERREIRA; TÁVORA;
HERNANDES, 2001; FREITAS et al., 2011; SOUSA et al., 2011), e sugere que isto ocorre
para manter a absorção de nutrientes e água do solo, de forma a minimizar os efeitos
prejudiciais do sal.
A área foliar (AF) das plantas mostrou-se bastante sensível aos efeitos do estresse
salino (Figura 3). A AF das plantas sofreu reduções de 80 e 89% aos 10 e 15 dias de estresse,
respectivamente, quando comparadas com as do grupo controle. A redução da área foliar é um
dos efeitos imediatos da salinidade sobre o crescimento das plantas, sendo comumente
observada nas mais variadas espécies vegetais (CHARTZOULAKIS et al., 2002; FREITAS et
al., 2011; PARIDA; DAS, 2005; PRAXEDES et al., 2010), e pode representar uma resposta
adaptativa para evitar a perda excessiva de água por transpiração (GREENWAY; MUNNS,
1980; PRAXEDES et al., 2010). Em milho, foram encontrados resultados semelhantes em
cultivares com diferentes tolerâncias a salinidade (MANSOUR et al., 2005; HAJLAOUI et
al., 2010). Por outro lado, a redução no crescimento foliar e, consequentemente, na área foliar
disponível para a fotossíntese, reduz o acúmulo de biomassa nos órgãos da planta (PARIDA;
DAS, 2005). Estas reduções, portanto, podem ter contribuído para a queda observada na
MSPA das plantas sob estresse salino (Figura 2A).
5.2. Teor de água e suculência das folhas
O teor de água na parte aérea das plantas foi pouco alterado pelo estresse salino
(Figura 4A e B). Em folhas e colmos, observou-se uma redução média de 2,5% em relação
51
Figura 3. Área foliar de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Áre
a fo
liar
(cm
2 pl
anta
- 1)
0
140
280
420
560
52
Figura 4. Teor de água em folhas (A), colmos + bainha (B) e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
ao controle. Já em raízes, este parâmetro foi 2,0% menor apenas no quinto dia de estresse,
apresentando nenhuma variação até o final do experimento. De modo semelhante aos
Tempo (dias)
0 5 10 15
Teo
r de
águ
a (%
)
0
5
10
80
90
Teo
r de
águ
a (%
)
0
5
10
80
90
Teo
r de
águ
a (%
)
0
5
10
80
90A
B
C
53
observados neste experimento, Viégas et al. (2001) não observaram maiores alterações no
teor de água de folhas, caules e raízes de plantas de cajueiro anão precoce submetidas a
estresse salino. Estes autores ainda supõem que as plantas podem ter desenvolvido
mecanismos de ajustamento osmótico para regular sua homeostase hídrica a valores similares
aos observados nas plantas do tratamento controle. Estes mecanismos podem ser a
compartimentalização de íons e de solutos orgânicos no citosol.
A suculência foliar é um parâmetro com importantes implicações anatômicas e
fisiológicas em plantas submetidas a algum tipo de estresse. Neste experimento, a suculência
foliar decresceu ao longo do desenvolvimento, tanto nas plantas controle como naquelas
estressadas de sorgo forrageiro (Figura 5). No entanto, nas plantas sob estresse salino a
suculência foliar foi maior, sendo observados aumentos de 25% aos 10 dias de estresse e de
80% no final do experimento. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por outros
autores, que mostraram que a suculência é uma resposta comum em folhas de plantas
estressadas com sais de cloreto (LACERDA et al., 2006; STROGONOV, 1964; ZEKRI,
1991). A suculência permite a regulação da concentração de sais nos tecidos foliares e
depende diretamente da absorção, transporte e acúmulo de íons nos tecidos foliares, podendo
contribuir para reduzir o efeito dos sais sobre o crescimento da planta (LACERDA et al.,
2006).
5.3. Trocas gasosas
Os parâmetros fotossintéticos foram medidos nas plantas controle e estressadas com
NaCl a 75 mM aos 5, 10 e 15 dias do início dos tratamentos. A taxa de fotossíntese líquida
não foi afetada pela salinidade aos 5 dias de estresse (Figura 6A). Contudo, em relação ao
54
Figura 5. Suculência de folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Suc
ulên
cia
folia
r
(H2O
cm
- 2)
0
14
28
42
56
55
Figura 6. Fotossíntese líquida (A), condutância estomática (B), transpiração (C) e relação entre a concentração de CO2 interna e externa (Ci/Ce; D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
controle, a fotossíntese líquida das plantas submetidas ao estresse por 10 e 15 dias apresentou
reduções de 22 e 20%, respectivamente. Estas reduções provavelmente foram responsáveis,
Tempo (dias)
0 5 10 15
Tax
a de
tran
spira
ção
(mm
ol H
2O m
- 2 s
- 1)
0
2
4
6
8
Tempo (dias)
0 5 10 15
Rel
ação
Ci/C
e
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Fot
ossí
ntes
e líq
uida
(mm
ol C
O2
m- 2
s- 1
)
0
10
20
30
40
Con
dutâ
ncia
est
omát
ica
(mol
m- 2
s- 1
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8A
C
B
D
56
pelo menos em parte, pelas diminuições observadas na área foliar e na produção de matéria
seca das plantas (Figuras 3 e 2). Diversas espécies vegetais mostraram reduções nas suas taxas
fotossintéticas quando submetidas à salinidade (GARCIA-SANCHEZ et al., 2006; M’RAH et
al., 2006; NAVARRO et al., 2007; PRAXEDES et al., 2010), indicando que a fotossíntese é
um fator limitante para o crescimento (NAVARRO et al., 2007). Mateos-Naranjo et al.
(2010), trabalhando com a halófita Spartina marítima, observaram reduções progressivas na
taxa de fotossíntese com o aumento da salinidade do meio até 510 mM de NaCl. Em plantas
jovens de cajueiro anão-precoce irrigadas com soluções salinas, Bezerra et al. (2005) também
verificaram reduções na fotossíntese líquida.
A condutância estomática das plantas de sorgo forrageiro não foi afetada pela
salinidade (Figura 6B). A habilidade das plantas para sobreviver em condições de salinidade
depende da capacidade para minimizar as perdas de água através da redução da condutância
estomática (FEIJÃO et al., 2011; WILSON et al., 2006). Portanto, a inibição na fotossíntese
observada neste trabalho não pode ser explicada por limitações estomáticas e resistência à
difusão do CO2 na folha. Dados semelhantes aos encontrados aqui foram observados por
M’rah et al. (2006) em plantas de Thelluginella halophilla estressadas com 50 mM de NaCl,
dose esta que não alterou a condutância estomática, nem a fotossíntese. Em plantas de
Sesuvium portulacastrum sob estresse salino com NaCl a 400 mM, a condutância estomática
foi reduzida drasticamente, mas não foi acompanhada por quedas na fotossíntese (RABHI et
al., 2010).
A taxa de transpiração não foi alterada pelo estresse salino, embora tenha aumentado
no final do experimento, independentemente do tratamento (Figura 6C). Portanto, apesar de
vários trabalhos ressaltarem que, sob estresse salino, as plantas mostram redução na taxa de
transpiração e na condutância estomática (BACKHAUSEN et al., 2005; PLAUT; GRIEVE;
57
MAAS, 1990; WILSON et al., 2006), e que tais fatores são possivelmente os responsáveis
pela inibição da fotossíntese, esta hipótese não foi confirmada neste experimento.
Em comparação ao controle, a relação entre a concentração interna de CO2 e a externa
(Ci/Ce) nas plantas estressadas não foi alterada (Figura 6D). A manutenção da relação Ci/Ce
foi concordante com a ausência de efeito do estresse salino na condutância estomática e
sugere a participação de fatores inibitórios não relacionados aos estômatos na redução da
fotossíntese do sorgo sob salinidade. Portanto, os resultados sugerem que a salinidade tenha
causado efeitos na fase bioquímica da fotossíntese, afetando algumas enzimas do ciclo de
Calvin (FEIJÃO et al., 2011; PRAXEDES et al., 2010).
5.4. Fluorescência da clorofila
A razão entre a fluorescência variável e a fluorescência máxima da clorofila (Fv/Fm)
não foi afetada pela salinidade e permaneceu praticamente constante ao longo de todo o
período experimental (Figura 7A). A relação Fv/Fm indica a eficiência quântica máxima do
fotossistema II (PSII), quando todos os centros de reação do PSII estão abertos (BAKER;
ROSENQVST, 2004). Em condições de salinidade podem ocorrer reduções neste parâmetro,
o que representa um distúrbio ou dano no aparato fotossintético (GLYNN; FRASER;
GILLIAN, 2003; PERCIVAL; FRASER, 2001). Em genótipos de girassol com tolerância
diferencial à salinidade, Azevedo-Neto et al. (2011) verificaram maiores declínios na relação
Fv/Fm nos genótipos mais sensíveis.
A eficiência quântica efetiva do PSII (Φ PSII) não foi alterada durante todo o
experimento mesmo entre plantas controle e estressadas com NaCl a 75 mM (Figura 7B).
Estes resultados diferem dos observados por Azevedo-Neto et al. (2011), que verificaram
reduções neste parâmetro em plantas de girassol submetidas à salinidade. Em adição, a Φ PSII
58
Figura 7. Rendimento máximo do fotossistema II (Fv/Fm; A), rendimento quântico efetivo do fotossistema II (Φ PSII; B), Dissipação fotoquímica (quenching fotoquímico) (qP; C) e Dissipação não fotoquímica (quenching não-fotoquímico) (NPQ; D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
foi reduzida na halófita Spartina marítima com o aumento da salinidade até 510 mM de NaCl
(MATEOS-NARANJO et al., 2010).
Tempo (dias)
0 5 10 15
qP
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Tempo (dias)
0 5 10 15
NP
Q
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Fv/
Fm
0,0
0,2
0,5
0,7
1,0
Φ P
SII
0,0
0,2
0,5
0,7
1,0A
C
B
D
59
Comparando com as plantas controles, a extinção fotoquímica (qP) e não-fotoquímica
(NPQ) não foram alteradas pelo estresse salino (Figura 7C e D). Em plantas de crisântemo
submetidas aos estresses salino e de alta irradiância combinados foram observados aumentos
em NPQ consistentes com a estimulação de mecanismos fotoprotetores de dissipação de
energia térmica (BROETTO; DUARTE; LÜTTGE, 2007).
5.5. Teores de clorofila
Os teores relativos de clorofila (ou leituras SPAD) foram menores nas plantas do
tratamento salino em relação àquelas do controle (Figura 8), sendo observadas reduções de
11, 12 e 16% aos 5, 10 e 15 dias de estresse, respectivamente. De modo geral, as plantas
quando submetidas a estresses abióticos, como a salinidade ou déficit hídrico, apresentam
reduções no conteúdo de clorofila (DEBOUBA et al., 2006; M’RAH et al. 2006; PANDA;
UPADHYAY; UPADHYAYA, 2006). Porém, tais reduções dependem do cultivar, do nível
de sal e do tempo de exposição ao estresse a que a planta é submetida. No entanto, pode
também ocorrer aumento na concentração de clorofila dependendo do nível de sal ao qual a
planta é exposta (MA et al., 1997). Lacerda et al. (2003b) observaram um aumento na
concentração de clorofila em plantas de sorgo deste mesmo cultivar quando submetidas a
estresse salino (NaCl a 100 mM), porém estes resultados foram diferentes dos aqui
observados. De acordo com Seemann e Critchley (1985) a redução no conteúdo de clorofilas é
mais comumente observada em plantas sensíveis à salinidade.
60
Figura 8. Teores relativos de clorofila em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
5.6. Teores de sódio, potássio, cloreto e relação K+/Na+
Tempo (dias)
0 5 10 15
Leitu
ras
SP
AD
0
10
20
30
40
61
A salinidade causou grandes aumentos nos teores de sódio (Na+) em folhas, colmos +
bainha e raízes das plantas de sorgo forrageiro (Figura 9). Nas folhas, os teores de sódio das
plantas sob estresse salino foram maiores que aqueles nas plantas controle em cerca de 6,0 e
7,5 vezes, respectivamente, aos 5 e 10 dias de estresse, enquanto no final do experimento o
aumento foi de apenas 3,0 vezes (Figura 9A). Em colmos + bainha, os aumentos foram ainda
mais marcantes. Nesses órgãos, os teores de Na+ das plantas sob estresse salino foram, em
média, cerca de 10 vezes maiores que aqueles do controle (Figura 9B), enquanto nas raízes os
valores foram cerca de 4,2 vezes maiores que aqueles do controle (Figura 9C). Aumentos nos
teores de sódio pela salinidade também foram observados por outros autores (FREITAS et al.,
2011; PRAXEDES et al., 2010). De acordo com Ashraf e Ahmad (2000), o efeito tóxico
causado pelo excesso de Na+ oriundo do meio externo pode ser reduzido pelos seguintes
mecanismos: restrição da entrada de Na+ na célula através da absorção seletiva; exclusão ou
compartimentalização no vacúolo do excesso de Na+ citosólico, bem como por um sistema
eficiente de partição deste íon na planta (ASHRAF; AHMAD, 2000).
Os teores de potássio (K+) foram fortemente afetados pelo tratamento salino, sendo
observadas reduções no acúmulo deste íon em todos os órgãos estudados da planta,
especialmente nas folhas e colmos + bainha (Figura 10). Aos 10 dias de estresse, as reduções
foram de 63 e 71%, e aos 15 dias de 62 e 69%, respectivamente, em folhas e colmos + bainha
(Figura 10A e B). Nas raízes, as reduções médias nos teores de K+ aos 5 e 10 dias de estresse
foram de 47% em relação ao controle (Figura 10C). Aos 15 dias de estresse, no entanto, a
redução nos teores de K+ neste órgão foi de 35% em relação ao controle. Reduções nos teores
de K+ nas folhas e nas raízes com o aumento da salinidade, porém em níveis mais elevados do
que os empregados aqui, foram também encontrados em sorgo (LACERDA, 2000;
NETONDO; ONYANGOA; BECK, 2004), bem como em outras espécies vegetais, como
62
Figura 9. Teores de sódio em folhas (A), colmos + bainha (B), e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Na+
( µm
ol g
-1 M
S)
0
320
640
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Na+
( µm
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-1 M
S)
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400
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Na+
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S)
0
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A
B
C
63
Figura 10. Teores de potássio em folhas (A), colmos + bainha (B), e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
K+
( µm
ol g
-1 M
S)
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K+
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ol g
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S)
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1500
2000
A
B
C
64
plantas do gênero Atriplex (BRILHANTE, 2006), em milho (AZEVEDO NETO et al., 2004;
HAJLAOUI et al., 2010), e em pinhão manso (SILVA et al., 2009). De acordo com Tester e
Davenport (2003), a redução nos teores de K+ nas folhas devida às elevadas concentrações de
sódio, deve-se à competição do Na+ com o K+ pelas proteínas de transporte que controlam a
absorção desse último íon. Portanto, é provável que a redução nos teores de potássio seja
causada pela diminuição na absorção (influxo) ou então pelo aumento no efluxo de K+ em
condições de salinidade provocada por NaCl. Na realidade, tem sido observada a existência de
múltiplos sistemas de absorção com diferentes seletividades para Na+ e K+ o que pode refletir
a necessidade da planta para coordenar o influxo desses cátions (ASSIS JUNIOR et al., 2007;
LACERDA et al., 2006; SCHACHTMAN; LIU, 1999).
Os teores de cloreto (Cl-) em condições salinas aumentaram, em relação ao controle,
nos três órgãos analisados e em todos os tempos de coleta (Figura 11). O acúmulo de Cl- foi
maior em raízes e colmos + bainha do que em folhas. Em colmos + bainha os aumentos foram
de 80, 179 e 298% aos 5, 10 e 15 dias de estresse, respectivamente (Figura 11B), enquanto
nas raízes os aumentos foram de 142, 265 e 450%, respectivamente aos 5, 10 e 15 dias
(Figura 11C). Por outro lado, nas folhas os aumentos foram de 42, 93 e 247%,
respectivamente aos 5, 10 e 15 dias de estresse (Figura 11A).
Vários trabalhos têm observado o acúmulo dos íons sódio e cloreto em plantas
submetidas à salinidade (COSTA et al., 2003; JAMES et al., 2002; PRAXEDES et al., 2010),
sendo os genótipos mais tolerantes ao estresse salino os que apresentam menor acúmulo desse
íon, principalmente na parte aérea (AMOR et al., 2000; JUAN et al., 2005; SANCHEZ et al.,
2002). É possível que o menor acúmulo desses íons nos limbos foliares esteja associada à
quantidade de água absorvida durante a aplicação do estresse, às diferenças na capacidade de
exclusão de íons nas raízes e as diferenças na capacidade de retenção desses íons nos caules
(TRINDADE et al, 2006). O componente iônico da salinidade pode causar danos irreparáveis
65
Figura 11. Teores de cloreto em folhas (A), colmos + bainha (B) e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Cl-
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-1 M
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560
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Cl-
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-1 M
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A
B
C
66
em estruturas celulares as quais podem comprometer a eficiência metabólica e até mesmo
provocar a morte celular (SHI; ZHU, 2002).
O aumento no acúmulo de íons tóxicos observados nas raízes em função do estresse
salino pode estar relacionado à exposição direta das raízes ao sal, o que provoca alterações na
integridade e permeabilidade seletiva da membrana plasmática (GRATTAN; GRIEVE, 1998;
VIÉGAS et al., 2001). Pode-se sugerir, portanto, que o comportamento de aumentar os teores
de sódio (Figura 9) e de cloreto (Figura 11), principalmente em colmos e raízes, em
detrimento de menores aumentos nas folhas, possa levar a uma maior proteção dos órgãos
fotossintetizantes (folhas) contra os efeitos deletérios da salinidade.
A relação K+/Na+ foi fortemente reduzida pelo tratamento salino, especialmente aos 5
e 10 dias de estresse, em todas as partes da planta (Figura 12). Em folhas e raízes, as reduções
foram de aproximadamente 90 e 95% aos 5 e 10 dias de estresse, respectivamente (Figura
12A e C). Nos colmos + bainha foram observadas reduções maiores que 96% em todos os
tempos de coleta após a imposição do estresse (Figura 12B). Esses resultados estão de acordo
com os observados por Viégas et al. (2001) e Alves et al. (2008), que observaram reduções na
relação K+/Na+, em plantas de cajueiro submetidas à salinidade, e por Silva et al. (2009), em
plantas de pinhão manso.
De acordo com Apse e Blumwald (2007), nas glicótifas sob condições normais, de
modo geral, a relação K+/Na+ tem valor elevado, situando-se em torno de 10 a 20. No presente
estudo (Figura 12), essa relação em plantas de sorgo foi altamente afetada pela salinidade,
sendo observado valores inferiores a 1, em todas as partes estudadas da planta. Portanto,
diversos processos celulares, como aqueles envolvidos na atividade enzimática e na regulação
osmótica são afetados em função do rompimento da homeostase iônica (APSE;
BLUMWALD, 2007; GHARS et al.,2008).
67
Figura 12. Relação potássio/sódio (K+/Na+) em folhas (A), colmos + bainha (B) e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
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A
B
C
68
5.7. Teores de solutos orgânicos
5.7.1. Prolina livre
Os teores de prolina aumentaram com a salinidade tanto em folhas quanto em raízes
(Figura 13A e C). Nas folhas, o maior aumento no conteúdo de prolina ocorreu aos 10 dias de
estresse, sendo esse aumento, em relação ao controle, de 269%. Já nas raízes o maior aumento
ocorreu aos 5 dias de estresse, com um valor 126% maior que o do controle. Resultados
semelhantes ao deste trabalho foram encontrados também por outros autores, trabalhando com
as mais diversas espécies vegetais, como: milho (HAJLAOUI et al., 2010), morango
(KEUTGEN; PAWELZIK, 2009), capim-marinho (LI; SHIA; FUKUDA, 2010). Da mesma
forma, Praxedes (2008) trabalhando com um cultivar de feijão de corda sensível à salinidade,
também observou um aumento significativo no conteúdo de prolina nos primeiros dias de
estresse. É fato que, em várias espécies vegetais, a prolina é o soluto orgânico que apresenta
maior aumento em seu conteúdo em resposta ao estresse salino, sendo muitas vezes utilizada
como parâmetro de tolerância aos sais (ASHRAF; FOOLAD, 2007; KRASENSKY; JONAK,
2012). Considera-se que a prolina atue como um osmólito, como eliminador de ROS, e como
chaperona molecular atuando na estabilização da estrutura das proteínas e, assim, proteger as
células dos danos causados pelo estresse (SZABADOS; SAVOURE, 2010). No entanto, o
papel benéfico da prolina para a tolerância das plantas ao estresse salino é ainda bastante
controverso e alguns estudos consideram o aumento no conteúdo desse osmólito como sendo
meramente uma conseqüência do estresse (LACERDA et al., 2003b).
5.7.2. Carboidratos solúveis
Nas folhas, o estresse salino aumentou os teores de carboidratos solúveis, porém
apenas aos 5 e 10 dias de estresse, com aumentos de 46 e 23%, respectivamente (Figura 13B).
Já nas raízes das plantas sob estresse salino, os teores de carboidratos solúveis tiveram um
69
Figura 13. Teores de prolina em folhas (A) e raízes (C) e de carboidratos solúveis em folhas (B) e raízes (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
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C
B
D
70
aumento de 45% aos 5 dias, porém aos 15 dias de estresse houve uma diminuição nos teores
desses solutos, em relação ao controle de 35% (Figura 13D). Corroborando com estes
resultados, Lacerda et al. (2001) relataram acúmulos de carboidratos solúveis em dois
genótipos de sorgo forrageiro com tolerâncias contrastantes à salinidade, sendo os maiores
acúmulos observados no genótipo tolerante. Aumentos nos teores de carboidratos solúveis
devido à salinidade também têm sido observados por outros autores (HAJLAOUI et al., 2010;
KEUTGEN; PAWELZIK, 2009; LI; SHIA; FUKUDA, 2010). O acúmulo de carboidratos
solúveis parece estar relacionado com o mecanismo de ajustamento osmótico em condições
salinas, permitindo o crescimento das plantas mesmo que a uma taxa reduzida (Lacerda et al.,
2003b).
Em geral, flutuações diurnas nos níveis de amido, estresse salino e déficit hídrico,
levam a uma depleção do teor de amido e, consequente, acumulação de carboidratos solúveis,
em folhas (BASU; ALI; CHATURVEDI, 2007; KAPLAN; GUY, 2004; KEMPA et al., 2008;
TODAKA; MATSUSHIMA; MOROHASHI, 2000). Dessa forma, carboidratos solúveis que
se acumulam em resposta ao estresse salino, além de poder funcionar como osmólitos para
manter a turgescência das células e ter a capacidade de proteger as membranas e proteínas dos
danos causados pelo estresse, podem ainda fornecer para a célula energia em caso de haver
uma redução na fotossíntese em resposta ao estresse (KRASENSKY; JONAK, 2012).
5.7.3. N-aminossolúveis
No presente trabalho, os teores foliares e radiculares de N-aminossolúveis foram
afetados significativamente pelo estresse salino (Figura 14A e C). Nas folhas das plantas de
sorgo sob estresse salino, os teores de N-aminossolúveis se mantiveram mais elevados
durante todo o período experimental, sendo os aumentos de 18, 47 e de 28%, aos 5, 10 e 15
71
Figura 14. Teores de N-aminossolúveis em folhas (A) e raízes (C) e de proteínas solúveis em folhas (B) e raízes (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
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C
B
D
72
dias de estresse, respectivamente, em relação ao tratamento controle (Figura 14A). Nas raízes,
observou-se um aumento nos teores de N-aminossolúveis pela salinidade, em média, de 25%,
em relação ao controle (Figura 14C).
O acúmulo de aminoácidos (um N-aminossolúvel) tem sido observada em muitos
estudos com plantas expostas a estresse abiótico (KEMPA et al., 2008; SANCHEZ et al.,
2008; USADEL et al., 2008; LUGAN et al., 2010). Esse acúmulo pode resultar da síntese de
novo de aminoácidos ou a partir da quebra de proteínas induzida por estresse. Embora o
acúmulo total de aminoácidos sob condições de estresse possa indicar dano celular em alguns
espécies (WIDODO et al., 2009), o aumento dos níveis de alguns aminoácidos específicos
tem um efeito benéfico durante o processo de aclimatação ao estresse. De maneira semelhante
aos nossos resultados, Oliveira et al. (2006) também observaram aumento nos teores de N-
aminossolúveis em plantas de sorgo submetidos a salinidade. Além disso, Azevedo-Neto et
al., (2009) observaram aumentos na concentração de aminoácidos livres em folhas e raízes de
plantas de milho sob estresse salino.
5.7.4. Proteínas solúveis
Os teores de proteínas solúveis foram pouco alterados pelo estresse tanto em folhas
quanto em raízes (Figura 14B e D). Nas folhas, a única alteração nos teores de proteínas
solúveis sob condições de estresse ocorreu aos 10 dias, com uma redução de 46%, em relação
ao controle. Já nas raízes, a única alteração ocorreu aos 5 dias de estresse, porém observou-se
um aumento nos teores de proteínas solúveis de 41% aos 5 dias de estresse (Figura 14D).
Praxedes (2008) observou em raízes de plantas de feijão-de-corda que a salinidade exerceu
pouco efeito sobre os teores de proteínas solúveis, inclusive no cultivar de feijão de corda
mais sensível à salinidade (TVu). Brilhante (2006), também constatou que em plantas de
Atriplex nummularia os teores de proteínas foram pouco afetados pela salinidade.
73
Oliveira et al. (2006), analisando diferentes genótipos de sorgo forrageiro em
condições de estresse salino observaram incrementos significativos nos teores de proteínas
solúveis, presentes no tecido foliar da planta, durante 63 dias de crescimento. Por outro lado,
o decréscimo no conteúdo de proteína, como foi observado no presente trabalho, em folhas
aos dez dias de estresse, pode refletir em um retardo na síntese protéica ou aceleração na sua
degradação, o que pode ter levado ao aumento na quantidade de aminoácidos livres como a
prolina (PIZA; LIMA; BRASIL, 2003). Mendes et al. (2011) constatou uma maior
concentração de proteínas em plantas de abacaxi submetidas à salinidade. Azevedo-Neto et al.
(2009), estudando plantas de milho em condições de salinidade (100 mM de NaCl), observou
aumento nos teores de proteínas solúveis apenas nas folhas de um dos genótipos.
5.7.5. Poliaminas livres
Os teores de putrescina (Put) nas folhas das plantas de sorgo, sob estresse salino,
foram aumentados em todos os tempos de coleta (Figura 15A). Foram observados aumentos
de 181, 155 e de 88% aos 5, 10 e 15 dias de estresse, respectivamente. Já em raízes, os teores
dessa poliamina livre foram maiores em condições de estresse, sendo observados aumentos de
252 e de 115%, respectivamente, aos 5 e 15 dias de estresse (Figura 15B). No 10° dia de
estresse, não foram encontrados valores detectáveis de Put nas raízes. Os teores de
espermidina (Spd), nas folhas, foram diminuídos de 49% no 5° dia de estresse, porém
apresentaram valores 6 vezes superiores ao do controle no 10º dia de estresse (Figura 15C).
No 15º dia não foi observada diferença significativa entre os tratamentos, com relação aos
teores de Spd. Nas raízes, os teores de Spd não foram alterados pela salinidade em todos os
tempos de coleta, não sendo detectadas quantidades significativas dessa poliamina a partir do
10º dia de estresse. Por outro lado, é importante destacar que não foram observados níveis
significativos de espermina (Spm) em nenhum dos órgãos estudados.
74
Figura 15. Teores de putrescina em folhas (A) e raízes (C) e de espermidina em folhas (B) e raízes (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
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B
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Nossos resultados foram semelhantes aos obtidos por Lima, Brasil e Oliveira (1999),
em plantas de Phaseolus vulgaris, que observaram aumentos nos teores de poliaminas livres
nas folhas, principalmente a Put, com o tempo e a concentração de NaCl. Além disso, eles
observaram que o teor de Spd também aumentou com o estresse, porém de forma menos
acentuada do que a Put. Também eles não detectaram níveis significativos de Spm nas folhas.
Erdei et al. (1996), trabalhando com plantas de milho e sorgo, observaram aumentos nos
teores das poliaminas livres, Put, Spm e Spd, nas folhas, com o aumento da concentração de
sal. De forma semelhante, Lima et al. (2007) observaram aumentos nas concentrações de
quatro poliaminas livres em folhas de Colocasia esculenta com o aumento da dose de NaCl.
De acordo com Mansour (2000), o aumento no teor de Put, em resposta ao estresse salino, é
comum em plantas. Já de acordo com Willadino et al. (1996), a tolerância à salinidade parece
estar associada não apenas à capacidade da planta em acumular Put, mas em manter ativo o
metabolismo das poliaminas, incluindo-se aí a síntese de Spd e Spm. É importante ressaltar,
no entanto, que as modificações nos teores de poliaminas em resposta ao estresse salino
também é bastante contraditória. Há autores que observaram diminuição apenas nos teores de
Put pela salinidade (LIN; KAO, 1999), enquanto outros observaram diminuições nos teores de
Spd e Spm (PRAKASH; PRATHAPASENAN, 1988).
5.8. Atividade das enzimas do estresse oxidativo
Neste trabalho, o estresse salino afetou a atividade da enzima dismutase do superóxido
(SOD) em folhas e raízes (Figura 16). A atividade da SOD nas folhas aumentou tanto no
controle como nas plantas sob estresse salino até o 10º dia, quando então a atividade
permaneceu praticamente a mesma até o final do experimento. As plantas estressadas
apresentaram maiores atividades da SOD aos 5 e 15 dias de estresse, sendo observados
aumentos de 40 e 18%, respectivamente, em relação ao controle (Figura 16A). Nas raízes, a
76
Figura 16. Atividade da dismutase do superóxido (SOD) em folhas (A) e raízes (B) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
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atividade da SOD foi aumentada pelo estresse salino em 39% no dia 5º dia, não diferiu no dia
10º dia e foi 140% maior no 15º dia de estresse, em relação ao controle (Figura 16B). A SOD
é considerada a primeira linha de defesa contra as espécies reativas do oxigênio (ROS), desde
que ela causa a dismutação do radical superóxido gerando o H2O2, o qual é eliminado
posteriormente pela enzima catalase ou por várias peroxidases (MITTLER et al., 2004). No
presente estudo, a salinidade reduziu a taxa de fotossíntese líquida nas folhas (Figura 6A),
possivelmente por uma inibição no ciclo de Calvin, como discutido anteriormente (item 5.3).
Como consequência disso, baixa a disponibilidade de NADP+ para receber os elétrons
provenientes do fotossistema I. Tal situação favorece a redução monovalente do oxigênio
molecular nesse fotossistema, gerando o radical superóxido através da reação de Mehler
(DEMIRAL; TÜRKAN, 2005; EDREVA, 2005). As folhas, mais precisamente os
cloroplastos, são consideradas os principais sítios de formação do radical superóxido
(EDREVA, 2005). Isto pode ser relacionado com as maiores atividades desta enzima nas
folhas quando comparadas com a das raízes (Figura 16). Costa et al. (2005) relataram indução
na atividade da SOD em genótipos de sorgo, tanto em folhas quanto em raízes, sugerindo que
esta enzima foi eficaz em atuar na remoção do radical superóxido. Em contraste, a atividade
da SOD permaneceu inalterada em folhas e decresceu em raízes de plantas de feijão-de-corda
sob estresse salino (CAVALCANTI et al., 2007), resultado que sugere que o estímulo na
atividade dessa enzima depende da espécie, bem como das condições experimentais
empregadas.
Em condições de salinidade, a atividade da peroxidase do ascorbato (APX) se manteve
superior à das plantas sob condições controle durante todo o período experimental, tanto em
folhas como em raízes (Figura 17A e C). Nas folhas, foram observados aumentos em
atividade da APX, em relação ao controle, de 35% aos 5 e 10 dias de estresse, e de 17% no
78
Figura 17. Atividade da peroxidase do ascorbato (APX) em folhas (A) e raízes (C) e da peroxidase do guaiacol (GPX) em folhas (B) e raízes (D) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
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A
C
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D
79
final do experimento (Figura 17A). Nas raízes, a atividade da APX em plantas sob salinidade
foi, em média, 12% superior àquela do controle (Figura 17C). A APX é uma das principais
enzimas responsáveis pela eliminação do peróxido de hidrogênio, utilizando o ascorbato
reduzido como doador de elétrons (MILLER et al., 2010). Tem sido observado um aumento
na atividade desta enzima em diversas condições de estresse em diferentes espécies vegetais.
Geralmente é atribuído a genótipos tolerantes uma maior atividade da APX sob estresse
(KOCA et al., 2007; BOR; OZDEMIR; TURKAN, 2003; MITTOVA et al., 2002; MAIA et
al., 2010). Recentemente, Gondim et al. (2012), trabalhando com plantas de milho pré-
tratadas com H2O2, observaram um aumento na atividade desta enzima em folhas quando as
plantas foram submetidas a estresse salino com 80 mM de NaCl, resultado que demonstra o
papel dessa enzima no processo de aclimatação das plantas de milho à salinidade.
A atividade da peroxidase do guaiacol (GPX), tanto em folhas quanto em raízes, se
mostrou crescente com o tempo de estresse, sendo maior nas plantas sob estresse salino em
relação àquelas do controle (Figura 17B e D). Nas folhas das plantas de sorgo sob estresse
salino, a atividade da GPX foi 33, 117 e 110% superior àquela do controle, respectivamente
aos 5, 10 e 15 dias de estresse (Figura 17B). Ressalte-se que, diferentemente da atividade da
APX nas folhas, que se mostrou crescente com o desenvolvimento, a atividade da GPX sob
condições controle praticamente não sofreu alteração. Nas raízes das plantas sob estresse
salino, a atividade dessa enzima foi 22, 62 e de 29% superior àquela do controle,
respectivamente aos 5, 10 e 15 dias de estresse (Figura 17D). Além disso, nas raízes, tanto em
condições controle como de estresse salino, a atividade dessa enzima foi, em termos
absolutos, superior àquela das folhas (em média, cerca de 6 vezes). A GPX, assim como a
APX, é responsável pela eliminação de H2O2 e o aumento em sua atividade tem sido
relacionado à tolerância das plantas à salinidade (GILL; TUTEJA, 2010). Vários trabalhos
80
têm demonstrado ocorrer aumento na atividade da GPX em resposta ao estresse salino
(AZEVEDO-NETO, et al., 2006; CAVALCANTI et al., 2007; GONDIM et al., 2012).
De acordo com Parida, Das e Mittra (2004), os aumentos nas atividades das enzimas
SOD, GPX e APX pelo estresse salino podem estar relacionados a um aumento na expressão
gênica ou a um aumento na atividade do pool de enzimas constitutivas presentes no tecido.
Contudo, neste trabalho, de modo geral não foi observado um aumento na concentração de
proteínas solúveis devido ao estresse nos tecidos de folhas e raízes (Figura 14B e D), o que
sugere que a ativação das enzimas constitutivas presentes nos tecidos deve ter sido a maior
responsável pelas alterações nas atividades observadas. No entanto, estudos de biologia
molecular, envolvendo a expressão gênica, são necessários para o real esclarecimento desta
questão.
A atividade da catalase (CAT) foi estudada em folhas e raízes, porém nesses últimos
tecidos não foram detectados níveis significativos dessa enzima. Nas folhas, a atividade da
CAT foi diminuída pela salinidade, sendo observadas reduções de 63 e 21%, respectivamente
aos 10 e 15 dias de estresse, em relação ao controle (Figura 18). A catalase é considerada a
principal removedora de peróxido de hidrogênio produzido na fotorrespiração, segundo
Mittler (2002). Mesmo essa enzima tendo diminuído sua atividade com a salinidade, em
termos absolutos, o valor de sua atividade nessa condição ainda foi cerca de 10 vezes maior
que a atividade da APX ou GPX nas folhas (Figura 17A e B), fato que destaca seu papel na
proteção antioxidativa, eliminando o H2O2. Alguns autores, comparando cultivares tolerantes
e sensíveis aos sais de Oryza sativa (VAIDYNATHAN et al., 2003), Morus alba
(SUDHAKAR; LASKSHMI; GIRIDARAKUMAR , 2001) e Triticum aestivum (SAIRAM;
RAO; SRIVASTAVA, 2002) observaram aumentos crescentes na atividade da CAT nos
cultivares tolerantes em resposta ao estresse salino. Por outro lado, semelhantemente ao
81
Figura 18. Atividade da catalase (CAT) em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
CA
T
( µm
ol g
-1 M
F)
0
100
200
300
400
82
observado neste trabalho, outros autores observaram reduções em atividade da CAT, como
por exemplo, em arroz (LEE; KIM; LEE, 2001; CARVALHO et al., 2011), algodão
(GOSSET; MILLHOLLON; LUCAS, 1994) e em girassol (SANTOS et al., 2001) sob
condições de estresse. Por outro lado, Gondim et al. (2012), trabalhando com plantas de milho
pré-tratadas com H2O2 submetidas à salinidade, também observou uma redução na atividade
dessa enzima, sendo os níveis de transcritos sob estresse salino inferiores aos do controle.
5.9. Mudanças nos teores de ascorbato e glutationa e estado redox
A salinidade aumentou os teores de ascorbato reduzido (ASA) nas folhas, em relação
ao controle, sendo observados valores 181, 116 e 78,8% maiores aos 5, 10 e 15 dias de
estresse, respectivamente (Figura 19A). O teor de ascorbato total [ASA + ascorbato oxidado
(DHA)] nas folhas das plantas sob salinidade foi aumentado em 136 e 59%, respectivamente
aos 5 e 10 dias de estresse, embora no último dia tenha apresentado valores próximos ao do
controle (Figura 19B). O H2O2 produzido pela atividade da SOD é reduzido à água pela
oxidação do ASA (produzindo DHA), em uma reação catalisada pela APX (ASADA, 2006).
Portanto, quando a capacidade de regeneração do ASA é limitada, como por exemplo, em
condições de estresse oxidativo induzido por sal, o pool de ASA nos tecidos pode ser
diminuído (CHAPARZADEH et al., 2004). Este, contudo, não foi o caso aqui observado, e os
aumentos observados pela salinidade nos teores de ASA (Figura 19A) sugerem um estímulo
na sua biossíntese e/ou inibição de seu catabolismo. Vários estudos mostram que a
aclimatação das plantas às condições de estresses abióticos pode estar relacionada com
aumentos no teor de ascorbato total (FAROUK, 2011; FOYER; NOCTOR, 2009). Em nosso
estudo, o teor em ascorbato total sob condições de estresse, foi maior, ou pelo menos igual,
ao das plantas sob condições controle (Figura 19B), resultado que pode ser interpretado como
83
Figura 19. Teores de ascorbato reduzido (A), total (B) e estado redox do ascorbato (C) em folhas de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Est
ado
redo
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asc
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to(%
)
0
10
20
30
40
Asc
orba
to to
tal
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-1 M
F)
0
6
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24
Asc
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to r
eduz
ido
( µm
ol g
-1 M
F)
0,0
1,2
2,4
3,6
4,8A
B
C
84
uma resposta de defesa da planta contra o possível estresse oxidativo induzido pela salinidade.
Mais importante do que o ascorbato total é a relação (ASA)/(ASA + DHA), que
representa o estado redox do ascorbato e depende de reações químicas que regeneram o ASA
no ciclo do ascorbato-glutationa (NOCTOR; FOYER, 1998). Nas folhas, o estado redox do
ascorbato foi maior nas plantas estressadas do que naquelas do controle, com aumentos de 19,
36 e 111% aos 5, 10 e 15 dias de estresse, respectivamente (Figura 19C). É importante
ressaltar que até os 5 dias de estresse houve uma redução no estado redox do ascorbato, tanto
nas plantas controle quanto naquelas sob estresse, podendo isso ser relacionado com os
aumentos na atividade da APX em ambos os tratamentos durante o mesmo período (Figura
17A). Já os aumentos subseqüentes no estado redox do ascorbato, observados aos 10 e 15 dias
de estresse nas folhas das plantas estressadas, indicam a ativação dos mecanismos de
regeneração do ASA pelo ciclo do ascorbato-glutationa. Nas raízes, não foi possível
determinar os teores de ascorbato total por problemas metodológicos, daí não ter sido possível
determinar o estado redox do ascorbato neste órgão.
Com relação à glutationa reduzida (GSH) nas folhas, a salinidade não alterou seus
teores em relação ao das plantas controle (Figura 20A). Além disso, a partir do 5º dia o teor
de GSH foi progressivamente reduzido até o final do período experimental, em ambos os
tratamentos. O teor de glutationa total [GSH+glutationa oxidada (GSSG)] nas folhas das
plantas controle permaneceu praticamente constante do 5º dia até o final do experimento
(Figura 20C). Contudo, quando as plantas foram submetidas ao estresse com NaCl a 75 mM,
o teor de glutationa foliar total aumentou, em relação ao controle, de 19 e 25%,
respectivamente, aos 5 e 10 dias de estresse, porém no final do experimento esse teor foi
reduzido em 22%. Nas folhas, o estado redox da glutationa, representado pela relação
(GSH)/(GSH + GSSG), se mostrou crescente até o 5º dia de estresse, quando a partir
daí decresceu até o final do experimento (Figura 20E). A salinidade afetou esse estado redox
85
Figura 20. Teores de glutationa reduzida, total e estado redox da glutationa em folhas (A, C e E) e raízes (B, D e F) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
Est
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glu
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Tempo (dias)
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Glu
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C D
Glu
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( µm
ol g
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F)
0
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16
24
32B
E D
86
somente aos 10 dias de estresse, causando uma redução de 31%, em relação ao controle.
Nas raízes das plantas sob estresse salino, o teor de GSH aos 5 dias de estresse foi
47% menor, em relação ao controle, porém no último dia de coleta, o teor desse antioxidante
foi 62% maior nas plantas estressadas com NaCl (Figura 20B). É importante destacar, que o
conteúdo de GSH nas raízes foi, em média, cerca de 59 e 37% menor do que nas folhas,
respectivamente, nas plantas controle e estressadas com NaCl (Figura 20A e B). Já o teor de
glutationa total nas raízes praticamente só foi alterado aos 15 dias de estresse, apresentando
uma redução de 38% em relação ao tratamento controle (Figura 20D).
Nas raízes, as diferenças entre os dois tratamentos foram bem mais acentuadas com
relação ao estado redox da glutationa que nas folhas (Figura 20F). Enquanto no 5º dia de
estresse salino o estado redox da glutationa foi reduzido em 52%, em relação ao controle, no
final do experimento a situação se inverteu e o estado redox da glutationa se mostrou 161%
maior (Figura 20F). O sistema redox da glutationa é essencial para impedir a oxidação e a
desnaturação de proteínas, além de modular a atividade de enzimas ativadas pela alteração de
seu estado redox, como algumas enzimas do estroma dos cloroplastos (BUCHANAN;
BALMER, 2005). Além de atuar diretamente na proteção oxidativa, reagindo com ROS, a
GSH é uma componente chave da via metabólica no ciclo ascorbato-glutationa, responsável
pela remoção do H2O2 e regeneração do pool de ASA (FOYER; NOCTOR, 2009). Gondim
(2012), analisando plantas de milho sob condições de estresse salino e pré-tratadas com H2O2,
observou aumentos nos teores de GSH em folhas e raízes, enquanto que os teores de
glutationa total em folhas não foram alterados pelo estresse. Ainda neste trabalho, o estado
redox foi aumentado nas folhas sob condições de estresse. Por outro lado, Bonifácio et al.
(2011) não observaram diferenças significativas nos teores de glutationa reduzida e no estado
redox da glutationa em folhas de plantas de arroz quando submetidas ao estresse salino.
87
5.10. Teores de peróxido de hidrogênio
Os teores de peróxido de hidrogênio (uma ROS) apresentaram alterações com a
salinidade, tanto em folhas quanto nas raízes (Figura 21). Nas folhas das plantas sob estresse,
foi observado um aumento de 14% nos teores dessa ROS aos 5 dias de estresse; no 10º dia foi
observado uma redução de 12% e no final do experimento os teores de H2O2 foram
praticamente iguais aos do controle (Figura 21A). Já em raízes, tanto nas plantas controle
como naquelas sob estresse salino, os teores de H2O2 se mostraram decrescentes até o 5º dia
do início dos tratamentos, quando a partir daí esses valores aumentaram até o final do
experimento, sendo 50% maior sob condições de estresse (Figura 21B). Bonifácio et al.
(2011), trabalhando com plantas de arroz, observaram um aumento na concentração de H2O2
em folhas, quando as plantas foram submetidas separadamente aos estresses salino e térmico.
Tal resultado foi discordante dos aqui apresentados em que os teores de H2O2 nas folhas
praticamente não foram alterados pela salinidade (Figura 21A). Essa manutenção nos níveis
de peróxido de hidrogênio foi concordante com o aumento de atividade das enzimas APX e
GPX nas folhas (Figura 17A e B). Além disso, o maior acúmulo de solutos orgânicos nas
folhas sob condições de estresse (Figura 13A e B; Figura 14A) pode também ter contribuído
para a manutenção dos níveis de H2O2, uma vez que a participação desses osmólitos na
proteção contra as ROS tem sido extensamente comprovada (ASHRAF; FOOLAD, 2007).
5.11. Peroxidação de lipídios
Os teores de malondialdeído (MDA), um produto da peroxidação dos lipídios foram
alterados pelo estresse salino, tanto em folhas quanto em raízes (Figura 22). Nas folhas das
plantas sob estresse, o teor de MDA aumentou até o 5º dia, quando se mostrou 92% superior
àquele das plantas controle; no entanto, a partir desse dia, o teor de MDA decresceu, porém
no último dia do período experimental foi 23% superior àquele das plantas controle, que, por
88
Figura 21. Teores de peróxido de hidrogênio (H2O2) em folhas (A) e raízes (B) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
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0
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F)
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0,5
0,6A
B
89
Figura 22. Teores de malondialdeído em folhas (A) e raízes (B) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
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Mal
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Mal
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18
24A
B
90
sua vez, pouco variaram durante o período experimental (Figura 22A). Já nas raízes, os teores
de MDA nas plantas de ambos os tratamentos pouco variaram até o 10º dia do início dos
tratamentos, porém no 15º dia, o teor de MDA nas plantas estressadas foi 20% inferior àquele
das plantas controle (Figura 22B).
A produção de MDA, em decorrência da peroxidação de lipídeos, tem sido utilizada
como indicativo dos danos oxidativos sofridos pelos tecidos vegetais (AZEVEDO NETO et
al., 2006; GONDIM et al., 2012; PARIDA; DAS, 2005). Assim, tem sido mostrado por
alguns autores um aumento na concentração de MDA, principalmente em genótipos sensíveis
(AZEVEDO NETO et al., 2006; FAROUK, 2011), indicando uma menor proteção destes
cultivares contra os danos oxidativos causados pelo estresse salino. Nas folhas, apesar do
estresse salino ter causado um grande aumento no teor de MDA no início do tratamento de
estresse salino, no final do período experimental esse aumento foi sensivelmente menor
(Figura 22A). É possível que os aumentos em atividades das enzimas SOD, APX e GPX, nas
folhas das plantas sob estresse, observados durante todo o período experimental (Figuras 17 e
18), sejam, pelo menos em parte, responsáveis pela redução dos danos oxidativos gerados
pelo estresse salino. Por outro lado, nas raízes, o fato da salinidade pouco ter afetado os níveis
de peroxidação de lipídios (Figura 22B), indica que o genótipo de sorgo CSF 18 aqui
estudado e considerado sensível aos sais (LACERDA et al., 2003b), possui um mecanismo de
eliminação de ROS relativamente eficiente. Assim, os resultados aqui observados sugerem
que o sistema enzimático antioxidativo da espécie em estudo tenha participado nessa proteção
contra os danos oxidativos nas membranas durante o estresse salino.
5.12. Atividade ribonucleásica
A atividade da ribonuclease (RNase) em plantas de sorgo submetidas à salinidade
foi aumentada em todos os órgãos analisados e em todos os tempos de coleta (Figura 23). Nas
91
Figura 23. Atividade da ribonuclease em folhas (A), colmos + bainha (B) e raízes (C) de plantas de sorgo forrageiro (genótipo CSF 18) crescidas em solução nutritiva de Hoagland 1:2 (controle - ) ou solução nutritiva contendo NaCl a 75 mM (estresse salino - ), em função do tempo de estresse. As barras representam o erro padrão.
Tempo (dias)
0 5 10 15
UA
g-1
MF
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0
2600
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7800
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A
B
C
92
folhas das plantas sob estresse, os aumentos na atividade RNásica, em relação ao controle,
foram crescentes e com valores de 93, 156 e 177%, aos 5, 10 e 15 dias de estresse,
respectivamente (Figura 23A), enquanto nos colmos + bainha, os aumentos em atividade
dessa enzima foram de 102, 113 e 72%, respectivamente, aos 5, 10 e 15 dias de estresse. Nas
raízes, foram observados aumentos de 137, 25 e 160%, aos 5, 10 e 15 dias de estresse,
respectivamente, em relação ao controle (Figura 23C).
Os resultados observados neste trabalho, sobre os efeitos da salinidade na atividade da
RNase, durante a fase de crescimento vegetativo, foram diferentes dos encontrados por
Gomes-filho, Enéas-Filho e Prisco (1996), em Vigna unguiculata, durante a fase de
estabelecimento da plântula (3 a 9 dias após a semeadura), que observaram decréscimos na
atividade dessa enzima em folhas, caules e raízes. É possível que esse resultado contrastante
seja devido ao fato de tratar-se de espécies diferentes, no caso uma dicotiledônea (V.
unguiculata) e uma monocotiledônea (S. bicolor). Também, podem ser devidos aos diferentes
estádios de desenvolvimento em que as plantas se encontravam, bem como às diferentes
condições experimentais empregadas. Por outro lado, nossos resultados foram parcialmente
concordantes com os observados por Oliveira (2011), trabalhando com o genótipo de sorgo
CSF 20, que é mais tolerante aos sais que o genótipo aqui estudado (LACERDA et al.,
2003a), sendo constatado que a atividade da RNase nas folhas aumentou com a salinidade,
porém diminuiu nas raízes. Ressalte-se que o estudo de Oliveira (2011) foi realizado com
plantas de sorgo submetidas a diferentes doses de NaCl, porém a análise foi feita apenas em
um tempo de coleta (20 dias de estresse) e não com coletas em diferentes tempos de estresse.
Embora o verdadeiro papel da RNase em plantas sob condições de estresse salino ainda não
tenha sido esclarecido, Gomes-Filho et al. (2008) observaram tratar-se de uma proteína com
massa molecular de 16 kDa, que, possivelmente, seja um membro da família das proteínas
relacionadas à patogênese (PR), especificamente uma PR 10.
93
6. CONCLUSÕES
• A salinidade reduziu o crescimento das plantas de sorgo, sendo esse efeito mais
acentuado com o aumento do tempo de estresse, tendo a parte aérea se mostrado mais
sensível aos sais do que as raízes;
• Nos órgãos estudados das plantas de sorgo (folhas, colmos + bainha e raízes) o teor de
água foi pouco afetado pela salinidade, enquanto a suculência foliar foi aumentada;
• A fotossíntese líquida foi afetada negativamente pela salinidade, provavelmente,
devido à inibição na sua fase bioquímica, enquanto os outros parâmetros de trocas
gasosas e a fluorescência da clorofila praticamente não foram afetados pelo sal;
• O estresse salino aumentou os teores dos íons tóxicos Na+ e Cl- e reduziu bastante os
teores de K+, resultando em menores relações K+/Na+ nos três órgãos estudados,
prejudiciais ao metabolismo;
• De modo geral, os solutos orgânicos, prolina, carboidratos solúveis, N-aminossolúveis
e putrescina, tiveram seus teores aumentados pela salinidade, especialmente nas
folhas, e isso deve ter contribuído para minorar os efeitos da salinidade nas relações
hídricas da planta e/ou na proteção oxidativa;
• O estresse salino causou aumentos nas atividades das enzimas antioxidativas,
superóxido dismutase, peroxidase do ascorbato e peroxidase do guaicol, e no estado
redox do ascorbato, especialmente nas folhas, podendo isso ter sido responsável, pelo
menos em parte, pela manutenção dos níveis de H2O2 e da peroxidação dos lipídeos,
principalmente aos 10 e 15 dias de estresse, tanto nas folhas como nas raízes;
• A catalase, embora não tenha sido detectada nas raízes, foi a principal removedora de
H2O2 nas folhas, podendo também ter contribuído na proteção contra os danos
oxidativos desde que sua atividade foi próxima àquela do controle no maior tempo de
estresse;
94
• A atividade da RNase nos órgãos estudados foi aumentada em condições de
salinidade, porém esse aumento não se relacionou com os níveis de proteína solúveis,
que pouco foram alterados pela salinidade. O verdadeiro papel dessa enzima nas
plantas sob condições de estresse permanece por ser esclarecido.
95
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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