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INDICAÇÕES GERAIS ............................................................................................................ 3

ASSIDUÍDADE MÍNIMA OBRIGATÓRIA: ......................................................................... 6

CRONOGRAMA:.................................................................................................................. 6

AVALIAÇÃO DA COMPONENTE LABORATORIAL ............................................................. 7

ELABORAÇÃO DE RELATÓRIOS:......................................................................................... 8

1. Digestão de carbohidratos, proteínas e gorduras.............................................................. 11

1.A - Digestão do amido pela amilase salivar.................................................................... 12

1.B - Digestão da albumina do ovo pela pepsina............................................................... 17

1.C - Digestão de lípidos pela acção da pancreatina e da bilis......................................... 20

2. Doseamento da glucose em plasma humano...................................................................... 23

3. Quantificação do colesterol total e do colesterol HDL...................................................... 27

3. A - Determinação de colesterol total: ............................................................................ 34

3. B - Determinação de colesterol HDL:............................................................................ 35

4. Análise de hormonas esteróides por T.L.C. ....................................................................... 36

5. ESTUDO HEMATOLÓGICO............................................................................................. 40

Obtenção de amostras de sangue e anticoagulantes: ........................................................ 42

Técnica de colheita de sangue capilar: ........................................................................... 42

Anticoagulantes: ............................................................................................................. 44

5. A – Contagem de eritrócitos e de leucócitos:................................................................. 47

Câmara de Neubauer modificada: .................................................................................. 47

Pipetas diluidoras de Thoma: ......................................................................................... 50

Líquido diluidor:............................................................................................................. 51

Tubo de borracha: ........................................................................................................... 51

5. B - Determinação da concentração em hemoglobina .................................................... 55

5. C - Determinação do tempo de prótrombina.................................................................. 59

5.D - Determinação do grupo sanguíneo ........................................................................... 63

Bibliografia: ........................................................................................................................... 66

ANEXO ................................................................................................................................... 67

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Maria Gil Ribeiro (Profª. Drª) – teóricas (regente da disciplina)

Gisela Oliveira (Engª) – práticas laboratoriais (turmas BUQ, CKL e CNJ)

Pedro Silva (Prof. Dr.) – práticas laboratoriais (turmas BUP, BUR e CKK)

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Para que os objectivos do trabalho sejam atingidos e a segurança no laboratório mantida, as

instruções quanto à execução do protocolo experimental devem ser estudadas previamente e

o aluno entender o que vai efectuar por forma a planear o tempo de um determinado trabalho

e a saber actuar de imediato caso seja confrontado com alguma contrariedade. Deve-se

trabalhar sem pressa, com método e cuidado para evitar acidentes e danificar o material do

laboratório que é geralmente bastante caro.

Relembram-se, a seguir, alguns dos cuidados a ter no laboratório:

Proibido fumar no laboratório e na zona de acesso imediato.

Proibido comer ou beber dentro do laboratório.

Proibido correr, gritar ou comportar-se de outros modos incorrectos.

Usar o máximo de cuidado se necessitar de ligar à corrente equipamentos

eléctricos. Verifique que tem as mãos perfeitamente secas e que a tomada e a ficha

também estão secos.

Vigiar placas de aquecimento e banhos térmicos que estejam ligados, para evitar

o seu excessivo ou desnecessário aquecimento.

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Nunca testar se uma superfície ou um objecto estão quentes com as próprias

mãos. Usar um termómetro ou um borrifo de água.

Nunca efectuar pipetagens com a boca mesmo que seja de água. Usar os

pipetadores adequados.

Ter conhecimento prévio da toxicidade, poder corrosivo e inflamabilidade dos

reagentes com que vai trabalhar (em caso de dúvida perguntar).

Não abrir recipientes de reagentes para cheirar ou espreitar. Alguns possuem

vapores tóxicos e / corrosivos.

Não misturar reagentes ou soluções que não estejam indicadas no protocolo

laboratorial ou que não tenha conhecimento prévio da sua compatibilidade.

Algumas substâncias são incompatíveis com outras e reagem violentamente quando

misturadas.

Limpar imediatamente reagentes que tenham sido derramados. Use toalhetes de

papel para evitar alastrar o derrame.

Não abandone nem pouse directamente em cima da bancada, pedaços de

algodão, lancetas, tubos ou outros objectos eventualmente contaminados com

sangue ou outros fluídos fisiológicos.

Utilize os contentores de resíduos perigosos para descartar objectos cortantes,

perfurantes, algodões, luvas, tubos e outros objectos descartáveis que possam estar

contaminados. Nunca misturar com outro tipo de resíduos.

Após utilização, colocar imediatamente o material de vidro não descartável e

contaminado com sangue em recipientes contendo detergente desinfectante. Não

misturar com o restante material de vidro.

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Pergunte ao docente responsável pela aula qual deverá ser o procedimento

correcto para a eliminação dos restos de soluções e reagentes após ter terminado o

seu trabalho experimental.

Não verter restos de soluções nas pias, sem perguntar; quando tiver de deitar

reagentes líquidos na canalização, ponha água a correr.

Não deitar pontas de pipetas ou outros objectos sólidos na canalização.

Despejar os resíduos sólidos e colocar o material de vidro (pipetas) e plástico

(pontas, cuvettes), nos locais apropriados.

No final do trabalho, colocar o material de vidro utilizado na bancada de

lavagem, deixar a bancada limpa, as torneiras fechadas e os equipamentos e

aparelhos desligados, a não ser que tenha indicações expressas do contrário.

É obrigatório usar bata branca. A bata é um Equipamento de Protecção Pessoal

(EPI) e deverá ter o tamanho adequado para proteger o indivíduo e as roupas em

caso de salpicos ou derrames.

A utilização de óculos de protecção é aconselhada pois este é também um EPI

fundamental em caso de salpicos que poderão ter consequências graves caso a

substância seja corrosiva ou tóxica. Em todos os laboratórios existem sistemas lava-

olhos mas que nalguns casos não são suficientes para impedir danos irreversíveis

(queimaduras) nos olhos.

As regras de segurança aqui descritas deverão ser cumpridas rigorosamente de modo a

garantir a segurança de todos os utilizadores do laboratório. Em caso de dúvida será sempre

preferível perguntar do que arriscar.

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Conforme consta no regulamento pedagógico da Faculdade de Ciências da Saúde, desta

universidade, os alunos são obrigados a frequentar 80% das aulas laboratoriais, ou seja,

comparecer a 11 aulas completas. O aluno que não complete a frequência mínima obrigatória

é considerado reprovado à disciplina, não podendo sequer realizar o exame de recurso no

final do semestre.

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Trabalho Turmas 5ª

feira

Turmas 6ª

feira

Apresentação, introdução aos trabalhos

experimentais 30 / 10 31 / 10

1A e 1B - Digestão de carbohidratos e

proteínas 6 /11 7 /11

1 C – Digestão de lípidos 13 / 11 14 / 11

2 – Doseamento de glicose 20 / 11 21 / 11

3 – Quantificação de colesterol 27 / 11 28 / 11

4 – Análise de hormonas esteróides 4 / 12 5 / 12

Introdução ao estudo hematológico (TP) 11 / 12 12 / 12

5 A – Contagem de glóbulos sanguíneos 18 / 12 19 / 12

5 B- Doseamento da hemoglobina 8 / 01 9 / 01

5 C – Tempo de pró-trombina 15 / 01 16 / 01

5 D – Análise ao grupo sanguíneo 22 / 01 23 / 01

Aula suplementar de compensação / dúvidas 29 / 01 30 / 01

Teste de avaliação teórico - prático 5 / 02 6 / 02

Aula suplementar de compensação* - apenas para alunos com faltas justificadas.

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* A aula suplementar destina-se à repetição dos trabalhos já realizados, no caso em que tenha

havido falha técnica ou humana e, ainda, permitir aos alunos compensar uma aula que

tenham perdido por motivos de força maior.

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A avaliação da componente laboratorial é feita de modo contínuo durante as aulas e pelas

notas obtidas nos relatórios e no teste de avaliação teórico-prático realizado no final do

semestre.

O aluno só pode ser admitido a exame teórico se tiver nota da componente laboratorial igual

ou superior a 10 valores. Conforme previsto no regulamento pedagógico da Faculdade de

Ciências da Saúde, e um aluno exceder 20% de faltas nas aulas laboratoriais, reprova à parte

laboratorial e consequentemente fica também reprovado à disciplina não podendo ser

admitido a exame teórico em nenhuma época. Automaticamente terá que se inscrever à

disciplina no ano seguinte.

Se o aluno tiver aprovação na componente laboratorial e contudo reprovar na avaliação

teórica, no ano seguinte só poderá repetir a componente teórica da disciplina. A nota obtida

na componente prática não é susceptível de ser melhorada e mantém-se válida durante dois

anos lectivos, após o aluno ter frequentado a disciplina.

Os alunos devem apresentar dois relatórios completos relativos aos trabalhos 3 –

Quantificação de colesterol total e HDL e 5 A – Contagem de glóbulos sanguíneos. A

data limite para entrega do trabalho 3 é o dia 11 de Dezembro e para o trabalho 5 A, o dia 15

de Janeiro.

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Os relatórios serão obrigatoriamente originais e todos os elementos do grupo que estiveram

presentes na aula devem participar activamente na sua elaboração. Os relatórios contendo

partes copiadas de relatórios de outros colegas serão fortemente penalizados e os relatórios

integralmente copiados não serão corrigidos nem considerados para avaliação.

Para os restantes trabalhos, os alunos devem entregar os resultados experimentais e a

respectiva ficha no final de cada aula. Esta ficha deve ser assinada por todos os elementos do

grupo presentes nessa aula. De igual modo, é suficiente a entrega de uma ficha de resultados

por grupo e por trabalho.

Cada relatório não entregue é contabilizada como zero no cálculo da nota laboratorial e os

atrasos superiores a uma semana relativamente ás datas de entrega estipuladas são

penalizados em 25% da classificação (o que é equivalente a restringir a escala de

classificação de zero a quinze valores).

Em termos de resultado numérico, a classificação da componente laboratorial é calculada da

seguinte forma:

35% (nota do relatório do trabalho 3) + 35% (nota do relatório do trabalho 5A) + 30% (nota

obtida no teste de avaliação teórico-prático) = 100%.

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Os relatórios deverão ser sintéticos, bem estruturados e a linguagem utilizada deverá ser

simples e directa. Um relatório deve traduzir o trabalho experimental efectuado, os

resultados obtidos e a sua interpretação. Geralmente considera-se que as secções que

compõem um relatório completo são as seguintes:

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O título do trabalho deve ser curto e informativo. Nesta página deve incluír-se o nome dos

alunos que efectuaram o trabalho experimental assim como o relatório e as datas de execução

do trabalho e de entrega do relatório.

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Na introdução deve ser mencionado o problema e a área de conhecimento em que ele se

insere, a importância do trabalho e também o seu objectivo. O texto deve ser relativamente

curto (uma página no máximo). A introdução deve ser informativa na sua globalidade e não

resumir-se a parágrafos desconexos copiados dos livros consultados. Exprimir-se por

palavras próprias é imperativo.

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Esta é uma das secções mais importantes num relatório científico pois a descrição do método

experimental permite a outras pessoas reproduzir a experiência efectuada. Contudo, em

relatórios de aulas, em que o destinatário final (e por vezes o único) é o docente que conhece

perfeitamente o trabalho, a transcrição do protocolo experimental é um desperdício de

tempo, por isso, devem mencionar-se apenas as alterações efectuadas ao procedimento

experimental ou outra informação relevante que não conste no protocolo.

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Esta secção é bastante valorizada na avaliação do relatório e deve incluir todos os resultados

obtidos com descrição das observações e medições efectuadas, tanto quanto possível sob a

forma de figuras, gráficos, tabelas ou registos. As tabelas, gráficos ou figuras devem estar

devidamente identificadas e os gráficos e figuras podem ter legendas. Uma legenda completa

inclui um título destacado e uma descrição sumária dos pormenores da experiência cujos

resultados nela são apresentados. A informação não deve ser repetida, ou seja, resultados

apresentados na forma de tabela não deverão depois ser repetidos na forma gráfica.

Os resultados devem ser apresentados em alíneas separadas, a não ser que se tratem de

resultados afins. Nos resultados numéricos deve ter-se em atenção os algarismos

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significativos e as dimensões das grandezas - deve optar-se sempre pelas unidades do

Sistema Internacional.

Os cálculos extensos e pormenorizados devem ser remetidos para o final do relatório na

forma de anexo, de modo a não tornar o corpo do relatório denso.

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Tal como as restantes partes do relatório, esta secção deve ser escrita com a maior clareza e

objectividade, de modo que o leitor possa distinguir entre as conclusões do trabalho e as

apreciações críticas resultantes da comparação dos dados experimentais com os resultados

teoricamente previsíveis. Esta é a secção mais importante do relatório. A discussão deverá

também incluir as conclusões do trabalho experimental e descrever a ocorrência, se for o

caso, de determinados erros ou desvios que possam ter afectado os resultados obtidos.

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Consiste na listagem, por ordem alfabética de autores ou pela ordem de citação no texto, de

artigos, livros, revistas ou sites consultados para a realização do trabalho. Não existe apenas

uma única forma válida de apresentar a bibliografia: algumas pessoas preferem indicar em

primeiro lugar o nome dos autores (é a situação mais vulgar), mas por vezes surgem

referências bibliográficas apresentadas por ano ou até pelo título do trabalho. Em várias

situações poderá também ser útil listar as referências por ordem numérica conforme são

citadas no texto. Contudo, deve-se ter o cuidado de ser coerente no modo de apresentação é

essencial manter-se o estilo na escrita de um trabalho.

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A nutrição é definida como um conjunto de fenómenos físico-químicos e fisiológicos que

ocorrem no interior do organismo e mediante os quais este recebe e utiliza os materiais

fornecidos pelos alimentos, que lhe são necessários para a formação e manutenção da sua

matéria viva e para a realização das actividades, próprias quer da vida vegetativa, quer da

vida de relação e trabalho. No conceito anglo-saxónico, nutrição é o estudo dos nutrientes

contidos nos alimentos, desde que são ingeridos até que os produtos finais do seu

metabolismo são excretados. Assim, inclui os processos de digestão e absorção, as reacções

catabólicas e anabólicas e o estudo das necessidades de nutrição para todos os segmentos do

organismo da pessoa saudável.

Os alimentos ingeridos são normalmente biopolímeros: proteínas, carbohidratos e gorduras.

O conjunto de acções sofridas pelos alimentos no tubo digestivo, desde a boca, que levam à

desagregação dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas em partículas

suficientemente pequenas para passarem a parede intestinal e entrarem na circulação, este

processo corresponde à digestão.

O tubo digestivo pode ser visualizado como uma “linha de desmontagem” que os alimentos

percorrem devido aos movimentos peristálticos e contracções musculares, e onde são

simultaneamente decompostos por acção de enzimas hidrolíticas e outras substâncias

excretadas pelas células epiteliais e diversos órgãos glandulares.

Os sistemas complexos de que dispõem o aparelho digestivo do homem para separar os

alimentos nos seus nutrientes (que serão, posteriormente, absorvidos), assentam num

processo básico, que consiste na actualização de enzimas desagregadoras das grandes

moléculas dos constituintes alimentares, sendo os hidratos de carbono convertidos em

glicose e outros açucares simples (6 átomos de carbono), as gorduras em ácidos gordos e

glicerol e as proteínas em aminoácidos. As enzimas estão contidas nos sucos digestivos da

boca, estômago e intestino e são produzidas por glândulas específicas, controladas pelos

sistemas nervoso e endócrino.

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As bactérias da parte terminal do intestino podem desempenhar algum papel na digestão de

certos alimentos, em especial dos constituintes do tipo da celulose, ou fibra, que, resistindo

às enzimas digestivas, podem sofrer modificações por acção das celulases bacterianas.

Normalmente, mais de 90% dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas que

formam os alimentos são completamente digeridos e absorvidos, mas os ácidos gordos e os

aminoácidos essenciais são absorvidos em mais de 98%.

Em fisiologia, a absorção é a penetração de uma substância através das mucosas ou da pele

ou da membrana celular para o meio interno do organismo ou para o protoplasma celular.

Em nutrição, a absorção corresponde à passagem através da mucosa do tubo digestivo dos

nutrientes que fazem parte da constituição dos alimentos e atingem a corrente sanguínea. A

absorção faz-se, principalmente, ao nível do intestino delgado e do cólon, de forma selectiva

para cada um dos nutrientes. Os processos fisiológicos da absorção são para certos nutrientes

mecanismos simples, como a osmose, mas na generalidade envolvem reacções complexas de

passagem para o interior das células da mucosa e, posteriormente, do meio interno destas

para os capilares sanguíneos ou linfáticos. Nestas reacções, muito delas ainda mal

conhecidas, intervêm iões e moléculas ionizadas, enzimas e hormonas.

Com este trabalho experimental pretende-se evidenciar a função das enzimas amilase salivar,

pepsina e lipase pancreática na digestão de alguns alimentos. A actividade ou capacidade

digestiva destas enzimas pode ser verificada in vitro medindo o desaparecimento de

substractos e o aparecimento dos produtos resultantes. Os resultados obtidos podem ser

relacionados com patologias derivadas perturbações genéticas específicas, que condicionam

anomalias metabólicas.

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A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode utilizar

directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo. Desta forma, os

alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a ruptura de parte das suas

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estruturas e, posteriormente, serem decompostos em moléculas suficientemente pequenas

para passarem a mucosa da parede intestinal e atingirem a corrente sanguínea.

A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas operações

prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão.

Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e complexos, que

começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da digestão enzimática, em

resultado dos movimentos de mastigação e pela acção múltipla da saliva. Esta actua pela sua

qualidade de líquido humidificante, lubrificante e como veículo da enzima amilase e de

elementos minerais.

A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de 99,5% de

água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai libertando dos

alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos polissacarídeos que são sensíveis à sua

acção.

A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é indispensável,

desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente apercebermos o sabor adocicado.

Mas este efeito não tem significado relevante em digestão porque é de curta duração, e cessa

quando o bolo entra em contacto com o suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo

no desdobramento dos polissacarídeos.

No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de consistência

cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a acção de enzimas

pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da amilase salivar) e intestinais

segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e de Lieberkuhn (dissacaridases:

sacarase, lactase, maltase e isomaltase).

Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas indicadas, sendo

quatro particularmente importantes:

Maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose.

Maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e 25% da maltose.

Possui uma rápida actividade.

Maltase II e maltase III: dissociam os restantes 25% de maltose.

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No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas hidrolases

sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do intestino, como a

hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de fermentações gasosas, podem

produzir alguma glicose.

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O amido é a forma de reserva glucídica nos vegetais. Encontra-se em geral na forma de grãos

de amido cuja morfologia só varia de acordo com a espécie vegetal. Na maior parte dos casos

é formado por dois constituintes:

� amilose, um poli-holósido de cadeias lineares, formada de unidades de D-glucose ligadas

entre si por ligações α-1,4-glicosídicas. Admite-se hoje, graças ao estudo dos espectros de

raios-X, que a cadeia está disposta em hélice com 6

anéis glucopiranósicos, de configuração em

cadeira, em cada volta. Esta estrutura explica a cor

azul obtida com o iodo: as moléculas de halogéneo

dispor-se-ão ao longo do eixo da hélice sob a forma

de um complexo iodo-amilose devido a forças

dipolares electrostáticas. Esta propriedade

desaparece pela fragmentação da molécula de

amilose, na hidrólise.

� amilopectina, um polissacarídeo cuja massa molecular pode atingir muitos milhões e é

formado de cadeias principais idênticas às da amilose, mas sobre as quais vêm ligar-se,

através de ligações α-1,6-glicosídicas, as cadeias laterais que apresentam estrutura idêntica à

das cadeias principais e cujo comprimento varia de 20 a 25 resíduos de glucose.

Figura 2. Estrutura química da amilose.

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O processo de digestão inicia-se na boca, por acção da saliva, que contém amilase salivar,

uma enzima que degrada o amido em açúcares redutores, principalmente a maltose.

A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está envolvida

numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um produto

intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais como o amido e o

glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de D-glucose através de uma ligação α-

1,4-glicosídica.

A função aldeídica ou cetónica dos açúcares é susceptível de ser oxidada; as aldoses e

cetoses vão, portanto, comportar-se como redutores e, em particular, vão poder reduzir os

sais metálicos, em solução alcalina, até ao estado de metal ou até ao grau de oxidação

inferior. Um dos reagentes mais utilizados para detectar a presença de açúcares redutores e

para os dosear consiste num sal cúprico (Cu2+). O processo de oxidação das oses ocorre com

a redução do hidróxido cúprico, em meio alcalino, de cor azul e solúvel, em hidróxido

cuproso, amarelo e insolúvel. Pelo aquecimento à fervura, este desidrata-se e converte-se em

óxido cuproso, dando origem a um precipitado vermelho-tijolo:

açúcar reduzido + 2 Cu(OH)2 açúcar oxidado + 2 CuOH (s) + H2O

2 CuOH Cu2O ↓ + H2O

Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um grupo

aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico susceptível de

fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da solução se desloca em função

da própria reacção.

Figura 1. Estrutura química da maltose.

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Material:

Estufa a 37ºC para incubação de amostras

Placa de aquecimento com banho-maria a 100ºC

Tubos de ensaio em vidro, cap. 10 ml

Suporte para tubos de ensaio

Molas para tubos de ensaio

Pipetas volumétricas de 3 ml, 4 ml, 5 ml

Pipetas de pasteur

Vortex

Pipetador

Cronómetro

Soluções: (encontram-se já preparadas):

Solução de amido: dissolver 1g de amido em 100 ml de H2O destilada com

aquecimento.

Lugol: dissolver 1g de iodo e 2g de iodeto de potássio em 300 ml de água.

Reagente de Benedict: Dissolver 5g de carbonato de calcio; 8,5g de citrato de sódio e

0,85g de sulfato de cobre em 500 ml de H2O.

Saliva ou solução de α-amilase (tipo VI-B) diluída de modo a ficar 300 unidades/ml

(equivalente à saliva).

Procedimento:

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� Identificar 4 tubos de ensaio (A1; A2; A3 e A4).

� Adicionar a 1 deles 3,0 ml de H2O destilada.

� Colocar nos restantes 3,0 ml de saliva ou solução de α- amilase.

� Ferver em banho de água o tubo A4 durante 3 min e deixar arrefecer.

� Adicionar (na hotte) 3 gotas de HCl concentrado ao tubo A3 e agitar.

� Adicionar a cada um dos 4 tubos 5.0 ml de solução de amido e agitar no vórtex.

� Incubar na estufa a 37 °C durante uma hora.

� Identificar mais 4 tubos de ensaio como B1; B2; B3 e B4;

� Transferir metade do volume existente no tubo A1 (ou seja 4 ml), para o tubo B1.

Repetir o procedimento para os outros tubos.

� Ao conjunto dos tubos A adicionar 3 gotas de solução de Lugol e observar o

resultado.

� À serie de tubos B adicionar 5.0 ml de reagente de Benedict e colocar em banho de

água a ferver durante 2 min. Retirar os tubos do banho e observar.

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As proteínas dos alimentos, quer de origem animal, quer de origem vegetal, só começam a

ser digeridas no estômago, e a sua decomposição (até que sejam libertados os aminoácidos

que as constituem), prossegue no intestino, onde se passam as fases principais.

No estômago, as substâncias quimicamente activas são o ácido clorídrico, o pepsinogénio e a

quimosina (ou renina). As acções do ácido clorídrico consistem principalmente na

acidificação do meio gástrico e no seu efeito hidrolítico. O HCl activa, igualmente, o

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pepsinogénio, transformando-o em pepsina, destrói os micróbios que possam estar presentes

nos alimentos e, ao atingir o duodeno, desencadeia diversos mecanismos essenciais para a

digestão das proteínas, nomeadamente as secreções pancreática e intestinal.

A desnaturação das proteínas pelo HCl, em resultado da destruição das ligações de

hidrogénio condicionadoras da estrutura terciária, que desaparece, facilita as acções das

enzimas proteolíticas.

A digestão das proteínas é iniciada no estômago pela pepsina, que tem origem nas células

principais sob a forma de fermento inactivo - o pepsinogénio. A activação da pepsina é

desencadeada, no pH adequado, por moléculas de outro pepsinogénio que desdobram o

pepsinogénio inactivo, seguindo-se a acção da pepsina activa que, por autocatálise, activa

novas moléculas de pepsinogénio.

A pepsina transforma as proteínas desnaturadas pelo ácido clorídrico em proteoses e estas em

peptonas, que são ainda polipeptídeos de elevado peso molecular, mas solúveis em solução

aquosa. Hidrolisa as ligações peptídicas, dentro da estrutura dos polipetídeos, pelo que se

trata de uma endopeptidase, actuando, preferencialmente nas ligações formadas pelos

aminoácidos dicarboxílicos e aromáticos.

No intestino, as proteínas e petídeos oriundos do estômago são atacados pelas enzimas do

suco pancreático, designadamente, a tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase.

As proteases pancreáticas libertam pequenos peptídeos com 2, 3 ou 4 aminoácidos e alguns

aminoácidos, sobretudo tirosina e triptofano.

O suco intestinal segrega várias enzimas, com acção sobre os derivados das proteínas

libertados anteriormente, incluindo a enteroquinase, activadora da tripsina.

Na parte final do intestino, no cólon esquerdo, alguns compostos azotados podem ser

substracto de acções bacterianas de putrefacção, com libertação de aminas de cheiro

característico, que são bases provenientes da descarboxilação de aminoácidos, como a

alanina, a tirosina e histidina.

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Material:

Bisturi

Tubos de ensaio de vidro de 15 ml

Congelador

Banho ou estufa a 37°C

Suporte para tubos de ensaio

Microespátula

Cronómetro

Vórtex

Pipetador

Pipetas volumétricas de 5 ml

Reagentes (encontram-se já preparadas):

Ovo cozido

Esguicho com H2O destilada

HCl concentrado (2M)

NaOH 10 M

Solução de pepsina (5g em 100 ml)

Procedimento:

� Colocar 1 microespátula de clara de ovo cozido previamente triturada em cada

tubo de ensaio

� Identificar os tubos com P1, P2, P3, P4 e P5

� Adicionar 1 gota de H2O ao tubo P1

� Adicionar 1 gota de HCl 2M aos tubos P2, P3, P4

� Adicionar 1 gota de NaOH 10 M ao tubo P5

� Adicionar 5,0 ml de solução de pepsina a cada um dos tubos e agitar.

� Colocar o tubo P3 no congelador durante 1 hora.

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� Colocar os restantes tubos na estufa a 37°C durante 1 hora.

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Na boca, as acções mecânicas e de ensalivação dos alimentos são predominantes, não

havendo para as gorduras modificações de ordem digestiva. Julga-se que na criança seja

segregada pequena quantidade de lípase, activada pelo leite materno.

No estômago, tem sido verificada a existência de uma lípase gástrica muito fracamente

activa, que na criança também seria activada pelo leite. Os lípidos são, desta forma, pouco

modificados no estômago, apenas se iniciando a sua emulsão pelos movimentos de agitação

do conteúdo gástrico que vai sendo evacuado para o intestino, com demora proporcional à

natureza dos constituintes dos alimentos em digestão.

Os lípidos desencadeiam a secreção das hormonas enterogastronas pela parede duodenal, as

quais inibem a motilidade e a evacuação gástricas.

O pâncreas produz um conjunto de enzimas vulgarmente designado por suco pancreático.

Este contém a lipase pancreática, uma enzima que degrada os lípidos emulsionados com os

sais da bílis em ácidos gordos e glicerol. O suco pancreático e a bílis são ambos

descarregados no duodeno.

No duodeno, a chegada do quimo ácido desencadeia as secreções pancreática, biliar e

intestinal, pelo contacto directo com a mucosa, que têm a função de neutralizar o quimo.

O desencadeamento da secreção pancreática é essencialmente hormonal, e devido, em

primeiro lugar, à secretina, que provoca a secreção de um volume abundante de suco

pancreático rico em iões bicarbonato que neutraliza a acidez do quimo, e em segundo lugar, à

colecistoquinina (CCK), a qual actua na seceção das enzimas pancreáticas.

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A secreção externa do pâncreas contem enzimas activas para todos os alimentos,

aumentando a quantidade de cada um deles, proporcionalmente ao uso no regime alimentar

de hidratos de carbono, gorduras e proteínas.

A lípase pancreática hidrolisa as gorduras neutras (triglicerídeos) em ácidos gordos e

glicerol, mas esta acção não leva sempre à separação completa, encontrando-se mono- e

diglicerídeos.

A bílis é enviada para a vesícula onde é concentrada e armazenada. O desencadeamento da

excreção biliar, para a secreção da bílis da vesícula, é efectuado intermitentemente pelas

gorduras chegadas ao duodeno, sendo a contracção da vesícula biliar estimulada pela

hormona CCK.

A bílis é segregada de forma contínua pelo fígado, em volume de 500-1000 ml por dia, sendo

estimulada a sua secreção pelos coleréticos fisiológicos e medicamentos. É constituída

fundamentalmente por três componentes: bilirrubina, colesterol e sais biliares.

Os sais biliares (glicolato e taurocolato de sódio, conjugados, respectivamente, com glicina e

taurina) têm grande capacidade de emulsão, dividindo as moléculas de gordura de forma a

constituírem pequenas gotículas, o que faz aumentar enormemente a sua superfície de

contacto com os fluídos biológicos, nos quais se encontram as enzimas hidrolíticas.

Os sais biliares desempenham o papel de activadores, ao prepararem as gorduras pela

emulsão e reforçarem a actividade das lípases pencreática e intestinal, indispensáveis para a

digestão das gorduras.

Material:

Estufa a 37°C

Tubos de ensaio em vidro de 15 ml

Microespátula

Caixa de Petri em vidro

Fita indicadora de pH

Pipetas de Pasteur em vidro ou em plástico

Pipetador

Pipetas volumétricas de 3 ml e 5 ml

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Cronómetro

Vórtex

Suporte para tubos

Reagentes:

Azeite

Sais de bílis

Solução de pancreatina (já preparada).

Procedimento:

� Identificar 3 tubos de ensaio com L1, L2, L3.

� Pipetar 3.0 ml de azeite para cada um dos tubos.

� Adicionar 1 microespátula de sais de bílis aos tubos L1 e L3 e agitar no vórtex.

� Pipetar 5.0 ml de solução de pancreatina para os tubos L2 e L3 e agitar no vórtex.

� Adicionar 5.0 ml de H2O destilada ao tubo L1 e agitar.

� Incubar os tubos a 37°C durante 1 hora. Retirar 2 gotas da solução do tubo L1 e

aplicar sobre a fita indicadora de pH. Repitar o processo de 20 em 20 min e para cada

um dos tubos de modo a obter 4 medidas de pH por tubo.

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Numa pessoa saudável, as concentrações plasmáticas dos diferentes monómeros e

biopolímeros (resultantes da digestão ) são mantidas constantes e variam apenas dentro de

limites apertados. Quando a concentração de uma destas moléculas no sangue se desvia dos

valores normais são activados mecanismos reguladores específicos de modo a compensar

estes desvios e a promover que a concentração volte ao normal (mecanismo de feed-back

negativo). Assim a homeostasia é mantida.

O diagnóstico de doenças associadas a disfunções no metabolismo dos açúcares depende da

determinação da concentração de glucose no sangue. A determinação da glicemia faz parte

das análises laboratoriais mais importantes e mais frequentes. Os métodos enzimáticos para o

doseamento da glucose têm sobre os outros métodos (processos de redução) a inestimável

vantagem de serem simples e rigorosamente específicos da glucose.

Entre estas doenças destaca-se a Diabetes mellitus que se caracteriza pela ocorrência de

valores elevados de glucose no plasma (estes valores elevados pode dever-se também à

hiperactividade das glândulas endócrinas, como a tiróide, ou das glândulas adrenais). Por

outro lado, a hipoglicémia caracteriza-se por níveis baixos de glucose que podem resultar de

doenças do fígado, dos rins, artrite, overdose de insulina, hipopituitarismo, etc. A análise de

glucose no sangue é por isso fundamental para o diagnóstico e controlo de várias doenças e

perturbações metabólicas. Os resultados das campanhas de despistagem precoce mostram

que, em cada dois diabéticos, um não está ainda reconhecido. Mas quanto mais cedo se

estabelece o diagnóstico, tanto melhor é o prognóstico. Afecções tardias, principalmente

macro- e microangiopatias, podem ser evitadas ou, pelo menos, detidas pelo tratamento

dietético e medicamentoso.

A pesquisa de diabetes é especialmente importante em doentes com antecedentes familiares

de diabetes, obesidade, lipémia, perturbações circulatórias coronária, periférica e cerebral,

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hipertensão, pielonefrite, durante a gravidez, em afecções crónicas cutâneas, prurido,

furunculose, micose e neuropatias.

As determinações da glicemia são indispensáveis tanto para o reconhecimento, como para o

controle da terapêutica e da evolução de diabetes mellitus. Cerca de um terço dos diabéticos

não apresentam temporariamente glicosúria, apesar de terem hiperglicemia significante.

Ainda mais importante que a análise da glicemia em jejum, que na diabetes ligeira pode estar

dentro dos limites normais, é a determinação da glicemia duas horas depois duma refeição

rica em hidratos de carbono. Reconhece-se mais exactamente uma perturbação metabólica

diabética com o “teste de sobrecarga de glucose” que permite verificar a presença não só da

diabetes manifesta, como também da latente.

Como método simples de pesquisa de diabetes, depois da realização do teste de sobrecarga

de glucose pode determinar-se somente o importante valor da glicemia após 2 horas.

Teste oral de tolerância à glucose.

Sobrecarga de glucose com 50 g ou 1 g de glicose por Kg de peso.

Em jejum Após 1 hora Após 2horas

< 100 mg/dl < 160 mg/dl < 120 mg/dl valores normais

100-130 mg/dl 160-220 mg/dl 120-150 mg/dl suspeito

> 130 mg/dl > 220 mg/dl > 150 mg/dl diabético

No ser humano, as concentrações normais de glicemia oscilam nos seguintes valores: 70 -

110 mg/dl pela manhã e em jejum.

O estado metabólico diabético latente é um factor de risco importante para as doenças

vasculares ateroscleróticas. Nesta patologia já se encontram frequentemente perturbações

circulatórias coronárias e periféricas, hipercolestrolémia e hiperlipidémia.

Especialmente depois de doses elevadas de insulina, encontram-se valores reduzidos de

glicemia. No caso de insulinoma e na doença de Addison, pode igualmente manifestar-se

hipoglicemia.

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Neste trabalho prático será feita a determinação da concentração de glucose em duas

amostras de plasma provenientes do mesmo indivíduo e que representam a amostra recolhida

em jejum e a amostra retirada 60 min após a ingestão de 100 g de glucose.

O método utilizado é um método indirecto e enzimático em que a glucose é inicialmente

oxidada a ácido glucónico e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela glucose

oxidase:

glucose + 2 H2O + O2 glucose oxidase ácido glucónico +H2O2

O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a

4-aminoantipirina e o p-hidroxibenzenossulfonato para formar a quinoneimina, que atinge

um máximo de absorção para o comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da cor

produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de glucose na amostra:

2H2O2 + p-hidroxibenzenossulfonato + 4-aminoantipirina peroxidase quinoneimina +

4H2O

Material:

Espectrofotómetro programado para 505 nm

Células de espectrofotómetro em acrílico de volume reduzido

Pipetador

Pipeta volumétrica de 1 ml

Micropipeta automática de 20 µl

Pontas amarelas para tubos de ensaio

Suporte para tubos eppendorf

Tubos eppendorf

Cronómetro

Reagentes:

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2 Amostras de plasma humano liofilizado e reconstituído, identificadas como:

J (amostra colhida em jejum);

1H (amostra colhida ao fim de 1 hora após ingestão de 100 g de glucose);

Solução padrão de glucose com a concentração de 300 mg/dl;

Reagente “Trinder” com a composição (a pH 7.0):

- 4-aminoantipirina 5x10-4 mol/l

- p-hidroxibenzenossulfonato 2x10-2 mol/l

- glucose oxidase 15 000 U/l

- peroxidase 10 000 U/l

Procedimento:

� Ligar o espectrofotómetro e ajustar o comprimento de onda para 505 nm;

� Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância;

� Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco;

Padrão; J e 1H;

� Pipetar 1 ml da solução “reagente Trinder” para cada um dos tubos;

� Pipetar 5 µl de água desionisada para o tubo com a designação Branco e inverter

para agitar;

� Aguardar 30 seg e pipetar 5 µl de solução padrão de glucose para o tubo com a

designação Padrão, agitar por inversão;

� Respeitando um intervalo de 30 seg, pipetar também 5 µl de cada uma amostras de

plasma para os respectivos tubos. Misturar por inversão suave dos tubos;

� Incubar à temperatura ambiente durante exactamente 18 min;

� Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 30 seg. entre amostras.

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Os lípidos constituem uma família de moléculas muito diversa que partilham uma

característica comum que é não serem solúveis em água e por isso também não o são no

plasma. Contudo, no plasma podem encontrar-se vários tipos de lípidos:

-ácidos gordos livres (também designados por ácidos gordos não esterificados);

-triglicerídeos (lípidos neutros: óleos e gorduras);

-fosfolípidos;

-esteróides.

Outro elemento comum a todas as moléculas de lípidos é o facto de todas possuírem átomos

de carbono, hidrogénio e oxigénio na sua estrutura. Os ácidos gordos apresentam-se em

cadeias longas lineares de 16 a 24 átomos de carbono. As moléculas que só possuem ligações

simples designam-se de ácidos gordos saturados enquanto que as moléculas que possuem

ligações duplas são chamadas de ácidos gordos insaturados. Os triglicerídeos e os

fosfolípidos têm estruturas ramificadas derivadas da molécula de glicerol. Numa molécula de

triglicerídeo encontram-se ligadas três cadeias de moléculas de ácido gordo. Os triglicerídeos

com grau de insaturação reduzido (poucas ligações duplas) apresentam-se como sólidos à

temperatura ambiente e são vulgarmente chamados de gorduras, enquanto que as moléculas

com maior grau de saturação são líquidos e designam-se normalmente por óleos. Os

fosfolípidos têm duas cadeias de ácidos gordos substituídas na molécula de glicerol e um

grupo fosfato na 3ª posição. Os esteróides possuem uma estrutura mais complexa com 3

anéis hexagonais, um 4º anel pentagonal e uma cadeia lateral. O colesterol constitui um dos

esteróides mais importantes no organismo e é o maior componente das lipoproteínas de baixa

densidade (designada por fracção LDL) e um componente menor das lipoproteínas de muito

baixa densidade (fracção VLDL) e da fracção HDL (lipoproteínas de alta densidade). A

designação de colesterol total inclui todas as formas de colesterol encontradas nas

lipoproteínas.

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Como componente de células e tecidos o substracto para a síntese de numerosos

compostos, o colesterol desempenha um papel importante no nosso

metabolismo. Para realizar essas tarefas, o

organismo humano dispõe de colesterol quer

exógeno (absorvido com os alimentos), quer

endógeno (sintetizado pelo próprio organismo).

Hábitos alimentares diferentes fazem variar muito a

quantidade de colesterol fornecido pelos alimentos.

Uma alimentação exclusivamente vegetariana não

fornece colesterol, enquanto que os produtos

alimentares de origem animal fornecem cerca de 1 g

de colesterol por dia.

A síntese endógena do colesterol tem lugar principal no fígado, a partir de acetil-CoA

que se forma no organismo por degradação dos hidratos de carbono, proteínas e,

principalmente, gorduras. Além disso, são local de síntese a mucosa do intestino

delgado e outros tecidos e orgãos (com excepção do cérebro do adulto).

É possível que entre a absorção fisiológica normal através dos alimentos e a biossíntese

endógena hepática exista um mecanismo de regulação específico que procure

estabelecer o equilíbrio do nível de concentração de colesterol no soro. Um vegetariano

pode ter uma concentração sérica de colesterol que não se distingue da concentração

apresentada por outro indivíduo saudável que faça uma alimentação mista. Naquele

caso, a síntese endógena é reforçada para se atingir o valor normal.

Num indivíduo que absorve grande quantidade de gorduras, principalmente animais, a

síntese endógena fica inibida, mas só para além dos valores normais da concentração do

colesterol no soro. A diminuição da absorção de colesterol diminui a colesterolémia; o

Figura 3. Estrutura química do colesterol.

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tratamento medicamentoso reforça esta medida. Parte do colesterol endógeno é lançado

na corrente sanguínea através da linfa, parte é transformado em ácidos biliares e

hormonas esteróides e, parte é integrada na membrana celular e no tecido nervoso.

O colesterol exógeno é emulsionado por sais biliares no intestino, ficando igualmente ao

dispor das vias de síntese atrás referidas.

O colesterol absorvido por biossíntese e o colesterol absorvido com os alimentos

constituem o pool de colesterol que, no adulto, é aproximadamente 130 a 150 g. Esta

quantidade de colesterol distribui-se do seguinte modo:

�� cérebro: 30 g;

�� músculos esqueléticos: 30 g;

�� pele: 15 g;

�� sangue: 10g;

�� fígado: 5 g;

�� glândulas supra-renais: 0,5 g;

�� restantes tecidos: 40 a 60 g.

A parte de colesterol que o organismo utiliza como produto de síntese é excretada por

três vias, de acordo com o metabolismo:

� pelas fezes, sob a forma de sais biliares e de esteróides

� pela urina, como catabolito de hormonas

� pela pele, evidentemente em quantidade insignificante

São as lipoproteínas que fazem o transporte do colesterol no sangue. Existem várias

lipoproteínas (Lps) que podem ser representadas pela estrutura geral demonstrada na

Figura 4 (página seguinte).

Todas as Lps são formadas por uma fracção protéica (apoproteina ou apolipoproteina) e

uma fracção lipídica (colesterol livre e esterificado, triglicerídeos e fosfolípidos), em

proporções diferentes, segundo o tipo de Lp:

� α-lipoproteínas ou HDl

� pré-β-lipoproteínas ou VLDL

� β-lipoproteínas or LDL

� quilomicras

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Do colesterol que aparece no sangue, 70% encontra-se sob a forma esterificada.

Depois da decomposição enzimática do éster, o colesterol esterificado e o colesterol

livre no soro são doseados sob a forma de colesterol total. A sua concentração depende

da idade, sexo e hábitos de vida do indivíduo.

Há evidências científicas de que valores elevados de colesterol no sangue, nomeadamente da

fracção LDL, associados a outros factores de risco como sejam a hipertensão e a condição de

fumador, contribuem para o aparecimento da aterosclerose. Por outro lado, a concentração da

fracção HDL no sangue está inversamente relacionada com o risco de doenças

cardiovasculares.

A determinação do nível de colesterol no sangue pode servir como um indicador da função

hepática, função biliar, da absorção intestinal, das funções da tiróide e das glândulas

adrenais. A análise do colesterol total e da fracção HDL são de grande importância no

diagnóstico e avaliação de doenças cardiovasculares, aterosclerose e outras doenças.

Diversos factores como o stress, a idade, a tendência natural (hereditariedade), o equilíbrio

hormonal e a gravidez são susceptíveis de afectar os níveis normais de colesterol num

indivíduo.

colesterol proteína

fosfolípido

Figura 4. Lipoproteína plasmática.

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Verificou-se que pelo menos 10% da população apresenta hiperlipoproteinémia que, na

maioria dos casos, não provoca perturbações, mas pode produzir graves alterações

patológicas das paredes dos vasos, especialmente, das coronárias, cujas consequências

são insuficiência circulatória e lesão de orgãos de importância vital. Estudos

epidemiológicos revelaram, igualmente, que a hipercolesterolémia, favorecida por

hipertensão e tabagismo, também é responsável pelas coronariopatias.

Angina do peito, insuficiência coronária, enfarte do miocárdio, morte súbita

manifestam-se tanto mais frequentemente num período de 10 anos, quanto mais elevada

for a concentração sérica de colesterol.

Em caso de hipercolesterolémia, a dieta deve ser rica em ácidos gordos insaturados, como o

ácido linoléico, e pobre em colesterol. Quando a terapêutica não baixa suficientemente a

concentração, administram-se medicamentos hipolipemizantes.

A hipocolesterolémia pode verificar-se no hipertiroidismo.

É problemática a fixação de valores normais de colesterol. As chamadas determinações do

valor normal, que se baseiam em análise duma amostra populacional clinicamente saudável,

não excluem que nesta amostra figurem indivíduos cujas doenças ateroscleróticas não sejam

ainda detectáveis e cujo nível lipídico é, portanto, erradamente considerado normal. Os

valores normais indicados não devem ser interpretados como limites decisivos de opção

terapêutica, sendo sempre necessário considerar o quadro global dos factores de risco. Deve

considerar-se valor limite de risco elevado de enfarte do miocárdio uma concentração de 220

mg de colesterol/100 ml de soro. Este valor foi obtido do estudo de Framingham, cujo

dispendioso método de doseamento fornece valores concordantes com os do teste

colorimétrico enzimático.

O “Adult Treatment Panel of National Cholesterol Education Program U.S.A.” considera:

�� valores desejáveis da concentração de Colesterol Total: < 200 mg/dl

limites aceitáveis entre 200 - 239 mg/dl

valores elevados: ≥ 240 mg/dl

�� valores desejáveis da concentração de LDLc: < 130 mg/dl

limites aceitáveis entre 130 - 159 mg/dl

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valores de risco elevado: ≥ 160 mg/dl

�� valores desejáveis da concentração de HDLc: H: > 45 mg/dl ; M: > 65 mg/dl

valores de risco moderado: H: 35 - 45; M: 45 - 65 mg/dl

valores de risco elevado: H: < 35 mg/dl ; M: < 45 mg/dl

Existem diversos métodos para análise de colesterol em sangue e, da mesma forma que para

a determinação de glucose, utilizar-se-á um kit de diagnóstico que se baseia num método

enzimático indirecto. A medição do colesterol em cada uma das fracções é determinada após

hidrólise enzimática e oxidação.

Os ésteres de colesterol são inicialmente hidrolisados a colesterol e a ácidos gordos livres por

acção da colesterol esterase. O colesterol produzido nesta reacção é seguidamente oxidado a

4-colesteno-3-ona e peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada pela colesterol oxidase:

ésteres de colesterol + H2O colesterol esterase colesterol + ácidos gordos

colesterol + O2 colesterol oxidase 4-colesteno-3-ona + H2O2

O peróxido de hidrogénio de hidrogénio formado, na presença da peroxidase, reage com a

4-aminoantipirina e o ácido hidroxibenzóico para formar a quinoneimina, um corante que

atinge um máximo de absorção para o comprimento de onda de 505 nm. A intensidade da

cor produzida pela reacção é directamente proporcional à concentração de colesterol na

amostra:

2H2O2 + ácido hidroxibenzóico + 4-aminoantipirina peroxidase quinoneimina + 4H2O

Material:

Espectrofotómetro programado para efectuar o varrimento entre 500 e 550 nm

Células de espectrofotómetro em acrílico de volume reduzido

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Estufa ou incubadora com temperatura constante a 37ºC

Vórtex

Pipetador

Pipeta volumétrica de 1 ml

Micropipeta automática de 20 µl

Suporte para tubos eppendorf

Tubos eppendorf

Cronómetro

Reagentes:

1 Amostra de plasma humano liofilizado e reconstituído

Solução padrão de colesterol total com a concentração de 200 mg/dl;

Solução padrão de colesterol HDL com a concentração de 50 mg/dl;

Solução de ácido fosfotúngstico (30.3x10-3 mol/l) e de cloreto de magnésio

(0.1 mol/l).

Reagente “Infinity” com a composição (a pH 6.6):

- 4-aminoantipirina 2.5x10-4 mol/l

-ácido hidroxibenzóico 1.0x10-2 mol/l

- colesterol oxidase 100 U/l

- colesterol esterase 1 250 U/l

- peroxidase 800 U/l

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Procedimento:

� Ligar o espectrofotómetro e ajustar o modo de funcionamento para varrimento entre

os comprimentos de onda de 500 a 550 nm;

� Usar água destilada para estabelecer o zero de absorvância;

� Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Branco;

Padrão total; Amostra total;

� Pipetar 1 ml da solução “reagente Infinity” para cada um dos tubos;

� Pipetar 10 µl de água desionisada para o tubo com a designação Branco e inverter

para agitar;

� Aguardar 30 seg e pipetar 10 µl de solução padrão de colesterol total para o tubo

com a designação Padrão total, agitar por inversão;

� Respeitando um intervalo de 30 seg, pipetar também 10 µl da amostra de plasma

para o respectivo tubo. Misturar por inversão suave dos tubos;

� Incubar à temperatura de 37ºC durante exactamente 5 min;

� Ler as absorvâncias respeitando também um intervalo de 30 seg entre amostras.

Anotar o comprimento de onda para o qual a absorvânica é máxima.

� Garantir que todas as absorvâncias são lidas durante os 30 min após a incubação.

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A determinação da fracção HDL necessita a prévia separação das fracções VLDL e LDL.

Esta separação pode ser efectuada por ultracentrifugação ou por precipitação selectiva, sendo

o sobrenadante posteriormente analisado em fracção HDL. No presente método utiliza-se

uma solução de ácido fosfotúngstico e de cloreto de magnésio que provoca a precipitação das

fracções VLDL e LDL, deixando a fracção HDL em suspensão. O doseamento do colesterol

HDL é efectuado a partir deste sobrenadante usando o mesmo método que para o colesterol

total.

Procedimento:

� Identificar uma série de tubos eppendorf com as seguintes designações: Padrão

HDL; Amostra HDL; Análise HDL

� Pipetar 500 µl de amostra de plasma para um tubo eppendorf

� Adicionar 100 µl de solução de solução de ácido fosfotúngstico / cloreto de

magnésio

� Agitar no vórtex e deixar repousar durante 5 min à temperatura ambiente.

� Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min;

� Transferir todo o sobrenadante para o tubo com a designação Amostra HDL;

� Proceder ao doseamento do colesterol HDL da mesma forma que efectuou a

determinação do colesterol total.

Obs.: para algumas amostras pode ocorrer a precipitação incompleta das

lipoproteínas VLDL e LDL, e neste caso deve utilizar-se uma amostra de plasma

diluída com soro fisiológico na proporção de 1:1.

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O sistema endócrino, com a sua grande quantidade de hormonas, afecta todos os tecidos do

corpo humano. Em resposta a um sinal apropriado, um mensageiro químico é libertado e

transferido para um tecido alvo, cuja actividade é subsequentemente modificada. Em

associação com o sistema nervoso autónomo, algumas hormonas mantêm a homeostasia;

outras, por exemplo, permitem a gestão do stress. As características sexuais, o tamanho e as

formas do corpo humano são determinas pelas hormonas esteróides.

Estruturalmente, as hormonas esteróides são derivados esteróides dos triterpenos,

caracterizam-se por terem uma estrutura de 4 anéis e possuem um núcleo

ciclopentanoperidrofenantreno, como está representado na Figura 5.. Este grupo é de

natureza alicíclica constituído por três anéis hexagonais

com composição fenantrénica, designados por A, B e C, e

por um pentagonal, o anel D.

Pequenas modificações na estrutura podem resultar em

grandes diferenças na actividade biológica dos esteróides.

Com base na estrutura e na actividade biológica, as

hormonas esteróides podem ser agrupadas em 4 categorias

funcionais: androgénios, estrogénios, progestogénios e corticosteróides.

Os androgénios são responsáveis pelo desenvolvimento dos caractéres sexuais secundários

masculinos, sendo o androgénio mais importante a testosterona, que é segregada

principalmente pelos testículos e, secundariamente, pelo córtex das supra-adrenais.

Os estrogénios promovem o aparecimento dos caractéres sexuais secundários femininos,

sendo a principal hormona o β–estradiol. Os estrogénios são segregados, pelos ovários,

ciclicamente, em que níveis elevados destas hormonas alternam com níveis mais reduzidos.

O nível máximo de estrogénios atinge-se na ovulação. A progesterona é também uma

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Figura 5. Núcleo esteróide.

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hormona cuja segregação é cíclica, surgindo na fase final da ovulação. Durante a gravidez, a

placenta produz progesterona em níveis que acompanham o desenvolvimento do feto.

Os corticosteróides são hormonas do córtex supra-adrenal e podem subdividir-se em duas

classes funcionais: os glucocorticóides e os mineralocorticóides, sendo segregados por duas

regiões distintas do córtex.

Os mineralocorticóides (como por exemplo a aldosterona e a desoxicorticosterona) são

produzidos pela zona glomerulosa e estão envolvidos na regulação dos iões sódio e,

consequentemente, potássio. Níveis elevados destes corticosteróides estão associados à

hipertensão, alterações de níveis de sódio e potássio, cirrose ou problemas de coração ou de

rins.

Os glucocorticóides são segregados pelas zonas fasciculada e reticulada do córtex supra-

adrenal e intervêm no metabolismo dos hidratos de carbono, proteínas e gorduras. Os

glucocorticóides mais potentes são a corticosterona, a cortisona e a hidrocortisona (ou

cortisol). Valores elevados de glucocorticóides no sangue estão associados com a gravidez,

hiperplasia adrenal e stress devido a doença, intervenção cirúrgica ou queimadura.

Este trabalho tem como objectivo a separação, pela cromatografia em camada fina (TLC -

Thin Liquid Chromatography), de hormonas derivadas do colesterol, designadamente, da

testosterona (androgénio), β–estradiol (estrogénio) e do hidrocortisona (glucocorticóide)

presentes nas amostras fornecidas aos alunos. Pretende-se, igualmente, proceder à

identificação dos compostos analisados, calcular os respectivos valores de Rf e, finalmente,

determinar a solubilidade relativa das hormonas ensaiadas.

Material:

Placas para TLC em silica gel com indicador de fluorescência F –254

Câmara de cromatografia

Lâmpada de luz UV (λ = 254 nm)

Tubos capilares para aplicação de amostras

Óculos de protecção com filtro UV

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Provetas de vidro

Régua

Reagentes:

Soluções padrão de hormonas esteróides, com concentração 1.0 mg/ml,

nomeadamente: testosterona, hidrocortisona, β-estradiol;

Amostras para análise contendo hormonas esteróides;

Eluente para desenvolvimento da TLC: 160 ml da mistura de solventes

contendo tolueno, acetato de etilo e acetona, na proporção de 6:1:1.

Procedimento:

� Preparar a solução eluente, na hotte, misturando num frasco com rolha de

vidro: 120 ml de tolueno, 20 ml de acetato de etilo e 20 ml de acetona, medidos

em proveta. Agitar vigorosamente para misturar e verter na câmara de TLC.

� Untar os bordos esmerilados da câmara e da tampa com silicone para

esmerilados de modo a manter a câmara bem vedada. Deixar a câmara em

repouso durante cerca de 20 min para equilibrar o eluente.

� Usando um lápis grosso, marcar suavemente uma linha recta à distância de 2

cm de uma das extremidades da placa de TLC. Todos os pontos de aplicação de

amostras e soluções padrão terão origem nesta linha.

� Marcar com o lápis os locais onde serão aplicadas as amostras e os padrões,

com um espaçamento de 1.5 cm.

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� Aspirar a solução padrão com o capilar e com muito cuidado aplicar a

amostra na placa sem ferir o adsorvente: encostar a extremidade do capilar à

placa mantendo-o quase na vertical e deixar saír uma gota.

� Depois desta gota secar aplicar mais solução padrão exactamente no mesmo

local, deixando a amostra evaporar entre aplicações. Anotar numa folha de

papel a localização da amostra aplicada.

� Repetir este procedimento para as restantes soluções padrão e também para

as amostras, respeitando os locais previamente marcados.

� Depois de aplicar todas as amostras e padrões, colocar a placa de TLC com

extremo cuidado e segurando-a pelas extremidades, garantindo que o nível de

solvente está abaixo da linha de aplicação das amostras. Deixar em repouso

durante cerca de 1 hora para que se desenvolva a cromatografia.

� Remover a placa da câmara, mantendo-a na vertical e segurando-a pelo

bordo superior. Com o lápis marcar a linha da frente do solvente em ambas as

extremidades laterais da placa de TLC.

� Escorrer o eluente e colocar a placa sobre uma folha de papel absorvente, na

hotte, para secar.

� Colocar a placa já seca sob a lâmpada de luz UV para observar os pontos de

aplicação. ATENÇÃO: Nunca olhar directamente para a luz ultravioleta!

Colocar os óculos de protecção!

� Delimitar com um lápis as manchas observadas e traçar a linha de frente do

solvente. Analisar o cromatograma e com uma régua medir as distâncias de

cada mancha à origem.

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O sangue é um constituinte importantíssimo do organismo e os seus diversos componentes

desempenham funções também diversas. O sangue é responsável pelo transporte e

distribuição de substâncias a todos os órgãos e tecidos do organismo, como a água, o

oxigénio (vindo dos pulmões) e os nutrientes (absorvidas pelo intestino delgado), e remove

os materiais residuais resultantes do metabolismo encaminhando-os para os órgãos

responsáveis pela sua eliminação como sejam o fígado, os rins, ou os pulmões. Ele transporta

os produtos celulares que são exportados para outros tecidos, assim como os mensageiros

químicos de natureza sanguínea que servem de comunicação entre os diferentes órgãos,

como sejam as hormonas segregadas pelas glândulas endócrinas e os anti-corpos produzidos

por alguns glóbulos brancos.. Além das funções de transporte e comunicação do sangue, os

seus vários componentes desempenham as suas próprias funções independentes.

O sangue proporciona os meios que tornam possível a regulação de muitos aspectos do

ambiente interno ou fluído extracelular. O grande volume e o efeito agitador contínuo da

circulação sanguínea permite que a composição do fluído que banha as células se mantenha

relativamente constante. No entanto, uma vez que a taxa de trocas entre o sangue e o fluído

tecidular pode variar pela alteração do gradiente de pressões, podem ser efectuadas rápidas

alterações sempre que necessário.

A regulação do ambiente interno requer normalmente a cooperação dos vários sistemas do

organismo, onde o sangue actua como mecanismo de ligação e de encadeamento. A

regulação da temperatura corporal pela distribuição do calor é um exemplo disso. Durante o

exercício físico, o músculo esquelético produz uma grande quantidade de calor que deve ser

libertado para que o corpo não aumente demasiado a sua temperatura. Para que isso se torne

possível, o calor é transportado pelo sangue até à pele, onde pode ser libertado para a

atmosfera. Quando o organismo está em repouso, o calor produzido pelo fígado nos

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processos metabólicos é transportado para os tecidos que se encontram mais frios, mantendo-

se assim a temperatura corporal.

O sangue é constituído por plasma e por células. A porção fluída do sangue é o plasma, do

qual nove décimos é formado por água, sendo esta utilizada para hidratar todas as células e

tecidos.

O plasma é um líquido de cor amarelada que constitui cerca de 55% de todo o sangue. Tem

muitas funções importantes:

� Distribuição do calor produzido pelo organismo.

� Actua como sistema de transporte para uma grande variedade de substâncias,

designadamente, gases, hormonas, nutrientes, electrólitos (Na+, Cl-, K+, Ca2+) e

produtos residuais, tais como, ureia e creatinina.

� Contém as proteínas plasmáticas, as quais constituem cerca de 7% do peso do

plasma, desempenhando um papel importante na manutenção da pressão osmótica

sanguínea. Sem o seu efeito osmótico seria impossível manter o volume sanguíneo

dentro do sistema vascular. Funcionam, igualmente, como tampões químicos,

regulando o equilíbrio ácido/base. As diferentes proteínas plasmáticas desempenham

papéis particulares. A albumina, por exemplo, devido à sua elevada concentração e

pequeno tamanho molecular, contribui significativamente, para a pressão osmótica

funcionando também como transportador de substâncias, nomeadamente de ácidos

gordos e de determinados fármacos. O plasma contém as proteínas necessárias para a

formação e posterior degradação de coágulos sanguíneos. Para além disso, contam

várias classes de proteínas, por exemplo, as gamaglobulinas, que são

imunoglobulinas essenciais ao mecanismo de defesa do organismo.

As células sanguíneas são por vezes referidas como “elementos figurados”, porque um dos

tipos de células, a plaqueta, não é uma célula completa e é desprovida de muitas estruturas

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celulares típicas. A expressão é mais vezes utilizada em fisiologia clássica, do que em

situações clínicas, onde a expressão “células sanguíneas” é perfeitamente aceitável.

Outros dois constituintes importantes do sangue são os glóbulos brancos (ou leucócitos) e os

glóbulos vermelhos (ou eritrócitos). Os glóbulos vermelhos contribuem para a função

respiratória do sangue pois são os responsáveis pelo transporte de oxigénio e em menor

extensão de dióxido de carbono. Os leucócitos e os seus produtos desempenham um papel

importantíssimo no sistema imunitário actuando em caso de infecção reconhecendo e

atacando moléculas e células estranhas ao indivíduo. O sangue também inclui as plaquetas

que em conjunto com as proteínas do plama ajudam amanter a integridade dos vasos

sanguíneos formando os coágulos.

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Antes de se iniciar um estudo hematológico é imprescindível ter conhecimento da técnica

correcta para colheita de amostras e também dos anticoagulantes disponíveis e como devem

ser utilizados. A maioria da técnicas hematológicas utiliza como amostra sangue completo

incoagulável ou plasma. Poderá colher-se por punção capilar, venoso, arterial ou do cordão

umbilical mas, estes dois últimos tipos só poderão ser efectuados por médicos. Nas análises

que serão efectuadas nesta disciplina todas as colheitas de sangue serão do tipo capilar e

efectuadas pelos próprios alunos por razões óbvias.

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� Escolher a zona a puncionar por ordem de preferência:

� a polpa do dedo polegar, médio ou indicador da mão;

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� a superfície plantar do calcanhar ou a polpa do dedo grande do pé

(indicados no caso de se tratar de um bébé);

� o lóbulo da orelha (deve usar-se apenas em último caso, pois os valores

obtidos com esta amostra são os que mais se distanciam dos obtidos com

amostras de sangue venoso).

� A zona escolhida não deve estar fria, edematosa ou cianótica.

� No caso do dedo, agitar a mão de modo a que a pressão sanguínea aumente e

desinfectar com álcool a 70% a zona a puncionar. Depois de seca, efectuar a punção

com uma lanceta estéril e descartável. A picada deve ser suficientemente profunda (1 a

2 mm) para que o sangue flua livremente. Uma picada superficial dói tanto como uma

de profundidade conveniente, pelo que uma punção eficiente evitará a necessidade de

novas punções para obtenção da amostra.

� Desprezar a primeira gota, contaminada com líquidos tecidulares e depois de limpar

a zona puncionada com papel de filtro ou com uma gaze, apontar o dedo para baixo

para recolher a amostra na quantidade e da forma conveniente para a execução das

análises pretendidas. O sangue deve fluir livremente, sem compressão, a fim de

prevenir a hemodiluição com linfa. Para as análises que se pretendem efectuar a

recolha de 2 a 3 gotas de sangue é suficiente para perfazer o volume necessário.

� Colhida a amostra pressiona-se (sem massajar) a zona puncionada com um algodão

embebido em álcool a 70% até estancar completamente a hemorragia.

Vantagens deste tipo de técnica:

Obtém-se facilmente.

Requer menos habilidade que a colheita de sangue venoso.

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Inconvenientes

Obtêm-se amostras de volume bastante exíguo.

Caso se torne necessária a repetição de uma determinação terá de proceder-se a nova punção.

Os resultados obtidos com esta amostra não apresentam tão boa reprodutibilidade como os

obtidos com sangue venoso, uma vez que é praticamente impossível evitar uma

contaminação mais ou menos extensa com linfa.

Aplicações

A punção capilar é particularmente usada em crianças e obesos, em que se torne difícil a

obtenção de sangue venoso.

Útil nos serviços de urgência e ainda para controlo rápido de algumas doenças crónicas (por

exemplo, diabetes).

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Os anticoagulantes usados em hematologia podem apresentar-se na forma sólida ou na forma

líquida, sendo os primeiros utilizados na preparação de amostras para estudos quantitativos,

uma vez que os líquidos ao misturarem-se com o sangue introduzem um erro de diluição.

A escolha do tipo de anticoagulante faz-se em função da determinação a executar sendo os

mais utilizados: heparina, sais de sódio e de potássio do EDTA, o citrato trissódico, o ACD

(mistura ácido-citrato-dextrose) e o CPD (mistura citrato-fosfato-dextrose).

Para além da escolha correcta do anticoagulante é também importante:

- conhecer e respeitar a relação conveniente de sangue e anticoagulante;

- promover a mistura eficaz dos dois;

- conhecer as acções adversas dos anticoagulantes;

- saber o tempo e condições de preservação das amostras.

A aplicação de uma quantidade insuficiente de anticoagulante permite uma coagulação

menos exextensa da amostra, enquanto que um excesso de anticoagulante revela-se

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sobretudo pela alteração da morfologia celular. A mistura sangue / anticoagulante deve ser

feita correctamente por inversões suaves do tubo que a contém.

EDTA

O EDTA é ao anticoagulante sólido mais usado na rotina laboratorial. Pode usar-se o sal

dissódico ou dipotássico, sendo este último preferido devido à sua solubilidade. A acção

deste anticoagulante deve-se à remoção por quelatação do iões cálcio intervenientes no

processo de coagulação do sangue.

Utiliza-se para obtenção de amostras para hemogramas, contagem de plaquetas,

determinação de grupos sanguíneos e factor Rh e ainda velocidade de sedimentação. A

concentração aconselhada é de 1 mg/ml, admitindo-se uma variação de ± 20%. A relação

sangue / anticoagulante deve ser respeitada porque o excesso afectará os glóbulos vermelhos

e brancos provocando a sua contracção e alterações degenerativas. Estas modificações

poderão traduzir-se numa diminuição do volume globular médio e no aumento da

concentração da hemoglobina. Também as plaquetas são afectadas, observando-se a sua

tumefacção e eventual desintegração, resultando num erro por excesso durante a sua

contagem.

HEPARINA

A HEPARINA é um mucopolissacarídeo extraído dos pulmões e do fígado bovinos e é

também um anticoagulante líquido que actua neutralizando a trombina e que se escolhe para

estudos de fragilidade osmótica, uma vez que preserva o tamanho celular. Não deve ser

usado para a execução de esfregaços sanguíneos pois confere-lhes um fundo azul. Também

não deve usar-se na numeração de leucócitos nem para o estabelecimento da fórmula

leucocitária porque não previne a sua agregação. A acção da heparina é de curta duração,

cerca de 24 horas, e deve utilizar-se na concentração de 0,2 mg / ml de sangue (15 ± 2,5

UI/ml).

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CITRATO TRISSÓDICO

O CITRATO TRISSÓDICO é um anticoagulante líquido que actua também por remoção do

ião cálcio. Escolhe-se para obtenção de amostras para as provas de coagulação e deverá usar-

se na proporção de 1:9 (relação citrato:sangue), e na concentração de 0,11 M. Na utilização

para obtenção de amostras de velocidade de sedimentação deve usar-se na proporção de 1:4

(relação citrato:sangue).

O ACD e o CPD são misturas de coagulantes que se utilizam quando se pretende preservar

as amostras por períodos de tempo de cerca de um mês e por este motivo são escolhidos par

as amostras destinadas a processos transfusionais.

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Para a numeração de eritrócitos, leucócitos e plaquetas existem dois métodos, os visuais

e os electrónicos.

Nos métodos visuais faz-se a contagem microscópica das células diluídas, em líquidos

apropriados. Esta contagem é efectuada em câmara de Neubauer modificada e

espalhada, de dimensões conhecidas. São métodos acessíveis, mas menos precisos,

menos reprodutíveis e também menos rápidos.

Os métodos electrónicos, que recorrem obviamente a contadores electrónicos de vários

tipos, são rápidos, mais precisos e reprodutíveis.

Apesar dos inconvenientes dos métodos visuais, acabados de referir, o seu estudo e

aplicação são actuais, uma vez que eles são ainda aplicados em laboratórios pequenos

que não dispõem de contadores de glóbulos. São igualmente utilizados na calibração de

contadores e nos casos em que a punção capilar se torna necessária.

Porque os contadores que fazem a numeração de plaquetas são bastante caros, esta

determinação faz-se ainda em grande número de laboratórios pelo método visual.

A execução do método visual necessita de material especial, designadamente, de:

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Esta contagem é feita em câmara de Neubauer modificada (também designada de

hemacitómetro), que é uma lâmina de vidro espesso, de forma rectângular, atravessada

transversalmente por dois sulcos que delimitam três plataformas: uma central e duas laterais.

A central, ainda subdividida em duas por um sulco perpendicular aos outros dois, apresenta

em cada uma destas plataformas centrais uma área reticulada. Estas duas plataformas

reticuladas estão 0,1 mm mais baixas que as plataformas laterais, onde se apoiará uma

lamela, deixando pois um espaço de 0,1 mm de profundidade entre elas.

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A câmara de Neubauer é acompanhada de uma lamela especial,

opticamente plana e de maior espessura que as lamelas comuns,

de forma a que assentando na câmara deixa um espaço

uniforme de 0,1 mm entre os retículos e a lamela.

Existem vários modelos de retículo, sendo no entanto o de

Neubauer, o preferido. Dos diversos modelos de câmara de

Neubauer, deve preferir-se a modificada e espalhada.

Cada área reticulada é um quadrado de 9 mm2 (3 mm x 3mm),

que está dividido em 9 quadrados grandes de 1 mm2. Os quatro

quadrados dos cantos são subdivididos em 16 quadrados

médios de 0,25 mm x 0,25 mm (com área de 0,0625 mm2). O

quadrado grande central é subdividido em 25 quadrados médios

de 0,2 mm x 0,2 mm (com área de 0,04 mm2), sendo cada um

destes subdividido em 16 quadrados pequenos de 0,05 mm x

0,05 mm (0,0025 mm2).

Para facilitar a técnica e os cálculos convencionou-

se que se contam apenas os glóbulos vermelhos

situados nos 4 quadrados grandes do cantos e no

quadrado médio central do quadrado grande central

(ou seja, conta-se o número de células situadas nos

quadrados identificados como A ; B ; C ; D e E

existentes no quadrado 5 da figura ao lado). Os

glóbulos brancos são contados nos 4 quadrados

grandes que constituem os cantos do retículo (ou

seja nos quadrados 1, 2 3 e 4). As plaquetas

contam-se em todo o quadrado grande central.

Figura 6. Câmara de Neubauer.

Figura 7. Câmara de Neubauer.

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Convencionou-se ainda que para prevenir a contagem repetida da mesma célula, esta se fará

começando pelo canto superior esquerdo do quadrado onde se pretende fazer a numeração.

Assim, as células da primeira fila serão contadas da esquerda para a direita, passando desta

fila para a inferior, que será contada da direita para a esquerda, e assim sucessivamente.

Na numeração incluem-se todas as células que toquem ou sobreponham a linha superior e a

linha esquerda, excluindo aquelas que toquem ou sobreponham a linha inferior e a linha

direita.

Dada a profundidade da câmara, as dimensões conhecidas do retículo, a diluição da

suspensão celular e o número de células contadas em determinada zona do retículo, é

possível calcular o número de células por litro de sangue.

Figura 8. Contagem na câmara de Neubauer.

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Estas pipetas de vidro usam-se para efectuar com rigor as amostras de sangue para contagem

de glóbulos sanguíneos. São constituidas por uma parte capilar seguida de um bolbo que

contém uma pérola de vidro vermelha (no caso de se tratar de uma pipeta para diluição de

amostras para numeração de eritrócitos) ou branca (para a numeração de leucócitos). Para

além de permitir identificar a pipeta, estas pérolas auxiliam ainda a homogeneização das

células no líquido diluidor. Acima do bolbo há outra porção capilar, reduzida, que

apresentará a marca 101 ou 11 consoante se trate da pipeta para glóbulos vermelhos ou para

glóbulos brancos. A pipeta de GV é também usada para diluição de amostras que se destinam

à numeração de plaquetas.

Nas pipetas para eritrócitos, o sangue é aspirado até à marca 0,5 e diluído por aspiração do

líquido diluidor até à marca 101, efectuando-se uma diluição do sangue de 1:200. Nas

pipetas para leucócitos, o sangue é aspirado até à marca 0,5 e diluído por aspiração do

líquido diluidor até à marca 11, efectuando-se uma diluição do sangue de 1:20.

Figura 9. Pipetas diluidoras de Thoma para GB (A) e para GV (B).

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A numeração de eritrócitos consiste na contagem dos glóbulos vermelhos do sangue ao

microscópio óptico, determinando o número de células por mililitro de sangue. De igual

modo a numeração de leucócitos consiste na contagem dos glóbulos brancos. Como estes

números são muito elevados (da ordem de 5x1012 cél / l de sangue), é necessário diluir a

amostra numa solução isotónica, contar o número de células nesta fracção diluída e depois

usar um factor de correcção. Para que os erros envolvidos nesta técnica sejam desprezáveis é

necessário garantir que a amostra seja representativa do sangue do indivíduo, os volumes

sejam medidos com rigor para que a diluição seja bem feita.

A função do líquido diluidor é essencialmente a diluição e preservação das células a

numerar.

São vários os líquidos diluidores para eritrócitos, no entanto vamos utilizar o de Dacie.

Os líquidos diluidores de GB, para além de diluir e preservar estas células, vão ainda lisar as

células anucleadas e, alguns deles, que têm um corante incorporado, permitem uma melhor

visualização dor leucócitos por conferirem uma certa coloração ao seu núcleo.

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Adapta-se às pipetas diluidoras, permitindo a aspiração da amostra e do líquido diluidor mais

facilmente em segurança.

Neste trabalho, para se proceder às contagens globulares efectua-se a contagem microscópica

(através do método visual) das células diluídas em líquidos apropriados (Dacie e Hayem),.

Esta contagem é executada em câmara de Neubauer modificada e espalhada, de dimensões

conhecidas. A execução deste método necessita de, para além da referida câmara, pipetas

diluidoras de Thoma, pelo que o seu manuseamento será, igualmente, objecto de

experimentação neste trabalho.

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Material:

câmara de contagem de Neubauer modificada e respectivas lamelas

Microscópio

Lancetas estéreis

Álcool a 70%

Algodão higienizado

Contentor para recolha de produtos contaminados

Pipeta de diluição de Thoma para glóbulos brancos

Pipeta de diluição de Thoma para glóbulos vermelhos

Pipetador automático

Reagentes (encontram-se já preparados):

Líquido diluidor (solução de Dacie) – para contagem dos glóbulos vermelhos:

- Formol a 40% ................................ 1 ml

- Citrato trossódico a 3% ................. 99 ml

Líquido diluidor (solução de Hayem) - para contagem dos glóbulos brancos:

- Azul de metileno ............................ 0,25 g

- Ácido acético ................................. 5 ml

- Água destilada ............................... qbp 100 ml

Procedimento:

� Colocar uma lamela em cima da câmara de Neubauer de modo a que esta cubra

uma das áreas de contagem (plataforma central)

� Adaptar a pipeta de Thoma, perfeitamente limpa e seca, ao pipetador

automático.

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� Efectuar uma picada no dedo conforme as indicações referidas na técnica de

remoção de sangue capilar. Rejeitar a primeira gota de sangue e aspirar as gotas

seguintes até à primeira marca (0,5) da pipeta diluidora de Thoma para glóbulos

vermelhos. Encher também até à primeira marca (0,5) a pipeta diluidora de Thoma

para os glóbulos brancos.

� Limpar as pipetas exteriormente com papel absorvente para remoção de algum

resíduo e efectuar de imediato a diluição da amostra prevenir a sua coagulação

com a solução de Dacie para os glóbulos vermelhos e com a solução de Hayem

para os glóbulos brancos. Neste caso, é desnecessário o uso de anticoagulante se a

técnica for executada correctamente e logo após a colheita de sangue.

� Para efectuar a diluição: aspirar imediatamente o líquido diluidor até à marca

101 (pipeta para eritrócitos) ou até à marca 11 (pipeta para leucócitos), tendo o

cuidado de não incorporar bolhas de ar e de fazer a aspiração continuamente.

� Terminada a diluição, tapar a extremidade graduada da pipeta com o polegar e a

outra extremidade (que estava adaptada ao pipetador) com o dedo médio. Agitação

manualmente com movimentos transversais e ondulatórios, durante 5 a 10 min.

Efectuar o mesmo procedimento para as duas pipetas.

� De imediato, proceder ao enchimento da câmara, colocando a extremidade da

pipeta com contacto com a lamela e, desprezando as primeiras 3 a 4 quatro gotas.

Deixar que a suspensão encha o retículo, penetrando nele por capilaridade. A zona

central da câmara deve ficar completamente cheia mas sem bolhas de ar e sem

transbordar para os sulcos laterais.

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� Manter as câmaras em repouso durante cerca de 10 min para que as células

sedimentem e permitam uma observação microscópica mais fácil.

� Colocar a câmara no microscópio e efectuar a contagem: localizar o retículo da

câmara usando a objectiva 5x. Depois de focado, trocar pela objectiva de 40x.

ATENÇÃO: devido ao perigo de exposição a agentes infecto-contagiosos como

sejam vírus (hepatite B, H.I.V. e outros), bactérias ou outros agentes nocivos durante o

manuseamento de sangue, cada aluno deverá trabalhar apenas com o seu próprio sangue.

Todos os objectos descartáveis que tenham estado em contacto com sangue deverão

ser depositados no recipiente amarelo que se destina à recolha deste tipo de produtos (não se

misturam com o lixo vulgar). Como objectos descartáveis entendem-se: lancetas, tubos de

recolha de sangue, algodões, luvas e tubos capilares.

Os objectos de vidro, não descartáveis, devem ser colocados nos recipientes que

contêm detergente desinfectante.

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A hemoglobina (Hb) dos glóbulos vermelhos transporta o oxigénio dos capilares dos

pulmões e liberta-os nos capilares dos tecidos. Uma característica importante no processo de

ligação do O2 à Hb é a sua reversibilidade. Em ambos os casos o oxigénio transfere-se de

acordo com o gradiente de concentração. Nos pulmões, onde a quantidade de oxigénio é alta,

este liga-se à Hb, mas nos tecidos, onde o nível de O2 é baixo, é libertado pela Hb,

difundindo-se para as células. A capacidade de oxigenação do sangue depende do número de

glóbulos vermelhos existente e consequentemente da quantidade de hemoglobina.

A hemoglobina é uma molécula protéica de grande dimensão, formada por dois pares de

cadeias polipetídicas globulares

(um par designado por cadeias α e

outro para chamado de cadeias β) e

quatro grupos orgânicos em forma

de disco que são os grupos heme,

cada um deles associado a uma

cadeia proteica. Cada grupo heme

contém no centro um ião ferroso

(Fe2+) capaz de se ligar a uma

molécula de oxigénio, por isso

cada molécula de hemoglobina

pode ligar-se a quatro moléculas de

oxigénio. É este complexo que

confere à Hb a sua cor vermelha característica.

Existem diferenças nas estruturas das cadeias da globina, que são designadas por alfa, beta,

gama e delta. Nos adultos, a forma mais comum (HbA) de Hb contém duas cadeias alfa e

duas cadeias beta.

Figura 10. Molécula de Hb.

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A Hb fetal á a forma principal existente no sangue do feto e do recém-nascido, sendo

constituída por duas cadeias alfa e duas cadeias gama. Esta forma tem propriedades que lhe

permite competir com sucesso com a HbA do sangue materno, de modo a captar o oxigénio

disponível, mesmo onde a sua concentração é baixa.

Cada molécula de Hb pode ligar-se quatro moléculas

de O2, uma a cada grupo heme, e nesta forma ela é

designada por oxihemoglobina. A forma que não

contém oxigénio ligado é chamada

desoxihemoglobina ou hemoglobina reduzida, tendo

uma cor vermelha muito mais escura do que a

oxihemoglobina. O sangue venoso, com um nível

mais baixo de O2, tem uma concentração superior de

desoxihemoglobina, exibindo este escurecimento da

cor.

A hemoglobina é, portanto, um composto corado que absorve luz na zona visível do espectro

e por isso torna-se possível medir a sua concentração de forma indirecta a partir da

intensidade de cor (absorvância) de uma amostra de sangue hemolisada. Contudo, uma vez

que os glóbulos vermelhos contém mais do que um tipo de hemoglobina, e estas absorvem a

luz a comprimentos de onda diferentes, não se pode efectuar a sua leitura directa. Existem

muitos métodos para avaliar a concentração de hemoglobina, a cujo conjunto se dá a

designação de hemoglobinometria. Todos eles são indirectos, dada a dificuldade em

cristalizar e pesar com rigor a hemoglobina (Hb).

Assim, no método a utilizar neste trabalho, utilizar-se-á o cianeto de potássio para converter

todas as formas de hemoglobina em cianometahemoglobina (HiCN é a forma oxidada da

hemoglobina na qual o ferro se apresenta na forma férrica – Fe3+). Uma amostra de sangue

completo com anticoagulante é diluída com uma solução que contém cianeto de potássio e

ferricianeto de potássio. O ferro da Hb, no estado ferroso, é convertido, pela acção do

ferricianeto de potássio, para o estado férrico, ou seja, a Hb é convertida em

metahemoglobina (Hi). Esta irá reagir com o cianeto de potássio, formando-se um pigmento

Figura 11. Grupo heme.

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de cor estável, a HiCN. A variação de absorvância relativamente à concentração de Hb

obedece à lei de Lambert-Beer. A absorvância da solução é medida

espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 546 nm, máximo de absorção da

HiCN, e onde não interferem a bilirrubina e os pigmentos carotenóides.

A concentração de hemoglobina pode então ser calculada após a medição da absorvância da

amostra e comparação com a absorvância de uma solução padrão de hemoglobina.

Material:

Espectrofotómetro programado para varrimento entre λ = 530 nm e λ = 550 nm

Células para espectrofotómetro de volume reduzido

Tubos de ensaio em vidro

Pipetas volumétricas de 2,0 ; 4,0 ; 5,0 e 6,0 ml

Micropipetas automáticas de 20 µl

Lancetas estéreis

Álcool a 70%

Algodão higienizado

Tubo com capilar e anticoagulante para recolha de amostra de sangue

Contentor para recolha de produtos contaminados

Cronómetro

Reagentes:

Reagente de Drabkin (já preparado)

Solução padrão de hemoglobina (metahemoglobina humana liofilizada)

equivalente à concentração de 18 g/dl de sangue completo (já preparada).

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Procedimento:

� Rotular 4 tubos eppendorf com as designações: Branco ; Padrão 1 ; Padrão 2

; Padrão 3 e um tubo de ensaio com o título Amostra.

� Distribuir a sol de Drabkin e a solução padrão de metahemoglobina de

acordo com os valores da tabela seguinte:

Tubo Sol. de Drabkin (ml) Sol padrão de Hb (ml) Concentração de Hb

Branco 1,5 0,0 0,0 g/dl

Padrão 1 1,0 0,5 6,0 g/dl

Padrão 2 0,5 1,0 12,0 g/dl

Padrão 3 0,0 1,5 18,0 g/dl

Amostra 1,25 0,0 ?

� Misturar muito bem as soluções contidas em todos os tubos.

� Calibrar o espectrofotómetro usando como referência a solução do tubo

Branco e efectuar a leitura das absorvâncias dos restantes tubos.

� Picar o dedo para obter uma amostra de sangue capilar seguindo

escrupulosamente o procedimento indicado na técnica de colheita de sangue

capilar, recolhendo 2 gotas de sangue num tubo apropriado.

� Misturar muito bem o sangue com o anticoagulante (poderá ser heparina,

EDTA ou citrato).

� Com o auxílio de uma micropipeta automática retirar 20 µl da amostra de

sangue e adicionar ao tubo Amostra. Misturar bem usando a micropipeta.

� Efectuar a leitura da absorvância usando novamente o Branco como

referência.

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A perfuração ou ruptura de um vaso sanguíneo desencadeia uma série de processos que, se

forem bem sucedidos, culminam na hemostasia, estancando a hemorragia. A hemóstase é um

processo complexo que envolve a parede vascular, as plaquetas e factores químicos, alguns

dos quais se encontram no sangue. A resposta à lesão de um vaso sanguíneo pode ser

considerada em três etapas.

�� O 1º processo é a resposta imediata do vaso (vasoconstrição) que faz diminuir o fluxo

sanguíneo no vaso danificado.

�� Segue-se a intervenção das plaquetas que ligando-se ao colagéneo do vaso libertam

ADP. A libertação deste ADP mantém as plaquetas juntas umas às outras no local

danificado formando o rolhão plaquetário uma espécie de barreira (um agregado

compacto que estanca a hemorragia).

�� Finalmente, dá-se a activação sequencial dos factores de coagulação do plasma que

têm como objectivo a formação da fibrina em torno do rolhão plaquetário (agregado

de plaquetas) criando um coágulo sanguíneo (coagulação).

A fibrina é uma proteína insolúvel, fibrosa que é produzida a partir do fibrinogéneo na

presença da enzima trombina. A produção de fibrina é instantânea desde que haja trombina

presente e por isso a formação de trombina a partir da pró-trombina é um processo bem

controlodo e que requer a activação sequencial de uma série de factores de coagulação.

A referida cascata pode ser iniciada quando os componentes do sangue entram em contacto

com uma superfície rugosa, como é o caso do vaso sanguíneo danificado. Não é necessária a

adição de factores externos ao sangue, sendo esta, portanto uma “via intrínseca”. É esta via

que entra em funcionamento quando o sangue é colocado num recipiente, por exemplo, num

copo de vidro, em que a coagulação é iniciada com a superfície do recipiente.

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Alternativamente, a activação da cascata pode ocorrer através de um factor libertado pelo

tecido lesado, a tromboplastina tecidular; esta é a “via extrínseca”.

As duas vias iniciais juntam-se numa via final comum, com a activação da protrombina e a

sua conversão em trombina. A protrombina, como muitos factores de coagulação, é formada

no fígado e circula como proteína plasmática. A conversão da protrombina em trombina é

conseguida pela acção do activador da protrombina, produzido como resultado da finalização

das vias extrínseca e intrínseca.

Quando o sistema de coagulação sanguíneo não é accionado pela tromboplastina tecidular

mas antes pela activação do factor de Hageman (factor XII) devido à exposição do plasma a

vidro, cristais ou colagéneo, então, os factores de coagulação são os intervenientes no

mecansimo intrínseco.

A etapa seguinte é a activação do fibrinogénio. Este é uma proteína plasmática produzida a

nível hepático. Quando o fibrinogénio é activado pela trombina, é convertido numa longa

molécula filamentosa, a fibrina. Nesta etapa, a fibrina é uma unidade simples, o monómero,

mas rapidamente se associa a outras moléculas para formar um polímero. Os filamentos de

fibrina são fragilmente mantidos unidos, mas o factor estabilizador da fibrina, ou factor XIII,

presente no plasma e nas plaquetas aprisionadas na rede de fibrina, provoca a formação de

fortes ligações cruzadas entre as suas cadeias, assim como favorece a adesão da fibrina às

paredes dos vasos. A coagulação está agora completa, o coágulo formado e a hemorragia

estancada.

A activação da via extrínseca provoca a coagulação sanguínea em apenas 10-15 seg, num

individuo saudável. A via intrínseca é geralmente mais lenta: 1-6 min.. Na prática, contudo, a

lesão resulta na activação das duas vias porque tanto o tecido danificado, e

consequentemente, a libertação da tromboplastina tecidular, como o traumatismo sanguíneo,

ocorrem simultaneamente.

Muitas pessoas apresentam alterações no tempo normal de formação da fibrina e esta

altreração pode ser devida a deficiências adquiridas ou congénitas. Existem várias

deficiências de origem hereditária nas quais um dos factores de activação pode estar ausente

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ou produzir-se de forma inadequada. A mais conhecida destas deficiências é a hemofilia

devida à incapacidade de produzir normalmente o factor de coagulação VIII. Outras

deficiências hereditárias estão associada aos factores II, VII, X, XI e XII.

Algumas pessoas possuem deficiências de vitamina K que é fundamental para a formação de

4 dos factores de coagulação e também da prótrombina. A insuficiêcnia em viatamina K

pode ser consequEñcia de terapias de antibióticos, de anticoagulantes orais, problemas

metabólicos relacionados com a absorção de lípidos e ainda pode surgir nos recém –

nascidos que não tenham ingerido a quantidade necessária de leite.

Este trabalho experimental consiste na determinação do tempo de pró-trombina que é um dos

testes de coagulação efectuados para determinar deficiências. Este teste detecta apenas

deficiências nos factores V, VII ou X, apresentando valores superiores aos normais. Para

efectuar um diagnóstico mais completo das deficiências associadas à coagulação do sangue é

necessário executar também o teste do tempo de activação parcial da tromboplastina que

detecta problemas ao nível do mecanismo intrínseco e é sensível a todos os factores de

coagulção excepto o factor VII (tromboplastina tecidular). Por exemplo, uma pessoa com

hemofilia poderá ter um valor normal no teste de pró-trombina e valores elevados no teste de

activação parcial da tromboplastina. Desta forma, estes dois testes complementa-se entre si.

A formação de trombina nas amostra de palsma será inibida se lhe for adicionado um

anticoagulante, como por exemplo o ácido cítrico ou o ácido oxálico pois removem os iões

cálcio do plasma. O cálcio é um cofactor na activação de um grande número de factores de

coagulação. Esta inibição pode ser facilmente revertida pela adição de Ca2+, durante os testes

de coagulação. Neste trabalho usar-se-á uma solução de tromboplastina tecidular extraída de

cérebro de coelho em solução tampão e cloreto de cálcio.

Material:

Centrífuga;

Tubos para recolha de sangue capilar com citrato de sódio a 3.2 %.

Banho térmico a 37ºC

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Micropipetas automáticas

Tubos de ensaio

Cronómetro

Tubos eppendorf

Reagentes:

Solução de tromboplastina com CaCl2

Cerca de 300 µl de sangue capilar

Procedimento:

� Recolher uma amostra de sangue capilar seguindo rigorosamente o

procedimento indicado na técnica de recolha de amostras para um tubo com

citrato de sódio. A proporção deverá ser de 9 partes de sangue para 1 parte de

anticoagulante e é crítica para a análise.

� Misturar bem o tubo contendo a amostra por inversão suave e centrifugar

durante 15 min a 1500 x g. Nofinal transferir todo o sobrenadante (plasma) para

um eppendorf.

� Aquecer a solução de tromboplastina em banho-maria a 37ºC durante 15

min.

� Aquecer também 100 µl de plasma num tubo de ensaio de vidro durante 1 a

3 min.

� Após o tempo de incubação adicionar rapidamente 200 µl de solução de

tromboplastina sobre a amostra de plasma e inicie simultaneamente o

cronómetro. Não retire a amostra do banho.

� Com a ajuda da micropipeta agitar a msitura continuamente durante cerca de

8 seg ( manter sempre no banho térmico).

� Após 10 seg remover o tubo do banho, enxugá-lo e colocá-lo em frente a

uma font de luz (janela ou lâmpada). Parar o cronómetro quando for visível o 1º

filamento de fibrina (que corresponde à alteração do aspecto de fluído para gel).

A utilização de um estilete pode ajudar nesta determinação. No caso de não ser

ainda visível a formação de coagulos colocar novamente no banho.

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A classificação do sangue humano em quatro grupos fundamentais, A, B, AB e O, baseia-se

na existência de factores antigénicos “contidos” nos GV e de dois anticorpos

correspondentes, que existem naturalmente no soro sanguíneo. Os primeiros chamam-se

isoaglutinogénios (substâncias aglutináveis) e os últimos isoaglutininas (substâncias

aglutinantes). No mesmo sangue não coexistem as isoglutininas e os aglutinogénios

correspondentes, isto é, o soro contém regularmente as isoglutininas para o isoglutinogénio

ausente.

Classificação GV Soro

AB . Contém aglutinogénio A e B.

. São aglutinados pelos soros dos

grupos A, B e O.

. Não contém aglutininas.

. Não aglutina os GV de nenhum

grupo.

A . Contém aglutinogénio A.


grupos B e O.

. Contém aglutininas anti-B.

. Aglutina os GV dos grupos B e AB.

B . Contém aglutinogénio B.


grupos A e O.

. Contém aglutininas anti-A.

. Aglutina os GV dos grupos A e AB.

O . Não contém aglutinogénio.

. Não são aglutinados por nenhum

soro.

. Contém aglutininas anti-A e anti-B.

. Aglutina os GV dos grupos A, B e

AB.

A determinação do grupo sanguíneo, através do método de placa é uma técnica bastante

rápida e de fácil execução. Contudo, apresenta a desvantagem de favorecer a pseudo-

aglutinação, fornecendo falsos positivos.

A aglutinação ocorre geralmente dentro de 1 a 2 min., mas em alguns casos pode ser tardia.

A leitura é efectuada da seguinte forma:

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negativo: não há aglutinação; a suspensão continua homogénea.

positivo: aglutinação visível macroscopicamente; os GV juntam-se, formando aglomerados

densos e irregulares.

A classificação é feita de acordo com o quadro:

Grupo Aglutinogénio Soro anti-A Soro anti-B Soro anti-AB

AB A e B + + +

A A + - +

B B - + +

O Nenhum - - -

Neste trabalho, a determinação dos grupos sanguíneos será efectuada através da pesquisa de

isoaglutinogénios existentes nos GV (classificação directa). Esta prova consiste em colocar,

numa placa, os glóbulos vermelhos “desconhecidos” em contacto com soros conhecidos, que

contêm aglutininas A, B e AB. De forma a evitar uma pseudo-aglutinação, os GV serão

previamente lavados. Os GV ensaiados serão classificados a partir da leitura visual dos

resultados.

Material

. Placas perfeitamente limpas, desengorduradas e secas

. Pipetas Pasteur e pequenos agitadores

. GV “desconhecidos” lavados e não diluídos

. Soro fisiológico

Reagentes - (previamente preparados)

.Soros anti-A, anti-B e anti-AB

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Procedimento

� Lave os GV “desconhecidos” com solução fisiológica para retirar o soro ou

plasma

� Coloque 1 gota de soro anti-A, anti-B e anti-AB em 3 cavidades da placa,

respectivamente

� Junte 1 gota de GV a cada uma delas

� Misture cuidadosamente as gotas com o agitador

� Imprima à lâmina movimentos suaves de inclinação lateral e ondulatórios, a

fim de acelerar a aglutinação

� Proceda à leitura dos resultados

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Fox, S. T. 1999. Laboratory Guide Human Physiology, 8th ed. WCB McGraw-Hill.

Vander A. Sherman, J. Luciano, D. 1998 Human Physiology: the mechanisms of body

function. WCB McGraw-Hill.

Murray, R. B., Granner, D. K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. 1996. Harper’s Biochemistry.

Appleton and Lange.

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Assinale na tabela seguinte os resultados experimentais obtidos, de acordo com a escala de

cores (exemplo para o teste de de Benedict):

- Azul (teste de Benedict negativo - não há presença de maltose)

+ Verde

++ Amarelo

+++ Laranja

++++ Castanho (teste de Benedict positivo – presença de açúcares redutores,

principalmente maltose).

Tubo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Conteúdo /

alteração

Teste do Iodo

Teste de

Benedict

Que conclusões se podem tirar quando o teste de Benedict e o teste do Iodo são ambos

positivos?

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Estes resultados seriam alterados se o tempo de incubação fosse prolongado?

Explique como é que a actividade da amilase é influenciada pelo pH e pela temperatura.

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Observe a aparência da clara do ovo após incubação em cada um dos tubos e preencha a

tabela seguinte com o registo das observações.

Tubo P1 Tubo P2 Tubo P3 Tubo P4 Tubo P5

Qual dos tubos apresenta a albumina mais digerida?

O que é que pode concluir acerca do valor de pH óptimo para a pepsina?

Compare o efeito da adição do HCl na parte A com a parte B deste trabalho. Explique as

diferenças em termos fisiológicos.

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Descreva a capacidade da pepsina para digerir proteínas de tamanho molecular elevado. Por

que motivo o estômago não se digere a ele próprio?

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Faça uma tabela com os valores de pH obtidos e relacione com as reacções verificadas.

Valores de pH Tubo L1 Tubo L2 Tubo L3

Em que tubo a digestão das gorduras ocorreu mais rapidamente?

Defina emulsão e explique os papéis individuais da bílis e da lipase pancreática na digestão

dos lípidos.

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Relativamente à digestão dos lípidos, descreva como os ácidos gordos e o glicerol são

absorvidos e transportados pelo organismo.

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Determine a concentração de glucose para cada amostra usando a seguinte fórmula:

300×−−

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AbsAbsAbsAbs

= conc. glucose (mg/dl)

Factor de conversão para unidades do Sistema Internacional: mg/dl x 0,0555 = mmol/l.

Explique o papel fisiológico da glucose no sangue e também porque motivo concentrações

anormais de glucose têm significado clínico importante.

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Registo dos resultados:

Registe na tabela seguinte as absorvâncias lidas no espectrofotómetro

Tubo /

Absorvância

Branco Padrão

total

Amostra

total

Padrão

HDL

Amostra

HDL

Análise

HDL

Determine a concentração de colesterol total para a amostra usando a seguinte fórmula:

200×−

−

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brancoamostra

AbsAbsAbsAbs

= conc. colesterol total (mg/dl)

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Determine a concentração de colesterol HDL para a amostra usando a seguinte fórmula:

50×−−

brancopadrãoHDL

brancoamostraHDL

AbsAbsAbsAbs

= conc. colesterol HDL (mg/dl)

Factor de conversão para unidades do Sistema Internacional: mg/dl x 0.0259 = mmol/l.

Indique qual é o principal transportador de colesterol no plasma humano:________________

Diga, justificando se algum dos plasmas testados lhe parece pertencer a um indivíduo com

um distúrbio metabólico.

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Registe na tabela seguinte as distâncias em cm medidas para cada um dos padrões e das

amostras analisadas:

Mancha Testosterona Hidrocortisona ββββ-estradiol amostra

Distância (cm)

Distância desde a origem até à frente do solvente = _____________(cm)

Calcular os valores dos factores de retenção Rf, para os padrões e para cada amostra usando a

seguinte expressão:

solvente

manchaf D

DR ≡ sendo:

Dmancha distância desde a origem até à mancha em cm;

Dsolvente distância desde a origem até à frente do solvente em cm;

Mancha Testosterona Hidrocortisona ββββ-estradiol amostra

Rf

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Com base nos valores de Rf dos esteróides conhecidos (padrões), determinar quais os

esteróides presentes nas amostras. Com base nos valores calculados indique qual é a

solubilidade relativa dos esteróides analisados.

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Contagem de GV:

Quadrado central

Quadrado A B C D E

Nº de células

Nº total de células nos quadrados contados =

Numeração de eritrócitos (nº de eritrócitos / ml) = nº total de células contadas nos 5

quadrados x 104

Tome em consideração a diluição efectuada.

Contagem de GB:

Quadrado nº 1 2 3 4

Nº de células

Nº total de células nos quadrados contados =

Numeração de leucócitos (nº de leucócitos / ml) = nº células total de contadas nos 4

quadrados x 104

Tome em consideração a diluição efectuada.

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Valores de referência:

Eritrócitos:

Homens adultos: 4,5 a 6,0 X 1012 / l de sangue

Mulheres adultas: 4,0 a 5,5 X 1012 / l de sangue.

Leucócitos (em adultos): 7,5 ± 3,5 109 / l de sangue

Comente os resultados obtidos.

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Registe na tabela os valores das absorvâncias medidos no espectrofotómetro para cada

solução:

Tubo Concentração de Hb Absorvância

Branco 0,0 g/dl

Padrão 1 6,0 g/dl

Padrão 2 12,0 g/dl

Padrão 3 18,0 g/dl

Amostra ?

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Com os valores de absorvância obtidos para as soluções padrão efectuar uma curva de

calibração. Determina no Excel a equação da recta.

Calcular a concentração de hemoglobina na amostra com base nessa equação.

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Comente o resultado obtido com base nos seguintes valores de referência para a

hemoglobina:

Homens adultos: 13 – 18 / dl de sangue

Mulheres adultas: 11 – 16 / dl de sangue

Recém – nascidos: 14 – 23 / dl de sangue.

Alguns bébés recém–nascidos, principalmente os prematuros, sofrem de icterícia. Como se

relaciona esta situação com o decréscimo da concentração em glóbulos vermelhos?

Apresente as causas e os perigos da anemia.

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Tempo de coagulação obtido: _______________(seg)

Comente o resultado:

Porque motivo se usou como anticoagulante o ácido cítrico em vez da heparina nos testes de

coagulação?

Seria recomendável que um indivíduo com um tempo de coagulação elevado fizesse terapia

com vitamina K? Este tratamento teria efeitos imediatos no tempo de coagulação?

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Para cada amostra analisada, registe na tabela seguinte se ocorreu (com um sinal +) ou não

(assinale com -) aglutinação com cada um dos soros:

Amostra Soro anti-A Soro anti-B Soro anti-AB Grupo sanguíneo

Em função dos resultados obtidos determine qual é o grupo sanguíneo de cada amostra

analisada.

homepage.ufp.pthomepage.ufp.pt/pedros/qfisio/q_fisio_lab.pdf · os relatórios serão...

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