-MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO

E DESINFECÇÃO

- CINÉTICA DE MORTE MICROBIANA

Definição de termos

Esterilização: destruição ou eliminação total dos microorganismos.

Sanitização: procedimento que envolve diferentes processos, visando obter o grau de higiene e limpeza adequados.

Desinfecção: processo para eliminar os microorganismos patogênicos, sem necessariamente eliminar, todas as bactérias e esporos.

Anti-sepsia: desinfecção da pele, mucosas ou

tecidos.

Agentes biocidas: morte dos microrganismos.

Agentes biostáticos: inibição do crescimento.

Definição de termos

- Métodos de esterilização e desinfecção -

Fatores que influenciam o crescimento microbiano

• Temperatura

• Tipo de microrganismo

• Fase de crescimento

• Ambiente

Resistência de microrganismos aos

métodos de esterilização e desinfecção

Maior resistência

Menor resistência

-Prions

- endosporos de bactérias

- mycobacterias

- Gram negativos

- Fungos

- Vírus (sem envelope)

- Gram positivos

- Vírus com envelope lipídico

MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO

- Significa a completa destruição de todos os

organismos vivos e seus esporos ou sua completa

remoção da preparação.

- Processos físicos: métodos térmicos

1. Calor úmido (Vapor);

2. Calor seco;

- Processos físicos: métodos não-térmicos

3. Filtração;

4. Radiação ionizante.

- Processos químicos:

5. Esterilização por GASES.

- Métodos de esterilização e desinfecção –

Modos de ação

Lesão dos ácidos nucleicos

Desnaturação das proteínas

Inibição do metabolismo

Ruptura da membrana celular

CALOR ÚMIDO OU VAPOR (método físico)

- Feita em autoclaves e emprega vapor sob pressão.

- Método escolhido na maioria dos casos em que o

produto é capaz de resistir a tal tratamento.

- Mais rápido que calor seco (pois quando há presença de

água, as bactérias são coaguladas e destruídas em Tº’s

mais baixas - desnaturação de proteína e quebra das

pontes de H – cinética morte microbiana)

10 libras de pressão (115ºC, por 30’) (não inativa endosporos

e alguns vírus)

15 libras de pressão (121ºC, por 20’)

20 libras de pressão (125ºC, por 15’)

Quanto > pressão, mais elevada a Tº e < tempo de esterilização

Útil para esterilizar: soluções farmacêuticas

em geral, frascos de vidro, compressas e

instrumentos cirúrgicos.

Não serve para esterilizar: preparações

oleosas ou outras que não sejam penetradas

por umidade e pós.

VAPOR (método físico)

Monitoramento do ciclo

Esterilização a vapor

• Mecânicos – registros tempo, T°C e pressão.

• Químicos – fita teste e Teste Bowie-Dick.

• Biológicos – Ampolas contendo esporos de Bacilos

Stearothermophilus.

Indicadores Químicos

Classe 1: Tiras impregnadas com tinta termo-química

que muda de coloração quando exposto a

temperatura.

usados externamente em todos os

pacotes

evidenciam a passagem do material

pelo processo

Teste de BOWIE & DICK - testa a eficácia do sistema de

vácuo da autoclave pré-vácuo. Classe 2:

verifica a eficiência da bomba de vácuo

espera-se mudança uniforme da cor do papel, em toda sua extensão

recomenda-se que seja feito no primeiro ciclo do dia ou pelo menos a

cada 24 horas

caso não haja homogeneidade na revelação, efetuar revisão imediata do

equipamento

Teste OK Falha no teste

VALIDAÇÃO DA ESTERILIZAÇÃO A

VAPOR

- Usa-se um indicador biológico (preparação constituída

de microrganismos específicos e resistentes a

determinado processo de esterilização).

- Bacillus stearothermophilus (120ºC)

- Bacillus subtilis (110ºC)

Indicadores Biológicos

- São preparações padronizadas de microorganismos,

numa concentração do inócuo em torno de 106,

comprovadamente resistentes e específicos para um

particular processo de esterilização para demonstrar

a efetividade do processo.

• Primeira geração: tiras de papel com esporos

microbianos, incubados em laboratório de

microbiologia com leitura em 2-7 dias.

Segunda geração: auto-contidos

com leitura em 24 a 48 horas.

Terceira geração: auto-contidos

com leitura em 1 a 3 horas.

CALOR SECO (método físico)

- Utiliza-se estufa;

-Tempos de exposição e temperatura: variam conforme o

tipo de material a ser esterilizado; Temperatura

171o.C

160o.C

149o.C

141o.C

121o.C

- Morte microorganismo, ocorre por desidratação celular

(OXIDAÇÃO);

- O maior problema relacionado é o fato de que a

penetração do calor é difícil, lenta e distribui-se de forma

heterogênea.

Tempo

60 minutos

120 minutos

150 minutos

180 minutos

16horas

ÚTIL PARA ESTERILIZAR: ÓLEOS FIXOS,

GLICERINA, DERIVADOS DE PETRÓLEO –

VASELINA E PARAFINA, DIVERSOS PÓS

ESTAVEIS AO CALOR (ÓXIDO ZINCO),

ARTIGOS DE VIDRO E INSTRUMENTOS

CIRÚRGICOS.

CALOR SECO (método físico)

FILTRAÇÃO (método físico)

-Remoção física de microrganismos por adsorção sobre

um meio filtrante;

- Usa-se este método quando as soluções são

termossensíveis;

- Existem, comercialmente, vários tipos de filtros com

especificações variadas quanto ao tamanho dos poros.

(ex. Millipore – 0,22 a 0,45µm);

-As membranas filtrantes permitem a filtração de grandes

volumes de produto, mantendo sua característica e

obtenção de um produto estéril.

- filtros HEPA – filtração do ar (qualidade do ar de salas

limpas).

- Vantagens: quando o aquecimento não pode ser

aplicado e para pequenos volumes líquidos.

-Desvantagem: membranas são frágeis (observar se

houve rompimento) e tempo de filtração quando

soluções viscosas.

VALIDAÇÃO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO:

- Via teste destrutivo: retenção bacteriológica

(concentração de 107 UFC de Brevundimonas

diminuta ATCC19146 por centímetro quadrado de área

filtrante).

- Via teste não destrutivo: integridade da membrana

(teste de Ponto de bolha e Fluxo Difusivo).

-Teste de Integridade

- Basicamente os filtros são hidrofílico (líquido

molhante=água),

- e hidrofóbico(líquido molhante=álcool isopropílico

60% + água 40%)

- São realizados testes iniciais e finais antes e depois

de cada processo de filtração.

-Teste de Ponto de bolha: O teste de Ponto de Bolha

consiste em se molhar o filtro com líquido conveniente

e aplicar uma pressão de gás (ar comprimido ou N2)

suficiente para expulsar o líquido de dentro dos

maiores poros da membrana. Ao atingir esta pressão,

o gás que está pressurizando a membrana molhada

consegue atravessá-la e pode ser visualizado na saída

do filtrado.

Teste de Fluxo Difusivo: O teste de Difusão mede a vazão

de gás que passa por difusão através do líquido que está

dentro dos poros da membrana molhada, isto é, sem

expulsar o líquido dos poros. O teste é realizado com

pressão constante e temperatura controlada. A vazão de

difusão deve ser menor que o valor definido pelo

fabricante do filtro, que também deve comprovar a

correlação do valor máximo de difusão com a retenção de

microorganismos, para garantir um grau de retenção

esterilizante para cada lote de fabricação.

Obs. B. diminuta é escolhida devido à sua característica

de crescimento mantendo células isoladas, de dimensão

(0,3 a 0,6µm), fácil manutenção e crescimento rápido.

Millipore

filtros HEPA

RADIAÇÃO GAMA (método físico)

• A radiação gama proveniente do Co-60 é uma onda

eletromagnética curta, de alta frequência e alta

energia que, assim como as microondas e as ondas

de rádio, faz parte do espectro natural de ondas

eletromagnéticas, um dos mais amplos da natureza.

Devido à sua energia, possui alto poder de

penetração.

• A energia transferida pela radiação gama provoca a

quebra da molécula de DNA dos microorganismos

através da retirada de elétrons orbitais dessas

moléculas.

• A quantidade de energia envolvida no processo é

desprezível e não provoca elevação de temperatura,

podendo ser classificado como um processo frio.

– Ionizante

• raios γ

• raios X

– Não-ionizante

• UV (260nm)

• micro-ondas Ar em ambientes

fechados

Fármacos, soros, vacinas

e material médico

Cinética de morte: radicais livres muito reativos

lesão do DNA

RADIAÇÃO

GÁS (método químico)

-Equipamento especializado, exposição ao óxido de

etileno ou óxido de propileno (gases altamente

inflamáveis, quando misturados com ar – diluir com gás

inerte (dióxido carbono);

Tempo de 4 a 18 hrs de exposição – óxido etileno, age

interferindo as células bacterianas - liga-se a grupos

funcionais (-SH;-COOH; -OH).

- Gás de alto poder penetrante (útil em utensílios

cirúrgicos: cateteres, agulhas e seringas descartáveis;

certos antibióticos, preparações enzimáticas termolábeis,

material têxtil).

ALDEÍDOS – líquido (método químico)

• Formaldeído

• Glutaraldeído Atuam por alquilação

mais eficaz e menos tóxico.

ativo na presença de matéria orgânica.

- Utilizado para embalsamar.

Carcinogénico!

Esterilização de filtros HEPA.

- Material hospitalar termo-sensível: -médico, -cirúrgico

Radiação gama

Desinfecção : Reduzida, Elevada, Intermediária.

Anti-sepsia

Lavagem de feridas e

pele pré-operatório.

Lavagem de mãos e

antebraços do cirurgião.

Desodorizantes

Lavagem de mãos

MÉTODO IDEAL:

Rápido

Eficaz contra todos microrganismos

Não tóxico

De fácil penetração

Estável

Aplicável a vários materiais e tecido humano

Sem odor e cor

Custo reduzido

PIROGÊNIO

PIROGÊNIO

- Década de 1912, a eliminação de bactérias por

esterilização térmica ou filtração, não eliminava a

pirogenicidade (febre) destas preparações. Esterilidade

não é sinônimo de apirogenicidade.

Pirogênios são substâncias orgânicas originadas de

microorganismos. Eles não estão vivos, mas há

presença de restos celulares e toxinas (endotoxinas

ou polissacarídeos da parede externa da célula

bacteriana). São responsáveis por muitas das reações

febris em pacientes após injeção intravenosa.

AÇÃO BIOLÓGICA:

- Muitas atividades biológicas estão atribuídas à unidade

lipídeo A da endotoxina, entre as quais: pirogenicidade,

toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose,

necrose da medula óssea, reabsorção do osso

embrionário, agregação plaquetária...

Indução de febre:

- Envolve a fagocitose do lipídeo A pirogênio endógeno

Atravessa barreira hematoencefálica

Altera o ponto de equilíbrio dos neurônios reguladores de temperatura

do hipotálamo

TESTE PARA PIROGÊNIO

TESTE IN VITRO:

- KIT “LAL”(teste lisado de amebócitos de Limulus) para

detecção de endotoxinas bacterianas.

- Extrato obtido de células sanguíneas de um crustáceo

(Limulus polyphemus) contém um sistema de proteínas e

enzimas que coagula na presença de baixos índices de

lipossacarídeos. Sensibilidade do ensaio 0,25 –

0,015UE/mL

- Faz-se diluição do produto em mais de duas vezes o seu

volume (inibe a interferência dos ativos da formulação no

resultado do teste).

- Resultado positivo: Gelificação do lisado do amebócito

de Limulus

TESTE IN VIVO:

-Teste de pirogênio em coelhos: é um ensaio limite, com

a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra, mediante

informações obtidas de um grupo de coelhos, e que

devem atender a um nível de padrão de estado febril.

- Cada grupo de animais recebe a injeção intravenosa da

amostra e é observado durante um período de ± 3hrs.

- Elevação térmica de pelo menos 0,5ºC é considerada

decorrente da inoculação de dose pirogênica de material

estranho.

Considerações:

- Quanto > nº de animais, mais segura decisão.

- Praticidade e Custos do ensaio.

- Reação fisiológica do animal.

PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO

Inativação ou remoção das endotoxinas.

- INATIVAÇÃO: detoxificação da molécula (LPS), usando

tratamentos químicos ou altas temperaturas.

1.Hidrólise ácido-base (reduz/elimina atividade biológica

LPS – desativação lípídeo A).

2.Oxidação: Peróxido de Hidrogênio (oxidação dos

ácidos graxos presentes no lipídeo A) – outros:

hipoclorito, permanganato de potássio, ácido nítrico.

3.Alquilação (redução da atividade – óxido de etileno):

materiais termolábeis.

4.Processo térmico: calor seco (estufas – 250ºC – 30 min)

5.Radiação Ionizante - 60Co.

- REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS

1. Destilação – água recém destilada, coletada emantida

em frascos despirogenizados estéreis é apirogênica.

2. Ultrafiltração: retidas no filtro.

3. Osmose reversa: filtração sob pressão.

4. Carvão ativo: baseado na adsorção de endotoxinas ao

carvão.

Obtenção de produtos apirogênicos

A partir dos métodos despirogenizantes, observa-se

limitações quanto à aplicação no produto terminado,

devido

Incompatibilidade de distintas naturezas, riscos envolvidos,

aspectos econômicos.

Exceto para água apirogênica!!

IMPORTÂNCIA em trabalhar todo processo produtivo em condições adequadas de:

-Higiene (operadores e ambiente);

-Matérias-primas com baixa carga microbiana;

-Processos validados;

-Pessoal Qualificado e Treinado;

-Aplicação de todos os conceitos de BPF.

Garantir que o produto seja obtido apirogênico no primeiro

processamento, dispensando reprocessos ou tratamentos adicionais!!!