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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
WESLLEY JOSÉ MOREIRA GARCIA
USO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA DETERMINAÇÃO
DE Streptococcus pneumoniae E SOROTIPOS COLONIZADORES
DA NASOFARINGE NA ERA PÓS-VACINAL
Dissertação de Mestrado
Goiânia
2013
i
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–
UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações –
BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o
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1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Weslley José Moreira Garcia
CPF: 011.303.391-57 E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não
Vínculo Empregatício do autor Não
Agência de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico Sigla: CNPq
País: Brasil UF: DF CNPJ: 33.654.831/0001-36
Título: Uso de técnicas moleculares para determinação de Streptococcus
pneumoniae e sorotipos colonizadores da nasofaringe: implicações para
avaliação do impacto de vacinas pneumocócicas
Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, portador nasofaríngeo, vacinas
pneumocócicas conjugadas
Título em outra
língua:
Using molecular techniques for Streptococcus pneumoniae and
nasopharyngeal colonizer serotypes determination: implications
for assessing the impact of pneumococcal vaccines
Palavras-chave em
outra língua:
Streptococcus pneumoniae, pneumococcal carriage,
pneumococcal conjugate vaccines
Área de concentração: Epidemiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 23/01/2013
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação de Medicina Tropical e
Saúde Pública
Orientador(a): Dra. Ana Lúcia Sampaio Sgambatti de Andrade
CPF: 235.715.191-91 E-mail: [email protected]
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_________________________________ Data: ____ / ____ / _____
Weslley José Moreira Garcia
1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
ii
WESLLEY JOSÉ MOREIRA GARCIA
USO DE TÉCNICAS MOLECULARES PARA DETERMINAÇÃO
DE Streptococcus pneumoniae E SOROTIPOS COLONIZADORES
DA NASOFARINGE NA ERA PÓS-VACINAL
Orientadora:
Professora Dra. Ana Lúcia S. S. de Andrade
Estudo realizado com o apoio financeiro da CNPq.
Goiânia
2013
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública,
área de concentração em Epidemiologia.
iii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno: Weslley José Moreira Garcia
Orientadora: Dra. Ana Lúcia S. S. de Andrade
Membros:
1. Prof. Dra. Ana Lúcia S. S . de Anndrade
2. Prof. Dr. André Kipnis
3. Prof. Dra. Ruth Minamisava
Data: 23/01/2013
v
“Não há nada permanente, a não ser a mudança.”
Heráclito
http://pensador.uol.com.br/autor/horacio/
xi
DEDICATÓRIA
A Lázara, minha mãe, pelo amor
incondicional e preocupação dispensada
durante esta e outras etapas da minha
vida.
A José Moreira (in memorian),
meu pai, pelos exemplos de superação
deixados à nossa família.
A Jean, meu irmão pelo apoio e
compreensão.
xii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela integridade da minha saúde, pela
sabedoria nos momentos de decisão e pela companhia nos momentos de solidão. A Sua
graça me permitiu chegar tão longe.
À Professora Doutora Ana Lúcia S. S. de Andrade, minha orientadora, pela
oportunidade que me foi cedida isenta de qualquer indicação pessoal. Pelo exemplo de
pesquisadora com incessante busca por conhecimento. Por sua capacidade visionária e
por cada momento compartilhado que me permitiram valiosos aprendizados. A ela, todo
meu respeito e admiração.
Ao Professor Doutor André Kipnis pelo exemplo de professor e pesquisador;
pelas sugestões e correções feitas tanto no exame de qualificação quanto na defesa da
dissertação que contribuíram para o enriquecimento deste trabalho.
À Professora Doutora Ruth Minamisava pelos ensinamentos na análise de dados
e pela participação na banca de defesa.
Às professoras Doutora Marília Turchi e Doutora Mariane Stefani que
gentilmente participaram da banca de qualificação.
À Professora Doutora Maria Aparecida Vieira pela coordenação das equipes de
campo do Projeto Impacto bem como a equipe da sala 410 que sempre disponibilizou as
informações necessárias ao trabalho laboratorial.
À Professora Doutora Maria Cláudia Dantas P. B. André pelo espaço cedido no
Laboratório de Microbiologia Aplicada para o desenvolvimento deste trabalho. Sua
generosidade e bom humor serão sempre lembrados.
xiii
À Professora Doutora Juliana Lamaro-Cardoso pela amizade sincera e pelos
conhecimentos compartilhados ao longo da jornada. Saber que poderia contar com ela
tornou a caminhada mais fácil.
À Equipe do Laboratório de Microbiologia Aplicada do IPTSP, pelo imenso
trabalho desenvolvido ao longo de todo o projeto. Agradeço pelos momentos de
companheirismo, aprendizado compartilhado, pela amizade verdadeira, cumplicidade e
convivência que tornaram o trabalho menos árduo. Compartilho o mérito deste trabalho
com vocês, Lorrane Neves, Luciana Ferreira, Tainá Guerreiro e Yves Mauro.
Aos amigos de pós-graduação, Fábio Muniz, Gabriela Camargo, Lázaro Neto,
Lorena Motta, Maísa, Natália Brandão, Renato Machado, Thaísa Cristina por
compartilharem as alegrias e ansiedades.
À amiga Ana Laura Zara pela amizade sincera, carinho e agradável convivência
rotineira. Agradeço o auxílio na formatação do trabalho, a generosidade e pelas vezes
que acreditou mais em mim do que eu mesmo. A ela, devo minha gratidão.
À amiga Sandra Maria pela amizade e serenidade transmitidas durante o
percurso da pós-graduação e por perdurarem fora dela.
À minha família, aos meus irmãos e amigos que sempre me apoiaram e
entenderam minhas ausências.
Às crianças e seus responsáveis que consentiram em participar do estudo, minha
gratidão.
xiv
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA .............................................................................................................. XI
AGRADECIMENTOS ................................................................................................... XII
SUMÁRIO ..................................................................................................................... XIV
FIGURAS E TABELAS ................................................................................................ XVI
SIGLAS E ABREVIATURAS ..................................................................................... XVII
RESUMO ...................................................................................................................... XIII
ABSTRACT .................................................................................................................... XIV
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
1.1 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E SAÚDE PÚBLICA .............................................................. 1
1.2 COLONIZAÇÃO POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE NA INFÂNCIA ...................................... 2
1.3 PREVALÊNCIA DE PORTADOR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E SOROTIPOS .................. 4
1.4 TECNOLOGIAS UTILIZADAS PARA DETECÇÃO DE SOROTIPOS .............................................. 5
1.5 IMPACTO DA VACINAÇÃO NO PORTADOR ......................................................................... 13
2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 16
3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 17
3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 17
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................... 17
4 MÉTODOS .................................................................................................................. 18
4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA .......................................................................................... 18
4.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO .................................................................................................. 18
4.3 AMOSTRAGEM E TAMANHO DA AMOSTRA ........................................................................ 18
4.4 COLETA DE DADOS EPIDEMIOLÓGICOS ............................................................................. 19
4.5 COLETA DE SWAB NASOFARÍNGEO ..................................................................................... 19
4.6 ISOLAMENTO DO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE .............................................................. 19
4.6.1 CULTURA (PADRÃO-OURO) ....................................................................................................... 19
4.6.2 EXTRAÇÃO DE DNA ................................................................................................................. 20
4.6.3 RT-PCR .................................................................................................................................... 20
4.6.4 PCR MULTIPLEX PARA SOROTIPAGEM DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ................................. 21
4.7 ANÁLISE DE DADOS ........................................................................................................... 22
4.8 ASPECTOS DE BIOÉTICA ..................................................................................................... 23
5 RESULTADOS ........................................................................................................... 24
xv
5.1 PREVALÊNCIA .................................................................................................................... 24
5.2 ACURÁCIA DA RT-PCR E PCR MULTIPLEX. ..................................................................... 25
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 30
7 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 34
8 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 35
xvi
FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Efeito da vacinação na patogênese da Doença Pneumocócica. ........................ 3
Figura 2. Gráfico de amplificação do gene lytA a aprtir do DNA extraído de amostras
nasofaríngeas. ................................................................................................................. 21
Figura 3. Curva ROC para valores de Ct preditivos de cultura positiva para pneumococo
para não vacinados.......................................................................................................... 26
Figura 4. Curva ROC para melhor acurácia na detecção de sorotipos de pneumococo
para não vacinados.......................................................................................................... 27
Tabela 1. Métodos moleculares utilizados para identificação de Streptococcus
pneumoniae e sorotipos .................................................................................................... 6
Tabela 2. Estudos de portador em nasofaringe utilizando técnicas moleculares para
detecção de Streptococcus pneumoniae e sorotipos capsulares em crianças no período
de 2000 a 2012 ................................................................................................................ 11
Tabela 3. Comparação entre prevalência de portador de Streptococcus pneumoniae em
crianças de 7 a 18 meses por cultura e pela técnica de RT-PCR. Goiânia, outubro/2010 a
março/2011 ..................................................................................................................... 24
Tabela 4. Prevalência de portador de Streptococcus pneumoniae em crianças de 7 a 18
meses de acordo com a situação vacinal da PCV-10 e técnica utilizada ........................ 25
Tabela 5. Valores de Ct* preditivos de cultura positiva para Streptococcus pneumoniae
por situação vacinal ........................................................................................................ 25
Tabela 6. Valores de Ct* preditivos de cultura positiva para Streptococcus pneumoniae
por situação vacinal ........................................................................................................ 26
Tabela 7. Prevalência de sorotipos de pneumococo pela PCR multiplex para valores de
Ct < 35,0 ......................................................................................................................... 27
Tabela 8. Prevalência de Streptococcus pneumoniae de acordo com situação vacinal e
diferentes valores de Ct .................................................................................................. 28
Tabela 9. Prevalência de sorotipos encontrados entre as crianças com valores de Ct entre
33 e < 35 e 30 e < 33 ...................................................................................................... 29
xvii
SIGLAS E ABREVIATURAS
µg Micrograma
µL Microlitro
CA Califórnia
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Ct Cycle threshold – Ciclo da PCR
DNA Ácido desoxirribonucleico
DPI Doença Pneumocócica Invasiva
E Especificidade
EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
EUA Estados Unidos da América
FAPEG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás
FUNAPE Fundação de Apoio à Pesquisa
g/mL Gramas por mililitro
GO Goiás
HCl Ácido clorídrico
HIV Human Immunodeficiency Virus - Vírus da Imunodeficiência Humana
IPSTP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
mL Mililitro
NJ New Jersey
OMS Organização Mundial de Saúde
PA Pennsylvania
PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase
PCV-7 Vacina pneumocócica conjugada 7-valente
PCV-9 Vacina pneumocócica conjugada 9-valente
PCV-10 Vacina pneumocócica conjugada 10-valente
PCV-13 Vacina pneumocócica conjugada 13-valente
xviii
PPV-23 Vacina pneumocócica de polissacarídeos 23- valente
PNI Programa Nacional de Imunização
PRONEX Programa de Apoio a Núcleos de Excelência
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da
Polimerase Quantitativa
RFLP Reference Fragment Lenght Polimorfism
ROC Receiver Operating Characteristics
RT-PCR Real Time Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da
Polimerase em tempo real
S Sensibilidade
S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae
SpNT Streptococcus pneumoniae não tipáveis
STGG Skim-milk Tryptone Glucose Glycerol
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
U/mL Unidades por mililitro
UFG Universidade Federal de Goiás
NVT Tipos não vacinais
VT Tipos vacinais
xiii
RESUMO
Introdução: O Brasil foi o primeiro pais a introduzir a vacina pneumocócica conjugada,
10-valente (PCV10), no Programa de Imunização infantil, em 2010. A colonização
nasofaringeana pelo Streptococcus pneumoniae ocorre na infância e é etapa obrigatória
para desenvolvimento da doença invasiva. Até o momento nenhum estudo avaliou o
impacto da vacinação na redução do estado de portador. Para avaliação do impacto de
vacinas deve-se utilizar tecnologias de alta acurácia. Este estudo utiliza técnicas
moleculares, recentemente desenvolvidas, para detecção de pneumococo e sorotipos de
secreção nasofaringeana.Objetivos: (i) Comparar a prevalência de colonização
nasofaringeana por S. pneumoniae pelas técnicas de PCR em tempo real (RT-PCR) e
cultura (“padrão-ouro”) em crianças residentes em Goiânia no primeiro ano de
introdução da PCV10; (ii) avaliar a colonização simultânea por pneumococo por
diferentes sorotipos por meio da reação de PCR multiplex. Métodos: Um inquérito
populacional domiciliar foi conduzido de outubro/2010 a março/2011, com coleta de
1.437 swabs nasofaríngeos de crianças < 24 meses de idade. A amostragem foi
sistemática, ponderada por setor censitário, com tamanho da amostra calculado para
prevalência esperada de 50% de portador. O isolamento do pneumococo foi realizado a
partir do caldo enriquecido (meio STGG). A cultura foi realizada pela semeadura do
caldo em placas de Agar sangue de carneiro. A RT-PCR foi direcionada para o gene
lytA do pneumococo, utilizando como positividade valores do ciclo da PCR (Ct-Cycle
threshold) <35,0. A reação de PCR multiplex para sorotipagem foi realizada para
amostras com valores de Ct<35,0. Foram construídas curvas ROC (Receiver Operating
Characteristics) para identificação de valores de Ct preditivos de cultura positiva e de
tipo capsular. Resultados: A prevalência de pneumococo obtida pela RT-PCR foi de
56,9%, estatisticamente maior do que a prevalência de 39,3% obtida pela cultura (p<
0,001), independente da situação vacinal da criança. Dentre as 818 crianças positivas
pela RT-PCR, em 54,2% delas foi possível detectar-se o tipo capsular. Cocolonização
por diferentes sorotipos foi encontrada em 6,9% (100/1.437) das crianças. Valores de
Ct33,0 apresentaram a melhor acurácia (91,4%) na predição de cultura positiva para
pneumococo (sensibilidade/S=88% e especificidade/E=81,2%). Para detecção de
sorotipos a melhor acurácia da PCR multiplex foi para valores de Ct32,0 (S=90% e
E=84,7%). Conclusão: Os resultados sugerem que as técnicas de PCR em tempo real e
multiplex apresentam grande potencial para serem utilizadas em estudos de avaliação de
impacto da vacinação, respectivamente no portador e nos sorotipos vacinais. Estudos
deverão ser conduzidos para se avaliar o custo-benefício da utilização desta tecnologia
em larga escala.
Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, portador nasofaríngeo, vacinas
pneumocócicas conjugadas.
xiv
ABSTRACT
Introduction: Brazil was the first country to introduce the pneumococcal conjugate 10-
valent vaccine into the National Immunization Program for infants, in 2010. The
nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae occurs early in life. It is the
first step for the development of invasive diseases. So far no study has evaluated the
impact of vaccination on the reduction on pneumococcal carriage. The evaluation of the
impact of vaccination should based on technologies with high accuracy. In this
investigation we applied molecular technologies, recently developed, to ascertain
pneumococcal nasopharyngeal colonization and serotypes. Objectives: (i) to compare
the prevalence of S. pneumoniae nasopharyngeal colonization by using real-time PCR
(RT-PCR) and multiplex PCR, and culture (“gold standard”) in children residing in
Goiania municipality; (ii) to evaluate the simultaneous colonization by different
serotypes by using the multiplex PCR technique. Methods: A household population-
based survey was carried out between October/2010 and March/2011 by using a
systematic sampling, weighted by census tract. Based on previous studies, the sample
size was calculated taking into account an estimated 50% of pneumocococcal carriage.
A total of 1,437 nasopharyngeal swabs were collected from children less than 24
months of age. Broth-enriched culture of nasopharynx specimens followed by
pneumococcal isolation by both, culture and RT-PCR targeting the lytA gene (S.
pneumoniae) were performed. Pneumococcal carriage was defined for RT-PCR Cycle
threshold (Ct) < 35.0, and therefore all samples were submitted to multiplex PCR to
detect serotypes. ROC curve (Receiver Operating Characteristics) were built up to
identify Ct values predicted of S. pneumoniae positive culture. Results: The prevalence
of pneumococcal carriage by RT-PCR (56.9%) was statistically higher (p< 0,001),
compared to that obtained by culture (39.3%), regardless of the vaccination status.
Among the 818 positive children/samples by RT-PCR, in 54.2% of them it was possible
to detect the serotype. Simultaneous colonization by different types was found in 6.9%
of the children. Ct values Ct33.0 showed the best accuracy (91.4%) to predict positive
pneumococcal culture (Sensitivity=88% and Specificity=81.2%). When using Ct values
32.0 we found the best accuracy of multiplex PCR in detecting serotypes (Sensitivity
=90% and Specificity =84,7%). Conclusion: Our findings suggest that RT-PCR and
multiplex PCR techniques showed great potential to be used in evaluating the
vaccination impact. Further studies are needed to evaluate the cost-effectiveness of
using these technologies on a large scale.
Keywords: Streptococcus pneumoniae, nasopharyngeal carriage, pneumococcal
conjugate vaccines.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E SAÚDE PÚBLICA
Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é o principal agente etiológico das
pneumonias, meningites e otite média, principalmente entre crianças e idosos (Andrade
et al. 2011). Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou 476.000 mortes
por infecções pneumocócicas em crianças menores de cinco anos de idade (WHO 2012)
sendo a principal causa de óbitos entre as doenças imunopreveníveis (MMWR 2006). A
taxa de doença e a mortalidade são maiores em países em desenvolvimento do que em
países desenvolvidos, com a maioria das mortes ocorrendo na África e Ásia (Roca et al.
2006; O'Brien et al. 2009).
No Brasil, no período de 2004 a 2006, a doença pneumocócica foi responsável
por 34.217 hospitalizações no Sistema Único de Saúde, sendo 64.8% destas internações
por pneumonia (Novaes et al. 2011). Estima-se que os gastos anuais com internação por
pneumonia na infância vêm crescendo substancialmente desde 1999, ultrapassando
sessenta e quatro milhões de dólares, em 2003 (Fuchs et al. 2005).
Um estudo de base populacional da Doença Pneumocócica Invasiva (DPI) e
pneumonia em crianças entre 28 dias a 36 meses realizado em três países - Brasil,
Colômbia e Costa Rica relacionou a importância do pneumococo do ponto de vista da
saúde pública na América Latina e no Brasil. O estudo mostrou que a pneumonia
acomete crianças até 3 anos de idade, entretanto, a maior carga da doença ocorre em
crianças com idade aproximada de 1 ano (mediana de 13 meses), refletindo diretamente
na taxa de mortalidade infantil (Arguedas et al. 2012).
Fatores como idade, etnia, imunossupressão incluindo infecção pelo HIV,
fatores socioeconômicos, como superlotação e associação de doenças respiratórias virais
afetam amplamente o risco de DPI (Hausdorff et al. 2005).
2
1.2 COLONIZAÇÃO POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE NA INFÂNCIA
S. pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva encapsulada e atualmente 93 tipos
capsulares distintos estruturalmente e sorologicamente já foram identificados, sendo os
sorotipos 6C (Park et al. 2007), 6D (Jin et al. 2009) e sorotipo 11E (Calix & Nahm
2010) os mais recentemente identificados (Gladstone et al. 2011).
A cápsula polissacarídica forma a camada mais externa da célula do S.
pneumoniae, medindo cerca de 200 a 400 nm de espessura (Sorensen et al. 1988) e é
ligada covalentemente à superfície externa do peptidoglicano da parede celular, com
exceção do sorotipo 3, e possivelmente outros sorotipos (Sorensen et al. 1990). A
cápsula apresenta ação anti-fagocítica em hospedeiros não-imunes (Austrian 1981) e é
indispensável à virulência do pneumococo, embora isolados não encapsulados tenham
sido associados a infecções superficiais, tais como conjuntivites (Martin et al. 2003;
Crum et al. 2004). A cápsula dispõe, ainda, de um grau de resistência a autólise
espontânea ou induzida por antibióticos, contribuindo assim para a tolerância a
antimicrobianos em isolados clínicos (Fernebro et al. 2004).
A cápsula expressa pelo pneumococo pode ser detectada por reação com
antissoro específico. No entanto, alguns isolados apresentam resultado negativo para
todos os mais de 90 antissoros tipo-específicos sendo designados como S. pneumoniae
não tipáveis (SpNT), que são importantes causadores de doença não invasiva, como
otite média e pneumonia não bacterêmica (Finland & Barnes 1977; Hathaway et al.
2004).
A nasofaringe é o reservatório e porta de entrada para o pneumococo. A
colonização da nasofaringe inicia-se logo após o nascimento, não havendo relatos de
colonização intraparto por S. pneumoniae (Faust et al. 2012). Estima-se que mais de
95% das crianças tornam-se colonizadas antes do segundo ano de vida (Gray et al.
1980). A colonização precede a doença pneumocócica invasiva e não invasiva,
fornecendo a base para a propagação horizontal na família e na comunidade (Bogaert et
al. 2004; Hammitt et al. 2006). Apesar de alta morbidade e mortalidade estarem
associadas ao S. pneumoniae, a doença pneumocócica é menos frequente do que a
colonização (CDC 2000).
Após adentrar a cavidade nasal, as células de S. pneumoniae encontram o muco.
A expressão da cápsula reduz a retenção no muco, permitindo assim que o pneumococo
possa aderir à superfície epitelial (Nelson et al. 2007). O epitélio da mucosa
3
nasofaringeana pode albergar, simultaneamente, diferentes sorotipos e determinar o
chamado “estado de portador” em indivíduos sem sintomatologia, caracterizando o
“portador assintomático”. Estudos têm mostrado que a duração da colonização do
pneumococo na nasofaringe é geralmente inferior a seis meses (Gray et al. 1980; Ekdahl
et al. 1997; Turner et al. 2011).
A colonização por um determinado sorotipo nem sempre induz a imunidade
local ou mesmo sistêmica suficiente para evitar a recolonização pelo mesmo sorotipo
(Fedson et al. 1999; Ghaffar et al. 1999). Dessa forma, múltiplos sorotipos podem
coexistir na nasofaringe e nem sempre existe associação entre sorotipos que colonizam
as vias respiratórias e os isolados de pessoas com doenças invasivas (Bogaert et al.
2004). Geograficamente há diferenças na prevalência dos sorotipos (Hausdorff et al.
2001), embora, antes da introdução das vacinas conjugadas a maioria das doenças
pneumocócicas invasivas (DPI) em todo mundo eram causadas por aproximadamente
23 desses 93 sorotipos (Hausdorff et al. 2005).
A Figura 1 ilustra o fluxograma da fisiopatogenia do pneumococo mostrando
que na maioria dos casos o estado de portador não causa qualquer doença, entretanto,
quando as condições do hospedeiro são alteradas, o pneumococo pode invadir sítios
adjacentes causando doenças não invasivas como otites ou invasivas como a meningite,
sepsemia e pneumonia bacterêmica.
Figura 1. Efeito da vacinação na patogênese da Doença Pneumocócica.
Fonte: Andrade et al. 2011
4
1.3 PREVALÊNCIA DE PORTADOR DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E
SOROTIPOS
A prevalência de portador de S. pneumoniae em crianças saudáveis menores que
cinco anos de idade varia entre as regiões geográficas, exibindo diferenças significativas
na dependência de vários fatores como mostrado em estudos nos Estados Unidos (29%);
Polônia (44%); Marrocos (46%); Faixa de Gaza (50%); Suíça (52%); Nigéria (53%);
Japão (60%); Quênia (66%); Gâmbia (66%); Finlândia (69%); Israel (69%) e Peru
(77%). Os sorotipos mais frequentemente detectados na nasofaringe são 3, 6A, 6B, 14,
15B, 15C, 18, 19F, 23F (Saukkoriipi et al. 2004; Billal et al. 2008; Antonio et al. 2009;
Brugger et al. 2009; da Gloria et al. 2010; Bouskraoui et al. 2011; Abdullahi et al. 2012;
Adetifa et al. 2012; Chien et al. 2012; Korona-Glowniak & Malm 2012; Regev-Yochay
et al. 2012; Wroe et al. 2012).
A prevalência de portador de pneumococo em crianças que frequentam creches
varia de 29% a 90% e os sorotipos mais frequentemente isolados são o 6A, 6B, 14, 15,
19A, 19F e 23F (Hill et al. 2006; Sa-Leao et al. 2006; Zemlickova et al. 2006;
Rodrigues et al. 2009; Sa-Leao et al. 2009; Grivea et al. 2011; Bae et al. 2012;
Ercibengoa et al. 2012; Korona-Glowniak & Malm 2012; Valente et al. 2012).
No Brasil, a prevalência de portador de S. pneumoniae varia de 13% a 72%
conforme a idade e presença de doenças associadas. A maioria dos estudos, entretanto,
tem sido conduzida em crianças que frequentam creches, sendo os sorotipos 6A, 6B, 14,
15, 19A, 19F, 23F os mais comumente detectados (Wolf et al. 2000; Lucarevschi et al.
2003; Reis et al. 2008; Franco et al. 2010; Lamaro-Cardoso et al. 2012).
A colonização simultânea por múltiplos sorotipos de pneumococo
(cocolonização) representa uma oportunidade para a transferência horizontal de genes, o
principal mecanismo da evolução dessa espécie (Spratt et al. 2001). As taxas de
cocolonização têm variado de 3,5 a 30% de acordo com diferentes estudos, na
dependência das variações geográficas na epidemiologia do pneumococo e diferentes
técnicas utilizadas para detecção, sendo maior em populações com altas taxas de
portador (Gratten et al. 1994; Bogaert et al. 2004; Moreno et al. 2005; Brugger et al.
2009; Rivera-Olivero et al. 2009; Brugger et al. 2010).
5
1.4 TECNOLOGIAS UTILIZADAS PARA DETECÇÃO DE SOROTIPOS
Atualmente, os procedimentos laboratoriais para isolamento, identificação e
tipagem capsular de S. pneumoniae em nasofaringe baseiam-se em técnicas laboriosas e
que requerem pessoal altamente treinado, o que nem sempre está disponível em países
em desenvolvimento.
As técnicas convencionais para diagnóstico e sorotipagem do S. pneumoniae
utilizadas globalmente são a cultura e a reação de Quellung (Austrian 1976),
respectivamente. A cultura bacteriana ainda é considerada o método padrão ouro para
detecção do pneumococo. A reação de Quellung é utilizada para sorotipagem, e está
relacionada com a capacidade de o antissoro específico reagir com a cápsula da bactéria
em suspensão (Sorensen 1993).
Um método de sorotipagem deveria, idealmente, apresentar alta sensibilidade
para detectar os principais sorotipos e também aqueles que geralmente são encontrados
em menor quantidade. O teste também deveria apresentar elevada especificidade devido
à complexidade da interação entre os microrganismos que compõem a microbiota da
nasofaringe e preferencialmente ser quantitativo (carga e proporção relativas). Além
disso, seria desejável que o teste pudesse ser realizado diretamente da amostra,
apresentar baixo custo, ser de fácil execução, fornecer outras informações como o
genótipo, resistência a antibióticos, além de determinar fenótipos e todos os sorotipos
conhecidos.
Técnicas moleculares para diagnóstico e sorotipagem de S. pneumoniae não
fazem parte da rotina de procedimentos diagnóstico do pneumococo. Dentre as
vantagens potenciais do seu uso, destacam-se a possibilidade de redução dos custos
operacionais quando realizado em larga escala, especialmente para regiões com
recursos escassos. Assim, a avaliação de testes para tipagem capsular realizados
diretamente de secreção de nasofaringe por meio de tecnologias moleculares é de
grande interesse para a avaliação do impacto da vacinação em países em
desenvolvimento com alta carga de doença pelo pneumococo. A tabela 1 mostra as
principais metodologias moleculares disponíveis para detecção de S. pneumoniae e
sorotipos.
6
Tabela 1. Métodos moleculares utilizados para identificação de Streptococcus pneumoniae e sorotipos
Técnica Referência Vantagens Desvantagens
Sequenciamento (Leung et al. 2012) Requer apenas uma única amplificação por PCR.
Requer apenas DNA genômico bruto (extração simples)
Custo inferior à sorotipagem por Quellung e Microarray
Não identifica todos os sorotipos de pneumococo e em alguns casos
identifica somente o sorogrupo.
Isolados com resultados ambíguos de sequenciamento devem ser
submetidos a métodos sorológicos convencionais ou baseados em
DNA.
Apresenta custo superior à PCR multiplex.
RFLP (Brugger et al. 2009)
Pode ser aplicada diretamente à amostras de nasofaringe.
Estima o número e quantidades relativas de cocolonização.
Técnica relativamente fácil e econômica.
Restrições quanto à identificação de alguns patógenos comensais da
microbiota oral, resultando em bandas atípicas.
PCR Multiplex (Pai et al. 2006) Simples, relativamente rápida em execução.
Bom rendimento.
Amplamente utilizada.
Pode ser acoplada com outros métodos de detecção.
Para detecção de múltiplos portadores todas as reações devem ser
realizadas.
Não abrange um conjunto completo de sorotipos até o momento.
Detecção de alguns sorogrupos e não sorotipos individualmente.
Não é quantitativa.
RT - PCR e
qPCR
(Carvalho et al. 2007) Altamente sensível.
Rápida e relativamente simples em execução.
Pode incluir outros genes, por exemplo, de resistência a
antibióticos.
Apresenta uma cobertura limitada de sorotipos até o momento.
Dificuldade na distinção de sorotipos geneticamente relacionados.
Multiplex
baseado em
microesferas
(Luminex)
(Dunbar et al. 2003;
Dunbar 2006; Benson et
al. 2008)
Quantitativa e qualitativa.
Alto rendimento.
Razoavelmente simples em execução.
Altamente sensível.
Cobertura limitada de sorotipos –
maior dificuldade de expansão da cobertura.
Equipamento e reagentes de alto custo.
Requer treinamento especializado para execução e interpretação.
Espectrometria
de massa com
ionização por
electrospray
aplicado ao
produto da PCR
(Massire et al. 2012) Alto potencial na determinação de genótipos e sorotipos de
amostras clínicas com culturas negativas para pneumococo
Adequado para detecção de múltiplos sorotipos em extratos
de DNA que passaram pela etapa de cultura enriquecida.
Equipamento de alto custo.
Operação do equipamento exige mão de obra altamente treinada.
Microarray (Hinds et al. 2010) Alta sensibilidade.
Detecta a maioria dos sorotipos.
Determina carga microbiana dos sorotipos detectados.
Detecta semelhança genética, outras espécies, e resistência a
antibióticos.
Pode ser mais adequada a laboratórios de referência, especialmente
para análises de resultados incomuns.
Tecnologia muito cara.
7
A técnica tradicional de sequenciamento de DNA desenvolvida na década de
70 por Sanger et al. (1977) consiste na amplificação de fragmentos de DNA a partir da
adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxirribonucleotídeos, os quais
quando incorporados pela Taq polimerase, não permitem a inclusão do nucleotídeo
seguinte por não apresentarem a hidroxila no carbono 3 da dideoxi-ribose do
nucleotídeo terminador, interrompendo a síntese da molécula de DNA a partir desse
ponto. Esta técnica tem sido amplamente utilizada em centros de pesquisa em todo o
mundo. Leung et al. (2012) utiliza um método baseado em sequenciamento para
identificação de sorotipos de isolados de laboratórios de referência do Reino Unido e
Estados Unidos.
A técnica de análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA
genômico (RFLP) desenvolvida inicialmente por Botstein (1980), baseia-se na hidrólise
do DNA com enzimas de restrição e posterior separação, por eletroforese, dos
fragmentos gerados, que correspondem a padrões de restrição específicos. Estes padrões
podem ser característicos ao nível da espécie ou mesmo ao nível de isolado. Uma vez
que isolados distintos apresentam diferenças (ainda que, por vezes, mínimas) ao nível
do genoma, o que esta técnica explora é a possibilidade dessas diferenças se
encontrarem no interior da sequência de reconhecimento da(s) enzima(s) de restrição
utilizada(s). A técnica de RFLP pode ser aplicada ao DNA plasmidial, a qual é menos
discriminatória por analisar apenas uma pequena parte do genoma e que está limitada a
isolados que exibem DNA plasmidial e ao DNA cromossômico, onde se encontra a
totalidade da informação genética. Brugger et al. (2009), aprimorou o método RFLP
para amostras de nasofaringe, baseado no modelo de restrição de uma região altamente
conservada de DNA dentro da espécie pneumocócica.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) multiplex convencional foi
inicialmente desenvolvida para a detecção de sorotipos de pneumococos da doença
invasiva. Mais recentemente, tem sido utilizada para detectar tipos capsulares de
pneumococos diretamente de secreções da nasofaringe (Antonio et al. 2009),
possibilitando tanto a detecção quanto a sorotipagem de S. pneumoniae. O DNA é
extraído diretamente da amostra clínica e a PCR é realizada para 5 sorotipos em cada
reação, totalizando 8 reações e até o momento, 40 sorotipos detectados. A reação utiliza
oligonucleotídeos sorotipo-específicos. É particularmente útil em vigilância
epidemiológica e nos casos em que o resultado da cultura é inicialmente negativo
devido ao uso prévio de antibióticos (Lawrence et al. 2000; Rubin & Rizvi 2004).
8
Embora disponível e utilizada rotineiramente em países desenvolvidos, a factibilidade
da implementação desta tecnologia na rotina de países em desenvolvimento e locais
com recursos escassos é ainda questionada.
A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) para
genotipagem do pneumococo começou a ser desenvolvida em 1997 (Messmer 2004), e
consiste na detecção do S. pneumoniae utilizando-se como alvo o gene capsular lytA a
partir de extratos de DNA preparados diretamente de uma amostra clínica. A
metodologia permite que os processos de detecção e amplificação de DNA sejam
realizados em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados, melhorando a
precisão e diminuindo o risco de contaminação da amostra (Corless et al. 2001).
A RT-PCR quantitativa (qPCR) pode ser utilizada para quantificar os ácidos
nucleicos por dois métodos comuns: quantificação relativa e quantificação absoluta. A
quantificação relativa é baseada em genes de referência internos para determinar
diferenças na expressão do gene alvo. A quantificação absoluta dá o número exato de
moléculas de DNA alvo por comparação com um DNA padrão (Dhanasekaran et al.
2010). Em estudo desenvolvido por Carvalho et al (2007), a detecção de S. pneumoniae
foi realizada por RT-PCR a partir de extratos de DNA preparados de amostras da
nasofaringe. Essa tecnologia utiliza oligonucleotídeos e sondas sorotipo-específicas e
vem sendo utilizada em publicações recentes (da Gloria et al. 2010; Lamaro-Cardoso et
al. 2012).
O sistema multiplex baseado em microesferas é uma plataforma de alto
rendimento para a detecção de ácido nucleico baseada em suspensão de microesferas
marcada com fluoróforos capazes de analisar até 100 diferentes ensaios em uma única
reação. Oligonucleotídeos de captura específicos para cada analito são acoplados nas
microesferas por meio de ligações covalentes não reversíveis. Estudos preliminares
(dados não publicados, comunicação do Centers for Disease Control and Prevention -
CDC) com sequências de pneumococos para sorotipagem, mostraram que a plataforma
é flexível, capaz de detectar de forma simultânea, sensível e específica, 10 diferentes
sorotipos sequenciais em uma única reação de amplificação. Até o momento 20
sorotipos podem ser detectados em 2 reações. Também vem sendo utilizada com
frequência crescente para detecção de patógenos específicos como o S. pneumoniae
(Dunbar et al. 2003; Dunbar 2006; Benson et al. 2008).
A técnica de espectrometria de massas com ionização por eletrospray (ESI-MS)
aplicada ao produto da PCR envolve a distribuição de um extrato de DNA nos poços de
9
uma placa de microtitulação, cada um dos quais contendo um ou mais conjuntos de
oligonucleotídeos iniciadores (Ecker et al. 2006). O produto da PCR é pulverizado
eletronicamente para um espectrômetro de massa, o que permite a derivação da
composição de base de cada cadeia de DNA a partir da razão massa/carga. Além disso,
um controle interno positivo sintético direcionado por um dos pares de
oligonucleotídeos é incluído em cada poço. Assim, se o sinal origina apenas do controle
positivo, é estabelecido que as condições de amplificação foram satisfatórias, mas a
concentração de DNA da amostra foi demasiada baixa ou os oligonucleotídeos não
hibridizaram com o DNA da amostra. Usando a análise combinada de composições de
bases de múltiplas reações de PCR, a avaliação do DNA genômico pode ser realizada. A
determinação da composição do DNA com base nos fragmentos especificamente
direcionados da PCR/ESI-MS tem um alto poder de resolução na identificação e
genotipagem de patógenos específicos (Ecker et al. 2009). Massire et al. (2012)
propuseram o mesmo sistema para a genotipagem e sorotipagem a partir de isolados de
pneumococo.
A técnica de microarray, ou DNA-chip (Hinds et al. 2010) consiste em um
arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou
oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida, usualmente lâminas
de vidro revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os microarrays
também podem ser preparados em membranas de nylon positivamente carregadas.
Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos (RNAm
na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras biológicas, as quais
sofrem hibridização com o DNA fixado no array (hibridação por complementariedade
de bases). A tecnologia de microarray vem sendo utilizada em estudos de portador
nasofaríngeo (Brugger et al. 2010; Turner et al. 2011; Valente et al. 2012).
Uma busca eletrônica foi realizada na base de dados do MEDLINE (National
Library of Medicine) com os seguintes descritores:
“Molecular tests pneumococcal carriage”;
“Molecular tests nasopharyngeal pneumococcal carriage”;
“Molecular techniques pneumococcal carriage”;
“Molecular techniques nasopharyngeal pneumococcal carriage”;
“Multiple serotypes pneumococcal carriage”;
“Multiple serotypes nasopharyngeal pneumococcal carriage”;
10
“Multiple colonization pneumococcal carriage”;
“Multiple colonization nasopharyngeal pneumococcal carriage”;
“Co colonization; co-colonization; cocolonization pneumococcal carriage”.
A busca foi realizada entre os dias cinco de agosto e 12 de novembro de 2012
para assegurar que o material mais recentemente publicado fosse incluído. A fim de
garantir que um maior número de estudos fosse selecionado realizou-se, também, busca
manual de artigos, contemplando estudos sugeridos pela base de dados. Estudos
elegíveis foram selecionados de acordo com os seguintes critérios de inclusão: (i)
publicações posteriores ao ano de 2000 até os dias atuais, (ii) estudos que utilizaram
alguma tecnologia molecular para determinação de S. pneumoniae e sorotipos a partir
de amostras de nasofaringe e (iii) estudos nos quais os participantes fossem
preferencialmente crianças com idade inferior a 6 anos. Estudos não elegíveis para
inclusão foram: (i) os que apresentaram data de publicação inferior ao ano de 2000, (ii)
que utilizaram técnica tradicional ou não molecular para a detecção e determinação do
tipo capsular do pneumococo, (iii) que descreveram o uso de uma técnica molecular não
para a detecção ou determinação dos sorotipos do pneumococo e (iv) que utilizaram
alguma técnica molecular somente para parte das amostras do estudo. Na tabela 2
sumarizamos os estudos que utilizaram técnicas moleculares, em que se observa que: (i)
os estudos de portador iniciam no ano de 2003; (ii) a maioria são conduzidos em
creches e pré escolas em crianças saudáveis e com doença não invasiva; (iii) a maioria
dos estudos foi conduzida em crianças menores de 5 anos; (iv) a prevalência de portador
variou de 11.8% a 90%, sendo a maior prevalência encontrada em crianças residentes
em um vilarejo em Gâmbia; (v) a incorporação de testes de sorotipagem ocorre a partir
do ano de 2005.
11
Tabela 2. Estudos de portador em nasofaringe utilizando técnicas moleculares para detecção de Streptococcus pneumoniae e sorotipos capsulares em crianças no período
de 2000 a 2012
População Prevalência Pneumococo
Referência Local Desenho Período Idade N Elegibilidade Técnica N % (IC 95%) Sorotipos Detectados
Saukkoriipi et al. 2004 Oulu – Finlândia Estudo de
corte tranversal
2003 10-24
meses
400 Crianças saudáveis qPCR
276 69 (64.3 – 73.4)
NR
Moreno et al. 2005 Bogotá – Colombia Estudo de corte
tranversal
2005 10 – 24 meses
19 Creches PCR multiplex
14 73.7 (50.9 – 89.6) 3, 4, 6, 14, 18, 19A e 19F
Billal et al. 2008 Wakayama – Japão Estudo de corte
tranversal
2006 12-60 meses
60 Crianças com Otite Média Aguda
PCR multiplex
36 60 (47.3 – 71.8) 3, 14, 19F, 23F, sorogrupo 6, 23, outros sorotipos.
Brugger et al. 2009 Berna – Suíça Estudo de corte
tranversal
2004-2005
< 5 anos 287 Crianças na era pré vacinas
pneumocócicas
PCR multiplex
RFLP
148 51.6 (45.8 - 57.3)
7F, 14, 22, 23F, 11,14, 3, 1, 22, 4, 18C, 19F, 15, 1,
8, 38
Antonio et al. 2009 Banjul – Gâmbia Estudo de corte
tranversal
2006 < 5 anos 279 Habitantes de vilarejos em Gâmbia
PCR multiplex
184 65.9 (60.2 - 71.3) 6A/6B, 3, 23F, 19F, 11, 16F, 14, 34, 35B, 18, 15B/C, 35F, 4, 9V, 7C, 19A, 33, 17F, 22F, 8, 1, 15A, 20
Brugger et al. 2010 Berna – Suíça Coorte Prospectiva
2004-2009
< 2 anos 1120 Pacientes ambulatoriais com
otite média aguda ou pneumonia
PCR multiplex
RFLP
Microarray
511 46 (46.6 – 48.5) 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 11, 14, 15, 18C, 19ª,22 ,23 23F, NT§, outros*.
da Gloria et al. 2010 Arizona – Estados Unidos
Coorte Prospectiva
2006-2008
< 2 anos 100 Crianças previamente
vacinadas com
PCV7 participantes de um estudo do
efeito a longo prazo
da vacinação no
portador
pneumocócico
PCR multiplex
RT - PCR
69 69 (59.4 – 77.5) 6C, 21, 15B/C, 23A, 23B, 11A/D, 10A, 35A/35C/42, 35B, 10F/10C/33C, 15A/15F, 34, 17F, 22F/22A, 19A , 33F/33A/37, 3, 4, 7F/7A , 12F/12A/44/46, 16F, 20, 31, 35F/47
¥ lytA Ct >30; §¥ lytA Ct >30; §Não-tipável pela PCR multiplex em 40 soroespecificidades; ND: não declarado; NR: não realizado; Outros: outros sorotipos que não sejam do tipo capsular 1, 3, 4, 14, 19A, 19F, 23F e sorogrupo 6, 18, 19 e 23;
Outros Outros *: Sorotipos com freqüência relativa menor que 2%, incluindo sorotipos/grupos 1, 8, 9 (exceto 9V), 10, 16, 17, 17F, 18 (exceto 18C), 20, 21, 28, 33, 34, 35, 38 e isolados não tipáveis.
12
Tabela 2. Estudos de portador em nasofaringe utilizando técnicas moleculares para detecção de Streptococcus pneumoniae e sorotipos capsulares em crianças no período de
2000 a 2012 (continuação)
População Prevalência Pneumococo
Referência Local Desenho Período Idade N Elegibilidade Técnica N % (IC 95%) Sorotipos Detectados
Vu et al. 2011 Nha Trang City – Vietnam
Caso – Controle
2007-2009 < 5 anos 900 Crianças saudáveis, Crianças com pneumonia
radiológica e
Infecção do trato
respiratório inferior
qPCR
PCR multiplex
176
119
106
19.6
13.2
11.8
(17.1 – 22.2)
(11.1 – 15.5)
(9.8 – 14.0)
6A/B, 19F, 23F, 14, 15B/C e 11A
Jourdain et al. 2011 Bruxelas -Bélgica Coorte
Prospectiva
2006-2008 3-6 anos 332 Crianças saudáveis em pré
escolas
PCR multiplex 229 69 (63.9 – 73,8) ND
Ercibengoa et al.
2012
San Sebastian-
Espanha
Coorte
Prospectiva
2004-2005 6 - 34
meses
105 Crianças saudáveis em
creches
PCR multiplex 94 89.5 (82.5 – 94.4) 4, 5, 6A, 6B, 6C,9V, 9N, 10A, 10B,
11A, 13, 14, 15B, 16F, 19A, 19F, 2O,
21, 22F, 23B, 35F, NT§
Valente et al. 2012 Oeiras - Portugal Estudo de
corte tranversal
2006-2007 18 - 71
meses
492 Crianças saudáveis em
creches
PCR multiplex
RFLP
Microarray
492 85.2 (81. 8 - 88.1) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3,
6A, 6C, 7F, 10A, 11A/11D, 15B/15C,
16F, 19A, 21, 23A, 23B, 35F, 37, outros.
Lamaro-Cardoso et al. 2012
Goiânia - Brasil Coorte Retrospectiva
2008 2 meses -14 anos
155 Crianças que tiveram contato com caso índice de
meningite causada por S.pneumoniae em creches e
contactantes
PCR multiplex
Real Time PCR
92 59.4 (52.7 – 68.1)
6A/6B, 14, 19F, 6C/6D, 22F/22A, 23F, 11A/11D, 13, 3, 15B/15C, 4, 8,
9V/9A, 12F/12A/44/46, 15A/15F,
16F,18(18A/18B/18C/18F),20, 23B, 33F/33A/37, 35B, 35F/47F, 39, Alto
valor de Ct para lytA¥, NT§
Chien et al. 2012 Cajamarca - Peru Coorte
Prospectiva
2009 0 – 35
meses
446 Crianças saudáveis de áreas
rurais
qPCR 345 77.4 (73.3 – 81.1) NR
Bergh et al. 2012 Amsterdam -
Holanda
Ensaio clínico
Randomizado
2008 - 2010 Até 24
meses
780 Crianças saudáveis em
domicílios
qPCR
PCR multiplex
424 54.4 (50.9 – 57.8) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F
¥ lytA Ct >30; §Não-tipável pela PCR multiplex em 40 soroespecificidades; ND: não declarado; NR: não realizado; Outros: outros sorotipos que não sejam do tipo capsular 1, 3, 4, 14, 19A, 19F, 23F e sorogrupo 6, 18, 19 e 23;
Outros*: Sorotipos com freqüência relativa menor que 2%, incluindo sorotipos/grupos 1, 8, 9 (exceto 9V), 10, 16, 17, 17F, 18 (exceto 18C), 20, 21, 28, 33, 34, 35, 38 e isolados não tipáveis.
13
1.5 IMPACTO DA VACINAÇÃO NO PORTADOR
Todas as vacinas pneumocócicas atualmente disponíveis são produzidas a partir
da cápsula polissacarídica da bactéria, um imunógeno que induz anticorpos que podem
ativar o complemento e a subsequente opsonização e fagocitose bacteriana. No entanto,
existem dois tipos diferentes de vacinas, que diferem fundamentalmente, em termos de
produção e propriedades imunogênicas; vacinas pneumocócicas de polissacarídeos
(VPP), tais como a 23 - valente (PPV-23) e vacinas pneumocócicas conjugadas (PCVs),
obtidas por conjugação dos polissacarídeos bacterianos com uma proteína
transportadora (Weintraub 2003).
A PPV-23 contém os 23 sorotipos de S. pneumoniae mais comuns associados
com a doença pneumocócica (sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F,
14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, e 33F), que são responsáveis por até 90%
de Doença Pneumocócica Invasiva (DPI) em crianças e adultos em todo o mundo
(Huebner et al. 2000). No entanto, a vacina só é eficaz em crianças maiores de dois anos
de idade, haja vista que as crianças menores de dois anos possuem um sistema
imunológico incapaz de desenvolver uma resposta robusta e protetora para o antígeno
polissacarídico após reexposição a uma dose de reforço (Lindberg 1999). A PPV-23 foi
incorporada pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI), no ano de 1992, para
grupos com quadros clínicos específicos. A partir de 1999, passou a ser aplicada durante
a Campanha Nacional de Vacinação do Idoso, com vistas a atingir às pessoas de 60 anos
ou mais que convivem em instituições fechadas.
A PCV-7 contendo sorotipos capsulares 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23 F, cada um
conjugado a um componente de proteína diftérica CRM197 foi desenvolvida pela
Wyeth (atual Pfizer) e mostrou-se segura e eficaz em ensaios clínicos em estudos pós-
licenciamento (Black et al. 2001). Os EUA foi o primeiro país a adicionar a PCV-7 ao
seu calendário de vacinação infantil de rotina em 2000. A vacina foi recomendada para
todas as crianças de dois a 23 meses e para crianças com idade entre 24 e 59 meses que
estão em um risco aumentado de doença pneumocócica. A partir de 2008, 91 países
licenciaram a PCV-7, sendo que 23 deles incorporaram a vacina na rotina de
imunização (Destefano et al. 2008). A PCV-7 foi introduzida no calendário de
imunização do Ministério da Saúde do Brasil em 2001, também em grupos
populacionais especialmente suscetíveis ao S. pneumoniae.
14
A PCV-9, desenvolvida pela Pfizer, contém 2 µg de polissacarídeo do tipo 1, 4,
5, 9V, 14, 19F e 23F, 4 µg do polissacarídeo tipo 6B e 2 µg do oligossacarídeo tipo 18C
ligados a um componente da proteína diftérica CRM197. A PCV-9 mostrou ser eficaz
contra 50% de todos os sorotipos causadores da DPI em um grande ensaio clínico
realizado no Gâmbia (Cutts et al. 2005). No entanto, os estudos com esta vacina foram
descontinuados e esta vacina foi substituída por uma formulação expandida com 13
sorotipos (vacina 13 valente).
A PCV-10, desenvolvida pela GlaxoSmithKline, obteve pré-qualificação da
OMS em 2009 (MMWR 2010). A vacina contém polissacarídeos capsulares dos
sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, e 23F (conjugados com proteína D do Haemophilus
influenzae não tipável), 18C e 19F (conjugados com toxóide tetânico e diftérico,
respectivamente). A proteína D é uma proteína de superfície presente em todos os
isolados de H. influenzae, inclusive o H. influenzae não tipável (NTHi) (Janson et al.
1993; Song et al. 1995). O Brasil foi o primeiro país a introduzir a PCV-10 no PNI, de
forma progressiva nos diferentes municípios, a partir de março de 2010. A vacina foi
licenciada para a vacinação primária e de reforço em crianças até dois anos de idade e
rotineiramente utilizada no esquema de três doses, aos dois, quatro, e seis meses de
idade ou duas doses de sete a onze meses de idade, e uma dose de reforço dos 12 aos 18
meses. De acordo com o PNI, a cobertura da PCV-10 estimada em Goiânia durante o
período do estudo foi de aproximadamente 90% para a primeira dose (PNI 2011).
A PCV-13, desenvolvida pela Pfizer, é composta dos sorotipos capsulares 1, 3,
4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F, cada um conjugado a um componente
de proteína diftérica CRM197. Esta vacina sucede a PCV-7 incluindo seis sorotipos
adicionais para proporcionar uma cobertura mais abrangente. Dentre os sorotipos
adicionados encontram-se o 3, frequente causador de pneumonia grave (Bender et al.
2010) e o 19A, causador de DPI e otite média (Choi et al. 2008; Dagan et al. 2009). A
PCV-13 foi licenciada no Chile em 2009 e em 2010 na Europa e nos EUA para uso em
crianças com idades entre seis semanas e 71 meses em substituição à PCV-7.
A introdução das vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes (PCV-7,
9,10,13) reduziram significativamente a ocorrência da doença pneumocócica invasiva
não só em crianças mas em todas as idades, tanto em indivíduos vacinados como em
não-vacinados, por meio do efeito indireto dessas vacinas. A vacinação reduziu também
portadores de tipos vacinais (VT). Em contrapartida, a emergência de tipos não vacinais
(NVT) em isolados colonizadores e invasivos tem gerado preocupações e necessidade
15
constante de monitoramento das mudanças na distribuição de sorotipos em populações
vacinadas e não vacinadas para a avaliação e adequação das vacinas atuais além de
prover subsídios para os programas nacionais de imunização (Whitney et al. 2003;
Whitney et al. 2006; Ray et al. 2009).
As vacinas pneumocócicas conjugadas disponíveis são seguras e eficazes e o
aumento do número de sorotipos presentes nestas vacinas, em comparação com a
primeira vacina conjugada licenciada (PCV-7) representam progressos significativos na
luta contra a morbidade e mortalidade pneumocócica, em particular para países em
desenvolvimento (Scott et al. 2011).
Evidências acumuladas do efeito da PCV-7 no portador mostraram que o
impacto foi maior nos VT em crianças menores que 24 meses de idade que não haviam
recebido nenhuma dose da vacina. Em geral, o efeito direto da vacina pneumocócica
inclui a redução do portador de VT, bem como secundariamente, aumento simultâneo
da ocorrência de NVT. O aumento do portador NVT foi relatado em indivíduos
vacinados, mesmo durante um curto período de seguimento após a vacinação (Mbelle et
al. 1999; Dagan et al. 2001; Dagan et al. 2002; O'Brien et al. 2003; Prymula et al. 2006;
O'Brien et al. 2007; Cheung et al. 2009; Prymula et al. 2009).
16
2 JUSTIFICATIVA
A efetividade da vacina 10-valente na redução do portador, que é considerado
a etapa obrigatória para aquisição da doença pneumocócica invasiva, deve ser
realizada com utilização de metodologias acuradas.
A técnica de RT-PCR tem sido utilizada para avaliar amostras de nasofaringe
de portadores de S. pneumoniae em população previamente vacinada (Moreno et
al. 2005; Billal et al. 2008; Antonio et al. 2009; Brugger et al. 2009; da Gloria et
al. 2010). A técnica de multiplex baseada em PCR convencional foi inicialmente
desenvolvida para determinação de sorotipos invasivos de pneumococo (Pai et al.
2006; Dias et al. 2007; Morais et al. 2007).
Mais recentemente, esta técnica vem
sendo utilizada para detectar tipos capsulares de pneumococo diretamente de
secreção de nasofaringe (Moreno et al. 2005; Antonio et al. 2009; da Gloria et al.
2010).
No Brasil, estudo recente conduzido em Goiânia utilizando técnicas
moleculares e tradicionais para detecção e sorotipagem do pneumococo em crianças
que frequentam creches observou uma prevalência de portador de S. pneumoniae de
49,6% com o RT-PCR e 36,6% pela cultura tradicional, mostrando a alta sensibilidade
da técnica molecular. Pelo multiplex PCR foi possível detectar 23 sorotipos, entre eles
sorotipos vacinais e não-vacinais (Lamaro-Cardoso et al. 2012). A combinação de
técnicas utilizadas no estudo anterior e os resultados obtidos nos impulsionaram a
continuar a análise populacional de crianças portadoras no município, na era das
vacinas conjugadas. A inclusão do componente domiciliar e a utilização de técnicas
moleculares poderão fornecer subsídios para melhorar a eficiência do rastreamento
soroepidemiológico dos isolados, e consequentemente avaliar o impacto vacinal na
população pediátrica.
Busca-se, com este estudo, avaliar a performance e acurácia de tecnologias
moleculares para diagnóstico e sorotipagem do S. pneumoniae quando comparados
às técnicas tradicionais para serem aplicadas na avaliação de impacto de vacinas em
países em desenvolvimento. A detecção de pneumococos e seus sorotipos
diretamente de amostras de nasofaringe utilizando RT-PCR e PCR multiplex
poderiam preencher esta lacuna.
17
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Comparar as técnicas de RT-PCR e cultura na determinação da prevalência de
colonização nasofaringeana por Streptococcus pneumoniae, em crianças menores de 24
meses residentes em Goiânia-GO.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Comparar valores de Ct encontrados para detecção de sorotipos de S.
pneumoniae com os valores utilizados pelo CDC.
2. Determinar a importância do valor de Ct no impacto vacinal com a PCV-10.
18
4 MÉTODOS
4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA
Um inquérito domiciliar (estudo tipo corte transversal) foi conduzido para coleta
de secreção de nasofaringe para detecção de portador de S. pneumoniae. A investigação
foi conduzida no município de Goiânia, Goiás, onde a vacina PCV-10 foi introduzida
em junho de 2010 no esquema de 3 doses (2, 4 e 6 meses de idade); 2 doses (entre 7 e
11 meses de idade); e 1 dose (12 a 18 meses de idade).
A coleta foi realizada no período de dezembro de 2010 e fevereiro de 2011 em
crianças alvo do PNI para a PCV-10.
4.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Foram consideradas não elegíveis as crianças que tomaram antibiótico nos sete
dias que antecederam a coleta ou apresentaram alguma doença que contra indicasse a
coleta de swab em nasofaringe.
4.3 AMOSTRAGEM E TAMANHO DA AMOSTRA
Uma amostra de 1426 crianças foi calculada assumindo-se prevalências de 50%
de portador nasal pela técnica de PCR e de 40% por cultura, erro de 2%, efeito de
desenho de 1,5, alfa de 0,05 e recusa de 10% (Franco et al. 2010; Lamaro-Cardoso et al.
2012). Crianças de 7 a 11 meses e 15 a 18 meses de idade foram selecionadas a partir de
uma lista de endereços do Sistema Nacional de Informação de Nascidos Vivos
(SINASC) de residentes do município de Goiânia. A escolha destas faixas etárias se deu
pelo fato de que no grupo etário de 7 a 11 meses, as crianças supostamente receberam 3
doses e no grupo etário de 15 a 18, as crianças supostamente receberam 4 doses,
tornando-se imunizadas. Amostragem sistemática foi aplicada nesta lista, ordenada por
sexo, idade e distrito censitário de residência. A partir da listagem dos casos sorteados,
foi realizada uma visita domiciliar para coleta de dados. Quando a criança não residia
no endereço, utilizou-se a técnica de snowball (bola de neve) para substituir o caso. Esta
19
técnica consiste na seleção de outra criança com as mesmas características da não
encontrada no mesmo setor censitário através da indicação do atual morador do
domicílio ou de um vizinho.
4.4 COLETA DE DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
Durante a visita domiciliar para coleta de swab nasofaríngeo, informações
demográficas e potenciais variáveis de risco para S. pneumoniae foram coletadas por
meio de entrevista com os pais. Antecedentes vacinais, como nome e data das vacinas
recebidas foram compilados da caderneta de imunização da criança para o formulário
epidemiológico.
4.5 COLETA DE SWAB NASOFARÍNGEO
Após a obtenção do consentimento dos pais ou responsável pela criança, swabs
de alginato de cálcio, ultrafinos e flexíveis (Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburg,
PA) foram coletados da nasofaringe de acordo com a técnica de perfusão pernasal
(WHO 1994) e introduzidos em 1 mL de meio Skim-milk Tryptone Glucose Glycerol
(STGG) para transporte. Os espécimes coletados foram encaminhados ao Laboratório
de Microbiologia Aplicada do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás (IPTSP-UFG) para cultura e tipagem molecular.
4.6 ISOLAMENTO DO STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
O isolamento de S. pneumoniae do meio STGG foi realizado com o auxílio do
caldo enriquecido que consiste de 5 mL do caldo Todd-Hewitt (BD, NJ, EUA) contendo
0,5% de extrato de levedura suplementado com 1 mL de soro de coelho (da Gloria et al.
2010). Após o descongelamento e vórtex dos tubos contendo os swabs imersos no meio
STGG, uma alíquota de 200 µL foi retirada e transferida para 5 mL de caldo
enriquecido e incubada por 4 horas a 37°C, em condições de microaerofilia. Após esse
período, a cultura enriquecida/STGG foi usada para identificação microbiológica e
extração de DNA
4.6.1 Cultura (padrão-ouro)
Alíquotas de 10 µL crescidas em caldo enriquecido/STGG foram semeadas em
placas de agar sangue (Columbia Blood Agar, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra)
20
suplementadas com 5% de sangue de carneiro e incubadas a 35°C, por 18-24 horas, em
condições de microaerofilia. As colônias alfa-hemolíticas sugestivas de pneumococo
foram testadas por metodologia padronizada que incluiu morfologia colonial,
suscetibilidade à optoquina (disco de 5 µg, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) e bile
solubilidade (Facklam & Whashington 1991). Apenas uma colônia de cada morfotipo
foi testada.
4.6.2 Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído a partir de 200 µL do caldo enriquecido/STGG
utilizando-se o kit DNeasy blood and tissue (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as
instruções do fabricante com um passo de pré-incubação de 1 hora em 100 µL do
tampão pré-lise (1,0 M Tris-HCl, 0,5 M EDTA, Triton X-100) acrescido de 0,02 g/mL
de lisozima e 5 U/mL de mutanolisina à 37°C. O restante do caldo enriquecido/STGG
foi armazenado a -80°C para futuras análises.
4.6.3 RT-PCR
O RT-PCR foi realizado no IPTSP/UFG para a detecção de S. pneumoniae
utilizando-se sonda TaqMan direcionada para o gene lytA (Carvalho et al. 2007) a partir
dos extratos de DNA preparados diretamente do caldo enriquecido/STGG. Um
resultado positivo foi indicado pela amplificação com aumento exponencial da
fluorescência da reação. O ponto que detecta o ciclo no qual a reação atinge o limiar da
fase exponencial é denominado Cycle threshold - Ct. Este ponto permite a quantificação
baseada na fluorescência emitida. Uma amostra foi considerada positiva quando o valor
do Ct foi menor que 35. Um Ct entre 35 e 40 foi interpretado como inconclusivo sendo
realizado uma diluição 1:5 e 1:10 e submetido a uma nova reação. Valores de Ct
maiores que 35 foram considerados como negativos conforme proposto por Corless et
al. (2001). Controles positivos e negativos foram incluídos em todas as reações. Como
controle positivo foi utilizado um isolado de S. pneumoniae (ATCC 49619; American
Type Culture Collection, Rockville, Md.).
A reação de amplificação foi realizada no aparelho IQ™5 Real-Time PCR
Detection System (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) seguindo o programa: 10 minutos
a 95ºC e 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 60 segundos a 60ºC.
21
Ao término de cada análise foram gerados gráficos referentes à amplificação
bem como os valores de Ct para cada amostra e controles que foram baseados no sinal
fluorescente emitido. Na ausência de sinal fluorescente após os 40 ciclos a amostra foi
considerada negativa e como consequência, quanto antes foi observado a amplificação,
maior a possibilidade de encontrar o gene alvo. A linha base do ciclo limite (baseline
threshold) foi ajustada para valores do controle positivo. A figura 2 ilustra um gráfico
de amplificação para o gene lytA a partir do DNA extraído das amostras de nasofaringe
obtidas no estudo.
Figura 2. Gráfico de amplificação do gene lytA a partir do DNA extraído de amostras
nasofaríngeas.
4.6.4 PCR multiplex para sorotipagem de Streptococcus pneumoniae
PCR multiplex convencional foi realizado para um total de 40
soroespecificidades utilizando-se oito reações sequenciais de acordo com o proposto por
Pai e colaboradores (2006) com modificações. Somente foram testadas as amostras que
se mostraram positivas para o gene lytA com valores do ciclo limite da PCR < 35. As
reações incluíram os seguintes sorotipos:
Reação 1 – 14, 6A/6B/6C, 23F, 19A, 9V/9A
Reação 2 – 19F, 3, 15B/15C, 18(18A/18B/18C/18F), 7F/7A
Reação 3 – 1, 5, 11A/11D, 9N/9L, 17F
Reação 4 -7C/7B/40, 12F/12A/44/46, 4, 38/25F, 23A
Reação 5 – 8, 2, 34, 20, 22F/22A
Ct- Ciclo limite no qual a
fluorescência cruza a linha
base do limite (baseline
threshold)
Linha base do limite
(BaselineThreshold) – Ponto de
detecção do gene lytA na
amostra.
22
Reação 6 - 33F/33A/37, 15A/15F, 35F/47F, 35B, 16F
Reação 7 – 39, 23B, 35A/35C/42, 13
Reação 8 – 24(24A/24B/24F), 21, 10F/10C/33C, 10A, 31
Amostras com valores de Ct menores que 35 que não tiveram a detecção do tipo
capsular foram classificadas como não tipáveis (SpNT).
4.7 ANÁLISE DE DADOS
Prevalências de portador de pneumococo e respectivo intervalo de confiança
de 95% foram calculados para cultura e RT-PCR. A Curva ROC (Receiver Operating
Characteristics) é uma ferramenta que permite estudar a variação da sensibilidade e
especificidade para diferentes valores de corte (Hanley & McNeil 1982). Para este
estudo, foram construídas curvas ROC a partir dos valores de Ct preditivos de cultura
positiva e de tipo capsular para identificação dos valores de Ct com maiores
sensibilidade e especificidade. Usando todos os Cts observados como pontos de corte, a
área sob a curva e o seu intervalo de confiança de 95% (IC de 95%) foram calculados
como uma medida discriminadora das técnicas testadas. A área sob a curva é utilizada
para a determinação da acurácia do teste.
Para o cálculo da prevalência de portador utilizando-se a RT-PCR foi criada uma
variável correspondente ao valor inverso do Ct constituída da divisão de 1 pelo valor de
Ct, tendo em vista que a curva gerada pelos valores de Ct é uma hipérbole. Caso não
fosse criada essa variável não seria possível a construção da curva ROC uma vez que os
valores na curva apresentavam-se negativos. Após o cálculo do Ct inverso, foi
identificado o valor do Ct correspondente ao valor do Ct inverso que apresentasse a
melhor acurácia. Comparação entre resultados obtidos pela cultura e pela RT-PCR entre
crianças não vacinadas, incompletamente vacinadas e completamente vacinadas foi
avaliada pelo teste do qui-quadrado de McNemar e índice Kappa (Cohen 1960). Do
ponto de vista imunológico, crianças “não vacinadas” foram definidas como crianças
que não tomaram nenhuma dose ou uma dose da vacina PCV-10 antes de 12 meses de
idade. Vacinação incompleta foi assumida para crianças que tomaram menos de três
doses antes de 12 meses e vacinação completa corresponderam a crianças que tomaram
três doses antes dos 12 meses ou uma dose após 12 meses. Os valores de Ct obtidos por
este estudo foram comparados aos valores de Ct que são utilizados pelo Centers for
Disease Control and Prevention (CDC) para positividade de pneumococo (Ct < 35) e
23
para detecção de sorotipos (Ct ≤ 30) de acordo com publicação de da Gloria et al.
(2010). A cocolonização foi calculada pela razão entre o número de amostras tipadas
pela PCR multiplex que apresentaram mais do que um sorotipo sobre o número total de
amostras do estudo.
4.8 ASPECTOS DE BIOÉTICA
O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás (protocolo nº 145/2010). O
consentimento livre e esclarecido, por escrito, foi obtido dos pais ou responsáveis
legais.
24
5 RESULTADOS
5.1 PREVALÊNCIA
Foram realizadas RT-PCR e cultura em paralelo em 1437 amostras. A
prevalência de portador de S. pneumoniae por técnica é apresentada na Tabela 3 na qual
se observa prevalência significativamente maior pela RT-PCR (56,9%) comparada com
a cultura (39,3%) (Qui-Quadrado de McNemar = 419,9 p < 0,001). O índice Kappa
revelou moderada concordância (0,509) entre as técnicas.
Tabela 3. Comparação entre prevalência de portador de Streptococcus pneumoniae em
crianças de 7 a 18 meses por cultura e pela técnica de RT-PCR. Goiânia, outubro/2010 a
março/2011
RT-PCR
Cultura
Total Positiva Negativa
n % n % n %
Positiva 510 35,5 308 21,4 818 56,9
Negativa 55 3,8 564 39,2 619 43,1
Total 565 39,3 872 60,7 1437 100,0
A prevalência de acordo com a situação vacinal é mostrada na tabela 4.
Utilizando-se positividade por qualquer uma das técnicas em crianças que receberam 3
doses da PCV-10 a prevalência foi significativamente menor (56,6%) quando
comparada com a positividade das que não receberam a PCV-10 (70,5%) (p=0,006).
25
Tabela 4. Prevalência de portador de Streptococcus pneumoniae em crianças de 7 a
18 meses de acordo com a situação vacinal da PCV-10 e técnica utilizada
Status Vacinal Cultura RT-PCR
Cultura ou
RT-PCR
N* n (%) n (%) n (%)
Não Vacinados 88 41 (46,6) 60 (68,2) 62 (70,5)
Vacinação 10 Valente
Incompleta 369 168 (45,5) 220 (59,9) 238 (64,5)
Completa 821 308 (37,5) 430 (52,4) 465 (56,6)
Total 1278 517 (40,5) 710 (55,5) 765 (59,8)
*Foram excluídos 159 casos de PCV-7
5.2 ACURÁCIA DA RT-PCR E PCR MULTIPLEX.
Sensibilidades e especificidades de Ct preditivos de cultura positiva para
pneumococo são mostrados na Tabela 5 para cada situação vacinal. A melhor acurácia
(0,914) foi obtida para crianças não vacinadas, para valores de Ct 33,0 (sensibilidade
88% e especificidade 81,2%), como representado na curva ROC da Figura 3.
Tabela 5. Valores de Ct* preditivos de cultura positiva para Streptococcus pneumoniae por
situação vacinal
Vacinação
Área da
Curva
ROC
IC 95% %
Sensibilidade
%
Especificidade
Valor de
Ct
Não Vacinados (n=224) 0,914 0,875 - 0,953 88 81,2 33,02
Incompleta (n=250) 0,863 0,811 - 0,915 82 80,1 32,79
Completa (n=963) 0,899 0,876 - 0,923 85 80,8 33,60
*Ct = Valor do ciclo da PCR que cruza o limite
26
Figura 3. Curva ROC para valores de Ct preditivos de cultura positiva para pneumococo
para não vacinados.
Para detecção de sorotipos de S. pneumoniae a melhor acurácia (0,936) foi
obtida para o valor de Ct 32,0, com sensibilidade de 90% e especificidade de 84,7%
para não vacinados (Tabela 6 e Figura 4).
Tabela 6. Valores de Ct* preditivos de cultura positiva para Streptococcus pneumoniae por
situação vacinal
Vacinação Área da
curva ROC IC 95%
%
Sensibilidade
%
Especificidade
Valor
de Ct*
Não Vacinados (n=224) 0,936 0,906 - 0,967 90 84,7 32,20
Incompleta (n=250) 0,927 0,896 - 0,958 90 80,1 32,36
Completa (n=963) 0,937 0,923 - 0,952 90 83,9 32,00
*Ct = Valor do ciclo da PCR que cruza o limite
27
Figura 4. Curva ROC para melhor acurácia na detecção de sorotipos de pneumococo
para não vacinados
Em 45,8% das 818 amostras positivas pela RT-PCR não foi possível detectar o
tipo capsular por meio das oito reações da PCR multiplex utilizando valores de Ct
35,0. Portanto, estas amostras foram classificadas como SpNT. A cocolonização por
diferentes sorotipos foi encontrada em 100 (6,9%) das 1437 amostras totais pela PCR
multiplex que corresponde a 22,5% das amostras tipadas (tabela 7).
Tabela 7. Prevalência de sorotipos de pneumococo pela PCR multiplex para valores
de Ct < 35,0
Número de sorotipos* N (%)
1 sorotipo 343 77,5
≥2 sorotipos 100 22,5
Total 443 100
* Números de sorotipos (n=40) detectados pela técnica de PCR Multiplex
28
A Tabela 8 compara a prevalência de S. pneumoniae obtida com os pontos de
corte estabelecidos pelo CDC (Ct < 35) e o ponto de corte (Ct ≤ 33) que alcançou a
melhor acurácia neste estudo. Entre as crianças que não receberam nenhuma PCV, as
prevalências foram, respectivamente, 67,0% e 51,8%, o que caracterizou um aumento
de 15,2% ao se utilizar o Ct estabelecido pelo CDC. Entre as crianças completamente
vacinadas com a PCV-10, os valores foram 52,4% e 38,5% respectivamente, com
aumento de positividade de 13,9% do Ct estabelecido pelo CDC sobre o Ct do nosso
estudo. No total observou-se que valores de Ct < 35 resultaram um acréscimo de 172
crianças positivas (13,5%) em relação a valores de Ct ≤ 33.
Tabela 8. Prevalência de Streptococcus pneumoniae de acordo com situação vacinal e
diferentes valores de Ct
Situação Vacinal N Ct > 0 e < 35 (a) Ct > 0 e ≤ 33 (b) Diferença (a - b)
n % n % n %
Não Vacinados 224 150 67,0 116 51,8 34 15,2
Vacinação PCV10
Incompleta 238 135 56,7 111 46,6 24 10,1
Completa 821 430 52,4 316 38,5 114 13,9
Total 1283 715 55,8 543 42,3 172 13,5
a) Valor do Ct utilizado como referência pelo CDC para positividade ao pneumococo
b) Valor do Ct com melhor acurácia obtido pelo nosso estudo, para positividade ao pneumococo
Na Tabela 9 é possível observar que dentre as 153 crianças com valores de Ct
>33 e <35, em 83,7% delas o pneumococo não foi tipável. Entre os tipáveis, detectou-se
a presença dos sorotipos vacinais 6A/6B, 14, 19F e 23F em 5,9%. Entre as 117 crianças
com amostras com valores de Ct >30 e < 33, 70,1% eram não tipáveis. Entre os tipáveis,
observou-se colonização por sorotipos vacinais em 16,2%.
29
Tabela 9. Prevalência de sorotipos encontrados entre as crianças com valores de Ct entre
33 e < 35 e 30 e < 33
Sorotipos da PCV-10 Ct > 0 e < 35 Ct >30 e < 33 Ct >33 e <35
n (%) n (%) n (%)
Vacinais 210 (32,3) 18 (16,2) 9 (5,9)
Não vacinais 139 (21,4) 16 (13,7) 16 (10,4)
SpNT 301 (46,3) 83 (70,1) 128 (83,7)
Total 650 (100,0) 117 (100,0) 153 (100,0)
30
6 DISCUSSÃO
A prevalência de portador de S. pneumoniae nesta investigação (56,9%) foi
semelhante à observada em estudos conduzidos em países onde se utilizou a tecnologia
PCR (Saukkoriipi et al. 2004; Moreno et al. 2005; Antonio et al. 2009; Brugger et al.
2009; da Gloria et al. 2010; Jourdain et al. 2011; Chien et al. 2012; Ercibengoa et al.
2012; Lamaro-Cardoso et al. 2012).
Os nossos achados mostraram que as prevalências de portador em crianças
vacinadas foram inferiores às obtidas em crianças que não tomaram nenhuma dose da
vacina PCV-10. Isso sugere que a vacina pneumocócica conjugada atua como fator de
proteção à colonização de pneumococos e sinaliza um impacto maior nos indivíduos
que foram imunizados.
Uma das principais limitações da PCR multiplex é o número limitado de
sorotipos detectados (máximo de 40, dos 93 já identificados pela reação de Quellung),
devido à indisponibilidade de sequências de oligonucleotídeos para outros sorotipos de
pneumococos além dos 40 detectados pela técnica (Billal et al. 2008). Outra
desvantagem é a incapacidade da técnica em discriminar sorotipos geneticamente
relacionados como o 6A e 6B, 7F e 7A, 9V e 9A, 11A e 11D, 15B e 15C, 18A, 18B,
18C e 18F, 24A, 24B, 24F, 33F, 33A e 37, 35A, 35C e 42, para os quais os resultados
são apresentados como sorogrupos. Assim, dentre as amostras que foram tipadas pela
PCR multiplex, a taxa de colonização por sorotipos vacinais foi de 58,7% assumindo-se
como sorotipos vacinais todos os sorogrupos contendo pelo menos um sorotipo vacinal.
Por outro lado, nota-se um decréscimo na taxa de colonização para 29,2% quando os
sorogrupos não são somados aos sorotipos vacinais. Este achado sugere que a
contabilização dos sorogrupos deve ser realizada junto aos sorotipos vacinais para evitar
a subestimação das taxas de portadores dos sorotipos circulantes na população.
Apesar dessas limitações, a PCR multiplex ainda apresenta um bom desempenho
devido sua sensibilidade para detectar colonização por múltiplos sorotipos, como visto
neste estudo. Estudos mostraram que a PCR multiplex foi o método mais eficaz para
sorotipagem do pneumococo em amostras de secreção nasofaringeana quando
comparado com a reação de Quellung (Antonio et al. 2009; Rivera-Olivero et al. 2009).
31
Além disso, a PCR multiplex permite o processamento de um grande número de
amostras simultaneamente. Nesta investigação, por exemplo, realizamos
aproximadamente 8 mil reações incluindo RT-PCR e PCR multiplex em um período de
6 meses.
A taxa de cocolonização encontrada entre as crianças participantes do nosso
estudo (6,9%) foi similar a encontrada em estudo anterior conduzido no Brasil, em
Goiânia (7,1%), com a tecnologia PCR multiplex (Lamaro-Cardoso et al. 2012), no
entanto, menor que os resultados relatados na Colombia (9,0%) e Israel (12%) (Moreno
et al. 2005; Carvalho et al. 2010), países que também utilizaram a PCR multiplex em
seus estudos. A maior taxa de cocolonização relatada foi de 39,0% em um estudo
conduzido na Espanha o qual realizou a detecção e sorotipagem do pneumococo a partir
de amostras de STGG com colônias sugestivas de S. pneumoniae, (Ercibengoa et al.
2012). Diferenças entre as taxas de cocolonização podem ser explicadas pelo perfil
genético do pneumococo, amostragem, sazonalidades e outras condições menos
conhecidas. Os sorotipos 6A/6B, 14, 18C, 19F e 23F, presentes na vacina PCV-10,
foram os mais comumente detectados na nasofaringe das crianças do nosso estudo,
semelhantemente a outros estudos que utilizaram soroaglutinação (Quellung) e PCR
multiplex (Wolf et al. 2000; Lucarevschi et al. 2003; Cardoso et al. 2006; Laval et al.
2006; Berezin et al. 2007; Reis et al. 2008; Andrade et al. 2010; Franco et al. 2010;
Lamaro-Cardoso et al. 2012).
O CDC sugere que a realização de PCR multiplex em amostras com valores de Ct
≤ 30 tendem a otimizar a detecção dos sorotipos, porém, no nosso estudo, detectamos
18 (16,2%) sorotipos vacinais para valores de Ct entre 30 e 33, contribuindo assim para
estimativas menos distorcidas do impacto da vacinação nos sorotipos vacinais. A
realização da PCR multiplex para a tipagem capsular em amostras com valores de Ct
menores de 35 adicionou um total de 153 portadores de pneumococo quando comparado
às amostras com valor do Ct menores de 33, estabelecido pelo nosso estudo. Entretanto,
dentre os 153 portadores adicionais, foi observado um grande número de amostras não
tipáveis (83,7%), o que sinaliza que um valor de Ct maior (alta sensibilidade) teria
utilidade em situações de vigilância, embora implique na perda da possibilidade de
sorotipar boa parte das amostras, aspecto importante na avaliação do impacto da vacina
em sorotipos não vacinais decorrente do efeito indireto devido à imunidade de grupo. A
realização da PCR multiplex em amostras com valores de Ct< 33, apresentou um
acréscimo de 117 sorotipos comparado à sorotipagem com valores de Ct<35,
32
permitindo uma otimização na detecção dos sorotipos devido a um menor número de
SpNT.
A avaliação de vacinas requer, portanto, técnicas com alto valor de especificidade,
para reduzir o número de falso positivos, e consequentemente minimizar vieses de
subestimativa do impacto da vacinação. Por outro lado, para finalidades de vigilância
(screening) são necessárias técnicas mais sensíveis, que captem um grande número de
portadores, ainda que com possibilidades de resultados falso positivos de portadores de
SpNT. Diante dos resultados do nosso estudo, para a avaliação do impacto da vacinação
no portador de pneumococo, seria recomendado o uso de valores de Ct menores que 35,
e para a sorotipagem o uso de valores de Ct até 33, resultando em uma maior
sensibilidade na detecção do sorotipo.
Nosso estudo detectou uma taxa alta (45,8%) de portador de SpNT, em
contraposição aos valores inferiores de SpNT (10,5%) encontrados em estudo prévio em
Goiânia, pela reação de Quellung, em crianças que frequentavam creches (Andrade et
al. 2010; Franco et al. 2010), indicando que a diferença nas prevalências de portador de
SpNT possa ser explicada pelas técnicas utilizadas na sorotipagem. A técnica de PCR
multiplex contempla somente 40 sorotipos enquanto a reação de Quellung (padrão ouro)
contempla mais de 90 sorotipos, o que contribuiria para uma diminuição de SpNT e
uma maior sensibilidade da técnica.
O potencial papel dos isolados não tipáveis na substituição de sorotipos na era
pós-vacinação é uma questão em aberto, no entanto, pode-se especular que isolados não
tipáveis poderiam servir como reservatório para futura substituição de doença por cepas
que sofreram mudança da cápsula. Estes achados suscitam a necessidade de se
monitorar a frequência de isolados não tipáveis e mudanças genéticas pós-vacinação,
para se detectar potenciais substituições de doença por sorotipos resultantes de “escape
de vacina”, especialmente em áreas onde a colonização por isolados não tipáveis é
frequente (Andrade et al. 2010). Neste sentido, resultados de estudo piloto com estes
isolados não tipáveis que vem sendo realizado atualmente no CDC (comunicação
pessoal Dra. Glória Carvalho) detectaram a presença de um sub-tipo do sorotipo 19F em
alguns deles. Estes estudos em andamento deverão clarear a relevância deste sub-tipo
19F na sub ou super-estimativa do impacto da vacinação, uma vez que o sorotipo 19F é
um sorotipo contido na vacina PCV-10.
O uso da RT-PCR em larga escala, como alternativa à cultura, se faz necessário
para monitorar o impacto direto e indireto da vacinação na taxa de portador e nos
33
sorotipos vacinais, tanto para países desenvolvidos como para aqueles em
desenvolvimento. Vale ressaltar que a técnica de RT-PCR requer um grande
investimento financeiro inicial que compreende desde a estrutura física, equipamentos,
reagentes e treinamento de pessoal, porém, com a rotina laboratorial esse custo é
compensado, uma vez que os insumos utilizados geralmente permitem o processamento
de muitas amostras simultaneamente em menor tempo quando comparado à cultura.
Técnicas com grande acurácia como a RT-PCR e PCR multiplex seriam, portanto, de
grande importância para medir impacto nesta era pós-vacinal.
Estudos de custo-efetividade devem ser encorajados para apoiarem a decisão de se
utilizar técnicas moleculares, como a RT-PCR e PCR multiplex em inquéritos para se
monitorar o impacto da vacinação.
34
7 CONCLUSÕES
A RT-PCR e a PCR multiplex são técnicas de alta acurácia que possibilitam o
monitoramento da dinâmica dos sorotipos vacinais e não vacinais do pneumococo no
portador contribuindo com informações essenciais para avaliação do impacto da vacina
e para o desenvolvimento de futuras vacinas pneumocócicas.
Diante dos diferentes valores de Ct encontrados neste estudo, concluímos que
para a avaliação do impacto da vacina pneumocócica no portador, seria recomendado o
uso de Ct menor que 35, enquanto que valores de Ct até 33 resultariam em maior
sensibilidade para detecção do sorotipo capsular.
35
8 REFERÊNCIAS
Abdullahi O, Karani A, Tigoi CC, Mugo D, Kungu S, Wanjiru E, Jomo J, Musyimi R,
Lipsitch M, Scott JA 2012. The prevalence and risk factors for pneumococcal
colonization of the nasopharynx among children in Kilifi District, Kenya. PLoS One, 7
(2), e30787.
Adetifa IM, Antonio M, Okoromah CA, Ebruke C, Inem V, Nsekpong D, Bojang A,
Adegbola RA 2012. Pre-vaccination nasopharyngeal pneumococcal carriage in a
Nigerian population: epidemiology and population biology. PLoS One, 7 (1), e30548.
Andrade AL, Franco CM, Lamaro-Cardoso J, Andre MC, Oliveira LL, Kipnis A, Rocha
CG, Andrade JG, Alves SL, Park IH, Nahm MH, Almeida SG, Brandileone MC 2010.
Non-typeable Streptococcus pneumoniae carriage isolates genetically similar to invasive
and carriage isolates expressing capsular type 14 in Brazilian infants. J Infect, 61 (4),
314-322.
Andrade AL, Toscano CM, Minamisava R, Costa PS, Andrade JG 2011. Pneumococcal
disease manifestation in children before and after vaccination: what's new? Vaccine, 29
Suppl 3, C2-14.
Antonio M, Hakeem I, Sankareh K, Cheung YB, Adegbola RA 2009. Evaluation of
sequential multiplex PCR for direct detection of multiple serotypes of Streptococcus
pneumoniae from nasopharyngeal secretions. J Med Microbiol, 58 (Pt 3), 296-302.
Arguedas A, Abdelnour A, Soley C, Jimenez E, Jimenez AL, Ramcharran D, Porat N,
Dagan R, Gray S, Rodgers GL 2012. Prospective epidemiologic surveillance of invasive
pneumococcal disease and pneumonia in children in San Jose, Costa Rica. Vaccine, 30
(13), 2342-2348.
Austrian R 1976. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. The
Mount Sinai journal of medicine, New York, 43 (6), 699-709.
—— 1981. Some observations on the pneumococcus and on the current status of
pneumococcal disease and its prevention. Reviews of infectious diseases, 3 Suppl, S1-
17.
Bae S, Yu JY, Lee K, Lee S, Park B, Kang Y 2012. Nasal colonization by four potential
respiratory bacteria in healthy children attending kindergarten or elementary school in
Seoul, Korea. J Med Microbiol, 61 (Pt 5), 678-685.
36
Bender JM, Ampofo K, Byington CL, Grinsell M, Korgenski K, Daly JA, Mason EO,
Pavia AT 2010. Epidemiology of Streptococcus pneumoniae-induced hemolytic uremic
syndrome in Utah children. Pediatr Infect Dis J, 29 (8), 712-716.
Benson R, Tondella ML, Bhatnagar J, Carvalho Mda G, Sampson JS, Talkington DF,
Whitney AM, Mothershed E, McGee L, Carlone G, McClee V, Guarner J, Zaki S,
Dejsiri S, Cronin K, Han J, Fields BS 2008. Development and evaluation of a novel
multiplex PCR technology for molecular differential detection of bacterial respiratory
disease pathogens. J Clin Microbiol, 46 (6), 2074-2077.
Berezin EN, Cardenuto MD, Ferreira LL, Otsuka M, Guerra ML, Brandileone MC
2007. Distribution of Streptococcus pneumoniae serotypes in nasopharyngeal carriage
and in invasive pneumococcal disease in Sao Paulo, Brazil. Pediatr Infect Dis J, 26 (7),
643-645.
Billal DS, Hotomi M, Suzumoto M, Yamauchi K, Arai J, Katsurahara T, Moriyama S,
Fujihara K, Yamanaka N 2008. Determination of pneumococcal serotypes/genotypes in
nasopharyngeal secretions of otitis media children by multiplex PCR. Eur J Pediatr,
167 (4), 401-407.
Black SB, Shinefield HR, Hansen J, Elvin L, Laufer D, Malinoski F 2001. Postlicensure
evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine.
Pediatr Infect Dis J, 20 (12), 1105-1107.
Bogaert D, De Groot R, Hermans PW 2004. Streptococcus pneumoniae colonisation:
the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis, 4 (3), 144-154.
Botstein D 1980. A theory of modular evolution for bacteriophages. Ann N Y Acad Sci,
354, 484-490.
Bouskraoui M, Soraa N, Zahlane K, Arsalane L, Doit C, Mariani P, Bingen E 2011.
Study of nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae and its antibiotics
resistance in healthy children less than 2 years of age in the Marrakech region
(Morocco). Arch Pediatr, 18 (12), 1265-1270.
Brugger SD, Frey P, Aebi S, Hinds J, Muhlemann K 2010. Multiple colonization with
S. pneumoniae before and after introduction of the seven-valent conjugated
pneumococcal polysaccharide vaccine. PLoS One, 5 (7), e11638.
Brugger SD, Hathaway LJ, Muhlemann K 2009. Detection of Streptococcus
pneumoniae strain cocolonization in the nasopharynx. J Clin Microbiol, 47 (6), 1750-
1756.
Calix JJ, Nahm MH 2010. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably
inactivated wcjE gene. J Infect Dis, 202 (1), 29-38.
37
Cardoso VC, Cervi MC, Cintra OA, Salathiel AS, Gomes AC 2006. Nasopharyngeal
colonization with Streptococcus pneumoniae in children infected with human
immunodeficiency virus. J Pediatr (Rio J), 82 (1), 51-57.
Carvalho MG, Tondella ML, McCaustland K, Weidlich L, McGee L, Mayer LW,
Steigerwalt A, Whaley M, Facklam RR, Fields B, Carlone G, Ades EW, Dagan R,
Sampson JS 2007. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA,
ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J Clin Microbiol, 45 (8),
2460-2466.
CDC 2000. Preventing pneumococcal disease among infants and young children. In
Morb Mortal Wkly Rep, Centers for Disease Control & Prevention, Recommendations
of the Advisory Committee on Immunization Practices p. 1-35.
Cheung YB, Zaman SM, Nsekpong ED, Van Beneden CA, Adegbola RA, Greenwood
B, Cutts FT 2009. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian
children who participated in a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine trial and in
their younger siblings. Pediatr Infect Dis J, 28 (11), 990-995.
Chien YW, Vidal JE, Grijalva CG, Bozio C, Edwards KM, Williams JV, Griffin MR,
Verastegui H, Hartinger SM, Gil AI, Lanata CF, Klugman KP 2012. Density
Interactions between Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and
Staphylococcus aureus in the Nasopharynx of Young Peruvian Children. Pediatr Infect
Dis J.
Choi EH, Kim SH, Eun BW, Kim SJ, Kim NH, Lee J, Lee HJ 2008. Streptococcus
pneumoniae serotype 19A in children, South Korea. Emerging infectious diseases, 14
(2), 275-281.
Cohen J 1960. A Coefficient of Agreement for Nominal Scales. Educ Psychol Meas, 20
(1), 37-46.
Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Fox AJ, Kaczmarski EB 2001.
Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and
Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-
time PCR. J Clin Microbiol, 39 (4), 1553-1558.
Crum NF, Barrozo CP, Chapman FA, Ryan MA, Russell KL 2004. An outbreak of
conjunctivitis due to a novel unencapsulated Streptococcus pneumoniae among military
trainees. Clin Infect Dis, 39 (8), 1148-1154.
Cutts FT, Zaman SM, Enwere G, Jaffar S, Levine OS, Okoko JB, Oluwalana C,
Vaughan A, Obaro SK, Leach A, McAdam KP, Biney E, Saaka M, Onwuchekwa U,
Yallop F, Pierce NF, Greenwood BM, Adegbola RA 2005. Efficacy of nine-valent
pneumococcal conjugate vaccine against pneumonia and invasive pneumococcal disease
in The Gambia: randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet, 365 (9465),
1139-1146.
38
da Gloria MC, Pimenta FC, Jackson D, Roundtree A, Ahmad Y, Millar EV, O'Brien
KL, Whitney CG, Cohen AL, Beall BW 2010. Revisiting pneumococcal carriage by use
of broth enrichment and PCR techniques for enhanced detection of carriage and
serotypes. J Clin Microbiol, 48 (5), 1611-1618.
Dagan R, Givon-Lavi N, Leibovitz E, Greenberg D, Porat N 2009. Introduction and
proliferation of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 19A clones that
cause acute otitis media in an unvaccinated population. J Infect Dis, 199 (6), 776-785.
Dagan R, Givon-Lavi N, Zamir O, Sikuler-Cohen M, Guy L, Janco J, Yagupsky P,
Fraser D 2002. Reduction of nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae
after administration of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine to toddlers attending
day care centers. J Infect Dis, 185 (7), 927-936.
Dagan R, Sikuler-Cohen M, Zamir O, Janco J, Givon-Lavi N, Fraser D 2001. Effect of a
conjugate pneumococcal vaccine on the occurrence of respiratory infections and
antibiotic use in day-care center attendees. Pediatr Infect Dis J, 20 (10), 951-958.
Destefano F, Pfeifer D, Nohynek H 2008. Safety profile of pneumococcal conjugate
vaccines: systematic review of pre- and post-licensure data. Bull World Health Organ,
86 (5), 373-380.
Dhanasekaran S, Doherty TM, Kenneth J 2010. Comparison of different standards for
real-time PCR-based absolute quantification. J Immunol Methods, 354 (1-2), 34-39.
Dias CA, Teixeira LM, Carvalho M G, Beall B 2007. Sequential multiplex PCR for
determining capsular serotypes of pneumococci recovered from Brazilian children. J
Med Microbiol, 56 (Pt 9), 1185-1188.
Dunbar SA 2006. Applications of Luminex xMAP technology for rapid, high-
throughput multiplexed nucleic acid detection. Clin Chim Acta, 363 (1-2), 71-82.
Dunbar SA, Vander Zee CA, Oliver KG, Karem KL, Jacobson JW 2003. Quantitative,
multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the
Luminex LabMAP system. J Microbiol Methods, 53 (2), 245-252.
Ecker DJ, Jared J. Drader, Jose Gutierrez, Abel Gutierrez, James C. Hannis, Amy
Schink, Rangarajan Sampath, Lawrence B. Blyn, Mark W. Eshoo, Thomas A. Hall,
Maria Tobarmosquera, Yun Jiang, Kristin A. Sannes-Lowery, Lendell L. Cummins,
Brian Libby, Demetrius J. Walcott, Christian Massire, Raymond Ranken, Sheri
Manalili, Cristina Ivy, Rachael Melton, Harold Levene, Vanessa Harpin, Feng Li, Neill
White, Michael Pear, Joseph A. Ecker, Vivek Samant, Duane Knize, David Robbins,
Karl Rudnick, Fred Hajjar, Hofstadler SA 2006. The Ibis T5000 Universal Biosensor:
An Automated Platform for Pathogen Identification and Strain Typing. JALA, 11, 341-
351.
39
Ecker DJ, Massire C, Blyn LB, Hofstadler SA, Hannis JC, Eshoo MW, Hall TA,
Sampath R 2009. Molecular genotyping of microbes by multilocus PCR and mass
spectrometry: a new tool for hospital infection control and public health surveillance.
Methods Mol Biol, 551, 71-87.
Ekdahl K, Ahlinder I, Hansson HB, Melander E, Molstad S, Soderstrom M, Persson K
1997. Duration of nasopharyngeal carriage of penicillin-resistant Streptococcus
pneumoniae: experiences from the South Swedish Pneumococcal Intervention Project.
Clin Infect Dis, 25 (5), 1113-1117.
Ercibengoa M, Arostegi N, Marimon JM, Alonso M, Perez-Trallero E 2012. Dynamics
of pneumococcal nasopharyngeal carriage in healthy children attending a day care
center in northern Spain. Influence of detection techniques on the results. BMC Infect
Dis, 12, 69.
Facklam RR, Whashington JA 1991. Streptococcus and related catalase-negative Gram
positive cocci. In Balows A, Hausler WJ, Hermann-Jr KL, Isenberg HD, Shadomy HJ,
Manual of clinical microbiology, 5 ed., American Society for Microbiology,
Washington D. C., p. 238-257.
Faust K, Demmert M, Bendiks M, Gopel W, Herting E, Hartel C 2012. Intrapartum
colonization with Streptococcus pneumoniae, early-onset sepsis and deficient specific
neonatal immune responses. Arch Gynecol Obstet, 285 (3), 599-604.
Fedson DS, Musher DM, Eskola J 1999. Pneumococcal vaccine. In Plotkin AS,
Orestein WA, Vaccines, 3 ed., Philadephia Saunders p. 553-608.
Fernebro J, Andersson I, Sublett J, Morfeldt E, Novak R, Tuomanen E, Normark S,
Normark BH 2004. Capsular expression in Streptococcus pneumoniae negatively
affects spontaneous and antibiotic-induced lysis and contributes to antibiotic tolerance.
J Infect Dis, 189 (2), 328-338.
Finland M, Barnes MW 1977. Changes in occurrence of capsular serotypes of
Streptococcus pneumoniae at Boston City Hospital during selected years between 1935
and 1974. J Clin Microbiol, 5 (2), 154-166.
Franco CM, Andrade AL, Andrade JG, Almeida e Silva S, Oliveira CR, Pimenta FC,
Lamaro-Cardoso J, Brandao AP, Almeida SC, Calix JJ, Nahm MH, de Cunto
Brandileone MC 2010. Survey of nonsusceptible nasopharyngeal Streptococcus
pneumoniae isolates in children attending day-care centers in Brazil. Pediatr Infect Dis
J, 29 (1), 77-79.
Fuchs SC, Fischer GB, Black RE, Lanata C 2005. The burden of pneumonia in children
in Latin America. Paediatr Respir Rev, 6 (2), 83-87.
Ghaffar F, Friedland IR, McCracken-Jr. GH 1999. Dynamics of nasopharyngeal
colonization by Streptococcus pneumoniae. Pediatr Infect Dis J, 18 (7), 638-646.
40
Gladstone RA, Jefferies JM, Faust SN, Clarke SC 2011. Continued control of
pneumococcal disease in the UK - the impact of vaccination. J Med Microbiol, 60 (Pt
1), 1-8.
Gratten M, Manning K, Dixon J, Morey F, Torzillo P, Hanna J, Erlich J, Asche V, Riley
I 1994. Upper airway carriage by Haemophilus influenzae and Streptococcus
pneumoniae in Australian aboriginal children hospitalised with acute lower respiratory
infection. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 25 (1), 123-131.
Gray BM, Converse GM, 3rd, Dillon HC, Jr. 1980. Epidemiologic studies of
Streptococcus pneumoniae in infants: acquisition, carriage, and infection during the first
24 months of life. J Infect Dis, 142 (6), 923-933.
Grivea IN, Tsantouli AG, Michoula AN, Syrogiannopoulos GA 2011. Dynamics of
Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal carriage with high heptavalent
pneumococcal conjugate vaccine coverage in Central Greece. Vaccine, 29 (48), 8882-
8887.
Hammitt LL, Bruden DL, Butler JC, Baggett HC, Hurlburt DA, Reasonover A,
Hennessy TW 2006. Indirect effect of conjugate vaccine on adult carriage of
Streptococcus pneumoniae: an explanation of trends in invasive pneumococcal disease.
J Infect Dis, 193 (11), 1487-1494.
Hanley JA, McNeil BJ 1982. The meaning and use of the area under a receiver
operating characteristic (ROC) curve. Radiology, 143 (1), 29-36.
Hathaway LJ, Stutzmann Meier P, Battig P, Aebi S, Muhlemann K 2004. A homologue
of aliB is found in the capsule region of nonencapsulated Streptococcus pneumoniae. J
Bacteriol, 186 (12), 3721-3729.
Hausdorff WP, Feikin DR, Klugman KP 2005. Epidemiological differences among
pneumococcal serotypes. The Lancet infectious diseases, 5 (2), 83-93.
Hausdorff WP, Siber G, Paradiso PR 2001. Geographical differences in invasive
pneumococcal disease rates and serotype frequency in young children. Lancet, 357
(9260), 950-952.
Hill PC, Akisanya A, Sankareh K, Cheung YB, Saaka M, Lahai G, Greenwood BM,
Adegbola RA 2006. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian
villagers. Clin Infect Dis, 43 (6), 673-679.
Hinds J, Gould K, Witney A, Baldry S, Lambersten L 2010. Investigation of serotype
diversity, non-typeable isolates and nasopharyngeal co-colonization by microarray-
based molecular serotyping of Streptococcus pneumoniae. 7th International Symposium
on Pneumococci and Pneumococcal Diseases (ISPPD-7). Tel Aviv, Israel. pp 129.
41
Huebner RE, Wasas AD, Klugman KP 2000. Trends in antimicrobial resistance and
serotype distribution of blood and cerebrospinal fluid isolates of Streptococcus
pneumoniae in South Africa, 1991-1998. International journal of infectious diseases :
IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases, 4 (4),
214-218.
Janson H, Ruan M, Forsgren A 1993. Limited diversity of the protein D gene (hpd)
among encapsulated and nonencapsulated Haemophilus influenzae strains. Infection and
immunity, 61 (11), 4546-4552.
Jin P, Kong F, Xiao M, Oftadeh S, Zhou F, Liu C, Russell F, Gilbert GL 2009. First
report of putative Streptococcus pneumoniae serotype 6D among nasopharyngeal
isolates from Fijian children. J Infect Dis, 200 (9), 1375-1380.
Jourdain S, Dreze PA, Vandeven J, Verhaegen J, Van Melderen L, Smeesters PR 2011.
Sequential multiplex PCR assay for determining capsular serotypes of colonizing S.
pneumoniae. BMC Infect Dis, 11, 100.
Korona-Glowniak I, Malm A 2012. Characteristics of Streptococcus pneumoniae
Strains Colonizing Upper Respiratory Tract of Healthy Preschool Children in Poland.
Sci World J.
Lamaro-Cardoso J, de Lemos AP, Carvalho Mda G, Pimenta FC, Roundtree A, Motta
L, Vieira MA, Sgambatti S, Thorn LK, Pessoa-Junior V, Minamisava R, Harrison LH,
Beall BW, Brandileone MC, Andrade AL 2012. Molecular epidemiological
investigation to determine the source of a fatal case of serotype 22F pneumococcal
meningitis. J Med Microbiol, 61 (Pt 5), 686-692.
Laval CB, de Andrade AL, Pimenta FC, de Andrade JG, de Oliveira RM, Silva SA, de
Lima EC, Fabio JL, Casagrande ST, Brandileone MC 2006. Serotypes of carriage and
invasive isolates of Streptococcus pneumoniae in Brazilian children in the era of
pneumococcal vaccines. Clin Microbiol Infect, 12 (1), 50-55.
Lawrence ER, Arias CA, Duke B, Beste D, Broughton K, Efstratiou A, George RC,
Hall LM 2000. Evaluation of serotype prediction by cpsA-cpsB gene polymorphism in
Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol., 38 (4), 1319-1323.
Leung MH, Bryson K, Freystatter K, Pichon B, Edwards G, Charalambous BM,
Gillespie SH 2012. Sequetyping: serotyping Streptococcus pneumoniae by a single PCR
sequencing strategy. J Clin Microbiol, 50 (7), 2419-2427.
Lindberg AA 1999. Glycoprotein conjugate vaccines. Vaccine, 17 Suppl 2, S28-36.
Lucarevschi BR, Baldacci ER, Bricks LF, Bertoli CJ, Teixeira LM, Mendes CM,
Oplustil C 2003. Oropharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae by children
attending day care centers in Taubate, SP: correlation between serotypes and the
conjugated heptavalent pneumococcal vaccine. J Pediatr (Rio J), 79 (3), 215-220.
42
Martin M, Turco JH, Zegans ME, Facklam RR, Sodha S, Elliott JA, Pryor JH, Beall B,
Erdman DD, Baumgartner YY, Sanchez PA, Schwartzman JD, Montero J, Schuchat A,
Whitney CG 2003. An outbreak of conjunctivitis due to atypical Streptococcus
pneumoniae. N Engl J Med, 348 (12), 1112-1121.
Massire C, Gertz RE, Jr., Svoboda P, Levert K, Reed MS, Pohl J, Kreft R, Li F, White
N, Ranken R, Blyn LB, Ecker DJ, Sampath R, Beall B 2012. Concurrent serotyping and
genotyping of pneumococci by use of PCR and electrospray ionization mass
spectrometry. J Clin Microbiol, 50 (6), 2018-2025.
Mbelle N, Huebner RE, Wasas AD, Kimura A, Chang I, Klugman KP 1999.
Immunogenicity and impact on nasopharyngeal carriage of a nonavalent pneumococcal
conjugate vaccine. J Infect Dis, 180 (4), 1171-1176.
Messmer G 2004. The German Name Authority File (PND) in the Bavarian Union
Catalogue: Principles, Experiences, and Costs. Cataloging & Classification Quarterly,
39 (1/2), 421-427.
MMWR 2006. Vaccine preventable deaths and the global immunization vision and
strategy, 2006–2015. MMWR. Morbidity and mortality weekly report, 55, 512-515.
—— 2010. Invasive pneumococcal disease in young children before licensure of 13-
valent pneumococcal conjugate vaccine - United States, 2007. MMWR. Morbidity and
mortality weekly report, 59 (9), 253-257.
Morais L, Carvalho Mda G, Roca A, Flannery B, Mandomando I, Soriano-Gabarro M,
Sigauque B, Alonso P, Beall B 2007. Sequential multiplex PCR for identifying
pneumococcal capsular serotypes from South-Saharan African clinical isolates. J Med
Microbiol, 56 (Pt 9), 1181-1184.
Moreno J, Hernandez E, Sanabria O, Castaneda E 2005. Detection and serotyping of
Streptococcus pneumoniae from nasopharyngeal samples by PCR-based multiplex
assay. J Clin Microbiol, 43 (12), 6152-6154.
Nelson AL, Roche AM, Gould JM, Chim K, Ratner AJ, Weiser JN 2007. Capsule
enhances pneumococcal colonization by limiting mucus-mediated clearance. Infect
Immun, 75 (1), 83-90.
Novaes HMD, Sartori AMC, Soárez PCd 2011. Hospitalization rates for pneumococcal
disease in Brazil, 2004 - 2006. Revista de Saúde Pública, 45, 539-547.
O'Brien KL, Millar EV, Zell ER, Bronsdon M, Weatherholtz R, Reid R, Becenti J,
Kvamme S, Whitney CG, Santosham M 2007. Effect of pneumococcal conjugate
vaccine on nasopharyngeal colonization among immunized and unimmunized children
in a community-randomized trial. J Infect Dis, 196 (8), 1211-1220.
43
O'Brien KL, Moulton LH, Reid R, Weatherholtz R, Oski J, Brown L, Kumar G,
Parkinson A, Hu D, Hackell J, Chang I, Kohberger R, Siber G, Santosham M 2003.
Efficacy and safety of seven-valent conjugate pneumococcal vaccine in American
Indian children: group randomised trial. Lancet, 362 (9381), 355-361.
O'Brien KL, Wolfson LJ, Watt JP, Henkle E, Deloria-Knoll M, McCall N, Lee E,
Mulholland K, Levine OS, Cherian T 2009. Burden of disease caused by Streptococcus
pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet, 374 (9693),
893-902.
Pai R, Gertz RE, Beall B 2006. Sequential multiplex PCR approach for determining
capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol, 44 (1), 124-
131.
Park IH, Pritchard DG, Cartee R, Brandao A, Brandileone MC, Nahm MH 2007.
Discovery of a new capsular serotype (6C) within serogroup 6 of Streptococcus
pneumoniae. J Clin Microbiol, 45 (4), 1225-1233.
PNI 2011. SI-PNI - Sistema de Informação do Programa Nacional de Imunizações.
Ministério da Saúde 2011.
http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?pni/CNV/CPNIGO.def . Acessado em 10 de
janeiro de 2013.
Prymula R, Kriz P, Kaliskova E, Pascal T, Poolman J, Schuerman L 2009. Effect of
vaccination with pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to Haemophilus
influenzae-derived protein D on nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae
and H. influenzae in children under 2 years of age. Vaccine, 28 (1), 71-78.
Prymula R, Peeters P, Chrobok V, Kriz P, Novakova E, Kaliskova E, Kohl I, Lommel
P, Poolman J, Prieels JP, Schuerman L 2006. Pneumococcal capsular polysaccharides
conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both
Streptococcus pneumoniae and non-typable Haemophilus influenzae: a randomised
double-blind efficacy study. Lancet, 367 (9512), 740-748.
Ray GT, Pelton SI, Klugman KP, Strutton DR, Moore MR 2009. Cost-effectiveness of
pneumococcal conjugate vaccine: an update after 7 years of use in the United States.
Vaccine, 27 (47), 6483-6494.
Regev-Yochay G, Abullaish I, Malley R, Shainberg B, Varon M, Roytman Y, Ziv A,
Goral A, Elhamdany A, Rahav G, Raz M, Collaborative P-I 2012. Streptococcus
pneumoniae Carriage in the Gaza Strip. PLoS One, 7 (4).
Reis JN, Palma T, Ribeiro GS, Pinheiro RM, Ribeiro CT, Cordeiro SM, da Silva Filho
HP, Moschioni M, Thompson TA, Spratt B, Riley LW, Barocchi MA, Reis MG, Ko AI
2008. Transmission of Streptococcus pneumoniae in an urban slum community. J
Infect, 57 (3), 204-213.
44
Rivera-Olivero IA, Blommaart M, Bogaert D, Hermans PW, de Waard JH 2009.
Multiplex PCR reveals a high rate of nasopharyngeal pneumococcal 7-valent conjugate
vaccine serotypes co-colonizing indigenous Warao children in Venezuela. J Med
Microbiol, 58 (Pt 5), 584-587.
Roca A, Sigauque B, Quinto L, Mandomando I, Valles X, Espasa M, Abacassamo F,
Sacarlal J, Macete E, Nhacolo A, Levine M, Alonso P 2006. Invasive pneumococcal
disease in children<5 years of age in rural Mozambique. Trop Med Int Health, 11 (9),
1422-1431.
Rodrigues F, Nunes S, Sa-Leao R, Goncalves G, Lemos L, de Lencastre H 2009.
Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal carriage in children attending day-care
centers in the central region of Portugal, in the era of 7-valent pneumococcal conjugate
vaccine. Microb Drug Resist, 15 (4), 269-277.
Rubin LG, Rizvi A 2004. PCR-based assays for detection of Streptococcus pneumoniae
serotypes 3, 14, 19F and 23F in respiratory specimens. J Med Microbiol, 53 (Pt 7), 595-
602.
Sa-Leao R, Nunes S, Brito-Avo A, Frazao N, Simoes AS, Crisostomo MI, Paulo AC,
Saldanha J, Santos-Sanches I, de Lencastre H 2009. Changes in pneumococcal
serotypes and antibiotypes carried by vaccinated and unvaccinated day-care centre
attendees in Portugal, a country with widespread use of the seven-valent pneumococcal
conjugate vaccine. Clin Microbiol Infect, 15 (11), 1002-1007.
Sa-Leao R, Simoes AS, Nunes S, Sousa NG, Frazao N, de Lencastre H 2006.
Identification, prevalence and population structure of non-typable Streptococcus
pneumoniae in carriage samples isolated from preschoolers attending day-care centres.
Microbiology, 152 (Pt 2), 367-376.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR 1977. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 74 (12), 5463-5467.
Saukkoriipi A, Leskela K, Herva E, Leinonen M 2004. Streptococcus pneumoniae in
nasopharyngeal secretions of healthy children: comparison of real-time PCR and culture
from STGG-transport medium. Mol Cell Probes, 18 (3), 147-153.
Scott P, Egger M, Rutjes AWS, Bermetz L, Robert N, Scott S, Lourenço T, Low N
2011. A systematic review of PCV schedules of data from randomized controlled trials
and observational studies of childhood schedules using 7, 9, 10 and 13 valent vaccines.
In WHO, SAGE Meeting, Strategic Advisory Group of Experts (SAGE) on
Immunization, p. 13.
Song XM, Forsgren A, Janson H 1995. The gene encoding protein D (hpd) is highly
conserved among Haemophilus influenzae type b and nontypeable strains. Infection and
immunity, 63 (2), 696-699.
45
Sorensen UB 1993. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J Clin
Microbiol, 31 (8), 2097-2100.
Sorensen UB, Blom J, Birch-Andersen A, Henrichsen J 1988. Ultrastructural
localization of capsules, cell wall polysaccharide, cell wall proteins, and F antigen in
pneumococci. Infection and Immunity, 56 (8), 1890-1896.
Sorensen UB, Henrichsen J, Chen HC, Szu SC 1990. Covalent linkage between the
capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae
revealed by immunochemical methods. Microbial pathogenesis, 8 (5), 325-334.
Spratt BG, Hanage WP, Feil EJ 2001. The relative contributions of recombination and
point mutation to the diversification of bacterial clones. Current opinion in
microbiology, 4 (5), 602-606.
Turner P, Hinds J, Turner C, Jankhot A, Gould K, Bentley SD, Nosten F, Goldblatt D
2011. Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal
serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray. J Clin
Microbiol, 49 (5), 1784-1789.
Valente C, Hinds J, Pinto F, Brugger SD, Gould K, Muhlemann K, de Lencastre H, Sa-
Leao R 2012. Decrease in pneumococcal co-colonization following vaccination with the
seven-valent pneumococcal conjugate vaccine. PLoS One, 7 (1), e30235.
Vu HT, Yoshida LM, Suzuki M, Nguyen HA, Nguyen CD, Nguyen AT, Oishi K,
Yamamoto T, Watanabe K, Vu TD 2011. Association between nasopharyngeal load of
Streptococcus pneumoniae, viral coinfection, and radiologically confirmed pneumonia
in Vietnamese children. Pediatr Infect Dis J, 30 (1), 11-18.
Weintraub A 2003. Immunology of bacterial polysaccharide antigens. Carbohydrate
research, 338 (23), 2539-2547.
Whitney CG, Farley MM, Hadler J, Harrison LH, Bennett NM, Lynfield R, Reingold A,
Cieslak PR, Pilishvili T, Jackson D, Facklam RR, Jorgensen JH, Schuchat A 2003.
Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-
polysaccharide conjugate vaccine. N Engl J Med, 348 (18), 1737-1746.
Whitney CG, Pilishvili T, Farley MM, Schaffner W, Craig AS, Lynfield R, Nyquist AC,
Gershman KA, Vazquez M, Bennett NM, Reingold A, Thomas A, Glode MP, Zell ER,
Jorgensen JH, Beall B, Schuchat A 2006. Effectiveness of seven-valent pneumococcal
conjugate vaccine against invasive pneumococcal disease: a matched case-control study.
Lancet, 368 (9546), 1495-1502.
WHO 1994. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization: WHO
position paper. Weekly Epidemiological Record, 82 (12), 93-104.
46
—— 2012. Pneumococcal vaccines: WHO position paper - 2012. Weekly
Epidemiological Record, 87 (14), 129-144.
Wolf B, Rey LC, Brisse S, Moreira LB, Milatovic D, Fleer A, Roord JJ, Verhoef J
2000. Molecular epidemiology of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae
colonizing children with community-acquired pneumonia and children attending day-
care centres in Fortaleza, Brazil. J Antimicrob Chemother, 46 (5), 757-765.
Wroe PC, Lee GM, Finkelstein JA, Pelton SI, Hanage WP, Lipsitch M, Stevenson AE,
Rifas-Shiman SL, Kleinman K, Dutta-Linn MM, Hinrichsen VL, Lakoma M, Huang SS
2012. Pneumococcal Carriage and Antibiotic Resistance in Young Children Before 13-
valent Conjugate Vaccine. Pediatric Infectious Disease Journal 31 (3), 249-254.
Zemlickova H, Urbaskova P, Adamkova V, Motlova J, Lebedova V, Prochazka B 2006.
Characteristics of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis and Staphylococcus aureus isolated from the nasopharynx of healthy
children attending day-care centres in the Czech Republic. Epidemiol Infect, 134 (6),
1179-1187.