ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA SINVASTATINA ENCAPSULADA

EM MICROESFERAS DE PLDLA NA REGENERAÇÃO ÓSSEA

Marlon Moda1, Cíntia C. Santos1, Diego D. Leonato1, Andrea R. Esposito1,2, Bruna A.

Mas1,2, Silvia M. M. Cattani1, Kelly F. Martins1, Maria L. P. Barbo1, Eliana A. R.

Duek1,2

1Laboratório de Biomateriais, Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, Sorocaba (SP), Brasil 2Departamento de Engenharia de Materiais, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), Brasil

E-mail: eliduek@pucsp.br

Resumo. Estudos recentes demonstram que o uso de polímeros biorreabsorvíveis como microcarregadores de fármacos oferece flexibilidade na dosagem e na cinética de liberação, melhorando a eficácia no tratamento e fornecendo melhores condições para os pacientes. A sinvastatina tem como efeito pleiotrópico a melhora da regeneração óssea mostrando-se adequada para associação a microesferas no tratamento do tecido ósseo. O objetivo deste estudo consistiu em obter microesferas do copolímero biorreabsorvível e biocompatível poli(L-co-DL ácido láctico) (PLDLA) contendo sinvastatina e investigar sua ação na regeneração óssea em estudo in vivo. Para tanto, microesferas com e sem o fármaco foram obtidas pelo processo de simples emulsão e caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura. No estudo in vivo, defeitos ósseos foram realizados na região proximal da tíbia de 45 ratos Wistar, nos quais as microesferas com e sem o fármaco foram implantadas, além do grupo controle que permaneceu sem tratamento. As microesferas obtidas apresentaram morfologia esférica, superfície lisa, tamanho em escala micrométrica e grande distribuição de diâmetros. Após os períodos de 15, 30 e 60 dias os resultados histológicos evidenciaram diferenças entre o crescimento ósseo dos grupos, principalmente no período de 15 dias pós-operatório. Todos os grupos apresentaram preenchimento do defeito com trabéculas jovens e irregulares, porém no grupo com microesferas contendo sinvastatina o fechamento foi total, sugerindo o efeito osteogênico do fármaco. Portanto, os resultados obtidos mostraram que as microesferas de PLDLA são dispositivos promissores para emprego na liberação controlada de fármacos na engenharia tecidual e medicina regenerativa, demonstrando a biocompatibilidade do dispositivo no tecido ósseo.

Palavras-chave: PLDLA, Microesferas, Sinvastatina, Liberação controlada de fármacos

INTRODUÇÃO

Atualmente, grande parte dos medicamentos é administrada por via parenteral e para assegurar a eficácia do tratamento, concentrações elevadas do fármaco ou alta frequência de dosagem devem ser administradas. Com isso, efeitos colaterais exacerbados e resposta imune intensa pode ser desencadeados levando o paciente a um grande desconforto e em alguns casos a desistência do tratamento (LANGER &

TIRELL, 2004; HAMMAN et al., 2005; BRANCO & SCHNEIDER, 2009; AYUKAWA et al., 2010).

Para aumentar a eficácia da liberação parental de fármacos, tratamentos localizados têm sido pesquisados. Eles envolvem carreadores que possibilitam a liberação do fármaco no local a ser tratado, de forma controlada e otimizada em um determinado período de tempo, reduzindo a toxicidade, pois o fármaco é mantido a um nível terapeuticamente desejável no plasma e com isso diminuem os efeitos colaterais (PAWAR et al., 2004; SHI & LI, 2005; GOLDBERG et al., 2007; LEE & YUK, 2007; JABR-MILANE et al., 2008; KIM et al., 2010; ROMEO & FANOVICH, 2010; ZOU et al., 2012 ).

Há vários meios de se promover a liberação controlada de fármacos, mas duas formas vêm se destacando pelas suas propriedades diferenciadas: as nano e as microesferas (PINTO et al., 2010).

As microesferas são partículas esféricas com diâmetro entre 1 e 250 µm desenvolvidas visando inúmeras aplicações terapêuticas já que muitos dos novos fármacos de estruturas complexas, como peptídeos, são frequentemente difíceis de serem administrados de maneira conveniente por outros meios e no caso dos antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) pode-se evitar a irritação da mucosa gástrica causada pelo medicamento (PEPPAS, 1997). Nestes vetores é possível encapsular o fármaco e controlar sua liberação obtendo, assim, além da redução de gastos, maior eficácia no tratamento parenteral (KUMAR, 2000).

A matriz ideal para liberação de fármacos deve ser inerte, biocompatível, confortável para o paciente, capaz de carregar altas cargas de fármacos, simples para administração e remoção, fácil de fabricar e esterilizar e de baixo custo. O modelo e material adequados para a seleção da matriz em cada aplicação específica dependem de diversas variáveis, incluindo propriedades físicas (mecânica, degradação, formação do gel), propriedades do transporte (difusão) e propriedades biológicas (adesão celular e sinalização) (DRURY & MOONEY, 2003).

Polímeros biorreabsorvíveis têm sido muito usados na área médica em decorrência das inúmeras vantagens apresentadas por essa classe de polímeros (BARBANTI et al., 2005; LIU et al., 2006; ESPOSITO et al., 2009; LEONATO et al, 2009; MODA et al., 2009; ESPOSITO et al., 2010; LIU et al, 2010; RAJPUT & AGRAWAL, 2010; CATTANI et al., 2011; ESPOSITO et al., 2011), sendo a principal delas o fato de degradarem por hidrólise de suas ligações ésteres, em contato com os fluidos corpóreos, originando produtos na forma de oligômeros solúveis e não tóxicos que, após sofrerem a ação metabólica do organismo, são transformados em CO2 e H2O (AMBROSE & CLANTON, 2004).

Neste sentido, microesferas poliméricas têm-se mostrado ideais, pois apresentam as características adequadas para a aplicação em questão e oferecem flexibilidade na dosagem, cinética de liberação e marcação de receptores para liberação de fármacos ou genes (YUN et al, 2004).

O poli(L-co-D,L acido lático), PLDLA, é um copolímero formado por dois enantiômeros do acido lático que tem como característica diminuir a cristalinidade, conferir boas propriedades mecânicas ao material, com tempo de degradação mais adequado ao requerido pelas fraturas ósseas e liberação controlada de fármacos (MOTTA & DUEK, 2008).

Apesar de a composição óssea possuir alta resistência, fraturas representam uma realidade absoluta dentro da área médica e com grandes repercussões na saúde pública. Mesmo com uma capacidade de regeneração extremamente eficaz, muitas fraturas determinam uma perda de massa óssea incompatível com o processo de regeneração

humana e é nesse contexto que a intervenção cirúrgica ganha destaque, sendo que, atualmente, duas estratégias são utilizadas: os transplantes e os implantes, isto é, obtenção de substitutos de origem sintética ou natural que sejam inertes e capazes de restabelecer a biomecânica da região envolvida (TREJO et al., 2000).

Neste contexto, microesferas contendo fatores de crescimento ósseo ou fármacos podem estimular a regeneração. Estudos recentes mostraram que as estatinas (dentre elas, a sinvastatina), um grupo de drogas usadas para a diminuição do colesterol, possuem entre os vários efeitos pleiotrópicos, a melhora da regeneração do tecido ósseo uma vez que podem alterar os mecanismos de formação e reabsorção óssea (MUNDY et al, 1999; GARRETT & MUNDY, 2002; THYLIN et al., 2002; JADHAV & JAIN, 2006).

O efeito benéfico da sinvastatina no tecido ósseo foi verificado em um modelo de ratas ovarioctomizadas, demonstrado que o fármaco preveniu parcialmente a perda de osso esponjoso enquanto aumentou a formação do osso cortical (OXLUND & ANDREASSEN, 2004). O aumento da expressão de BMP-2 também foi verificado em trabalhos de cultura de células indiferenciadas tratadas com sinvastatina (SUGIYAMA et al., 2000; MAEDA et al., 2001; PHILLIPS et al., 2001; SONG et al., 2003).

Recentemente, Nyan e colaboradores (2010) mostraram que a sinvastatina libertada a partir de α-tricálcio fosfato por mais de 2 semanas melhorou a cicatrização de defeitos realizados em calvárias de ratos, aparentemente através de um aumento expressão de BMP-2 e TGF-β1.

Griffiths & Cartmell (2007), fizeram cultura de osteoblastos em uma solução contendo sinvastatina e subsequentemente semearam as células em um arcabouço de poli(L-ácido lático) (PLLA). A análise da matriz mostrou um aumento da mineralizacão e da expressão da proteína óssea morfogenética do tipo 2 e da proteína não colágena ostepontina. Esses achados sugerem que as estatinas além de aumentarem a mineralizacão da matriz, têm o potencial de aumentar a diferenciação e crescimento de osteoblastos, podendo contribuir assim, em cirurgias ortopédicas de reconstrução.

O estudo de caracterização das microesferas de PLDLA/sinvastatina realizado por Santos (2011) evidenciou que o método de simples emulsão possibilitou a obtenção de microesferas de PLDLA com morfologia e diâmetro variável entre 4 a 60 µm, portanto compatível para a aplicação como dispositivo para liberação controlada de fármacos, com eficiência na encapsularão da sinvastatina, mantendo a integridade das estruturas do polímero e do fármaco. Além disso, a análise de HPLC demonstrou que houve maior liberação inicial de fármaco, característica de sistemas compostos por microesferas de diâmetros variados.

Sabe-se que para a obtenção de microesferas para liberação de fármaco por um longo período de tempo é desejável que as partículas tenham distribuição de tamanho variando de 20 a 100 µm (JEFFERY et al., 1991; JOHANSON et al., 2000; O’HAGAN & SINGH, 2004).

Diante deste cenário, o presente estudo tem como objetivos obter microesferas de PLDLA e estudar a eficiência desse novo dispositivo polimérico com encapsulação da sinvastatina, visando aplicações terapêuticas no processo de regeneração de tecidos ósseos.

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Obtenção das Microesferas

As microesferas de PLDLA com e sem o fármaco foram obtidas pelo processo extração/remoção do solvente onde a técnica por simples emulsão (O/W) foi escolhida em função do fármaco hidrofóbico utilizado.

1.1. Microesferas sem o medicamento

O PLDLA foi sintetizado no laboratório de Biomateriais da PUC-SP, conforme descrito por Motta (2007).

Inicialmente 1,0 g de PLDLA granulado foi dissolvido em 10,0 mL de clorofórmio (Merck) sob agitação em agitador magnético (Ika) para sua total dissolução. A solução resultante foi adicionada a 100 mL de solução aquosa de PVAl a 1% (Vetec) sob agitação constante em emulsificador a 24 rpm por 6 minutos formando-se a assim a simples emulsão.

Para que ocorresse a evaporação do solvente, a solução final permaneceu em agitação por 3 horas. O conteúdo do béquer foi, então, vertido em tubos de ensaio e estes submetidos à centrifugação por 5 minutos a 3500 rpm. As microesferas foram retiradas do tubo e secas por 24 horas em estufa à vácuo e, ao final foram congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas para estocagem. O processo descrito foi adaptado de Garret e colaboradores (2007).

1.2. Microesferas com o fármaco Sinvastatina

O procedimento para a obtenção das microesferas de PLDLA com o fármaco seguiu a mesma metodologia da obtenção das microesferas sem o fármaco. A diferença, entretanto foi a adição 0,2g de sinvastatina dissolvida em 4mL de acetona à solução de PLDLA. Posteriormente a solução polímero/fármaco foi submetida à emulsificação com PVAl 1% seguindo a metodologia descrita anteriormente.

2. Morfologia das microesferas (MEV)

Para a análise morfológica das microesferas de PLDLA com e sem o fármaco foi utilizado um microscópio eletrônico de varredura modelo JEOL JXA 840A com tensão de 10kV. Para metalização das amostras foi utilizado um metalizador SPUTER COATER BALTEC SCD 050 com corrente de 40mA por 200s.

3. Estudo in vivo

3.1. Animais experimentais

Foram utilizados quarenta e cinco (45) ratos Wistar de ambos os sexos com idade aproximada de três meses e pesando entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério da Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde da Pontifícia Universidade Católica de São Paulo (FCMS/PUC-SP). Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas recebendo ração comercial e água “ad libitum” e em regime de claro-escuro correspondente a 12 horas e temperatura controlada de cerca de 23 ºC 2 ºC.

Eles foram divididos em três (3) grupos equivalentes aos tempos de implantes das microesferas: quinze (15), trinta (30) e sessenta (60) dias, sendo quinze (15) ratos para cada tempo, onde cinco (n=5) receberam implantes de microesfera de PLDLA pura, cinco receberam implantes de microesferas de PLDLA com sinvastatina, e os outros cinco não receberam nenhum tratamento (controle negativo), a fim de evitar a

influência sistêmica do medicamento. A figura 1 representa, esquematicamente, através de uma radiografia simples, o local onde foi realizado o defeito na tíbia do animal e os tratamentos utilizados.

Figura 1: Esquema representativo do local de implante na tíbia de ratos Wistar visto através de uma radiografia simples e dos tratamentos utilizados (microesferas de PLDLA, microesferas de PLDLA encapsuladas com sinvastatina e controle negativo, onde foi realizado apenas o defeito, sem implante de nenhum material).

3.2. Procedimento cirúrgico

Os ratos foram pesados e submetidos à anestesia geral administrada via intramuscular com uma solução de cloridrato de cetamina 10% (40 mg/kg) mais cloridrato de xilazina 2% (5 mg/kg) por peso corporal.

Para o implante das microesferas de PLDLA (Fig. 2-A), depois de anestesiados, os animais foram posicionados em decúbito dorsal e submetidos à tricotomia da região medial da pata traseira direita (Fig. 2-B). Foi realizada uma incisão longitudinal na pele de aproximadamente 2cm ao longo da borda anterior da tíbia. Com auxilio do bisturi, o tecido muscular foi seccionado e afastado até a exposição do periósteo e do tecido ósseo (Fig. 2-C). Com o uso de um mini-motor odontológico elétrico de baixa rotação (Beltec) e uma broca Carbide de 2mm de diâmetro, foi produzido um defeito no terço superior da tíbia (Fig. 2-D) sob irrigação constante com solução fisiológica estéril a fim de evitar superaquecimento das bordas do defeito (ALMEIDA PRADO et al., 2006; ANBINDER et al., 2006). A cavidade foi produzida na camada cortical atingindo o canal medular, permitindo a introdução de 1,6 mg de microesferas contendo ou não sinvastatina, de acordo com o grupo de tratamento (Fig. 2-E). Este procedimento foi realizado em uma das patas de todos os animais para evitar um maior trauma e a influência da droga. A sutura da musculatura e da pele foi realizada com Mononylon 4.0 com pontos simples (Fig. 2-F), seguida de anti-sepsia com solução de iodo-polvedine na região do ferimento.

Para o grupo controle, o defeito crítico de 2 mm ocasionado na tíbia do animal permaneceu vazio.

Molécula de Sinvastatina

Figura 2: Procedimento cirúrgico utilizado para o implante das microesferas de PLDLA. (A) microesferas; (B) tricotomia da região medial da pata traseira direita; (C) incisão longitudinal na pele ao longo da borda anterior da tíbia com exposição do periósteo e do tecido ósseo; (D) defeito crítico no terço superior da tíbia; (E) implante das microesferas com ou sem sinvastatina, de acordo com o grupo tratamento; (F) sutura simples da pele.

Finalizados os períodos pós-cirúrgicos, os animais foram sacrificados por overdose de Halotano, um anestésico inalante. Em seguida, as tíbias de cada animal foram cuidadosamente removidas e colocadas em solução fixadora de líquido de Bouin por um período de 8 horas.

4. Processamento do material

As tíbias foram transferidas para uma solução de EDTA a 4,13% por aproximadamente 30 dias, para a descalcificação.

A região do defeito foi marcada com tinta nanquim e os segmentos contendo os defeitos foram preparados para análise histológica convencional de acordo com as técnicas utilizadas para microscopia de luz, utilizando-se parafina como meio de

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inclusão. A marcação com corante nanquim possibilitou o rápido reconhecimento das áreas de osso neoformado após o trauma, isto também facilitou a inclusão do material e a realização dos cortes.

Três cortes semi-seriados de cada bloco, com aproximadamente 3µm de espessura e 15µm entre cada nível foram realizados a fim de analisar toda a região do defeito realizado. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) e analisadas e fotografadas em microscópio óptico com luz polarizada (Eclipse E800 – Nikon).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Morfologia das microesferas

As imagens obtidas pela microscopia eletrônica de varredura demonstraram que as microesferas de PLDLA com e sem o fármaco apresentaram morfologia esférica, superfície lisa, tamanho em escala micrométrica, grande distribuição de diâmetros, e ausência de agregação ou adesão como pode ser observado na Fig. 3.

Figura 3: Eletromicrografias de varredura das microesferas de PLDLA com o fármaco (A e B) e sem o fármaco (C).

Segundo Martin e colaboradores (2000) microesferas preparadas com polímeros amorfos como o PLGA, poliestireno e resinas acrílicas tem levado a formação de esferas com superfície lisa enquanto que as preparadas com polímeros cristalinos como o poli(hidroxi butirato), PHB, e o poli(hidroxi butirato-co-valerato), PHBV, tem apresentado superfície rugosa e porosa, sugerindo que as porções cristalinas do PHB e do PHBV determinam o comportamento das cadeias poliméricas.

A porosidade das microesferas depende, em parte, do fluxo de água entre as partículas poliméricas que vão originar as microesferas. Microesferas porosas permitem maior facilidade de difusão do meio pelo interior da mesma, liberando assim o fármaco de forma mais acelerada quando comparadas às microesferas maciças (WISCHKE & SCHWENDEMAN, 2008), contudo, apresentam degradação mais rápida.

2. Estudo In vivo

Todos os animais sobreviveram ao procedimento cirúrgico até o tempo da eutanásia. Durante o pós-operatório observou-se satisfatória recuperação clínica dos ratos, os quais não apresentaram qualquer imobilização e mantiveram suas funções e atividades semelhantes aos ratos não operados. Na execução do procedimento cirúrgico foram encontradas algumas dificuldades relacionadas à retenção das microesferas no interior do defeito, devido ao fluxo de sangue proveniente da medula óssea. Embora durante o período de implantação das microesferas o fluxo sanguíneo tenha cessado ou diminuído, não se pode afirmar o mesmo após o fechamento da incisão. Esta dificuldade

A B C

também foi relatada por outros autores (AYUKAWA et al., 2010; MASUZAKI et al., 2010).

2.1. Análise macroscópica

A avaliação macroscópica da pele demonstrou que todos os animais apresentaram completa cicatrização da incisão. Nenhuma diferença clínica pôde ser detectada entre os grupos estudados.

Em relação à morfologia externa das tíbias retiradas no tempo de 15 dias pós-operatório pode-se observar no grupo controle (Fig. 4-A) a presença do defeito crítico parcialmente fechado, sem evidencia de fibrose externa. Já no grupo com microesferas puras (Fig. 4-B) e com microesferas contendo sinvastatina (Fig. 4-C) observou-se a presença de um tecido fibroso envolvendo todo o defeito, resultado semelhante ao encontrado no tempo de 30 dias pós-operátório com a diferença de que neste tempo houve aparente fechamento total do defeito no grupo controle (Fig. 4-D).

Figura 4: Imagens macroscópicas das tíbias. (A) 15 dias - Grupo controle mostrando defeito; (B) 15 dias - Grupo com microesferas apresentando tecido fibroso ao redor do defeito; (C) 15 dias - Grupo com microesferas contendo sinvastatina notando-se fibrose ao redor do defeito; (D) 30 dias - Grupo controle com aparente fechamento total do defeito. As setas indicam os defeitos.

No tempo de 60 dias pós-operatório nota-se que no grupo controle houve fechamento total do defeito semelhante ao período anterior. No grupo contendo microesferas puras e com sinvastatina evidencio-se que em 4 ratos houve fechamento total com escassa presença de fibrose enquanto que em um deles foi possível notar um tecido fibrótico ao redor do defeito, semelhante ao tempo anterior.

2.2. Análise histológica

Grupo controle

A análise histológica após 15 dias pós-operatórios (Fig. 5-A e B) revela que houve preenchimento das feridas em padrão irregular com formação de delicadas trabéculas ósseas de aspecto imaturo, porém sem formação de osso cortical propriamente dito, o que resultou em aspecto esponjoso. As trabéculas estão rodeadas

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por células osteoblásticas hiperplásicas (indicativas de intensa atividade) e, entre elas, evidenciam-se capilares e células fusiformes, sem presença de elementos das linhagens hematopoiéticas, isto é, sem medula propriamente dita. No periósteo há fibrose evidente e o osso neoformado é de padrão membranoso com pequenos focos de ossificação endocondral, localizados nas bordas da lesão. Na medula observam-se macrófagos com hemossiderina.

Após 30 dias pós-operatório (Fig. 5-C e D) houve fechamento quase total, porém ainda irregular, com focos de fibrose e trabéculas mais espessas e agora anastomosadas, com presença de medula entre elas e sem hiperplasia das células osteoblásticas. Nota-se a presença de osso de aspecto mais maduro.

No tempo de 60 dias pós-operatório (Fig. 5-E), evidencia-se fechamento total ainda sem osso totalmente maduro e em algumas lâminas observam-se falhas com delicada fibrose. Um animal apresentou osteomielite e fechamento total do defeito, porém com sequestros de osso necrótico, fibrose e abundante tecido de granulação com polimorfonucleares neutrófilos (Fig. 5-F).

Implante de microesfera de PLDLA sem fármaco

Observou-se que no tempo de 15 dias pós-operatório (Fig. 6-A e B), houve fechamento praticamente total, porém irregular, com trabéculas delicadas rodeadas por acentuada hiperplasia das células osteoblásticas. Diferentemente do grupo controle, entre as trabéculas observam-se elementos medulares com células da linhagem hematopoiética. Houve degradação do polímero caracterizada por macrófagos espumosos, sem presença de células gigantes e a fibrose é escassa. Além disso, ocorreu neoformação óssea ao redor, tendendo a invadir a área representada pelo polímero. O calo ósseo é evidente e há acentuada presença de osso jovem de aspecto esponjoso.

Após 30 dias pós-operatório (Fig. 6-C e D) é possível observar o fechamento total, porém também irregular, com trabéculas mais espessas do que as observadas no período anterior. Há crescimento ósseo ao redor do polímero, porém sem invasão das porções internas do dispositivo. Este mostra, além de células espumosas, presença de escassas células gigantes multinucleadas. As células osteoblásticas, ao redor das trabéculas ósseas, são de volume e número menor do que no tempo anterior.

O tempo de 60 dias pós-operatório (Fig. 6-E e F) demonstrou fechamento total com osso praticamente maduro com trabéculas espessas. Em alguns cortes identificam-se restos do polímero com delicada fibrose ao redor. Em um animal há calo ósseo maduro rodeando toda a espessura da haste óssea e presença de macrófagos com hemossiderina.

Implante de microesfera de PLDLA com Sinvastatina

O tempo de 15 dias pós operatório (Fig. 7-A e B) apresentou fechamento irregular com trabéculas jovens e não há exuberante hiperplasia das células osteoblásticas como observado no grupo sem sinvastatina. Nota-se maior crescimento ósseo nas áreas não lesadas, apresentando-se mais espesso na cortical ao redor de toda a haste óssea, para fora do periósteo.

Após 30 dias pós-operatório (Fig. 7-C e D) houve fechamento total sem aspecto uniforme, o que resulta em aspecto semelhante ao observado no grupo controle. Em alguns animais é possível identificar o polímero. Nota-se hiperplasia das células osteoblásticas no osso cortical maduro contralateral.

No tempo de 60 dias pós-operatório (Fig. 7-E e F) ocorreu fechamento total com osso praticamente maduro e de aspecto semelhante ao anterior. Também não se encontra o polímero em todos os animais e quando observado, o aspecto é semelhante ao descrito anteriormente. A sinvastatina aparentemente não modificou o aspecto do polímero e este continua a apresentar macrófagos espumosos e escassas células gigantes.

Os resultados histológicos estão de acordo com a avaliação macroscópica.

Figura 5: Fotomicrografias do grupo controle: (A) 15 dias - Preenchimento da lesão em padrão irregular com neocrescimento ósseo, HE, 20x; (B) 15 dias - Fibrose evidente e o osso neoformado, HE, 100x; (C) 30 dias - Fechamento total, porém ainda irregular, HE, 20x; (D) 30 dias - Tecido ósseo neoformado na área da lesão e fibrose evidente, HE, 100x; (E) 60 dias - Fechamento total com tecido maduro e trabéculas ósseas espessas, HE, 20x; (F) 60 dias - Osteomielite, HE, 20x.

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Figura 6: Fotomicrografias do grupo contendo microesferas de PLDLA sem fármaco: (A) 15 dias - Fechamento total e irregular da lesão com presença de micoresferas no interior, HE, 20x; (B) 15 dias - Osso neoformado na área lesionada, HE, 100x; (C) 30 dias - Fechamento total sem a presença de microesferas, HE, 20x; (D) 30 dias - Tecido ósseo neoformado com trabéculas espessas, HE, 100x; (E) 60 dias - Fechamento total com presença das microesferas, HE, 20x; (F) 60 dias - Tecido ósseo neoformado com trabéculas e medula, HE, 100x.

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Figura 7: Fotomicrografias do grupo contendo microesferas de PLDLA com sinvastatina: (A) 15 dias - Fechamento irregular da lesão com presença de microesferas com sinvastatina no interior do defeito, HE, 100x; (B) 15 dias - Neoformação óssea com trabéculas finas. HE, 200x; (C) 30 dias - Fechamento total sem a presença de microesferas, HE, 20x; (D) 30 dias - Tecido ósseo neoformado em direção as microesferas com trabéculas espessas, HE, 100x; (E) 60 dias - Fechamento total sem a presença de microesferas, HE, 20x; (F) 60 dias - Crescimento neotecidual ósseo na região em que o defeito foi realizado, HE, 100x.

Um estímulo para a osteogênese local é um fator importante nareparação de defeitos ósseos em geral. Nos últimos anos várias substânciastêm sido utilizadas com este objetivo, incluindo proteínas morfogenéticas ósseas, fatores de crescimento, drogas e hormônios. No entanto, tais substâncias ainda não são

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empregadas clinicamente devido a problemas como custo, eficácia e segurança. (MERAW et al., 1999; SCHMIDMAIER et al., 2002; FRANKE et al., 2003; STENPORT et al., 2003; TRESGUERRES et al., 2003; SYKARAS et al., 2004; DE RANIERI et al., 2005; CARTMELL, 2008; MORIYAMA et al., 2008; AKAGAWA et al., 2009; AYUKAWA et al., 2010; MASUZAKI et al., 2010; MORIYAMA et al., 2010; BROWN, et al., 2011; ZOU et al., 2012 ).

No presente estudo empregou-se uma estatina no intuito de verificar sua influência na regeneração óssea. Além de atuar na redução dos níveis de LDL-colesterol as estatinas exercem efeitos pleiotrópicos, tais como anti-inflamatório, antioxidante, imunomoduladores, antitrombóticos e angiogênicos (HORIUNCHI & MAEDA, 2006). Em relação à osteogênese seus efeitos estão associados ao aumento da biossíntese do BMP-2 por inibir a prenilação de pequenas GTPases (MUNDY et al, 1999; SUGIYAMA et al., 2000; GARRETT et al., 2001; OHNAK et al., 2001; SKOGLUND et al., 2002; PARK, 2009; MASUZAKI et al., 2010; MORIYAMA et al., 2010; NYAN et al., 2010; ZOU et al., 2012).

Vários estudos têm indicado que o uso de estatinas em seres humanos pode estar associado ao aumento da densidade mineral óssea e uma diminuição do risco de fraturas (EDWARD et al., 2000; CHAN et al., 2000; MEIER et al., 2000; MORIYAMA et al., 2010).

Na formação óssea, os efeitos benéficos estão mais associados ao aumento da expressão de BMP-2, que estimula a proliferação e diferenciação dos osteoblastos. Embora o exato mecanismo pelo qual as estatinas influenciam a formação óssea ainda não esteja claro, existe a possibilidade de que pequenas enzimas GTPases, preniladas pelos produtos da síntese do colesterol, regulem negativamente a expressão de BMP-2 (MUNDY et al, 1999; GARRETT & MUNDY, 2002; ANBINDER et al., 2006; HORIUCHI & MAEDA, 2006; WU et al., 2008; PARK, 2009; MASUZAKI et al., 2010; NYAN et al., 2010; ZOU et al., 2012).

Por outro lado, as estatinas também podem ter efeito na diminuição da reabsorção óssea. Os osteoclastos usam moléculas intermediárias da biosíntese do colesterol, o farnesil e geranilgeranil, para modificar e ativar proteínas chaves intracelulares. Assim, a ausência desses subprodutos pode causar efeitos que diminuem a formação e função dos osteoclastos (CRUZ & GRUBER, 2002; GRASSER et al., 2003).

Estudos demonstram que tanto a administração sistêmica/oral quanto a local possuem efeitos positivos no osso. Porém, o primeiro apresenta uma maior dificuldade para se conseguir a osteogênese, pois, uma vez que a droga sofre metabolização hepática (reduzindo a concentração que chega ao osso), exige administração diária e em maiores doses, exacerbando os efeitos colaterais e trazendo desconforto ao paciente. Por outro lado, a administração local não sofre o metabolismo de primeira passagem no fígado, mas exige o estabelecimento de um sistema de liberação controlada da droga. Por esse motivo, neste estudo utilizou-se a aplicação local (CORSINI et al., 1999; AYUKAWA et al., 2004; GUTIERREZ et al., 2006; MORIYAMA et al., 2008; AYUKAWA et al., 2010; MASUZAKI et al., 2010; ROMEO & FANOVICH, 2010; ZOU et al., 2012).

Vários tipos de carreadores foram empregados nos estudo citados acima, tais como géis de metilcelulose, esponjas de colágeno, sulfato de cálcio e micro e nanoesferas de polímeros biodegradáveis (THYLIN et al., 2002; WONG & RABIE, 2003; GARRETT et al., 2007; NYAN et al., 2007; LEE et al., 2008; JIANG et al., 2010; MORIYAMA et al., 2010).

Sistemas poliméricos de liberação de fármacos são largamente utilizados e não só permitem uma liberação lenta e gradual do ingrediente ativo, como também podem possibilitar o direcionamento a alvos específicos do organismo a ser tratado, como um sítio de inflamação e tumor (MOTTA & DUEK, 2008).

A partir da análise histológica dos resultados pode-se perceber diferenças entres os grupos, principalmente no tempo de 15 dias pós operatório. A melhor resposta foi obtida no grupo utilizando microesferas encapsuladas com sinvastatina conforme relatado, também, por outros autores (MORIYAMA et al., 2008; MASUZAKI et al., 2010; MORIYAMA et al., 2010).

Todos os grupos apresentaram preenchimento do defeito com trabéculas jovens, irregulares e delicadas, porém no grupo contendo apenas microesferas esse fechamento ocorreu quase totalmente enquanto que no grupo com microesferas contendo sinvastatina o fechamento foi total. Além disso, esse último grupo apresentou células da linhagem hematopoiética entre as trabéculas e menor quantidade de osteoblastos hiperplásicos o que indica uma menor atividade óssea devido à maior maturação do osso, ou seja, as trabéculas desse grupo encontravam-se em um estado de maior maturação que as dos grupos anteriores.

A presença de tecido conjuntivo entre as trabéculas é inversamente proporcional à maturidade óssea (em oposição à presença de células hematopoiéticas, que é proporcional), uma vez que a regeneração de defeitos ósseos ocorre à partir da diferenciação de células do tecido conjuntivo em osteoblastos que secretam a matriz orgânica a ser mineralizada (OLIVEIRA, 2006).

Outra característica encontrada apenas no grupo de microesferas contendo sinvastatina é a hiperplasia das células osteoblásticas no osso cortical maduro contralateral, o que contraria os resultados encontrados por AYUKAWA e colaboradores (2010) que não evidenciaram os efeitos da sinvastatina nessa região. Tal resultado pode indicar que a sinvastatina teve ação não só na área do defeito, mas também em regiões próximas, propagando-se através dos vasos sanguíneos da região.

A presença de macrófagos e células gigantes incluindo o desenvolvimento de algum tecido de granulação já era considerada uma resposta esperada. Para os materiais degradáveis a ação dessas células é necessária, caso contrário haveria a formação de uma espessa cápsula fibrosa em torno do material, gerando diversas consequências negativas (KATJA & RECHENBERG, 2008).

Analisando apenas os animais do grupo controle, apesar de em todos os tempos analisados ter ocorrido o fechamento linear do defeito experimental, em todos os espécimes o defeito foi identificado, diferindo do tecido ósseo antigo, sem haver completa remodelação espontânea conforme descrito anteriormente por Almeida Prado e colaboradores (2006).

No presente estudo, o defeito crítico realizado com 2mm de diâmetro está de acordo com a literatura que utiliza roedores como modelo animal, encorajando sua utilização para a avaliação da ação de medicamentos e materiais em estudos de regeneração óssea (ALMEIDA PRADO et al., 2006). Além de defeitos maiores como, por exemplo, de 3,5 cm e 4,0 cm, serem desencorajados por outros pesquisadores devido ao elevado risco de fraturas e por isso não foram realizados (ALMEIDA PRADO et al., 2006).

Diante do exposto, o presente estudo encontrou-se maior diferença histológica entre o grupo controle e o de microesferas com sinvastatina no tempo de 15 e 30 dias pós operatório do que no período de 60 dias, sendo mais evidente no tempo de 15 dias. Tal achado corrobora os resultados de Masuzaki e colaboradores (2010) que avaliaram a influência de microesferas de PLGA encapsuladas com sinvastatina no processo de

regeneração óssea ao redor de implantes realizados em tíbias de ratos. Esses autores observaram que o efeito da droga no local do implante foi maior até a segunda semana e manteve-se até a quarta semana, mas as diferenças entre os grupos de estatina e não-estatina foram menores em 4 semanas do que às em 2 semanas. Esses resultados podem implicar que a formação de osso atingiu um patamar em menos de 4 semanas. Neste contexto, estatinas podem atuar numa fase precoce da formação do osso.

CONCLUSÕES

Os resultados evidenciaram que a obtenção de microesferas de PLDLA é uma técnica eficaz para aplicação na liberação controlada de fármacos além de demonstrar a biocompatibilidade desse material polimérico no tecido ósseo.

A sinvastatina mostrou ter propriedade osteoindutora, uma vez que ocorreu um aumento na formação de tecido ósseo no defeito quando analisado histologicamente.

Os resultados sugerem o potencial para uso do material na engenharia tecidual e medicina regenerativa.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pela bolsa concedida (Processo 10/20421-2).

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INFLUENCE OF SIMVASTATIN LOADED PLDLA MICROSPHERES IN BONE REGENERATION

Marlon Moda1, Cíntia C. Santos1, Diego D. Leonato1, Andrea R. Esposito1,2, Bruna A.

Mas1,2, Silvia M. M. Cattani1, Kelly F. Martins1, Maria L. P. Barbo1, Eliana A. R.

Duek1,2

1Laboratory of Biomaterials, Pontifical Catholic University of São Paulo, Sorocaba (SP), Brazil 2Departament of Materials Engineering, State University of Campinas, Campinas (SP), Brazil

E-mail: eliduek@pucsp.br

Abstract. Recent studies have shown that the use of bioresorbable polymers as drug microcarriers provides flexibility in dosage and in the kinetics of release, improving the effectiveness in treating and providing better conditions for the patients. Simvastatin has like a pleiotropic effect the improvement of bone regeneration proved to be suitable for combination with microspheres in the treatment of bone tissue. The aim of this study was to obtain microspheres of the bioresorbable and biocompatible copolymer poly(DL-co-L lactic acid) (PLDLA) loaded with simvastatin and investigate its effect on bone regeneration. For this purpose, microspheres with and without the drug were obtained by the process of simple emulsion and subjected to in vitro characterization using scanning electron microscopy. Bone defects were made in the proximal tibia of 45 Wistar rats in which the microspheres with and without drug were implanted, in addition to the control group remained untreated. After periods of 15, 30 and 60 days the histological results showed differences of bone growth between the groups, especially after 15 days postoperatively. All groups showed a filling defect with irregular and young trabecular, but in the group with microspheres containing simvastatin closure was complete, suggesting the osteogenic effect of the drug. Therefore, the results showed that the PLDLA microspheres are promising devices for use in controlled drug delivery in tissue engineering and regenerative medicine, demonstrating the biocompatibility of the device in the bone tissue.

Keywords: Microspheres, PLDLA, Simvastatin, Controlled drug delivery system