DESENVOLVIMENTO DE SUPORTES POROSOS A BASE DE GELATINA E GALACTOMANANA DE CASSIA FISTULA

Iolanda Frota de Farias1, Leonira Morais da Silva1, Francisco de Araújo Magalhães1, Daniele Maria Alves Teixeira2, Jeanny da Silva Maciel1

1Depto. deQuímica Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil 2Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Ceará - Curso Tecnologia em Alimentos

E-mail: jeanny@dqoi.ufc.br

Resumo. Na Engenharia de Tecidos, suportes porosos são aplicados nas técnicas de reconstrução tecidual. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de suportes porosos de gelatinareticulados com galactomanana de Cassia fistula (GCF) oxidada. A GCF foi oxidada em graus de 10 e 20% (GCFOX10 e GCFOX20), pela reação com NaIO4. A gelatina é reticulada através da reação dos grupos aminos com os grupos aldeídicos da galactomanana oxidada (formação da base de Schiff ou imina). Os hidrogéis foram obtidos nas razões em massa de GCFOX/gelatina 1:1 e 1:10 em seguida congelados a -80 °C e liofilizados. Os hidrogéis foram analisados com microscopia eletrônica de varredura (MEV), quanto à cinética de intumescimento e espectroscopia no infravermelho. A liberação de Bovine Serum Albumin (BSA) a partir das matrizes GCFOX10/gelatina em pH 7,4 a 37 °C foi acompanhada por espectroscopia UV-Vis a 280 nm. Observou-se na MEV que os géis com maior concentração de GCFOX apresentam superfícies menos homogêneas. O aumento do grau de oxidação da GCF provoca diminuição de até 55% na capacidade de intumescimento e favorece a formação de géis com maior estabilidade em meio fisiológico; porém, para um mesmo grau de oxidação o aumento da concentração de GCFOX provoca um decréscimo tanto na estabilidade em meio aquoso quanto na homogeneidade dos materiais. O gel de GCFOX10/gelatina 1:1 libera 58% mais BSA no mesmo intervalo de tempo que o gel GCFOX10/gelatina 1:10, indicando que o último apresenta estrutura com maior grau de reticulação. Conclui-se que os géis de GCFOX/gelatinacom maior grau de oxidação e menor concentração de GCFOX são promissores para desenvolvimento de suportes porosos para liberação de moléculas bioativas no processo de regeneração do tecido.

Palavras-chave: polissacarídeo, biomaterial, scaffolds

1. INTRODUÇÃO

A gelatina é um biopolímero, biocompatível, biodegradável, e solúvel em pH fisiológico à temperatura ambiente, o que a torna ideal para aplicações farmacêuticas. Na construção de biomateriais a gelatina tem sido preferida em relação ao colágeno, pois por ser desnaturada tem mais baixa antigenicidade. Além disso, gelatina é muito mais viável economicamente que o colágeno [Lien, Li e Huang (2008)]. Suportes porosos a base de gelatina estão sendo desenvolvido para aplicações em diferentes áreas da engenharia de tecidos [Liu e col. (2009); Wu e col. (2010); Peter e col. (2010); Wang e col. (2009)].

Suportes porosos são utilizados para o crescimento de células no processo de regeneração ou substituição de tecidos. Géis a base de gelatina e polissacarídeo são atraentes na preparação de suportes porosos em função da semelhança com matrizes

extracelulares de tecidos moles, como cartilagem e pele. No sentido de preparar biomateriais com baixo potencial de toxicidade tem sido proposta a preparação de géis de gelatina reticulados com polissacarídeos oxidados a aldeídos. A reação de oxidação de polissacarídeos com periodato de sódio modifica as hidroxilas vicinais dos monossacarídeos para aldeídos. A reticulação ocorre devido à formação da base de Schiff na reação entre o -amino grupos da lisina ou grupos laterais da hidroxilisina e os aldeídos disponíveis [Schacht e col. (1997)]. Essa reação diminui a solubilidade da gelatina e do polissacarídeo formando géis estáveis em meio fisiológico.

Os hidrogéis são frequentemente utilizados para estabilizar e liberar moléculas bioativas no processo de regeneração tecidual. Vários hidrogéis tem sido propostos para incorporar e liberar proteínas. Um dos estudos mais comuns é a liberação de proteínas que promovem a angiogenese do tecido [Drury e Mooney (2003)]. O transporte de moléculas em géis pode ser afetado pelo grau de reticulação do gel [Mi e col., 2000].

A galactomananautilizada para preparação dos géis nesse trabalho foi extraída e caracterizada das sementes de árvores da espécie Cassia fistula da cidade de Limoeiro do Norte no Estado do Ceará [Silva, 2012]. Os resultados de RMN 1H mostraram razão de manose:galactose (M:G) de 3,2:1, próximo a razão reportada para a goma locusta.

O objetivo desse trabalho é preparar géis de gelatina reticulados com a galactomanana de “Cassia fistula” oxidada para aplicação com suportes porosos (scaffolds) na engenharia de tecidos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Reação de oxidação da galactomanana de Cassia fistula com periodato de sódio

A galactomanana, extraída das sementes de Cassia fistula foi suspensa em água (0,5% m/v) e deixada sob agitação por 24 h, após completa dissolução, volumes distintos de solução de NaIO4foram adicionados lentamente com o objetivo de obter derivados oxidados da galactomanana de Cassia fistula nos graus de 10 e 20% nomeados como GCFOX10 e GCFOX20, respectivamente. A mistura reacional foi deixada por 24 h à temperatura ambiente e no escuro. Ao final das 24 h uma alíquota de 20 mL foi retirada para determinação do grau de oxidação e em seguida adicionado etilenoglicol ao restante da mistura para parar a reação. As soluções de GCFOX obtidas foram dialisadas contra água destilada em membrana de celuloseaté que a condutividade da diálise fosse igual a da água destilada e posteriormente as soluções foram liofilizadas.A Tabela 1 apresenta os dados experimentais e resultados da oxidação com periodato.O grau de oxidação das GCFOX foi determinado por espectroscopia de absorção na região do UV-VIS, como descrito por Gomez, Rinaudo e Villar (2007). Utiliza-se um indicador preparado com volumes iguais de soluções de KI 5% m/v e amido 1% m/v dissolvidos em tampão fosfato pH=7,4 (0,077 mol/L). Misturou-se então 1,5mL do indicador com volumes variados da alíquota da solução previamente reservada.

O complexo formado foi analisado em espectrofotômetro UV-1800 Shimadzuem 486 nm. A diferença entre a quantidade inicial e final de periodato corresponde à quantidade de grupos hidroxilas transformados em grupamentoaldeído[Gomez, Rinaudo e Villar, 2007]. O resultado é resumido na Tabela 1.

Tabela 1 – Dados experimentais da reação de oxidação da Galactomanana de Cassia

fistula com periodato de sódio.

Grau de oxidação

teórico (%)

N° de mols de NaIO4 (em mols)

Adicionado Consumido

Grau de oxidação real (%)

Rendimento da GCF

Oxidada (% em massa)

10 6,2 x10-4 6,1 x10-4 9,9 79,6

20 1,2 x10-3 1,2 x10-3 19,9 82,8

2.2 Síntese do gel de galactomanana de Cassia fistula e gelatina e incorporação de BSA

Os géis foram preparados pelo método de congelamento seguido de liofilização (freeze-drying) [Lien, Li e Huang (2008) e Choi e col. (1999)]. Uma solução com concentração 3% (m/v) de galactomanana foi misturada com água destilada e deixada sob agitação até a completa dissolução (período de 24h). A gelatina foi dissolvida em tampão fosfato pH 7,4, para a obtenção de uma solução com concentração final de 10% (m/v), e solubilizada em um banho a 50 °C, por 15min, até obter uma solução transparente. A solução de GCFOX foi colocada no mesmo banho, para que estabilizasse a temperatura. Volumes variados da solução de GCFOX foram então misturados com a gelatina, para obtenção das seguintes razões em massa GCFOX/gelatina 1:1 e 1:10.

Os frascos foram deixados à temperatura ambiente por 30 min e, em seguida mantidos a –80 °C em UltralowfreezerNuairepor 24 h e por fim a mistura foi liofilizada no frasco cilíndrico.

2.3 Caracterização dos géis de galactomanana oxidada e gelatina

Espectroscopia na região do infravermelho.Os espectros dos géis foram obtidos em um espectrômetro modelo 8300 da

Shimadzu, entre 400 e 4000 cm-1, utilizando pastilhas de KBr. A Figura 1 mostra os espectros na região do infravermelho para os géis de GCFOX/gelatina.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).A morfologia da superfície dos géis foi investigada com microscopia eletrônica de

varredura (MEV). Após a liofilização, os géis foram recobertos com platina e sua superfície observada com Microscópio Eletrônico de Varredura XL30 – Phillips. A Figura 2 apresenta as micrografias dos géis de GCFOX/gelatina.

Ensaios de Intumescimento.Foram realizados ensaios de intumescimento, em triplicata, dos géis em tampão

fosfato pH 7,4 e temperatura ambiente. Os géis secos e pesados (Ms) foram imersos em solução tampão pH 7,4 e, na primeira hora, foram retirados em intervalos de 20 min, as superfícies dos géis intumescidos foram secas com papel de filtro e a suamassa medida (Mu).Na segunda hora, o intervalo aplicado foi de 30 mine depois de60 min até a quinta hora. A porcentagem de intumescimentofoi obtida pela Equação 1:

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Abs

orbâ

ncia

Número de onda (cm-1)

GCFOX10%/gelatina GCFOX20%/gelatina GCF gelatina

Intumescimento % = [(Mu - Ms)/Ms]x100% (1)

Estudos de liberação de BSA (BovineSerumAlbumine)

Os géis para liberação de BSA foram preparados utilizando o mesmo procedimento do item 2.2, com a diferença que BSA foi dissolvido na solução de GE para obter a concentração de 20 g/L[Liu e col., 2007].

Os géis foram imersos em 10 mL de tampão fosfato pH 7,4 à temperatura constante de 37 °C sob agitação constante. Alíquotas de 1mL foram retiradas e diluídas para 3 mL e em seguida analisadas em espectrofotômetro UV-1800 Shimadzu a 280 nm. O processo de liberação foi realizado em 5 horas, sendo que, na primeira hora foram realizadas medidas de 20 em 20 minutos, na segunda hora, de 30 em 30 minutos e nas três últimas horas, realizou-se a medida com intervalos de uma hora.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Caracterização dos géis de galactomanana oxidada e gelatina

Espectroscopia na região do infravermelhoPara confirmar a reticulação via formação da base de Schiff (imina – C=N) foram

obtidos os espectros na região do infravermelho. A Figura 1 mostra os espectros dos géis GCFOX 1:1 preparados com GCFOX 10% e 20%, respectivamente. Observa-se que os géis apresentam absorções características do polissacarídeo e da proteína. As absorções em torno de 1650 cm-1, 1540 cm-1, e 1239 cm-1 são atribuídas às vibrações da ligação C-O (amida I) da gelatina, N-H (Amida II) e C-N da amida, respectivamente. A principal absorção que indica a presença do polissacarídeo aparece em 1080 cm-1, correspondente a C-O de álcool. A absorção da ligação C=N (ligação da imina - base de Schiff) é difícil de ser observada, pois pode ser sobreposta pela banda de Amida I [YueXiao, 2008].

Figura 1- Espectros na região do infravermelho da GCF, gel de gelatina, e dos géis GCFOX/gelatina.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Na Figura 2 estão representadas as micrografias dos géis GCFOX20% na razão de 1:10 e 1:1 com gelatina. Pode-se observar que o aumento da concentração de gelatina confere maior regularidade na superfíciedo gel. Os resultados indicam que as concentrações de gelatina não podem ser diminuídas para razões 1:1, desde que nessas condições o gel não apresenta características interessantes para a aplicação proposta. O material esperado para aplicação como suportes porosos deve ser estável em meio fisiológico e também apresentar homogeneidade.

Figura 2- Micrografias dos géis: A e B – GCFOX20/gelatina 1:10; C e D GCFOX20/gelatina 1:1 aumento de 500 e 1000 vezes, respectivamente.

Ensaios de Intumescimento.A Figura 3 apresenta a variação do grau de intumescimento em função do tempo

para os géis de GCFOX10/gelatina e GCFOX20/gelatina. Os resultados mostram que o intumescimento é dependente do grau de oxidação da GCFOX. Observa-se que a capacidade de intumescimento dos géis de gelatina/GCFOX decresce com o aumento do grau de oxidação da galactomanana, o que indica maior grau de reticulação entre as cadeias da proteína e o polissacarídeo oxidado. Observa-se que para maiores concentrações de gelatina os géis mostram menor capacidade de intumescimento, indicando uma maior estabilidade em meio aquoso.

Ensaio de liberação de BSA

A Figura 4 apresenta as curvas de percentual de liberação in vitro de BSA a partir dos géis GCFOX10/gelatina, na razão de 1:1 e 1:10. O gel de GCFOX/gelatina 1:1 libera maior quantidade de BSA que o gel GCFOX1:10 quando comparados no mesmo intervalo de tempo liberação. Essa diferença, em torno de 58%, pode ser atribuída a uma

A B

DC

estrutura com menor grau de reticulação, como observado no resultado de intumescimento.

Figura 3- Variação do grau de intumescimento com o tempo para os géis GCFOX10 e 20/gelatina.

Figura 4- Gráfico da variação da concentração de BSA em função do tempo.

CONCLUSÕES

Os géis de galactomanana oxidada/gelatina apresentam potencial para preparação de suportes porosos para as condições em que o grau de oxidação da galactomanana modificada é de 20% e para a razão GCFOX/gelatina 1:10. Para essas matrizes obteve-se maior homogeneidade da superfície do gel e maior estabilidade em meio aquoso.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao apoio financeiro do CNPq (Projeto Universal 2009 e INOMAT).

REFERÊNCIAS

Choi, Y. S., Lee, S. B., Hong, S. R., Lee, Y. M., Song, K. W., Park, M. H., Nam Y. S. (2001) Journal of Materials Science: Materials in Medicine,12, 67.Drury, J.L., Mooney, D. J. (2003) Biomaterials, 24, 4337.Gomez, C. G., Rinaudo, M., Villar, M. A., (2007) Carbohydrate Polymers, 67, 296.Lien, S.-M., Li, W.-T., Huang, T.-J., (2008) Materials Science e Engineering C, 28, 36.Liu, H., Fan, H., Cui, Y., Chen, Y., Yao, K., Goh, J.C.H. (2007) Biomacromolecules, 8, 1446.Liu, X., Smith, L. A., Hu, J., Ma, P. X. (2009) Biomaterials, 30, 2252.Mi, F. L., Kuan, C-Y., Shyu S-S, Lee S-F.(2000) Carbohydrate Polymers, 41, 389.Peter, M., Binulal, N. S., Nair, S. V., Selvamurugan, N., Tamura, H., Jayakumar, R. (2010) Chemical Engineering Journal, 158, 353.Schacht, E., Bogdanov, B., VandenBulcke, A., DeRooze, N. (1997) Reactive and Functional Polymers, 33, 109.Silva, L. M. Galactomanana de sementes de Cassia fistula: Extração, Caraterização e Modificação Química. Dissertação apresentada no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica – Universidade Federal do Ceará. 2012.Wang, S., Liu, W., Han, B., Yang, L. (2009).Applied Surface Science, 255, 8701.Wu, X., Liu, X., Wen, P., Zhang Y., Long, Y., Wang, X., Guo, Y., Xing, F., Gao, J. (2010 ) ActaBiomaterialia, 6, 1167.Yu, H., Xiao, C. (2008) CarbohydratePolymers, 72, 479.

PREPARATION OF SCAFFOLDS FROM CASSIA FISTULA GALACTOMANNAN AND GELATIN

Iolanda F. Farias1, Leonira Morais da Silva1, Francisco de Araújo Magalhães1, Daniele Maria Alves Teixeira2, Jeanny da Silva Maciel1

1Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brazil 2Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Ceará - Curso Tecnologia em Alimentos

E-mail: jeanny@dqoi.ufc.br

Abstract. Within the tissue engineering, scaffolds are applied in the tissue reconstruction techniques. The aim of this study is about the preparation of the scaffolds from oxidized Cassia fistula galactomannan (CFG) crosslinked gelatin. The GCF was modified by reacting with the NaIO4 in order to obtain the oxidized polysaccharide with the following oxidation degrees: 10% and 20% (CFGOX10 and CFGOX20). The gelatin is crosslinked in the reaction of the amino groups with the aldehyde groups of the oxidized galactomanan (formation of the Schiff base or the imine). The gels were obtained in the weight ratios of the GCFOX/gelatin 1:1 and 1:10, following by a freeze-drying. The hydrogels were analyzed with the scanning electron microscopy (SEM), the kinetics of swelling and the infrared spectroscopy. The releases of Bovine Serum Albumin (BSA) from the matrices GCFOX10/gelatin at pH 7.4 at 37 °C was monitored by UV-Vis spectroscopy at 280 nm. We observed that in the SEM gels with higher concentrations of GCFOX, do have heterogeneous surfaces. Increasing the degree of oxidation in GCFOX, causes a reduction of up to 55% in swelling capacity, therefore, it facilitates the formation of gels with a higher stability in the physiological media. However, for the same degree of oxidation in an increasement in the concentration of GCFOX, causes a decrease in the stability on the aqueous medium, as the homogeneity of the aforesaid gels. The gel 1:1 GCFOX10/gelatin releases 58% more BSA in the same interval of time than the gel GCFOX10/gelatin 1:10, therefore, indicating that the gel GCFOX10/gelatin 1:10 shows a greater degree of crosslinking. The gels of the GCFOX/gelatin with a higher degree of oxidation and a lower concentration of the GCFOX, are promising for the development of porous supports in the releases of bioactive molecules for the process in the tissue regeneration.